JP2002542794A - 標識担持標的を検出するための単層および電極ならびにその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 結合対の構成要素間の相互作用を検出するための電極であって、非伝導性の自己集合単層の形成により修飾されている電極、およびこのような電極を使用して、核酸または受容体、リガンド、抗原または抗体を含む他の標的等の、生体分子を検出する方法。自己集合単層に結合されたオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸と接触すると、標的核酸と反応して、ハイブリダイズした核酸を修飾電極表面上に形成する。ハイブリダイズした核酸を、ハイブリダイズした核酸中の予め選択された塩基を酸化還元反応で酸化することができる遷移金属錯体と反応させ、酸化還元反応を検出し、検出された酸化還元反応から核酸の有無を判定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願に関するクロスリファレンス 本出願は、１９９５年６月２７に提出の出願第０８／４９５，８１７号(現在
は放棄された)の一部継続である、１９９６年６月２０日に提出の出願番号第０
８／６６７，３３８号の分割出願である（現在は米国特許第５，８７１，９１８
号である）、１９９８年１０月２７に提出の同時係属出願第０９／１７９，６６
５号の一部継続、および１９９５年６月２７に提出の出願第０８／４９５，８１
７号(現在は放棄された)の一部継続である、１９９６年６月２０日に提出の出願
第０８／６６７，３３８号（現在は米国特許第５，８７１，９１８号）の一部継
続である、１９９７年１０月１４日に提出の同時係属出願第０８／９５０，５０
３号の一部継続であって、以上の出願の開示内容は参照することにより本明細書
に組み込まれるものとする。

【０００２】発明の背景 発明の分野 本発明は、結合対相互作用を分析するための修飾電極、および特に核酸分析お
よびタンパク質-タンパク質相互作用におけるこれらの電極の使用に関する。

【０００３】従来技術の説明 本発明は、結合対の構成要素間の相互作用を検出するための電極であって、非
伝導性の自己集合した単層の形成によって改変された電極、およびこのような電
極を使用して、核酸、または受容体電極は、リガンド抗原または抗体を含む他の
標的等の、生体分子を検出するための方法に関する。

【０００４】 固体表面における核酸ハイブリダイゼーションの検出は、臨床標本中の伝染性
生物の同定（Ｓｐａｒｇｏ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ７，３９５-４０４；Ｍａｒ
ｔｉｎ，Ｗ．Ｊ．，１９９４，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｎ
Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ (Ｋ．Ｂ．
Ｍｕｌｌｉｓ，Ｆ．Ｆｅｒｒｅ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｇｉｂｂｓ，ｅｄｓ．)，ｐ
ｐ．４０６-４１７，Ｂｅｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ)、遺伝子発現分析の
ためのｍＲＮＡの定量(Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９５，．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７０，４６７-４７０)、および高密度「チップ」アレイ上のゲノ
ムＤＮＡの配列決定または再配列決定に（Ｃｈｅｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９
９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，６１０-６１３）使用されてきた。本明細書で
引用する出版物および特許出願の開示内容を、参照することにより本明細書に組
み込むものとする。今のところ、この検出は、蛍光標識を標的核酸に付着させる
ことを含み、次いでこれをプローブ修飾した表面とハイブリダイズさせ、ハイブ
リダイズしなかったＤＮＡを固体表面から洗浄除去した後、検出する。ハイブリ
ダイゼーションの検出にはフォトンの検出が必要なため、この方式で標識された
アレイの分析には、高解像度蛍光顕微鏡が必要である。あるいは、表面結合した
ハイブリッドを、次には、１つまたは複数の蛍光標識か、または非蛍光性支持体
を蛍光性のものに転換する酵素を担持する、さらなるシグナルプローブにハイブ
リダイズするサンドイッチアッセイを使用して、ハイブリダイゼーションの間接
的検出を行ってもよい（Ｓｐａｒｇｏ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ７，３９５-４０
４）。多数の酵素をシグナルプローブに付着させることにより、大きいシグナル
増幅を行うことができる（Ｈｏｌｏｄｎｉｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９，３５１０-３５１６）が、これらの多数の酵素系の
調製は複雑である。

【０００５】 担体上に固定した核酸プローブおよび二本鎖核酸用の特異的認識物質を使用す
る遺伝子検出方法を開発した研究者もいるが、これらの方法では、レポーター基
を核酸中に挿入することが必要なため、１本鎖の標的を認識することはできない
（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、米国特許第５，７７６，６７２号）。

【０００６】 Ｈｅｌｌｅｒ（米国特許第５，５３２，１２９号、第５，５６５，３２２号、
第５，６０５，６６２号および第５，６３２，９５７号）に付与された特許には
、電極上に置かれたアガロースゲルである透過層を有する電極の使用について開
示されている。電極に電位を印加すると、プローブまたは標的核酸が電極上の反
応部位に移動するが、これは、蛍光プローブの使用によって進行する検出ステッ
プの一部ではない。

【０００７】 Ｃｈｒｉｓｅｙらに付与された特許（米国特許第５，６８８，６４２号）に記
載されている通り、オリガノシラン類を、二酸化ケイ素等の、ヒドロキシル化さ
れた支持体表面の選択された位置で、共有結合的に付着させて、オリガノシラン
単層フィルムまたは二重層フィルムまたはコーティングを形成することが可能で
ある。ヒドロキシル化された支持体表面に結合するための少なくとも１つの反応
性部位と、コーティングの他のオリガノシラン分子または支持体のいずれにも結
合することができないが、これらとは異なる分子（たとえば、チオール基または
アミノ基を付加することによって修飾された核酸）に結合するのに使用すること
ができるもう１つの反応性部位とを有するオリガノシランが使用される。

【０００８】 タンパク質-タンパク質相互作用の検出には、標識されたタンパク質および可
溶性試薬が使用されてきた。たとえば、Ｗｅｅｔａｌｌに付与された特許（米国
特許第５，０６６，３７２号）には、試薬が浸透でき且つタンパク質を固定する
ことができる作用電極上の支持層について開示されている。Ｈｉｌｌに付与され
た米国特許第４，９４５，０４５号、Ｈｉｇｇｉｎｓに付与された米国特許第４
，５４５，３８２号、およびＧｒａｔｚｅｌに付与された米国特許第５，３７８
，６２８号も参照されたい。

【０００９】 Ｗａｎｇらの論文（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ
．６９，４０５６-４０５９）には、高分子量の核酸の存在下で、オリゴヌクレ
オチドを分析するための膜被覆炭素電極について記載されている。この膜の目的
は、高分子量のＤＮＡを排除する一方で、低分子量の分子は炭素電極による電気
分析用の膜を通過できることである。この膜は、プローブの付着には使用されず
、膜被覆電極で、シーケンスレベルでの識別はできない。

【００１０】 親出願（それらの全明細書、図面、特許請求の範囲を、具体的に、参照するこ
とにより本明細書に組み込むものとする）は、数ある発明の中でも、とりわけ配
列決定および核酸ハイブリダイゼーションを定性的および定量的に検出する方法
について開示している。このような発明は、当技術分野における重大な進歩を表
し、また酵素または蛍光標識を付加せずに触媒方式で作用し、標的核酸の有無を
判定するのに有用な方式で、グアニン、あるいは代わりの塩基の濃度を与えるた
めの触媒電流を実現し、且つ極めて正確な試験方法を実現する、酸化還元錯体を
提供する。

【００１１】 自己集合単層を表面上に形成することにより、特異的レドックス活性検体、太
陽エネルギー転換および基礎電気化学を研究するための新しいインターフェース
を設計することが可能になった。以前の単層は、アルカンチオール−金連結およ
びカルボキシレートおよびホスホネートと金属酸化物表面（たとえば、スズドー
プ酸化インジウム）との間の関連した連結によって形成されいた。従って、自己
集合は、ヘキサメチレンリンカーによりオリゴヌクレオチドに連結されたチオー
ル基により５’末端にて官能化されたＤＮＡを用いて、高い塩濃度の金上のオリ
ゴマーＤＮＡ単層の構造を調節するのに、使用されていた。明らかに、ＤＮＡは
、そのチオール末端基を介して付着したままであるが、ＤＮＡ主鎖と表面との間
の接触は、メルカプトヘキサノール単層の形成によって妨げられる。オリゴマー
核酸プローブは、その相補配列に容易にハイブリダイズする（Ｌｅｖｉｃｋｙ，
Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，９
７８７）。電極と接触していた核酸からの直接電子移動を利用して設計されたが
、介在電子移動も自己集合単層も使用しない他の系としては、Ｈａｌｌｅｔａｌ
．，ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６３１のものがある。

【００１２】 広バンドギャップ半導体の表面修飾で使用したり界面電子移動反応キネティク
スに応答させるために使用する場合、表面付着を実現するための一法として、カ
ルボキシレート官能化ルテニウムビピリジル錯体を高面積ナノ結晶酸化チタンフ
ィルムと一緒に使用してもよい。フィルム状（電極）またはコロイド形のナノ結
晶Ｔｉ０２への表面付着、およびその後の分子の保持を遂行するための別の方法
は、Ｒｕ（ｂＰＹ）₃ ²⁺のヘキサホスホン化である（Ｙａｎ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６，Ｊ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，１００，６８６７）。こ
の従来技術は、本発明の場合のような介在溶液電気化学と関係がなく、むしろ直
接電子移動に関し、電圧の代わりに光を刺激として使用する。

【００１３】 自己集合単層を用いた以前の研究は、結合対構成要素を結合させることができ
ないメチルまたは水酸化物等の要素を末端に有し、且つ生体分子の単層への結合
と異なる目的、また一般に生体分子の単層への結合と矛盾した目的に使用される
、単層の形成を含んでいた。たとえば、金属酸化物上に吸着された、メチルまた
はヒドロキシルを末端に有する長鎖アルカンヒドロキサム酸の自己集合単層は、
金属の腐食阻害に使用されており（Ｆｏｌｋｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１
９９５，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１１，８１３およびＬａｉｂｉｎｉｓ，Ｐ．Ｅ．ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，８４５）、また、金属を静電
気的に結合するチオール末端自己集合単層が形成されている（Ｔａｒｌｏｖ，Ｍ
．Ｊ．ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ，Ｅ．Ｆ．，１９９１，Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１１３，１８４７）。

【００１４】 本発明に関連した初期の研究は、電極上の酸化インジウム酸化スズ（ＩＴＯ）
上の１，１２-ドデカンジカルボン酸（ＤＤＣＡ）の単層形成を用いて行われ、
この電極を、水溶性カルボジイミドで活性化した後、ペンダントカルボキシレー
トと核塩基の内在性アミンとの反応を介して、ＤＮＡでさらに誘導体化した（Ｎ
ａｐｉｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１３，６３４２
）。ＤＮＡを電極に付着させることは、酸化された金属錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺
によるグアニンの酸化による、触媒の大幅な増強につながる。カルボキシレート
-ＩＴＯインターフェースは、Ｅ_1/2=１．０５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）で
、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^2+/3+の電気化学と合致するが、金-チオール単層の場合には
、そうではないであろう。しかし、１，１２ドデカンジカルボン酸単層は、熱ス
トレス下で安定ではなく、また、本発明のホスホネートと比較して、カルボキシ
レート単層は安定性が低いため、再現可能に生じない。

