JP2005520175A - 多重標的化合物の電気化学的検出方法 - Google Patents

Abstract

（ａ）導電性の酸化還元反応検出電極を提供するステップと、（ｂ）第１の標的分子及び第２の標的分子を含むと考えられるサンプルを、第１の標的分子及び第２の標的分子が電極上に付着する条件で、電極に接触させるステップであって、第１の標的分子が第１の標識を含み、第２の標的分子が第２の標識を含むステップと、（ｃ）該電極に、第１の酸化還元反応で第１の予め選択された標識を酸化する第１の遷移金属錯体、及び第２の酸化還元反応で第１及び第２の標識を酸化する第２の遷移金属錯体を接触させるステップであって、第１の酸化還元反応と第２の酸化還元反応とが異なる検出可能なシグナルを生じさせるステップと、（ｄ）第１の酸化還元反応を検出することにより、第１の標的分子の存在を検出するステップと、（ｅ）第２の酸化還元反応を検出することにより、第２の標的分子の存在を検出するステップとによって、２つの異なる標的分子を１つの電極で検出する方法が実施される。本方法を実施するための装置も開示する。

Description

本発明は、特異的結合対のメンバーの電気化学的検出方法に関する。

異種ＤＮＡサンプル中の個々のＤＮＡ配列を検出することにより、遺伝子の同定、ＤＮＡプロファイリング、及び新規なＤＮＡ配列決定方法の基礎が得られる。１つのＤＮＡハイブリダイゼーション検出方法は、表面結合オリゴマーの、異種サンプル中の配列へのハイブリダイゼーションを示す分析的応答を使用してアッセイすることができる、表面結合ＤＮＡ配列の使用を含む。これらの従来の分析方法は、一般に、標的ＤＮＡ鎖上に共有結合した標識から生じるレーザー誘導性蛍光を含み、その方法は、表面結合二重鎖における一塩基ミスマッチに敏感ではない。たとえば、ピラング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）らに付与された米国特許第５，１４３，８５４号及び米国特許第５，４０５，７８３号；Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５（１９９３）；Ｂａｉｎｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０７：３５６（１９９５）；及びＮｏｂｌｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７（５）：２０１Ａ（１９９５）は、この用途のための表面又は「チップ」を提案している。Ｈａｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．Ｉｎｔｅｒ．３２（１）：２１（１９９４）により提案された代替方法では、ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ダブルストランドＤＮＡと比較した、シングルストランドＤＮＡの酸化還元挙動の観察を含む電気化学的方法で検出される。この技術もやはりＤＮＡサンプルにおける一塩基ミスマッチに敏感ではない。

ソープ（Ｔｈｏｒｐ）らに付与された米国特許第５，８７１，９１８号及び及び米国特許第６，１３２，９７１号には、酸化還元反応における予め選択された塩基を検出することにより、標的分子を電気的に検出する方法及び装置について記載されている。同特許に開示されている方法及び装置は、ＤＮＡ配列決定、診断用アッセイ、及び定量分析を含む様々な用途で使用することが可能である。この方法は、マルチウェル・プレートを含む様々な異なるアッセイ形式及びアッセイ構造で、各ウェルで実施される異なるアッセイにより、有利に実施することができる。しかし、これらの参考文献には、１つのウェルで多数のアッセイを実施する方法は記載されていない。

本発明の第１の態様は、１つの共通電極によって２つの異なる標的分子を検出する方法である。一般に、本方法は、
（ａ）導電性の酸化還元反応検出電極を提供するステップと、
（ｂ）（以下でさらに論ずる通り）、第１の標的分子及び第２の標的分子を含有すると考えられるサンプルを、第１の標的分子及び第２の標的分子が電極上に付着する条件で、（たとえばアフィニティ結合、沈殿等により）、サンプルを該電極に接触させるステップであって、
第１の標的分子は、第１の予め選択された標識を含み、第２の標的分子は、第２の予め選択された標識を含み、かつ第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識は異なるステップと、
（ｃ）該電極に、（ｉ）第１の遷移金属錯体と第１の予め選択された標識との間に、第１の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、第１の予め選択された標識を酸化する第１の遷移金属錯体、及び（ｉｉ）第２の遷移金属錯体と第２の予め選択された標識との間に、第２の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識を酸化する第２の遷移金属錯体を、同時に接触させるステップであって、これらの予め選択された標識から、対応する遷移金属錯体への電子移動があり、その結果、触媒回路の一部として、対応する遷移金属錯体の還元形が再生し、第１の酸化還元反応と第２の酸化還元反応とが異なる検出可能なシグナルを生じさせるステップと、
（ｄ）第１の酸化還元反応を検出することにより、第１の標的分子の存在を検出するステップと、
（ｅ）第２の酸化還元反応を検出することにより、第２の標的分子の存在を検出するステップとを含む。

この接触させるステップは、任意の適当な方法、たとえば、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、直接アッセイ、固定化標的物質用競合アッセイ、又は結合相互作用アッセイ（その全てを、以下のセクションＨでより詳細に論じる）により実施することが可能である。

前述の一実施形態では、サンプルは、第３の標的分子を含有すると考えられ、この第３の標的分子は、第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識と異なる第３の予め選択された標識を含み、接触させるステップ（ｃ）は、電極（ｉｉｉ）に、第３の遷移金属錯体と第３の予め選択された標識との間に、第３の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、第１、第２及び第３の予め選択された標識を酸化する第３の遷移金属錯体を、接触させることをさらに含み、第１、第２及び第３の酸化還元反応は、異なる検出可能なシグナルを生じさせ、さらに、本方法は、（ｆ）第３の酸化還元反応を検出することにより、第３の標的分子の存在を検出するステップをさらに含む。

前述の別の特別な実施形態では、サンプルは、第４の標的分子を含むと考えられ、この第４の標的分子は、第１、第２及び第３の予め選択された標識と異なる第４の予め選択された標識を含み、接触させるステップ（ｃ）は、該電極（ｉｖ）に、第４の遷移金属錯体と第４の予め選択された標識との間に、第４の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、第１、第２、第３及び第４の予め選択された標識を酸化する第４の遷移金属錯体を接触させることをさらに含み、第１、第２、第３及び第４の酸化還元反応が異なる検出可能なシグナルを生じさせ、本方法は、（ｇ）第４の酸化還元反応を検出することにより、第４の標的分子の存在を検出するステップをさらに含む。

本発明の第２の態様は、少なくとも２種の異なる結合対の、少なくとも２つの異なるメンバーの電気化学的検出に有用な超小型電子装置である。本装置は、（ａ）超小型電子基材と、（ｂ）該基材上の導電性酸化還元検出電極と、（ｃ）非導電層上に固定化された第１の特異的結合対の第１のメンバー（たとえば、タンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチドプローブ）であって、サンプル中に存在する第１の特異的結合対の第１のメンバーが第２のメンバーと結合し、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、第１の結合対の第１のメンバーが検出電極に隣接している（又は十分に近い）第１の特異的結合対の第１のメンバーと、（ｄ）サンプル中に存在する第２の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第２の特異的結合対の第１のメンバー（たとえば、タンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチドプローブ）であって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、検出電極に隣接している第２の結合対の第１のメンバーとを含み、第１の結合対の第１のメンバーと第２の結合対の第１のメンバーが異なる。

前述の特別な一実施形態では、本装置は、サンプル中に存在する第３の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第３の特異的結合対の第１のメンバー（たとえば、タンパク質、ペプチド又はオリゴヌクレオチドプローブ）であって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、検出電極に隣接している第３の結合対の第１のメンバーをさらに含み、第１の結合対の第１のメンバー、第２の結合対の第１のメンバー、及び第３の結合対の第１のメンバーが異なる。本装置は、他の結合対に関する記載と同様に検出電極に隣接した第４の結合対の第１のメンバーをさらに含んでもよい。

前述のある実施形態では、該超小型電子基材は、導電性酸化還元検出電極及び第１の結合対及び第２の結合対の固定化された第１のメンバーを含む、サンプル容器を含む。

ある実施形態では、該超小型電子基材は、複数の導電性酸化還元検出電極及び第１の結合対及び第２の結合対の、複数の固定化された第１のメンバーを含む、サンプル容器を含む。ある実施形態では、本装置は、導電性金属を含む導電性参照電極をさらに含む。ある実施形態では、本装置は、導電性金属を含む導電性補助電極をさらに含む。ある実施形態では、酸化還元反応は、各導電性酸化還元検出電極からの電気的接続により検出可能である。従って、ある実施形態では、本装置は、酸化還元反応検出器をさらに含む。