【００１５】 本発明以前には、オリゴヌクレオチドプローブの直接付着およびグアニン酸化
を介して固定されたＤＮＡの電気化学的検出を考慮に入れた自己集合単層に関す
る記載はなかった。本発明の自己集合単層は、熱安定性であり、耐酸化性であり
、迅速且つ再現可能に形成される。カルボキシレートを末端基として使用すると
き、非特異的結合が最小限に抑えられる。さらに、発明で使用される好ましいホ
スホネート化合物は、以前には入手できないか、合成することが非常に困難であ
った（Ｃ₃カルボキシホスホネートおよびＣ₃アミノホスホネートだけは、市販さ
れていると分かっていた）。

【００１６】 他のホスホネート化合物を用いた先の研究は、たとえば、クロマトグラフによ
る分離を強化するため（Ｌｕｋｅｓ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１７３７）、絶縁用多層フィルムを形成するため
（たとえば、Ｈｏｎｇ，Ｈ-Ｇ，ｅｔ ａｌ.，１９９１，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，７
，２３６２のチオールホスホネートおよびＹａｎｇ，Ｈ.Ｃ. ｅｔ ａｌ.，１
９９３，Ｊ Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ.，１１５，１１８５５の金属アルカン
ビスホスホネート）または絶縁用単層（Ｋａｙｙｅｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＰＣ
Ｔ／ＴＪＳ９７／２００１４、所望の位置における電子移動のみが起きるように
、オリゴヌクレオチドを電極から引き離し、電荷担体を電極表面から離しておき
、電極への溶剤接近可能性をブロックする不動態化剤を電極表面上に提供するた
め）、またはホスホン酸の金属表面との反応を研究するため（Ｇａｏ，Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１２，６４２９）の溶液であった。た
とえば、フェロセンで標識された、官能化されたチオール類、カルボン酸類また
はホスホン酸類の直交自己集合のシステムは、Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，６９２７により研
究された。この研究の中で、結合対の構成要素の、電極上のホスホネート自己集
合単層への結合に関するものはない。ＤＮＡが、このような先のフィルム上に固
定されている場合、それは、静電結合による、ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの挿入を
介したものであって、共有結合的付着によるものではなかった（Ｘｕ，Ｘ-Ｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，８３８６）
。

【００１７】 電極上の層を用いた他の研究は単層に関係がないが、たとえば、ＳｉＯ₂上に
集合した脂質含有二重層およびリガンドと生体分子との相互作用を研究するため
の二重層（Ｂｏｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１８３５）、また
は選択された核酸配列の検出に使用される膜と電極との間に空間を有するする二
重層（Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＡＵ９７／００３１６）；標準
的な脂質単層テクノロジーによって形成された、ポリ不飽和基の重合の結果とし
て導電性である、一様に延伸された層として、界面活性剤フィルムの状態で存在
してもよい、特異的結合対の構成要素を結合させる対象である導電性界面活性剤
層を有する、電気シグナル、光学シグナルおよび機械的シグナルを使用する、重
合層（Ｒｉｂｉ（ＥＰ ０ ４０２ ９１７ Ｂ１）；または、全く異なる目的
に使用される半透性膜（Ｍａｌｅｙｅｔａｌ．、米国特許第５，７１１，８６８
号，この特許では作用電極が半透性膜で被覆された電気化学的センサーが、酵素
によるグルコースの探知に使用される）のいずれかに関する。

【００１８】 従って、本発明の目的は、標的核酸へのハイブリダイゼーションまたは標的タ
ンパク質への結合、およびその後の酸化還元反応による検出に使用できるように
、オリゴヌクレオチドプローブまたはタンパク質結合性物質を、ＩＴＯ等の、電
極表面上に固定する方法を提供することにある。

【００１９】 本発明のさらなる目的は、標的生体分子、たとえば、核酸あるいは容体、リガ
ンド、抗原または抗体を含む他の標的の、検出および定量に使用することが可能
な電極上に、非伝導性の自己集合単層を作る方法を提供することにある。

【００２０】 他の目的および利点は、以下の開示内容および添付のクレームからさらに十分
に明らかになるであろう。

【００２１】発明の概要 本発明は、電極上に自己集合したホスホネート単層であって、好ましい実施形
態では、ＩＴＯ表面上のカルボキシ-アルキルホスホネートであり、結合対の構
成要素がそれに共有結合している。本発明は、電極表面に自己集合単層を形成す
るために単層材料を使用する方法および修飾電極表面上に結合対構成要素を固定
する方法も含む。好ましい実施形態の自己集合単層を有する電極は、核酸中の予
め選択された塩基の電気化学的検出、およびサンプル中の標的核酸の存在を判定
するのに有用である。自己集合単層に結合されたオリゴヌクレオチドプローブは
、標的核酸と接触すると、標的核酸と反応してハイブリダイズした核酸を修飾電
極表面上に形成する。ハイブリダイズした核酸を、ハイブリダイズした核酸中の
予め選択された塩基を酸化することができる遷移金属錯体と、酸化還元反応で反
応させ、その酸化還元反応を検出し、検出された酸化還元反応から、ハイブリダ
イズした核酸の有無を判定する。固定された結合対から遷移金属錯体に電子が移
動した後、単層は、遷移金属錯体が電子を電極表面に移動させることを許し、そ
こで、電子が検出されるため、本発明に従って、酸化還元反応を検出することが
できる。このように、自己集合単層は非伝導性であり、反応物を電極表面付近に
固定するのを助け、遷移金属錯体が固定された反応物から電極の伝導性作用面に
自由に動くことを可能にし、電子移動を可能にする。場合によっては、本発明と
共に、当技術分野で周知の増幅技術を使用することが可能である。

【００２２】 本発明を使用して、他の標的（たとえば、受容体、リガンド、抗原、抗体等々
）を検出することも可能である。たとえば、標的タンパク質を、本発明の自己集
合単層に付着させた抗体等の、タンパク質結合性物質と反応させ、続いて、酸化
還元反応で酸化されることができる標識が結合した第２の抗体等の、第２のタン
パク質結合性物質を付加することによって、サンプ中の標的タンパク質を検出す
ることが可能である。核酸を用いる場合、標識を、酸化還元反応で標識を酸化す
ることができる遷移金属錯体と反応させる。酸化還元反応を検出することにより
、標的タンパク質の有無を判定することができる。本発明で使用するのに適した
１つの標識は、オリゴヌクレオチドである。

【００２３】 本発明の他の目的および特長は、以下の開示および上述の特許請求の範囲から
、さらに十分に明らかになるであろう。

【００２４】発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態 本発明は、結合対の構成要素が電極上に共有結合したホスホネート自己集合単
層、およびこれらの自己集合単層の使用方法を提供する。

【００２５】 本明細書で使用される用語非伝導性の「単層」は、（好ましい実施形態におい
て）、溶液からＩＴＯ電極表面上に自己集合したアルキルホスホネートを、ホス
ホネート上の酸素と電極内の金属原子との間の「配位」（「ｄａｔｉｖｅ」また
は「ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ」）結合と呼ばれてきたものの中に含むことが好
ましい、電極の伝導性作用面を覆う単一層を含む。本発明の単層の形成は、真の
共有結合を形成するために電子を共有することができる、Ｃ、ＮおよびＯ等の２
つの非金属の間に見られるような真の共有結合の形成を含まない。本発明は、ポ
リマー膜も含まない。

【００２６】 具体的には、本発明の自己集合単層は、ＩＴＯ電極等の電極に接着して電極を
修飾することができるホスホネート分子から形成される。本発明で使用される分
子は、最小限少なくとも１つの、ＩＴＯ表面に結合する表面活性な官能基（ホス
ホネートが好ましい）と、少なくとも１つの、結合対の構成要素が共有結合して
いる末端基Ｒ₁、たとえば、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシルまたはメチルと
を有する多官能性である。さらに、これらの分子は、好ましくは、１つまたは複
数の炭素原子および随伴する置換基（一般に水素）を、ホスホネート基とＲ₁基
との間に含む、有機スペーサーＲ₂を有していてもよい。好ましくは、ホスホネ
ート単層は、カルボキシアルキルホスホネート（ここで、Ｒ₁=−ＣＯ₂Ｈであり
、Ｒ₂=−（ＣＨ₂）_n−である）を含み、以下でさらに詳細に論ずる通り、ホスホ
ネート単層は、１１−カルボキシウンデカンホスホン酸（ここで、Ｒ₁=−ＣＯ₂
Ｈであり、Ｒ₂=−（ＣＨ₂）₁₁−である）であることが最も好ましい。本明細書
で使用される用語「結合対の構成要素」は、核酸、受容体、リガンド、抗体、抗
原ｓおよび炭水化物等の、互いに結合することができる全ての生体分子を含む。
本明細書に記載の例は、主としてオリゴヌクレオチドの使用に関するが、当業者
は、これらの例および本明細書の開示内容を、他の生体分子に利用することがで
きるであろう。

【００２７】 本発明で使用される電極は、伝導性支持体か、または伝導性作用面の役割を果
たす外面を有する支持体を含む。支持体は、それ自身伝導性であってもよく、非
伝導性であってもよいが、伝導性作用面を有する。電極は、当技術分野で定型的
な任意の形状、たとえば、外側に伝導性作用面を有する円柱形の電極または片面
に伝導性作用面が形成された平らなシートを有してもよい。単層を上に集合させ
る伝導性の支持体は、従来使用されている任意の金属または非金属の材料であっ
てもよく、グラファイト、ガラス状炭素、熱分解性グラファイト、炭素ペースト
、および炭素繊維等の炭素；インジウムドープ酸化スズ（ＩＴＯ）、酸化スズ、
酸化チタン、酸化マグネシウム、および酸化鉛等の、ドープ処理した酸化物およ
び未ドープ処理の酸化物；および、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ₂およ
びＧａＡｓ等の半導体材料、等々がある。ＩＴＯは、その性質が比較的よく知ら
れており、安価であり、また、中性のｐＨの水中で高い酸化電位限界および比較
的低い帯電電流を有するため、ＩＴＯを使用することが好ましい。本発明を、Ｉ
ＴＯに関してさらに説明する。チオール類または二硫化物を吸着した金等の金属
は、グアニン酸化に必要な電位より低い電位で酸化されるため、本発明と一緒に
使用することはできない。

【００２８】 標識担持標的の存在を判定するための装置は、たとえば、流体サンプルを入れ
るためのサンプル容器と；伝導性作用面を上に有する支持体を含む、電極と；上
記伝導性作用面上の、非伝導性の自己集合単層であって、ホスホネート分子を含
み、各ホスホネート分子が最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なく
とも１つのＲ₁基を有し（ここで、Ｒ₁基は結合対の構成要素に共有結合している
）、その単層を介して、遷移金属錯体が、固定された反応物から伝導性作用面に
自由に移動して、電子を伝導性作用面に移動させることができる、単層と；単層
と電子的に連絡しているポテンシオスタットとを含んでもよい。この装置は、自
己集合単層に付着させたオリゴヌクレオチドプローブまたは自己集合単層に付着
させたタンパク質結合性物質等の、結合対の構成要素をさらに含む。

【００２９】 一般に、サンプル中の標的核酸の存在を判定する方法は、オリゴヌクレオチド
プローブが単層に共有結合的に付着するように、電極上に自己集合した単層を、
オリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、標的核酸およびオリゴヌ
クレオチドプローブが、ハイブリダイズした核酸を修飾電極上に形成するように
、電極上のプローブ修飾単層を、核酸溶液と接触させるステップと、ハイブリダ
イズした核酸を、ハイブリダイズした核酸の予め選択された塩基を酸化還元反応
で酸化することができる遷移金属錯体と反応させるステップと、酸化還元反応を
検出するステップと、検出された酸化還元反応から核酸の有無を判定するステッ
プとを含む。あるいは、電極上への単層集合前に、オリゴヌクレオチドプローブ
をホスホネートと結合させてもよい。