本発明の第３の態様は、
（ａ）上述の装置を提供するステップと、
（ｂ）第１の結合対の第２のメンバー及び第２の結合対の第２のメンバーを含むと考えられるサンプルを接触させるステップと、
（ｃ）基材に、（ｉ）第１の遷移金属錯体と第１の予め選択された標識との間に、第１の酸化還元反応を引き起こす条件で、酸化還元反応において、第１の予め選択された標識を酸化する第１の遷移金属錯体、及び（ｉｉ）第２の遷移金属触媒と第２の予め選択された標識の間に、第２の酸化還元反応を引き起こす条件で、酸化還元反応において、第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識を酸化する、第２の遷移金属錯体を同時に接触させるステップであって、これらの予め選択された標識から遷移金属錯体への電子移動があり、その結果、触媒回路の一部として、対応する遷移金属錯体の還元形が再生し、第１の酸化還元反応と第２の酸化還元反応とが異なる検出可能なシグナルを生じさせるステップと、
（ｄ）第１の酸化還元反応の検出から、第１の結合対の第２のメンバーの存在を検出するステップと、
及び（ｅ）第２の酸化還元反応の検出から、第２の結合対の第２のメンバーの存在を検出するステップと
を含む、共通電極を介して、少なくとも２つの異なるハイブリダイゼーション事象を検出する方法である。

前述で好適な遷移金属錯体の例としては、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｆｅ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｏｓ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｏｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺（これらの正式な名称は、後述する）、フェロセン、アミノフェロセン、及びＲｅＯ₂（ｐｙ）₄ ¹⁺などが挙げられるが、この限りではない。

本明細書に記載の方法及び装置で、核酸に適した予め選択された標識の例としては、アデニン、グアニン、及びそれらの類似体、たとえば、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンなどが挙げられるが、この限りではない。

前述の幾つかの実施形態において、第１の結合対のプローブ／第１のメンバー、及び第２の結合対のプローブ／第１のメンバーは、オリゴヌクレオチドである。

前述の幾つかの実施形態において、第１の結合対のプローブ／第１のメンバー、及び第２の結合対の第１のメンバーは、ペプチド又はタンパク質である。

前述のさらに他の実施形態において、第１の結合対のプローブ／第１のメンバーはオリゴヌクレオチドであり、第２の結合対のプローブ／第１のメンバーはタンパク質又はペプチドである。

前述のある実施形態において、第１の結合対の標的分子／第２のメンバー、及び第２の結合対の第２のメンバーは、タンパク質又はペプチドである。

前述の他の実施形態において、第１の結合対の標的分子／第２のメンバー、及び第２の結合対の第２のメンバーは、オリゴヌクレオチドである。

前述のさらに他の実施形態において、第１の結合対の標的分子／第２のメンバーは、タンパク質又はペプチドであり、第２の結合対の標的分子／第２のメンバーは、オリゴヌクレオチドである。

本発明の幾つかの実施形態において、第１の結合対の第２のメンバー及び第２の結合対の第２のメンバーの少なくとも１つは、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸である。このような方法は、接触させるステップの前に核酸を増幅するステップをさらに含んでもよい。

前述のある実施形態において、電極は、超小型電子基材（たとえばケイ素又はガラス）により支持されている。

前述のある実施形態において、電極は、インジウムスズ酸化物を含む。

前述のある実施形態において、検出ステップは、多段階のクロノアンペロメトリー又はサイクリックボルタンメトリーによって実施される。

本発明の前述及び他の目的及び態様を、以下に記載の明細書に詳細に説明する。

本明細書に使用される専門用語は、ある特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本発明及び添付の特許請求の範囲に使用される単数形は、明記されていない限り、複数形も含むものとする。

本明細書で使用される「標的分子」は、ペプチド類、タンパク質、核酸、多糖類、脂質、リポ蛋白質等を含むがこの限りではない、検出が望まれるあらゆるタイプの分子を指す。

「結合対」は、一方が標的分子であってもよい一対の分子であって、該分子対のメンバーが、特異的にかつ選択的に、互いに結合する分子対を指す。適当な結合対の例としては、核酸と核酸、タンパク質又はペプチドと核酸、タンパク質又はペプチドとタンパク質又はペプチド、抗原と抗体、受容体とリガンド、ハプテン、又は多糖類等が挙げられるがこの限りではない。結合対のメンバーは、本明細書で「バインダー」とも呼ばれる。

本明細書で使用される「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者を含む、あらゆる核酸を指す。本発明の核酸は、一般に、ポリ核酸である。すなわち、３’，５’ホスホジエステル結合により共有結合されている個々のヌクレオチドのポリマーである。