【００３０】 タンパク質の場合、サンプルにおける標的タンパク質の存在の判定には、本発
明に従って、結合性物質が単層に共有結合的に付着するように、電極上に自己集
合した単層を、タンパク質結合性物質と接触させるステップと、電極上のタンパ
ク質修飾単層を、サンプルと接触させるステップと、修飾電極を、標識を含むよ
うに修飾された第２のタンパク質結合性物質と接触させるステップと、単層を、
酸化還元反応で標識を酸化させることができる遷移金属錯体と反応させるステッ
プと；酸化還元反応を検出するステップと、検出された酸化還元反応から標的タ
ンパク質の有無を判定するステップとを含む。本発明で使用するのに適した１つ
の標識は、オリゴヌクレオチドである。あるいは、電極上への単層集合前にタン
パク質結合性物質をホスホネート単層に結合させてもよい。

【００３１】 ホスホネート類。先に論じた通り、本発明の自己集合単層を形成する分子は、
ＩＴＯ電極表面に結合するホスホネート基（−ＰＯ₃Ｈ₂）と、および結合対の構
成要素と共有結合することができるＲ₁基とを含む。ホスホネート基は、モノホ
スホネート部分であってもよく、ジホスホネート部分であっても、トリホスホネ
ート部分であっても、テトラホスホネート部分であっても、またはポリホスホネ
ート部分であってもよい。Ｒ₁末端基としては、カルボキシル、ハロゲン化酸、
酸無水物、ヒドロキシル、エポキシド、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、
ニトリルおよびアミノ基などがあるが、その限りではない。ホスホネート基とＲ ₁ は、有機スペーサーまたはリンカーＲ₂（存在するとき、鎖状、分枝状、環状、
または高分子量構造であってもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、およ
び芳香族構造を含んでもよい）で架橋さえていることが好ましい。Ｒ₂は、ＩＴ
Ｏ表面に結合することができる、任意の数のホスホネート分子で置換されていて
もよい。

【００３２】 ホスホネートソースは、カルボキシアルキルホスホネートであることが好まし
い。本発明の自己集合単層において、カルボキシアルキルホスホネートのホスホ
ネート部分はＩＴＯに結合し、アルキル部分の炭素数が増加するにつれて、安定
性が増大する。カルボキシ部分は、負の電荷を単層に与え、結合対の構成要素に
結合するのはカルボキシ基である。正の単層電荷が望ましい場合、アミノアルキ
ルホスホネートを使用することができ、中性の表面電荷には、メチルホスホネー
トまたはヒドロキシルホスホネートを使用することができる。

【００３３】 今日までに実施された試験に基づいて、最も好ましいカルボキシアルキルホス
ホネートは、１２−炭素カルボキシアルキルホスホネート（本明細書では、１１
−カルボキシウンデカンホスホン酸とも呼ぶ）である。（好ましい新しい調製方
法については、実施例２を参照）。この１２−炭素ホスホネートは、主として本
明細書に記載の試験で使用された。試験は、アルキル基中に２〜１４個の炭素を
有するカルボキシアルキルホスホネートは、本発明で使用するのに必要な十分な
安定性および特徴を備えた自己集合単層を形成する働きをすることを示した。本
発明での有用性が低下する順序で、１２−炭素カルボキシアルキルホスホネート
に次ぐのは、単独で単層に使用されたときに判断すると、３−炭素アミノアルキ
ルホスホネートおよび３−炭素カルボキシアルキルホスホネートである。ホスホ
ネート鎖中の炭素数が増加するにつれて、結果として得られる単層の安定性が増
大する。

【００３４】 カルボキシアルキルホスホネートの合成は、実施例２でさらに詳細に記載する
通り、一般に、（１）塩化オキサリルとの反応によって、ブロモアルキルカルボ
ン酸を酸塩化物中間体に転換するステップと、（２）アルカリ条件で、エタノー
ル等のアルコールとの反応によって、酸塩化物中間体をブロモアルキルエステル
に転換するステップと、（３）亜リン酸トリエチル（または亜リン酸トリメチル
）と反応させ、次いで酸を再生するために酸加水分解することによって、ブルモ
アルキルエステル中間体をカルボキシアルキルホスホネートに転換するステップ
と、を含む。

【００３５】 本明細書の実施例で論られるホスホネート自己集合単層は、化学的に均質であ
る、すなわち、カルボキシアルキルホスホネートのみで構成される。しかし、本
発明は、これらのホスホネートに、単層の物理的性質および化学的性質（たとえ
ば、単層上の全電荷および電荷分布）を変える他の材料、たとえば、様々な長さ
の、アミノアルキルホスホネート類、ヒドロキシ−アルキルホスホネート類、メ
トキシ−アルキルホスホネート類、メチル−アルキルホスホネート類、チオール
−アルキルホスホネート類、アルデヒド−アルキルホスホネート類、トリフルオ
ロメチル−アルキルホスホネート類および双極性イオンのホスホネート類を加え
た、不均質の自己集合単層も含む。これらの材料は、結合対の構成要素と共有結
合ができてもよく、できなくてもよい。特殊な条件下での混合単層は、結合対の
構成要素への特異的標的分子の結合を増強し且つ／または電極表面への非標的分
子の非特異的結合を減少させる。

【００３６】 被験サンプル。標的核酸またはタンパク質等の他の標的生体分子を含む被験サ
ンプルに対して、本方法を実施することができる。生検サンプル等の組織サンプ
ルならびに血液、喀痰、尿および精液サンプル等の生物学的流体、細菌培養、土
壌サンプル、食物サンプル、細胞培養等々を含むがその限りではない、標的を含
む疑いのある被験サンプルを使用することができる。標的は、試験の個々の目的
に応じて、動物、植物または微生物（たとえば、ウイルス、原核生物ならびに細
菌、原生動物、および真菌等々を含む真核生物）を含む、いずれの起源のもので
あってもよい。例としては、外科的標本、医学的診断に使用された標本、遺伝子
検査に使用された標本、環境標本、細胞培養標本、食物標本、歯科標本および獣
医学標本などが挙げられる。当業に者周知の技術または明白な技術に従って、本
方法を実施する前に、サンプルを処理または精製しもよく、また、本方法を実施
する前に、必要に応じて、その中の核酸を消化、断片化、および／または増幅（
以下参照）してもよい。

【００３７】 増幅。本発明による自己集合単層を有する電極を使用する工程は、標的核酸サ
ンプルをオリゴヌクレオチドプローブに接触させて、ハイブリダイズした核酸を
生成することを含むため、発明を使用するある一定の用途には、オリゴヌクレオ
チドプローブと接触させる前に、核酸を増幅することが望ましいかもしれない。
同時係属出願（ＳＮ０９／１７９，６６５およびＳＮ０８／９５０，５０３）で
開示されまた論じられた方法等の適当な方法で、選択された、または標的の、核
酸配列の増幅を実施することが可能である。

【００３８】 核酸の検出。上述の通り、自己集合単層が上に形成された本発明の電極、およ
びこの電極を使用する方法は、ハイブリダイズした核酸の検出を可能にする。こ
の方法では、標的核酸を、自己集合単層に結合したオリゴヌクレオチドプローブ
と接触させて、ハイブリダイズした核酸を形成する。本発明の方法で有用なオリ
ゴヌクレオチドプローブは、約４または６塩基〜約８０または１００塩基以上で
構成されてもよく、さらに好ましくは、約８〜約３０塩基で構成される。当技術
分野で周知の技術従って、多種多様な塩基配列のいずれかを有するオリゴヌクレ
オチドプローブを作成することができる。オリゴヌクレオチドプローブを作成す
るのに適した塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミン
等の天然のヌクレオチド塩基；および非天然のすなわち「合成の」ヌクレオチド
塩基、たとえば、８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチ
ルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチル
シチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオウリジン、５−カル
ボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチル偽ウ
リジン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イ
ノシン、７−デアザグアニン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルア
デノシン、１−メチル偽ウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン
、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン
、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メ
チルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル
−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニ
ルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテ
ニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン
−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル
プリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキ
シ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、偽ウリ
ジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−
チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリ
ン−６−ｙｌ）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリ
ジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カル
ボキシプロピル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルアデニン、および２’−Ｏ−メチ
ルイノシンから選択することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭素環、およびフルオ
ロおよびメトキシ等の２’置換を含む糖などの修飾された糖を含む、いずれかの
オリゴヌクレオチド主鎖を使用してもよい。オリゴヌクレオチドは、メチルホス
ホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペ
ラジデートおよびホスホルアミデートｓ等の、ヌクレオチド間架橋性ホスフェー
ト残基の少なくとも１つ、または全てが修飾されたホスフェートであるオリゴヌ
クレオチドであってもよい（たとえば、記載の通りに、ヌクレオチド間架橋性ホ
スフェート残基が１つおきに修飾されていてもよい）。オリゴヌクレオチドは、
Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４
９７−１５００に記載されているような、「ペプチド核酸」であってもよい。唯
一の必要条件は、オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも一部が標的核酸の
配列の一部に相補的である配列を持っていなければならないことである。一部の
用途では、核酸サンプルを、異なる塩基配列を有する多数のオリゴヌクレオチド
プローブに接触させることが望ましい場合もある（たとえば、サンプル中に２つ
以上の標的核酸がある場合、または「サンドイッチ」アッセイで１つの標的核酸
を２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる場合）。

【００３９】 予め選択される塩基。ハイブリダイゼーション後、電極上に自己集合した単層
に付着させたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした標的核酸を、予
め選択された塩基を酸化還元反応で酸化することができる適当なメディエーター
と反応させる。予め選択された塩基は、選択されたメディエーターと反応する際
に酸化を受ける、天然または合成のヌクレオチド塩基であってもよい。予め選択
された塩基は、対形成したとき、予め選択された塩基が不対であるときと比較し
て独特の酸化速度を示す。予め選択された塩基は、天然の４つの塩基のそれぞれ
と対形成したとき、独特の酸化速度を示さなければならない。一般に、１０⁴Ｍ^{- 1} ｓ^-1以上の速度定数を示す５’−モノヌクレオチド（たとえば、５’−デオキ
シリボヌクレオチドまたは５’−リボヌクレオチド）を有する塩基は、触媒反応
を使用して検出することができる。適当な予め選択された塩基の例としては、グ
アニン、アデニン、８−オキソ−グアニン、８−オキソ−アデニン、８−ブロモ
−グアニン、キサンチン、偽ウリジン、６−メルカプトグアニン、８−メルカプ
トグアニン、２−チオキサンチン、６−チオキサンチン、６−メルカプトプリン
、２−アミノ−６−カルボキシメチル−メルカプトプリン、２−メルカプトプリ
ン、６−メトキシプリン、２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、６−メ
チルチオ−２−ヒドロキシプリン、２−ジメチルアミノ−６−ヒドロキシプリン
、２−ヒドロキシプリン、２−アミノプリン、６−アミノ−２−ジメチルアリル
プリン、２−チオアデニン、８−ヒドロキシアデニン、および８−メトキシアデ
ニンなどが挙げられるが、その限りではない。一般に．予め選択された塩基は、
グアニン、アデニン、６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニン、および
８−オキソ−アデニンからなる群から選択され、グアニンが一般に好ましい天然
の予め選択された塩基であり、８−オキソ−グアニンまたは６−メルカプトグア
ニンが、一般に好ましい合成の予め選択された塩基である。

【００４０】 メディエーター。電子移動を可能にするのに必要なメディエーターは、予め選
択された塩基と、特有の酸化電位で反応して、電子を核酸から電極に移動させる
、陽イオン分子、陰イオン分子、非イオン分子または双極性イオン分子等の分子
であってもよい。従って、メディエーターの選択は、選択した、個々の予め選択
された塩基によって左右され、当業者は容易に決定できるであろう。特に好まし
いメディエーターとしては、触媒周期の完了時に、還元型の金属錯体が再生され
るとように、予め選択された塩基との、金属−核酸電子移動をすることができる
遷移金属錯体などがある。本発明の方法で使用するのに適した遷移金属錯体の例
としては、たとえば、ルテニウム²⁺（２，２’−ビピリジン）₃（「Ｒｕ（ｂｐ
ｙ）₃ ²⁺」）、ルテニウム²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）₃（
「Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、ルテニウム²⁺（５，６−ジメチル−１，１０
−フェナントロリン）₃（「Ｒｕ（Ｍｅ₂−フェン）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（２，２’−
ビピリジン）₃（「Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（５−クロロフェナントロリン
）₃（「Ｆｅ（５−Ｃｌ−フェン）₃ ²⁺」）、オスミウム²⁺（２，２’−ビピリジ
ン）₃（「Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、オスミウム²⁺（５−クロロフェナントロリン
）₃（「Ｏｓ（５−Ｃｌ−フェン）₃ ²⁺」）、ジオキソレニウム¹⁺ホスフィン、お
よびジオキソレニウム¹⁺ピリジン（「ＲｅＯ２（ｐｙ）₄ ¹⁺」）などが挙げられ
る。メディエーターとして有用な幾つかの陰イオン錯体は、Ｒｕ（ｂｐｙ）（（
ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ）₂ ^2-およびＲｕ（ｂｐｙ）（（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ）₂ ^2-であり
、メディエーターとして有用な幾つかの双極性イオン錯体は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₂
（（ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ）およびＲＵ（ｂｐｙ）₂（（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ）であっ
て、ここで、（ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ^2-は４，４’−ジスルホナト−２，２’−ビピ
リジンであり、（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ^2-は４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビ
ピリジンである。ピリジン、ビピリジンおよびフェナントロリン基の適当な置換
誘導体を、前述の金属のいずれかとの錯体で使用することもできる。適当な置換
誘導体としては、４−アミノピリジン、４−ジメチルピリジン、４−アセチルピ
リジン、４−ニトロピリジン、４，４’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、５
，５’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジアミノ−２，２’−ビ
ピリジン、４，４’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、５，５’−
ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジエチレンジアミン−
２，２’−ビピリジン、４，４’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、５
，５’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジヒドロキシル−
２，２’−ビピリジン、４，４’，４”−トリアミノ−２，２’，２”−テルピ
リジン、４，４’，４”−トリエチレンジアミン−２，２’，２”−テルピリジ
ン、４，４’，４”−トリヒドロキシ−２，２’，２”−テルピリジン、４，４
’，４”−トリニトロ−２，２，２”−テルピリジン、４，４’，４”−トリフ
ェニル−２，２’，２”−テルピリジン、４，７−ジアミノ−１，１０−フェナ
ントロリン、３，８−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジエチ
レンジアミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジエチレンジアミン−１
，１０−フェナントロリン、４，７−ジヒドロキシル−１，１０−フェナントロ
リン、３，８−ジヒドロキシル−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジニト
ロ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジニトロ−１，１０−フェナントロ
リン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジフェニル
−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジスペルアミン−１，１０−フェナン
トロリン、３，８−ジスペルアミン−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［
３，２−ａ：２’，２’−ｃ］フェナジン、６，６’−ジクロロ−２，２’−ビ
ピリジン、フタロシアニン類およびポルフィリン類などがあるが、その限りでは
ない。

【００４１】 酸化還元反応。メディエーターと予め選択された塩基との酸化還元反応を行う
のに十分な条件で、メディエーターを、ハイブリダイズした核酸と反応させるこ
とができる。酸化還元反応が行われる溶剤は、核酸を可溶化するのに適した溶剤
であってもよく、水を含むことが好ましい。酸化還元反応を起こさせるのに適当
な条件は、当業者に分かるであろう。

【００４２】 酸化還元反応の検出。酸化還元反応の発生を示す電子シグナルの変化を観察す
るための、本発明による自己集合単層を有する電極で酸化還元反応の発生を検出
することが可能である。この電極は、メディエーター溶液と接触して配置され、
一般に、参照電極および補助電極も、作用電極（と補助電極を通過する電流の大
部分）とともに、メディエーター溶液と接触して配置される。同様に、適当な参
照電極も当技術分野で周知であり、たとえば、銀／塩化銀電極などがある。適当
な補助電極は、Ｐｔ電極である。

【００４３】 酸化還元反応と関連した電子シグナルを検出することによって、標的の有無を
判定することが可能である。標的の有無を判定するステップは、一般に、（ｉ）
酸化還元反応の反応速度を測定するステップと、（ｉｉ）測定された反応速度を
、核酸が存在するまたは存在しない、遷移金属錯体の酸化還元反応速度と比較す
るステップと、次いで（ｉｉｉ）測定された反応速度が、標的が存在するまたは
存在しない、遷移金属錯体の酸化還元反応速度と本質的に同じか否かを判定する
ステップと、を含む。反応速度を測定するステップは、適当な方法で実施するこ
とが可能である。たとえば、同じ走査速度、プローブ濃度、標的濃度、メディエ
ーター、緩衝溶液、温度、および／または電気化学的方法における電流を比較す
ることによって相対的反応速度を決定することが可能である。

【００４４】 当業者に周知の適当な方法に従って、酸化還元反応速度を測定することが可能
である。一般に、酸化還元反応速度は、酸化還元反応の発生と関連した電子シグ
ナルを測定することにより測定される。たとえば、酸化還元反応と関連した電子
シグナルは、本明細書に開示されている自己集合単層で被覆された電極と電子的
に連絡している適当な装置を提供することによって測定される。適当な装置は、
ハイブリダイズした核酸とメディエーターとの間の反応の酸化還元反応速度を測
定できるように発生させた電子シグナルを測定することができるポテンシオスタ
ットである。検出すべき標的がタンパク質であるとき、検出装置には酸化還元反
応で酸化されることができる標識を結合させてあるが、１つのこのような標識は
、予め選択された塩基を含むオリゴヌクレオチドである。

【００４５】 電子出力は、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリ
ー、クロノアンペロメトリー、クロノクーロメトリー、または矩形波ボルタンメ
トリーを含む、典型的な電気化学的方法であってもよく、サイクリックボルタン
メトリーおよびクロノアンペロメトリーが一般に好ましい形態である。当技術分
野で周知の通り、電極使用の管理およびこのような使用結果の記録にコンピュー
ターを使用することができる。本発明によるＩＴＯ電極上に自己集合した単層を
用いた核酸の分析に最も高頻度で使用される方法は、サイクリックボルタンメト
リーである。サイクリックボルタンメトリーでは、電気化学系の電位を、初期電
位（０〜８００ｍＶ）から最終電位（１３００〜２０００ｍＶ）まで直線的に変
化させる。最終電位に達したとき、走査方向を逆にして、同じ電位範囲を逆方向
に掃引する。一定の走査速度（たとえば、約１０ｍＶ／秒〜約５０００Ｖ／秒）
で電位を変える。大半の実験では、初期電位は０ｍＶに設定され、最終電位は走
査速度によって実験的に決定される。一般に好ましい走査速度は、最終電位１６
００ｍＶで２０Ｖ／秒である。各電位における電流を収集し、データを電流対電
位スペクトルとしてプロットする。

【００４６】 サイクリックボルタンメトリーの代替法として、クロノクーロメトリーまたは
クロノアンペロメトリー等の電位ステップ法を使用して、本発明の単層で核酸を
分析することが可能である。クロノクーロメトリーでは、電気化学系を、初期電
位（０ｍＶ〜８００ｍＶ）から最終電位（１０００ｍＶ〜１６００ｍＶ）まで直
ちにステップさせる。明記された時間（５０マイクロ秒〜３０秒）、電気化学系
を最終電位に維持し、電荷を時間の関数として収集する。現在は行われていない
が、必要に応じて、電位を初期電位に戻し、初期電位における電荷を時間の関数
として収集してもよい。クロノアンペロメトリーでは、明記された時間（５０マ
イクロ秒〜３０秒）、電気化学系を初期電位（０ｍＶ〜８００ｍＶ）から最終電
位（１０００〜１６００ｍＶ）まで直ちにステップさせ、電流を時間の関数とし
て収集する。必要に応じて、電位を初期電位に戻し、初期電位における電流を時
間の関数として収集してもよい。好ましい電位ステップは、収集時間５００ミリ
秒で１１００ｍＶであるが、好ましい電位ステップおよび時間は、異なるアッセ
イパラメーターとともに変化する可能性がある。

【００４７】 検出方法。本発明による非伝導性の自己集合単層を有する電極を使用した標的
核酸上の予め選択された塩基の検出は、（ａ）被験サンプルを、標的核酸に特異
的に結合する、本発明による単層に結合したオリゴヌクレオチドプローブに接触
させて、ハイブリダイズした核酸を形成するステップと、（ｂ）ハイブリダイズ
した核酸を、予め選択された塩基を酸化還元反応で酸化する遷移金属錯体に接触
させるステップと、（ｃ）ハイブリダイズした核酸と関連した酸化還元反応の有
無を検出するステップと、（ｄ）予め選択された塩基にて検出された酸化還元反
応から被験サンプル中の標的核酸の有無を判定するステップとを含む。

【００４８】 標的核酸は、好ましくは、予め選択された塩基を、オリゴヌクレオチドプロー
ブよりも少なくとも約１０個多く含み、さらに好ましくは、予め選択された塩基
を、オリゴヌクレオチドプローブよりも少なくとも５０個以上多く含む。標的核
酸が、予め選択された塩基を、オリゴヌクレオチドプローブよりも数多く含むと
き、より大きい電流の増強が都合よく得られる。

【００４９】 標的核酸は、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブより長く、且つ、予め
選択された塩基の少なくとも１つは、米国特許第５，８７１，９１８号に記載さ
れているように「突出（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）」しており、ハイブリダイズ
した核酸の状態で、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしていないす
。少なくとも１０、５０、または１００の予め選択された塩基が「突出」塩基で
あり、その結果、検出される電気化学的シグナルの実質的な増幅が得られること
が好ましい。

【００５０】 任意選択的に、しかし好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブ配列は、予め
選択された塩基を含まない。標的核酸に都合よくハイブリダイズするであろうが
、予め選択された塩基を含まない、天然の塩基のこのような配列を入手できない
場合、レドックス不活性な代替塩基を使用する方法（以下で論じる）を使用する
ことが可能である。

【００５１】 たとえば、グアニン残基を含まないオリゴヌクレオチドプローブ配列（たとえ
ば、Ａ、Ｔ、およびＣのみ）を選択することができる。この鎖の存在下でのＲｕ
（ｂｐｙ）₃のサイクリックボルタモグラムは、オリゴマーを含まないサイクリ
ックボルタモグラムと非常によく似ている。次いで、このオリゴヌクレオチドプ
ローブを、突出塩基対領域および／または標的核酸がオリゴヌクレオチドプロー
ブより長ければ突出領域のいずれかにグアニンを含む標的核酸鎖に、ハイブリダ
イズさせる。多数のグアニンが検出されるため、形成されたハイブリッド数に比
べてシグナルが増幅される。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが標的核酸鎖である場合
、多数の突出グアニンに出会い、これが非常に大きいシグナル増幅を与える。