本明細書で使用される用語「相補的核酸」は、別の核酸に特異的に結合して、ハイブリダイズされた核酸を形成するオリゴヌクレオチドプローブを含むあらゆる核酸を指す。

語句「有無を決定する」は、検出事象（たとえば、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡハイブリダイゼーション、検出標的核酸等）の有無の定性的決定及び定量的決定を含むことを意図する。

用語「ハイブリダイズされたＤＮＡ」及び「ハイブリダイズされた核酸」は、ハイブリダイズされてダブルストランドＤＮＡ又は核酸を形成するシングルストランドＤＮＡ、又はハイブリダイズされてトリプルヘリックスＤＮＡ又は核酸を形成するダブルストランドＤＮＡ又は核酸を指す。

本明細書で使用される用語「プローブ」は、結合対として別の分子に特異的に結合する分子を指し、そのプローブ分子を使用して、他方の分子の有無を決定することが可能である。プローブは、結合対の任意のメンバーであってもよく、たとえば、タンパク質、ペプチド類、天然の核酸又は合成の核酸、たとえばＤＮＡ又はＲＮＡ等を含む。

本明細書で使用される用語「サンプル」は、電極に適用するか又は電極上に付着させるものを指し、そのサンプルは、１つのソースから誘導又は獲得されてもよく、複数のソースから誘導又は獲得されてもよい。本明細書で使用される用語「電極上に付着する」は、プローブにて、又はそのプローブにより捕捉された標的にて生じる酸化還元反応が、隣接する電極にて検出されるように、たとえば、サンプルが、（ａ）電極の表面上、又は（ｂ）電極の非導電層上、又は（ｃ）（ｉ）電極表面、又は（ｉｉ）非導電層上、又は（ｉｉｉ）電極近隣及びそれに十分に近い、捕捉プローブ上に付着してもよいことを意味する。

本明細書で使用される語句「同時に接触させる」は、錯体が、電極に同時に添加されても順次添加されてもよいが、錯体が検出電極上又は検出電極に同時に存在することを意味する。

本明細書では、ＤＮＡに関して本発明の方法及び装置が時々説明されるが、これは明確にするためであり、当然のことながら、本発明の方法及び装置は、他の核酸、たとえばＲＮＡ、及び他の標的又は特異的結合対のメンバー、たとえばタンパク質にも応用できる。

本発明は、とりわけ、ソープ（Ｔｈｏｒｐ）らに付与された米国特許第５，８７１，９１８号及び米国特許第６，１３２，９７１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の技術を使用して実施することが可能である。

Ａ．標識
一般に、本発明を実施するために使用される標識は、本発明を実施するのに適した電圧範囲内、たとえば約０又は０．２ボルトから約１．４又は１．６ボルトまでの範囲で酸化され得る化合物、部分又は基である。たとえば、本発明で使用される標識は、予め選択されたペプチド類及び予め選択されたヌクレオチド塩基からなる群より選択されてもよく、内因性標識であっても外因性標識であってもよい。本標識は、本発明で電子を導電性基材に移動させるためのメディエーターとして使用される遷移金属錯体を含まない。本標識は、遷移金属メディエーターの酸化電位とほぼ同じか又はそれより低い酸化電位を有する。

標的分子が核酸であるとき、標識は、その核酸上の予め選択された塩基であってもよい。適当な予め選択された塩基の例としては、グアニン、アデニン、８−オキソ−グアニン、及び８−オキソ−アデニン、８−ブロモ−グアニン、グアノシン、キサントシン、ワイオシン、プソイドウリジン、６−メルカプトグアニン、８−メルカプトグアニン、２−チオキサンチン、６−チオキサンチン、６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−カルボキシメチル−メルカプトプリン、２−メルカプトプリン、６−メトキシプリン、２−アセチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、６−メチルチオ−２−ヒドロキシプリン、２−ジメチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、２−ヒドロキシプリン、２−アミノプリン、６−アミノ−２−ジメチルアリルプリン、２−チオアデニン、８−ヒドロキシアデニン、８−メトキシアデニン、５−アミノシトシン、５−アミノウリジン、及び６−アミノシトシンなどが挙げられるが、この限りではない。一般に、この予め選択された塩基は、グアニン、アデニン、８−オキソ−グアニン、８−オキソ−アデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、５−アミノシトシン、５−アミノウリジン、及び６−アミノシトシンからなる群より選択され、グアニンが一般に好ましい天然の予め選択された塩基であり、７−デアザグアニンが一般に好ましい合成の予め選択された塩基である。容易に酸化又は還元される予め選択された塩基は、Ｂａｉｋ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００１）（近刊）に記載の理論的方法を使用してデザインすることができる。