【００５２】 好ましい実施形態において、標的核酸鎖上の予め選択された塩基に関するアッ
セイは、（好ましくはレドックスサイレントな）オリゴヌクレオチドプローブ鎖
を、電極表面上の自己集合単層上に固定することを含み、これによって、メディ
エーターの存在下で走査したとき、低いバックグラウンドシグナルが実現する。
次いでこの単層を、予め選択された塩基を含む、標的核酸の溶液と接触させる。
ハイブリダイゼーションが起きる場合、その時は、標的核酸が電極にきわめて接
近しており、メディエーターの存在下で電流の増大が検出される。

【００５３】 グアニンの代わりをする（たとえば、核酸二重鎖グアニンのように、シトシン
に対して他の塩基より大きい結合アフィニティを有する塩基）が、適当な反応条
件でメディエーターによって酸化されない代替塩基を、オリゴヌクレオチドプロ
ーブ鎖に使用することが可能である。標的核酸中の予め選択された塩基がグアニ
ンであり、且つ標的核酸がシトシン（通常、オリゴヌクレオチドプローブ中のグ
アニンと結合する）も含むとき、プローブは、ハイブリダイズした核酸中のシト
シンに結合する代替塩基を含む。この代替塩基は、電気化学的反応性がグアニン
より３桁小さいイノシンであってもよい。反応ステップは、一般に、代替塩基を
酸化せずに、予め選択された塩基を選択的に酸化するのに十分な条件で、遷移金
属錯体を核酸と反応させることを含む。

【００５４】 従って、標的核酸が少なくとも１つの予め選択された塩基を含み、オリゴヌク
レオチドプローブが代替レドックス不活性塩基を含む場合、標的核酸を検出する
方法は、（ａ）標的核酸を、標的核酸に特異的に結合してハイブリダイズした核
酸を形成する、相補的オリゴヌクレオチドプローブに接触させるステップと、（
ｂ）ハイブリダイズした核酸を、予め選択された塩基を酸化還元反応で酸化する
ことができる遷移金属錯体と反応させるステップと、（ｃ）酸化還元反応を検出
するステップと、（ｄ）予め選択された塩基にて検出された酸化還元反応から、
ハイブリダイズした核酸の有無を判定するステップとを含む。

【００５５】 核酸の定量。上述の方法は、核酸の定量的検出に特に適する。このセクション
に記載されている例では、ハイブリダイズした核酸の、メディエーター（たとえ
ば、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺）による酸化に関する速度定数を、サイクリックボルタ
モグラムから、デジタルシミュレーションにより決定することができる。大抵の
条件で、この反応は二次反応速度論に従うため、速度=ｋ［Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺］
［ＤＮＡ］（ここで、ｋは、特定のオリゴヌクレオチドプローブ−標的核酸ハイ
ブリッドに特異的な速度定数であり、［Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺］は、メディエータ
ーの濃度であり、［ＤＮＡ］はハイブリダイズした核酸（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドであってもよい）の濃度である。ｋおよび［Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺］が分か
っていれば、ハイブリダイズした核酸の量を決定することができる。実際には、
標的核酸を含む標準溶液の異なる量で得られる電流増強に関する較正曲線を作成
し、この電流増強を使用してハイブリダイズした核酸の量を直接得る。ついで、
この量を、標的核酸を含む材料（たとえば、臨床サンプル中の伝染性微生物）の
量と直接関連づける。たとえば、Ｍ．Ｈｏｌｏｄｎｉｙ ｅｔ ａｌ．，１９９
５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９，３５１０−３５１６；Ｊ．Ｍｅｌｌｏｒｓ ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，１１６７− １１７０を参照。

【００５６】 タンパク質の場合での使用。本発明の開示内容とともに当業者に周知のタンパ
ク質の場合に有効な方法を使用して、電極の伝導性作用面上に自己集合した単層
を、タンパク質等の、核酸以外の生体分子の検出にも使用することができる。核
酸の場合と同様、他の生体分子の場合での本発明の使用には酵素標識を必要とし
ない。たとえば、サンプル中の標的タンパク質を検出する方法は、（ａ）タンパ
ク質結合性物質を、伝導性作用面上に自己集合した単層に付着させるステップと
、（ｂ）標的タンパク質を、単層に結合されたタンパク質結合性物質と接触させ
るステップと、（ｃ）単層に結合した標的タンパク質を、酸化還元反応で酸化さ
れることができる標識が結合した第２のタンパク質結合性物質に接触させるステ
ップと、（ｄ）標的タンパク質に結合した第２のタンパク質結合性物質上の標識
を、酸化還元反応で標識を酸化することができる遷移金属錯体と反応させるステ
ップと（ｅ）酸化還元反応を検出するステップと、（ｆ）検出された酸化還元反
応の標的タンパク質の有無を判定することと、を含む。

【００５７】 本発明の特長は、発明を限定すると考えるべきではない以下の実施例を参照す
ることにより、さらに明白に理解されるであろう。

【００５８】実施例 実施例１。試薬およびＤＮＡ。これらの実験で使用した無機試薬は、分析級以
上であった。試薬のソースは以下の通りであった。実施例２に従うか、またはＳ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＡｌｄｒｉｃ
ｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）により製造されたカルボキシアルキルホスホネ
ート；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミン（Ｓｉ
ｇｍａ ｏｒ Ａｌｄｒｉｃｈ）；［γ−³²Ｐ］アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）
（Ｐｈａｎｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
ＮＪ）；水（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｐｌｕｓ精製システム、
Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、合成オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．，
Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）；１−ブロモドデカン酸、Ｎ，Ｎ’
−ジメチルホルムアミド、および亜リン酸トリエチル（Ｓｉｇｍａ）；塩化オキ
サリル、ジクロロメタン、無水エタノール、およびトリエチルアミン（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）；およびＮａ₂Ｐ０₄、ＮａＨ₂ＰＯ₄、ＮａＣｌおよび濃ＨＣＩ（Ｆｉｓ
ｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）。

【００５９】 実施例２。Ｃ−１２ホスホネート調製の好ましい方法。ある一定のホスホン酸
は一般に市販されている（たとえば、アミノプロピルホスホン酸および２−カル
ボキシエチルホスホン酸（ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈ））、１１−カルボ
キシウンデカンホスホン酸（Ｃ−１２ホスホネート）等の、高炭素ホスホン酸を
使用することが好ましい。

【００６０】 Ｃ−１２ホスホネートは、以下の通りに調製することができる。５０ｍｌ丸底
フラスコ内で、ブロモドデカン酸１．１２ｇ（４ｍｍｏｌｅ）を、ジクロロメタ
ン１０ｍｌに溶解する。窒素雰囲気下、室温で、攪拌しながら塩化オキサリル（
２Ｍのもの２ｍｌ）を加え、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００
μｌを加えることにより、反応を開始する。反応開始後１分および２分に、さら
に１００μｌのＤＭＦを溶液に加える。１５分後、ジクロロメタン８ｍｌを反応
混合物に加え、窒素下で１５分間攪拌を続ける。次いで、窒素流れで、酸塩化物
中間体から溶剤を除去する。

【００６１】 酸塩化物中間体を直ちにジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、急速に攪拌しなが
ら、エタノール（３５０μｌ）およびトリエチルアミン（８３５μｌ）を加える
。ｐＨ紙で試験したとき、溶液のｐＨは７〜８である。溶液を室温で１時間攪拌
する。溶剤を蒸発除去し、生成物をヘキサン１０ｍｌに溶解し、水１０ｍｌで洗
浄する。ヘキサン相を回収し、蒸発乾固してエチルエステル中間体を除去する。

【００６２】 １００ｍｌ用丸底フラスコ内でエチルエステル中間体に亜リン酸トリエチル（
１．５ｍｌ）を加え、この溶液を窒素下で再還流する。１．５時間後、追加の亜
リン酸トリエチル（１．５ｍｌ）を反応混合物に加え、窒素下での還流を４．５
時間続ける。反応混合物をおよそ５０℃まで冷却し、ＨＣｌ １３．２ｍｌを加
える。１６時間還流した後、反応混合物をビーカー内にピペッティングし、水５
ｍｌを加える。反応混合物が温度まで冷めるにつれて、１２−ホスホノドデカン
酸生成物が溶液から析出する。この生成物を濾過で回収し、水で洗浄して乾燥さ
せる。

【００６３】 実施例３。電極上の単層の調製。ｏｆ所望のサイズおよび形状の、ガラス上のＩ
ＴＯ電極（Ｄｅｌｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，Ｍ
Ｎ）、たとえば、１５ｍｍ×１５ｍｍ平方、抵抗率が１０オーム／スクエアおよ
び２０００ÅのＳｉＯ₂の基層を有する厚さ１４００〜１６００ÅのＩＴＯ層を
、使用前にきれいにし、風乾させる。

【００６４】 きれいにして乾燥させた電極を、有機溶剤（たとえば、メタノールまたはエタ
ノール）に溶解した選択されたカルボキシアルキルホスホネートに、室温で曝露
する。カルボキシアルキルホスホネートはメタノールに非常によく溶け、またメ
タノールから申し分なく自己集合するため、メタノールが好ましい。カルボキシ
−アルキルホスホネートの濃度は、０．１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲であり、十分な
単層形成を実現するためには、２〜５ｍＭのカルボキシアルキルホスホネートが
好ましい。適当な自己集合時間は、３秒から２０時間まで変化してもよく、３０
分が一般に好ましい好ましい。付着しなかったカルボキシアルキルホスホネート
を、水で３回洗浄してＩＴＯ電極からすすぎ落し、電極を乾燥させる。ホスホネ
ートが不十分であった場合、層は不調で、カルボキシレート基を活性化およびオ
リゴヌクレオチドプローブ付着に利用できない恐れがある。余分の単層は、遷移
金属錯体がオリゴヌクレオチドから電極表面に移動するのを阻害することによっ
て、電子移動に対するバリヤーの役割を果たす。また、余分のカルボキシアルキ
ルホスホネート単層は、オリゴヌクレオチドプローブ結合および標的ハイブリダ
イゼーションの静電阻害につながる。

【００６５】 本発明の単層／ＩＴＯ電極上への試薬の布置は、当技術分野で周知の通り、た
とえば、電極の非伝導性側に印をつけることにより、標準化されている。

【００６６】 実施例４。電極の単層の活性化。実施例３による単層を上に有するＩＴＯ電極
を、活性化／カップリング化合物１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）
（４：１のモル比）に曝露する。ＥＤＣの濃度は２０〜４００ｍＭの範囲であり
、ＮＨＳの濃度は５〜１００ｍＭの範囲である。一般に好ましい範囲は４００ｍ
Ｍ ＥＤＣおよび１００ｍＭ ＮＨＳである。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液３０μｌを、
各ＩＴＯ電極／単層上にピペッティングし、室温で３０分間インキュベートする
。付着しなかったＥＤＣ／ＮＨＳを水で３回洗してＩＴＯ電極からすすぎ落し、
次いで電極を風乾させる。