本発明の方法を使用して、内因性標識、たとえば、特定のアミノ酸をタンパク質中に含む標的を電気化学的に検出することが可能である。内因性標識は、アッセイの結合メンバーのいずれかの中に生来含まれる部分である。電気化学的タンパク質検出のために、メディエーターを用いた触媒反応で、内因性標識を酸化又は還元する。タンパク質検出システムにおいて、これらの部分は、当該電位範囲（６００−１２００ｍＶ）でかつ水の酸化に必要な電位より低い電位で、触媒を介した電気化学により酸化されるアミノ酸を含む。この中には、システイン、チロシン、トリプトファン、及びヒスチジンが含まれる。他のアミノ酸も酸化され得るが、ここに記載されているアッセイ条件では酸化されない。

６００〜１２００ｍＶの電位範囲で酸化可能なアミノ酸は、ほとんどのタンパク質分子（従って、標的分子）に存在するため、触媒を介した電気化学によって、タンパク質を直接検出することができる。このことは、特に巨大タンパク質及びトリプトファン又はチロシンに富むタンパク質について言える。

外因性標識は、合成手段、人工的手段、天然手段、又は他の手段によって、結合メンバー又は標的に付加される部分である。外因性標識の役割は、他の状況では電気化学的に不活性であろう分子に電気化学的活性を与えるか、又は既に活性な分子の電気化学的活性を高めることである。触媒が介在する電気化学的検出に使用される外因性標識の例としては、ペプチド類、修飾アミノ酸を含むペプチド、他のタンパク性電子供与体及び受容体化合物、及び介在電気化学により酸化還元を受ける予め選択されたヌクレオチド塩基を含むオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。タンパク質に共有結合され得る他の電子供与体又は受容体化合物を、タンパク質標的及び他の物質の電気化学的検出用の標識として使用することが可能であり、当業者に明白であろう。特に、およそ、≦０．６Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位で酸化される供与体化合物は、アッセイ中に存在する核酸又はアミノ酸の酸化からのバックグラウンドシグナルが無い条件で、介在電気化学により酸化され得るため、標識として有用である。低電位標識の例としては、修飾アミノ酸である５−ヒドロキシトリプトファンを含むペプチド類、３−アミノチロシン、及び３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンなどが挙げられる。これらの修飾アミノ酸は、それぞれ、およそ、≦０．４７Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の酸化電位を有し、介在触媒酸化還元反応で、約０．４７Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の酸化還元電位を有する遷移金属メディエーターＯｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺と反応するのに適している。

結合相互作用の検出に関して前述した多数の標識は、ここで使用するのに適さず、本出願に含まれない。たとえば、介在電気化学的検出用標識として除かれるものは、酵素触媒によって電気化学的シグナル又は光学シグナルを発生するために基材を必要とする遷移金属錯体及び酵素標識である。本発明の介在触媒電気化学的検出において、遷移金属錯体は、標識としてではなく、触媒としての役割を果たす。

Ｂ．酸化還元反応の遷移金属錯体メディエーター
本発明を実施するために使用されるメディエーターは、上述の通り、対応する標識への電子移動を可能にする化合物、一般に、遷移金属錯体である。一般に、異なるメディエーターが各標識に使用され、それに特定のメディエーターが対応する。メディエーターは、任意の分子、たとえば、固有の酸化電位で電気化学的標識と反応して、標識から電極に電子を移動させる陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、又は両イオン性分子であってもよい。本明細書の本発明で使用されるメディエーターは、検出しようとしている標識で観察されるものとほぼ同じ酸化電位又はそれより高い電位で可逆的な酸化還元対を示すように選択されることが重要である。従って、チロシン又はトリプトファンを標識として使用するためには、メディエーターは、Ａｇ／ＡｇＣ１に対して、それぞれ、約≧０．６５Ｖ又は≧０．８Ｖの酸化電位を持たなければならない。適当なメディエーターは、それぞれ、Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＦｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺であろう。同様に、グアニンを標識として使用するためには、メディエーターはＡｇ／ＡｇＣｌに対して≧約１．１Ｖの酸化電位を持たなければならず、適切なメディエーターは、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺である。本発明の方法で使用するのに適したメディエーターの他の例は、たとえば、ルテニウム²⁺（２，２’−ビピリジン）₃（「Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、ルテニウム²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）₃（「Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、ルテニウム²⁺（５，６−ジメチル−１，１０−フェナントロリン）₃（「Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（２，２’−ビピリジン）₃（「Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）₃（「Ｆｅ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（５−クロロフェナントロリン）₃（「Ｆｅ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺」）、鉄²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）（ビピリジン）₂（「Ｆｅ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）（ｂｐｙ）₂ ²⁺」）、鉄²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）₂（ビピリジン）（「Ｆｅ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₂（ｂｐｙ）²⁺」）、オスミウム²⁺（２，２’−ビピリジン）₃（「Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、オスミウム²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）₃（「Ｏｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺」）、オスミウム²⁺（５−クロロフェナントロリン）₃（「Ｏｓ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺」）、オスミウム²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）（ビピリジン）₂（「Ｏｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）（ｂｐｙ）₂ ²⁺」）、オスミウム²⁺（４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン）₂（ビピリジン）（「Ｏｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₂（ｂｐｙ）²⁺」）、ジオキソレニウム¹⁺ホスフィン、及びジオキソレニウム¹⁺ピリジン（「ＲｅＯ₂（ｐｙ）₄ ¹⁺」）を含む、遷移金属錯体である。メディエーターとして有用な陰イオン性錯体を以下に挙げる。Ｒｕ（ｂｐｙ）（（ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ）₂ ^2-及びＲｕ（ｂｐｙ）（（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ）₂ ^2-であり、メディエーターとして有用な両イオン性錯体は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₂（（ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ）及びＲｕ（ｂｐｙ）₂（（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ）であり、ここで（ＳＯ₃）₂−ｂｐｙ^2-は４，４’−ジスルホナト−２，２’−ビピリジンであり、（ＣＯ₂）₂−ｂｐｙ^2-は４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビピリジンである。フェロセン分子の誘導体も、優れたメディエーターである。ピリジン、ビピリジン及びフェナントロリン基の好適な置換誘導体も、前述の金属のいずれかと共に錯体に使用することが可能である。適当な置換誘導体は、４−アミノピリジン、４−ジメチルピリジン、４−アセチルピリジン、４−ニトロピリジン、４，４’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジメチル−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジメチル−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、４，４’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、６，６’−ジヒドロキシル−２，２’−ビピリジン、４，４’，４″−トリアミノ−２，２’，２″−ターピリジン、４，４’，４″−トリエチレンジアミン−２，２’，２″−ターピリジン、４，４’，４″−トリヒドロキシ−２，２’，２″−ターピリジン、４，４’，４″−トリニトロ−２，２’，２″−ターピリジン、４，４’，４″−トリフェニル−２，２’，２″−ターピリジン、４，７−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジヒドロキシル−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジヒドロキシル−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジスペラミン（ｄｉｓｐｅｒａｍｉｎｅ）−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジスペラミン（ｄｉｓｐｅｒａｍｉｎｅ）−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２’，２’−ｃ］フェナジン、４，４’−ジクロロ−２，２’−ビピリジン、５，５’−ジクロロ−２，２’−ビピリジン、及び６，６’−ジクロロ−２，２’−ビピリジンなどがあるが、この限りではない。

Ｃ．酸化還元反応
メディエーターは、触媒反応により、標識とメディエーターの酸化還元反応を達成するのに十分な条件で、捕捉された標的、代理の標的、又はバインダーの中又は上の、標識と反応させることが可能である。酸化還元反応が中で起こる溶液は、アッセイの成分を可溶化するのに適した任意の溶液であってもよく、好ましくは水を含む。酸化還元反応を引き起こすのに適した条件は、当業者に周知である。

Ｄ．酸化還元反応の検出
当業者に周知の適当な方法により、本発明の酸化還元反応の発生を検出することが可能である。たとえば、酸化還元反応の発生は、酸化還元反応の発生を示す電気化学的シグナルの変化を観察するための検出（作用）電極を使用して検出することが可能である。本明細書に記載の方法による標識の検出に適した電極は、その表面に作用表面を有する導電性基材を含み、かつメディエーターと標識との間の電子の移動に敏感である。この導電性基材は、半導体基材を含む、金属性基材であっても非金属性基材であってもよい。好ましくは、電極は、スズドープ酸化インジウム（ＩＴＯ）電極、酸化スズ電極又は酸化インジウム電極である。あるいは、電極は、金、炭素繊維、カーボンペースト、又はグラッシーカーボンであってもよい。ある特定の電極材料の適性は、選択された標識及びメディエーターを含むその材料の、それらの所要酸化還元電位における有用性に最終的に左右される。導電性基材は、任意の物理学的形態、たとえば、一端に形成された作用表面を有する細長い形状をした装置、又はたとえば微量滴定プレートのウェルにおいて、片面に作用表面を有するフラットシート等をとることが可能である。