【００６７】 実施例５。ＤＮＡプローブの付着。３’末端または５’末端にアルキルアミン
リンカーを有するオリゴヌクレオチドプローブを、活性化させた単層に結合させ
る。アルキルアミンの長さは、少なくとも炭素３個、好ましくは炭素３〜１２個
長くなければならず、一般に好ましい長さは炭素６個である。１Ｍ ＮａＣｌ／
０．２５Ｍ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９に２０〜１００μＭの濃度のオリゴヌクレオ
チドプローブ（２０μｌ）を、活性化させた単層上にピペッティングし、室温（
およそ２５℃）で３０分間でインキョベートする。オリゴヌクレオチドプローブ
溶液を除去し、水に浸漬し、続いてで０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ
７、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび水で洗浄することにより、電極を洗浄する。³²Ｐ
標識オリゴヌクレオチドプローブを反応混合物に加えることにより、単層へのオ
リゴヌクレオチドプローブ付着の程度を放射化学的に評価することができる。

【００６８】 オリゴヌクレオチドプローブと反応しなかった活性化カルボキシル基を、エタ
ノールアミンでブロックして、非特異的標的結合を減少させる。電極を０．１Ｍ
エタノールアミン、ｐＨ８中に、２５℃で約２０分間浸漬する。エタノールアミ
ンを水で３回洗浄して電極からすすぎ落し、電極を風乾させる。

【００６９】 当業者に明白であろうが、オリゴヌクレオチドプローブの濃度、ｐＨ、インキ
ュベーション時間、温度およびブロキング剤を変えてもよい。

【００７０】 実施例６。電極の標的核酸への曝露。オリゴヌクレオチドプローブ配列の一部
に相補的な核酸配列を有する核酸標的を、プローブにハイブリダイズさせる。今
のところ、２３グアニンを含む相補的合成オリゴヌクレオチドが使用されている
。標的核酸（０．８Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．０
中に２０μｌ）を、オリゴヌクレオチドプローブ／単層上にピペッティングし、
２５℃で１時間インキュベートする。標的核酸溶液を除去し、水に続いて０．１
Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．０、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび水で電極を洗浄する
。当業者に明白であろうが、ハイブリダイゼーション条件を変えてもよい。³²Ｐ
標識標的核酸を反応混合液に加えることにより、オリゴヌクレオチドプローブに
対する標的核酸ハイブリダイゼーションの程度を放射化学的に評価することがで
きる。

【００７１】 実施例７。電極の電気化学。一般に、電極に、気化学的に応答させる好ましい
方法は、サイクリックボルタンメトリーであるが、クロノアンペロメトリー、ク
ロノクーロメトリーおよびステップボルタンメトリー等の電気化学的応答方法も
有用である。以下の通り、各ＩＴＯ電極に対して、サイクリックボルタンメトリ
ーが実施される。適当な走査速度とには、約５０ｍＶ／秒〜５０００Ｖ／秒の走
査速度が含まれ、２０Ｖ／秒が好ましい走査速度である。この走査速度で、結合
ＤＮＡから最大シグナルが、バックグラウンド最小シグナルが得られる。電位は
、最初は正方向で掃引し、電位０Ｖで開始して、走査速度に応じて、電位を１．
３〜１．８Ｖに切りかえる。３電極セットアップ、すなわち、Ａｇ／ＡｇＣｌ参
照電極、Ｐｔワイヤー補助電極、および発明による修飾されたＩＴＯ作用電極を
使用する。修飾されたＩＴＯ電極を電気化学セルに入れ、１００μＭ Ｒｕ（ｂ
ｐｙ）₃ ²⁺を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０） ２００μ
ｌを修飾電極の上に布置する。緩衝溶液は、ＮａＣｌを含んでもよく（一般に約
１Ｍまで、研究中の特定の系での必要に応じて）、これによって、シグナル分離
が高まる場合もある。参照電極およびＰｔ電極を、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺溶液と接
触した状態で電気化学セルに入れる。サンプルに応答シグナルを発信させ、デー
タを収集し、保存して分析する。

【００７２】 実施例８。単層形成評価。図１ａおよび１ｂは、単層が結合できるオリゴヌク
レオチドプローブの量（ピコモル（ｐｍｏｌ）で示す）で示した、自己集合時間
が単層形成に及ぼす影響を示す図である。図１ａは２時間までの自己集合時間の
ものであり、図ｌｂは９０時間までのものである。単層に結合したオリゴヌクレ
オチドプローブの量は、単層形成の間接的な尺度である。およそ１０時間までの
自己集合時間の場合、自己集合時間は、単層がオリゴヌクレオチドプローブを結
合する能力に実質的に影響を及ぼさないようである。２０時間の自己集合後、単
層がオリゴヌクレオチドプローブを結合する能力が劇的に降下した。単層に結合
したオリゴヌクレオチドプローブの量は、３秒から１０時間までのインキュベー
ション時間で、一定であった。

【００７３】 単層形成を、電極が曝露されるホスホネート溶液の濃度の関数として評価した
。図２に示す通り、オリゴヌクレオチド鎖のグアニンｐｍｏｌ当たりのバックグ
ラウンドを超えた電流（電流分割）を調査することにより、この評価を実施した
。全濃度で、２時間自己集合時間を使用して単層を形成し、サイクリックボルタ
ンメトリー（２０Ｖ／秒）およびＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺濃度１００μＭを使用して
、電気化学的測定を行った。電気化学的応答を、単層に結合されたグアニンｐｍ
ｏｌ当たりのバックグラウンドを超えたピーク分離のμＡとして測定した。自己
集合溶液中の１２−炭素カルボキシアルキルホスホネートの濃度は０．１〜２０
ｍＭの範囲であった。ホスホネート溶液の濃度の影響は軽微であった。

【００７４】 オリゴヌクレオチドを含むまたは含まない、自己集合単層の安定性を評価した
。第０日に、単層をＩＴＯ電極上に自己集合させ、グアニン含有オリゴヌクレオ
チドを電極の６０％に付着させせた。次いで、全ての電極を冷却した貯蔵所に入
れた。第１、２、３、６および７日に、５つの電極（２つは単層のみ、３つは単
層プラスオリゴヌクレオチド）を選択し、電気化学的に分析して、発生したシグ
ナルを判定した。サイクリックボルタンメトリー（２０Ｖ／秒）およびＲｕ（ｂ
ｐｙ）₃ ²⁺濃度１００μＭを使用して、電気化学的測定を行った。電極に付着さ
せたオリゴヌクレオチド鎖中のグアニンｐｍｏｌ当たりの、バックグラウンドを
超えた発生したシグナル（電流）のμＡを決定するために、サンプルを評価した
。７日以上、感知できるほどの電気化学的応答の変化は見とめられず、従って、
単層は、これらの条件で７日以上安定であった（図３）。

【００７５】 実施例９。単層のサイクリックボルタモグラム。図４は、異なる量のグアニン
含有オリゴヌクレオチドが付着している自己集合単層電極の用量応答を示す図で
ある。単層に結合させたオリゴヌクレオチドの量は、各電極上に０．００８〜０
．４６６ｐｍｏｌの範囲のオリゴヌクレオチド鎖であった。オリゴヌクレオチド
は、鎖当たり２３グアニンを有する合成の３４量体であった。サイクリックボル
タンメトリー（２０Ｖ／秒）およびＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺濃度１００μＭを使用し
て、電気化学的測定を行った。この図から異なる量のオリゴヌクレオチドが付着
した単層を識別できることがわかる。シグナル（電流）は、各電極上のグアニン
の数に比例している。

【００７６】 図５は、図４をグラフで表現した図であり、バックグラウンドを超えたシグナ
ルのμＡ対各電極上のオリゴヌクレオチド鎖中のグアニンのｐｍｏｌがプロット
されたいる。様々な量のオリゴヌクレオチドを有する単層を調製し、電気化学的
応答（バックグラウンドを超えたピーク分離のμＡ）を測定して、単層に結合さ
せたオリゴヌクレオチド中のグアニンの量（ｐｍｏｌ）の関数としてプロットし
た。このグラフから、電気化学的応答とグアニン量が正比例することがわかる。

【００７７】 実施例１０。カルボキシアルキルホスホネートを介してオリゴヌクレオチドを
固定する代替法。オリゴヌクレオチドを付着させた自己集合単層を形成する代替
法は、自己集合単層の形成前に、カルボキシアルキルホスホネートをオリゴヌク
レオチドに結合させる方法である。３’末端または５’末端にアルキルアミンリ
ンカーを有するオリゴヌクレオチドを、０．００５〜１ｍＭカルボキシアルキル
ホスホネート、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ
ＨＳ）を含有するジメチルスルホキシドの溶液に加える。反応混合物の最終容量
は、１００〜２００μｌであり、オリゴヌクレオチドの濃度は２０μＭである。
この反応混合物を、２５℃で６〜８時間インキュベートしてもよい。電極へのオ
リゴヌクレオチド−ホスホネート付着の程度を定量する場合、放射標識したオリ
ゴヌクレオチドを使用してもよい。カルボキシアルキルホスホネートオリゴヌク
レオチド複合体を含む反応混合物（２０μｌ）を、ＩＴＯガラス電極上にピペッ
ティングし、２５℃で２〜４時間インキュベートして、単層を形成させる。付着
しなかった材料を除去し、電極を、水、０．１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．０）
、１．０Ｍ ＮａＣｌおよび水で逐次洗浄する。

【００７８】 一般に、カルボキシアルキルホスホネートをオリゴヌクレオチドに結合させる
この方法を使用すると、オリゴヌクレオチドに付着した１つまたは複数のカルボ
キシアルキルホスホネート基を有する不均質の生成物が生じ、一次付着部位は、
オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のアルキルアミンであり、塩基上
のエキソサイクリックアミンはカルボキシアルキルホスホネートの二次付着部位
の役割を果たす。オリゴヌクレオチド上にカルボキシアルキルホスホネート基が
幾つ存在するかによって、ＩＴＯ電極への付着および標的核酸分子のハイブリダ
イゼーションに影響を及ぼすことができる。

【００７９】 カルボキシ−アルキルホスホネート１つだけが、５’末端または３’末端のア
ルキルアミンを介して各オリゴヌクレオチドに結合されるように、ブロックされ
たエキソサイクリックアミノ基を有するオリゴヌクレオチドを使用して、オリゴ
ヌクレオチド−ホスホネート生成物を調製するために、他の方法を使用してもよ
い。たとえば、水性−非水性溶剤混合物中のカルボジイミドを使用して、カルボ
キシアルキルホスホネートを合成後にガラスビーズ上に固定され、且つエキソサ
イクリックアミン上の保護基を未だ保持しているオリゴヌクレオチドに結合させ
ることができる。カルボキシアルキルホスホネートを結合させた後、反応物を容
易に洗い流して純粋な生成物を作ることができる。

【００８０】 純粋なカルボキシアルキルホスホネートオリゴヌクレオチド複合体は、先ず、
複合体を８５〜１００％ジメチルスルホキシドに溶解することにより、ＩＴＯ電
極に付着させることが好ましい。この溶液に遊離のカルボキシアルキルホスホネ
ートを加えて、約５μＭ〜５ｍＭの濃度を有するアルキルホスホネートの溶液と
する。この混合物（２０μｌ）をＩＴＯガラス電極上にピペッティングし、２５
℃で２〜４時間インキュベートして、単層を形成させる。付着しなかった材料を
除去し、電極を、水、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ、および水で逐次洗浄する。