固定化された生物学的結合実体による改良に適した電極を作製するためには、適当な非導電層を用いて電極を改良する。非導電層は、生体分子の共有結合を提供すること、電極への非特異的結合をブロックすること、及びメディエーターと電極および／またはメディエーターと標識との間の電子移動を可能にすることを含む、多数の機能の１つ以上を有することが可能である。非導電層は、下記の１つ以上であってもよい、たとえば自己集合した単分子層（たとえば、米国特許第６，１２７，１２７号）、架橋したポリマー層、アルキルシラン層、ホスホン酸アルキル、リン酸アルキル、カルボキシアルカン、アルケンチオ、又はアルキルアミンを主成分とする層、ポリマー膜（米国特許第５，９６８，７４５号における）および／または生体分子、たとえば、タンパク質、抗体、ビオチン結合性分子（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、受容体、又はオリゴヌクレオチド等の１つ以上の層。生体分子で構成される非導電層の場合、非導電層は、バインダー、標的タンパク質、代理標的、又はアフィニティリガンドに対する捕捉層の役割を果たすことができる。たとえば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を検出するための電極では、非導電層は、抗ｈＣＧ捕捉抗体であってもよく、リガンドを検出するための電極では、受容体分子が非導電層の役割を果たすこともあり得る。あるいは、非導電層は、捕捉抗体に関するタンパク質Ａ又は、捕捉分子に対する抗体（すなわち捕捉分子としてストレプトアビジンを使用する結合アッセイの場合の抗ストレプトアビジン抗体、受容体に基づくアッセイの場合の抗受容体抗体）等の、捕捉分子を結合する生体分子であってもよい。非導電層の性質と関係なく、この層は最終的に、電気化学的検出前にメディエーターを含有する溶液と接触して配置される。

一般に、検出電極と併せて、参照電極及び補助電極も、メディエーター溶液と接触して配置される。適当な参照電極は当該技術で周知であり、たとえば、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、及び銀擬似参照電極（silver pseudo reference electrode）などがある。適当な補助電極は白金電極である。

標識の触媒的酸化還元により生じる電気化学的シグナルを検出することにより、サンプル中に特定の物質が存在するか存在しないかを決定することが可能になる。本明細書で使用される、物質の「有無」を決定又は検出する等の用語は、本発明を説明するために使用されるとき、物質の計量も含む。本発明では、遷移金属メディエーターが電極により酸化される。次いで、このメディエーターは標識により還元され、次いで電極にて再酸化される。従って、触媒回路の一部として、遷移金属メディエーターの還元形が再生される結果となる、標識から遷移金属メディエーターへの電子移動が存在する。サンプル中の標的の有無を決定するステップは、一般に、（ｉ）標的を特異的に結合することができる電極及び標的を特異的に結合することができない電極で、メディエーターの酸化還元反応により発生する電気化学的シグナルを測定することと、（ｉｉ）両電極で、遷移金属錯体から測定されるシグナルを比較することと、次いで（ｉｉｉ）標的を結合することができる電極で、メディエーターから発生する電気化学的シグナルが、標的を結合しない電極でメディエーターから発生する電気化学的シグナルと本質的に同じであるか、より大きいか、又はより小さいかを決定することとを含む。電気化学的シグナルを測定するステップは、適当な方法で実施することが可能である。例えば、同一走査速度、メディエーター濃度、緩衝液条件、温度、及び／又は電気化学的方法で、標的を結合することができる電極、及び結合することができない電極からの電気化学的シグナル（たとえば、電流又は電荷）を比較することにより、電気化学的シグナルの差を決定することが可能である。

酸化還元反応と関連した電気化学的シグナルは、検出電極と電気的に連絡している適当な装置を提供することにより測定することが可能である。適当な装置は、標識とメディエーターと間に反応が起こったか否かの指標となるように発生される電子シグナルを測定することができるポテンシオスタットである。この電子シグナルは、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー、及び矩形波ボルタンメトリーを含む電気化学的方法に特有のものであってもよく、クロノアンペロメトリー及びサイクリックボルタンメトリーが一般に好ましい形態である。