【００８１】 本発明を具体的な実施形態に関連して説明してきたが、多数の変更、修飾、お
よび実施形態が可能なことは理解されるであろう、従って、このような変更、修
飾、および実施形態は全て、本発明の精神および範囲の中であると考えるべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１ａおよび図１ｂ】 結合したグアニン含有オリゴヌクレオチドの量（ｐｍｏｌ）対、本発明の自己
集合単層の集合時間のグラフであり、自己集合時間が単層形成に及ぼす影響を、
単層が結合できるオリゴヌクレオチドプローブの量の関数として表す。

【図２】 自己集合単層に結合させたグアニン含有オリゴヌクレオチドの電気化学的応答
によって示した、自己集合溶液中のＣ₁₂カルボキシホスホネートが単層形成に及
ぼす影響を示すグラフである。走査速度２０Ｖ／秒のサイクリックボルタンメト
リーおよび１００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺濃度を使用して、電気化学的測定を
行った。

【図３】 １２−炭素カルボキシアルキルホスホネートを使用し、本発明に従って作成し
たグアニン含有オリゴヌクレオチド単層の安定性を示すグラフである。走査速度
２０Ｖ／秒のサイクリックボルタンメトリーおよび１００μＭのＲｕ（ｂｐｙ） ₃ ²⁺ 濃度を使用して、電気化学的測定を行った。

【図４】 様々な量のグアニン含有オリゴヌクレオチドを付着させたオリゴヌクレオチド
結合単層に関して、用量応答を示す一連のサイクリックボルタモグラムである。
走査速度２０Ｖ／秒のサイクリックボルタンメトリーおよび１００μＭのＲｕ（
ｂｐｙ）₃ ²⁺濃度を使用して、電気化学的測定を行った。

【図５】 図４に示した用量応答を示すグラフである。走査速度２０Ｖ／秒のサイクリッ
クボルタンメトリーおよび１００μＭのＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺濃度を使用して、電
気化学的測定を行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９３ 33/543 ５９３ 33/547 33/547 33/553 33/553 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ネイピア，メアリ・イー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27510， カーボロ，ウッズ・ウォーク・コート 106 (72)発明者 トーマス，ロバート・エス アメリカ合衆国ノースカロライナ州27243， エフランド，シルヴァー・フォックス・レ イン 5012 (72)発明者 ソープ，エイチ・ホールデン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27514， チャペル・ヒル，マリリン・レイン 215 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA12 DA13 DA14 DA36 FA34 FB01 FB02 FB03 FB05 FB15 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA12 HA14 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QQ79 QR31 QR38 QR48 QR55 QR84 QS32 QS34 QS39 QX05 4H045 AA10 AA30 BA60 EA50 EA65 FA50 FA80

Claims (120)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）伝導性作用面を上に有する支持体と、 （ｂ）前記伝導性作用面上の非伝導性の自己集合単層であって、最小限少なく
   とも１つのホスホネート基および少なくとも１つのＲ₁基を有するホスホネート
   分子を含み、前記Ｒ₁基が結合対の構成要素に共有結合しており、その単層を介
   して、遷移金属錯体が、前記単層上に固定された反応物から前記伝導性作用面に
   自由に移動して、電子を前記伝導性作用面に移動させることができる単層と を含む電極。
2. 【請求項２】 有機スペーサー基Ｒ₂が、ホスホネート基とＲ₁基との間に位
   置する、請求項１に記載の電極。
3. 【請求項３】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項２に記載の電極。
4. 【請求項４】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネートを
   含む、請求項１に記載の電極。
5. 【請求項５】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキシ
   ウンデカンホスホン酸である、請求項４に記載の電極。
6. 【請求項６】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項１に記載の電
   極。
7. 【請求項７】 自己集合単層の形成前に、前記Ｒ₁基が、結合対の構成要素
   に結合された、請求項１に記載の電極。
8. 【請求項８】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含む
   、請求項１に記載の電極。
9. 【請求項９】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請求
   項１に記載の電極。
10. 【請求項１０】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項９
    に記載の電極。
11. 【請求項１１】 前記Ｒ₁基が、カップリング剤で活性化されている、請求
    項１に記載の電極。
12. 【請求項１２】 前記カップリング剤がカルボジイミドを含む、請求項１１
    に記載の電極。
13. 【請求項１３】 前記支持体が金属支持体および非金属支持体からなる群か
    ら選択される、請求項１に記載の電極。
14. 【請求項１４】 （ａ）流体サンプルを入れるためのサンプル容器と、 （ｂ）伝導性作用面を上に有する支持体と；前記伝導性作用面上の非伝導性の
    自己集合単層であって、最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なくと
    も１つのＲ₁基を有するホスホネート分子を含み、前記Ｒ₁基が結合対の構成要素
    に共有結合しており、その単層を介して、遷移金属錯体が、固定された反応物か
    ら前記伝導性作用面に自由に移動して、電子を前記伝導性作用面に移動させるこ
    とができる単層と、 （ｃ）前記電極と電子的に連絡しているポテンシオスタットと、 を含む装置。
15. 【請求項１５】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項１４に記載の装置。
16. 【請求項１６】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項１４に記載の装置。
17. 【請求項１７】 最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なくとも
    １つのＲ₁基を有するホスホネート分子を含み、前記Ｒ₁基は結合対の構成要素に
    共有結合している、支持体上の非伝導性の自己集合単層。
18. 【請求項１８】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項１７に記載の自己集合単層。
19. 【請求項１９】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項１８に記載の自己集合単
    層。
20. 【請求項２０】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項１７に記載の自己集合単層。
21. 【請求項２１】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項２０に記載の自己集合単層。
22. 【請求項２２】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項１７に記載
    の自己集合単層。
23. 【請求項２３】 自己集合単層の形成前に、前記Ｒ₁基が、結合対の構成要
    素に結合された、請求項１７に記載の自己集合単層。
24. 【請求項２４】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項１７に記載の自己集合単層。
25. 【請求項２５】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項１７に記載の自己集合単層。
26. 【請求項２６】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項２
    ５に記載の自己集合単層。
27. 【請求項２７】 結合対の構成要素に共有結合される前に、前記Ｒ₁がカッ
    プリング剤で活性化された、請求項１７に記載の自己集合単層。
28. 【請求項２８】 前記カップリング剤がカルボジイミドを含む、請求項２７
    に記載の自己集合単層。
29. 【請求項２９】 前記支持体が金属支持体および非金属支持体からなる群か
    ら選択される、請求項１７に記載の自己集合単層。
30. 【請求項３０】 （ａ）伝導性作用面を有する電極の非伝導性の自己集合単
    層であって、最小限少なくとも１つのホスホネート基および結合対の構成要素に
    共有結合した少なくとも１つのＲ₁基を有するホスホネート分子を有し、その単
    層を介して、遷移金属錯体が、前記単層上に固定された反応物から前記伝導性作
    用面に自由に移動して、電子を前記伝導性作用面に移動させることができる単層
    を、酸化還元反応で酸化されることができる標識担持標的を含む疑いのあるサン
    プルと接触させて、固定された結合対の構成要素および存在する場合には標的が
    、前記単層上に標的複合体を形成するステップと、 （ｂ）前記単層および存在する場合には標的複合体と、前記標識担持標的を酸
    化還元反応で酸化することができる遷移金属錯体とを接触させるステップと、 （ｃ）酸化還元反応を検出するステップと、 （ｄ）検出された酸化還元反応から前記標的の有無を判定するステップと を含む、サンプル中の標識担持標的の存在を判定する方法。
31. 【請求項３１】 前記遷移金属錯体がＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺であり、検出され
    る酸化還元反応がグアニン酸化である、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項３０に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記標識担持標的が、核酸、タンパク質および炭水化物か
    らなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項３０に記載
    の方法。
38. 【請求項３８】 前記標識担持標的がグアニンを含む核酸であり、前記固定
    された結合対の構成要素が前記標的とハイブリダイズすることができるオリゴヌ
    クレオチドプローブであって、ハイブリダイズした標的複合体を形成することが
    できる、請求項３０に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記自己集合単層を前記標的と接触させる前に、標的核酸
    を増幅して増幅された核酸溶液を作ることをさらに含む、請求項３８に記載の方
    法。
40. 【請求項４０】 前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、リガー
    ゼ連鎖反応、および核酸配列増幅法からなる群から選択された方法で実施される
    、請求項３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項３０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項３０に記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項４
    ２に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記サンプルが合成または天然のオリゴヌクレオチド、外
    科的標本、医学的診断に使用された標本、遺伝子検査に使用された標本、環境標
    本、細胞培養標本、食物標本、歯科標本および獣医学的標本からなる群から選択
    される、請求項３０に記載の方法。
45. 【請求項４５】 ステップ（ａ）の前に、前記Ｒ₁基が結合対の構成要素に
    共有結合され、次いで結果として得られたホスホネート分子が電極に適用された
    、請求項３０に記載の方法。
46. 【請求項４６】 （ａ）非伝導性の自己集合単層を電極上に形成し、その単
    層を介して、遷移金属錯体が、前記単層上に固定された反応物から伝導性作用面
    自由に移動して、電子を前記伝導性作用面に移動させるため、前記伝導性作用面
    を有する電極を、最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なくとも１つ
    のＲ₁基を有し、前記Ｒ₁基が結合対の構成要素に共有結合しているか、結合対の
    構成要素に共有結合されることができる、ホスホネート分子とを接触させるステ
    ップと、 （ｂ）前記Ｒ₁基が前記結合対の構成要素に既に結合されているのでなければ
    、カップリング剤で前記Ｒ₁基を活性化することにより、前記Ｒ₁基を前記結合対
    の構成要素に結合させ、前記結合対の構成要素を固定するために、前記活性化さ
    れたＲ₁基を、標的に結合することができる結合対の構成要素と接触させるステ
    ップと、 （ｃ）前記結合対の構成要素が上に固定された自己集合単層を、酸化還元反応
    で酸化されることができる標識担持標的を含む疑いのあるサンプルと接触させて
    、前記固定された結合対の構成要素および前記標的が前記単層上に標的複合体を
    形成するステップと、 （ｄ）前記単層および存在する場合には標的複合体を、酸化還元反応で前記標
    識担持標的を酸化することができる遷移金属錯体と接触させるステップと、 （ｅ）酸化還元反応を検出するステップと、 （ｆ）検出された酸化還元反応から前記標的の有無を判定するステップと、 を含む、サンプル中の標識担持標的の存在を判定する方法。
47. 【請求項４７】 前記遷移金属錯体がＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺であり、前記検出
    される酸化還元反応がグアニン酸化である、請求項４６に記載の方法。
48. 【請求項４８】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項４６に記載の方法。
49. 【請求項４９】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項４８に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項４６に記載の方法。
51. 【請求項５１】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項５０に記載の方法。
52. 【請求項５２】 前記標識担持標的が、核酸、タンパク質および炭水化物か
    らなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
53. 【請求項５３】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項４６に記載
    の方法。
54. 【請求項５４】 前記標識担持標的がグアニンを含む核酸であり、前記固定
    された結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブである前記標的とハイブ
    リダイズしてハイブリダイズした標的複合体を形成できる、請求項４６に記載の
    方法。
55. 【請求項５５】 前記自己集合単層を前記標的と接触させる前に、前記標的
    核酸を増幅して、増幅された核酸溶液を作成する、請求項５４に記載の方法。
56. 【請求項５６】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、リガ
    ーゼ連鎖反応、および核酸配列増幅法からなる群から選択される方法で実施され
    る、請求項５５に記載の方法。
57. 【請求項５７】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項４６に記載の方法。
58. 【請求項５８】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項４６に記載の方法。
59. 【請求項５９】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項５
    ８に記載の方法。
60. 【請求項６０】 前記カップリング剤がカルボジイミドを含む、請求項４６
    に記載の方法。
61. 【請求項６１】 前記サンプルが合成または天然のオリゴヌクレオチド、外
    科的標本、医学的診断に使用された標本、遺伝子検査に使用された標本、環境標
    本、細胞培養標本、食物標本、歯科標本および獣医学的標本からなる群から選択
    される、請求項４６に記載の方法。
62. 【請求項６２】 （ａ）伝導性作用面を有する支持体を提供するステップと
    、 （ｂ）最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なくとも１つのＲ₁基
    を有し、前記Ｒ₁基が結合対の構成要素と共有結合することができるホスホネー
    ト分子を提供するステップであって、前記自己集合単層が非伝導性であり、その
    単層を介して、遷移金属錯体が、前記単層上に固定された反応物から前記伝導性
    作用面に自由に移動して、電子を前記伝導性作用面に移動させることができる、
    ホスホネート分子を提供するステップと、 （ｃ）前記支持体を前記ホスホネート分子と接触させて自己集合単層を形成す
    るステップと、 を含む、自己集合単層を電極上に調製する方法。
63. 【請求項６３】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項６２に記載の方法。
64. 【請求項６４】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項６３に記載の方法。
65. 【請求項６５】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項６２に記載の方法。
66. 【請求項６６】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項６５に記載の方法。
67. 【請求項６７】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項６２に記載
    の方法。
68. 【請求項６８】 前記自己集合単層を形成する前に前記Ｒ₁基を前記結合対
    の構成要素に結合させる、請求項６２に記載の方法。
69. 【請求項６９】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項６２に記載の方法。
70. 【請求項７０】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項６２に記載の方法。
71. 【請求項７１】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項７
    ０に記載の方法。
72. 【請求項７２】 前記Ｒ₁基をカップリング剤で活性化することを含む、請
    求項６２に記載の方法。
73. 【請求項７３】 前記カップリング剤がカルボジイミドを含む、請求項７２
    に記載の方法。
74. 【請求項７４】 （ａ）伝導性作用面を有する電極を提供するステップと、 （ｂ）表面上の非伝導性の自己集合単層の形成を促す条件で、前記表面を選択
    されたホスホネート分子に曝露するステップであって、前記ホスホネート分子は
    最小限少なくとも１つのホスホネート基および少なくとも１つのＲ₁基を有し、
    前記Ｒ₁基は結合対の構成要素と共有結合することができ、その単層を介して、
    遷移金属錯体が、前記単層に固定された反応物から前記伝導性作用面に自由に移
    動して、電子を前記伝導性作用面移動させることができるステップと、 （ｃ）前記Ｒ₁基をカップリング剤で活性化するステップと、 （ｄ）前記自己集合単層を、結合対の構成要素と接触させるステップと、 を含む、結合対の構成要素を電極表面上に固定する方法。
75. 【請求項７５】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項７４に記載の方法。
76. 【請求項７６】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項７５に記載の方法。
77. 【請求項７７】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項７４に記載の方法。
78. 【請求項７８】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項７７に記載の方法。
79. 【請求項７９】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項７４に記載
    の方法。
80. 【請求項８０】 前記自己集合単層を形成する前に前記Ｒ₁基を前記結合対
    の構成要素に結合させる、請求項７４に記載の方法。
81. 【請求項８１】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを含
    む、請求項７４に記載の方法。
82. 【請求項８２】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、請
    求項７４に記載の方法。
83. 【請求項８３】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項８
    ２に記載の方法。
84. 【請求項８４】 前記カップリング剤がカルボジイミドを含む、請求項７４
    に記載の方法。
85. 【請求項８５】 （ａ）伝導性作用面を有する電極上の非伝導性の自己集合
    単層を提供するステップであって、前記単層は最小限少なくとも１つのホスホネ
    ート基およびオリゴヌクレオチドプローブに共有結合した少なくとも１つのＲ₁
    基を有するホスホネート分子を含み、その単層を介して、遷移金属錯体が、前記
    単層に固定された反応物から前記伝導性作用面に自由に移動して、電子を前記伝
    導性作用面に移動させることができるステップと、 （ｂ）前記オリゴヌクレオチドプローブが上に固定された前記自己集合単層を
    、酸化還元反応で酸化されることができる標的核酸を含む疑いのあるサンプルと
    接触させて、前記固定されたオリゴヌクレオチドプローブおよび存在する場合に
    は標的核酸が、前記単層上に標的複合体を形成するステップと、 （ｃ）前記単層および存在する場合には前記標的複合体を、酸化還元反応で標
    的核酸を酸化することができる遷移金属錯体と接触させるステップと、 （ｄ）酸化還元反応を検出するステップと、 （ｅ）検出された酸化還元反応から前記標的核酸の有無を判定するステップと
    、 を含む、サンプル中の標的核酸の存在を判定する方法。
86. 【請求項８６】 前記遷移金属錯体がＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺であり、グアニン
    酸化が検出される、請求項８５に記載の方法。
87. 【請求項８７】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項に８５記載の方法。
88. 【請求項８８】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項８７に記載の方法。
89. 【請求項８９】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネート
    を含む、請求項に８５記載の方法。
90. 【請求項９０】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボキ
    シウンデカンホスホン酸である、請求項８９に記載の方法。
91. 【請求項９１】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項８５に記載
    の方法。
92. 【請求項９２】 前記自己集合単層を形成する前に前記Ｒ₁基を前記結合対
    の構成要素に結合させる、請求項８５に記載の方法。
93. 【請求項９３】 前記自己集合単層を前記標的と接触させる前に、標的核酸
    を増幅して、増幅された核酸溶液を作成する、請求項８５に記載の方法。
94. 【請求項９４】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、リガ
    ーゼ連鎖反応、および核酸配列増幅法からなる群から選択される方法で実施され
    る、請求項９３に記載の方法。
95. 【請求項９５】 前記サンプルが、合成または天然のオリゴヌクレオチド、
    外科的標本、医学的診断に使用された標本、遺伝子検査に使用された標本、環境
    標本、細胞培養標本、食物標本、歯科標本および獣医学的標本からなる群から選
    択される、請求項８５に記載の方法。
96. 【請求項９６】 （ａ）伝導性作用面を有する電極上の非伝導性の自己集合
    単層を提供するステップであって、前記単層は最小限少なくとも１つのホスホネ
    ート基およびタンパク質結合性物質に共有結合した少なくとも１つのＲ₁基を有
    するホスホネート分子を含み、その単層を介して、遷移金属錯体が、前記単層に
    固定された反応物から前記伝導性作用面に自由に移動して、電子を前記伝導性作
    用面に移動させることができるステップと、 （ｂ）前記タンパク質結合性物質が上に固定された前記自己集合単層を、標的
    タンパク質を含む疑いのあるサンプルと接触させるステップと、 （ｃ）存在する場合には、前記単層に結合した標的タンパク質を、酸化還元反
    応で酸化されることができる標識に結合した第２のタンパク質結合性物質と接触
    させて、前記タンパク質結合性物質および存在する場合には標的タンパク質が前
    記単層上に標的複合体を形成するステップと、 （ｄ）前記単層および存在する場合には標的複合体を、酸化還元反応で前記標
    識を酸化することができる遷移金属錯体と接触させるステップと、 （ｅ）酸化還元反応を検出するステップと、 （ｆ）検出された酸化還元反応から前記標的タンパク質の有無を判定するステ
    ップと、 を含む、サンプル中の標的タンパク質の存在を判定する方法。
97. 【請求項９７】 前記標識がオリゴヌクレオチドを含む、請求項９６に記載
    の方法。
98. 【請求項９８】 タンパク質結合性物質がタンパク質である、請求項９６に
    記載の方法。
99. 【請求項９９】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に位
    置する、請求項９６に記載の方法。
100. 【請求項１００】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項９９に記載の方法。
101. 【請求項１０１】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネー
     トを含む、請求項９６に記載の方法。
102. 【請求項１０２】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボ
     キシウンデカンホスホン酸である、請求項１０１に記載の方法。
103. 【請求項１０３】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項９６に記
     載の方法。
104. 【請求項１０４】 前記サンプルが、合成または天然のオリゴヌクレオチド
     、外科的標本、医学的診断に使用された標本、遺伝子検査に使用された標本、環
     境標本、細胞培養標本、食物標本、歯科標本および獣医学的標本からなる群から
     選択される、請求項９６に記載の方法。
105. 【請求項１０５】 （ａ）伝導性作用面を有する電極上の非伝導性の自己集
     合単層を提供するステップであって、前記単層は最小限少なくとも１つのホスホ
     ネート基およびタンパク質結合性物質に共有結合した少なくとも１つのＲ₁基を
     有するホスホネート分子を含み、その単層を介して、遷移金属錯体が、前記単層
     に固定された反応物から前記伝導性作用面に自由に移動して、電子を前記伝導性
     作用面に移動させることができるステップと、 （ｂ）前記タンパク質結合性物質が上に固定された前記自己集合単層を、酸化
     還元反応で酸化されることができる標識が結合した標的タンパク質を含む疑いの
     あるサンプルと接触させて、前記固定されたタンパク質結合性物質および存在す
     る場合には標的タンパク質が前記単層上に標的複合体を形成するステップと、 （ｃ）前記単層および存在する場合には標的複合体を、酸化還元反応で前記標
     識を酸化することができる遷移金属錯体と接触させるステップと、 （ｄ）酸化還元反応を検出するステップと、 （ｅ）検出された酸化還元反応から前記標的タンパク質の有無を判定するステ
     ップと、 を含む、標的タンパク質の存在を判定する方法。
106. 【請求項１０６】 前記標識がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０５に
     記載の方法。
107. 【請求項１０７】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項
     １０５に記載の方法。
108. 【請求項１０８】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に
     位置する、請求項１０５に記載の方法。
109. 【請求項１０９】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項１０８に記載の方法。
110. 【請求項１１０】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネー
     トを含む、請求項１０５に記載の方法。
111. 【請求項１１１】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボ
     キシウンデカンホスホン酸である、請求項１１０に記載の方法。
112. 【請求項１１２】 前記伝導性作用面がＩＴＯ表面を含む、請求項１０５に
     記載の方法。
113. 【請求項１１３】 最小限少なくとも１つのホスホネート基および結合対の
     構成要素に共有結合した少なくとも１つのＲ₁基を有するホスホネート分子。
114. 【請求項１１４】 有機スペーサー基Ｒ₂がホスホネート基とＲ₁基との間に
     位置する、請求項１１３に記載のホスホネート分子。
115. 【請求項１１５】 Ｒ₂が（ＣＨ₂）₁₁を含む、請求項１１４に記載のホスホ
     ネート分子。
116. 【請求項１１６】 前記ホスホネート分子がカルボキシアルキルホスホネー
     トを含む、請求項１１３に記載のホスホネート分子。
117. 【請求項１１７】 前記カルボキシアルキルホスホネートが、１１−カルボ
     キシウンデカンホスホン酸である、請求項１１６に記載のホスホネート分子。
118. 【請求項１１８】 前記結合対の構成要素がオリゴヌクレオチドプローブを
     含む、請求項１１３に記載のホスホネート分子。
119. 【請求項１１９】 前記結合対の構成要素がタンパク質結合性物質を含む、
     請求項１１３に記載のホスホネート分子。
120. 【請求項１２０】 前記タンパク質結合性物質がタンパク質を含む、請求項
     １１９に記載のホスホネート分子。