サイクリックボルタンメトリーでは、一定の走査速度で（０．０１ｍＶ／ｓ〜２００Ｖ／ｓ）、０〜８００ｍＶの初期電位から５００〜１６００ｍＶの最終電位まで、電気化学システムの電位を直線的に変化させる。最終電位に到達したとき走査方向を逆にし、反対方向に同じ電位範囲を再度スイープする。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺に好適な走査速度は、初期電位０ｍＶ及び最終電位１４００ｍＶで、１〜２０Ｖ／ｓである。各電位における電流を収集し、データを電位対電位走査としてプロットする。Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＯｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺等の低電位メディエーターの場合、これらのメディエーターを酸化するのに必要な酸化還元電位が低いため、０〜８００ｍＶから５００〜１６００ｍＶまでの走査の代わりに、約０〜１００ｍＶから３００〜１０００ｍＶ（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して）まで走査することが好ましい。

本明細書の本発明で使用されるクロノアンペロメトリーでは、電気化学的システムを、０ｍＶ〜８００ｍＶの初期電位から、５００〜１６００ｍＶの最終電位まで直ちに進め、そこで指定された時間（５０μｓ〜１０ｓ）維持し、電流を時間の関数として収集する。必要に応じて、電位を初期電位に戻してもよく、及び初期電位における電流を時間の関数として収集してもよい。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺に好ましい電位ステップは、５０〜１０００ｍｓの収集時間で、０〜８００ｍＶから１３００ｍＶ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）までの間である。Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＯｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺等の低電位メディエーターの場合、約０〜１００ｍＶから３００−１０００ｍＶ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）まで進むことが好ましい。

クロノクーロメトリーでは、やはり電位ステップが適用される。本明細書に記載の本発明で使用するためには、初期電位（０ｍＶ〜８００ｍＶ）で開始し、電気化学的システムを最終電位（５０ｍＶ〜１６００ｍＶ）まで直ちに進める。電気化学的システムを、指定された時間（５０μｓ〜１０ｓ）、最終電位に保ち、電荷を時間の関数として収集する。現在は行われないが、必要に応じて、電位を初期電位に戻し、初期電位における電荷を時間の関数として収集することができる。

本明細書の本発明に使用されるであろう代表的な装置は、たとえば、流体サンプルを収容するためのサンプル容器、上述のような電極、及び電極表面と電気的に連絡しているポテンシオスタットを含んでもよい。さらに、本装置は、好ましくは、電極又は電極表面上の非導電層に付着した、結合対の第１のメンバー、たとえば捕捉抗体を含む。本発明は、第１及び第２の対向する面、第１の面上の導電性電極、及び第２の面上の酸化還元反応の検出を可能にするほど十分に第１面に近い第２面上の、標的物質のための固定化バインダーを有する超小型電子基材を含む超小型電子装置と共に使用することができる。酸化還元反応アッセイ形式は、１）固定化された第１のバインダーにより捕捉される標的物質が、標的物質用の第２の標識バインダーによって検出される、サンドイッチ形式、２）標的物質が固定化された第１のバインダーにより捕捉され、標的に結合した標識により直接検出される形式、３）固定化バインダーへの結合に関して、サンプル中の標的物質と競合する標識された標的又は標識された代理標的を使用した、競合形式、４）標識されたバインダーの結合に関して、サンプル中の標的物質が競合する標識されたバインダー及び固定化標的物質を使用した競合形式、又は５）固定化された第１のバインダー、第２の標識されたバインダー、及び２つのバインダー間の相互作用に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよい被検サンプルを使用した、結合アッセイ形式のいずれであってもよい。

Ｅ．シグナルの解析
２種のメディエーターのサイクリックボルタモグラムが得られるとき、各メディエーターに対応する電位で、２つのピーク電流を測定することができる。サンプルが、今問題になっている２つのＤＮＡ配列の一方または両方を含むと考えられる場合、各配列に、予め選択された塩基を選択する。第１の予め選択された塩基は、第２の予め選択された塩基より高い電位で酸化される。たとえば、第１の予め選択された塩基は、７−デアザアデニンであってもよい。この塩基は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺により還元され、そのため、第１のメディエーターはＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺である。次いで、第２の予め選択された塩基は、第１の予め選択された塩基より低い電位を有するよう選択される。第２のメディエーターは、第１のメディエーターより低いが、第２の予め選択された塩基を酸化できるほど十分に高い電位を有するように選択される。たとえば、この場合、第２の予め選択された塩基は、たとえば、７−デアザグアニンであってもよい。７−デアザグアニンを酸化するが７−デアザアデニンを酸化しない第２のメディエーターは、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺であろう。第２の予め選択された塩基の電位は、第１の予め選択された塩基より低いため、第２の予め選択された塩基も第１のメディエーターにより酸化される。従って、第１のメディエーターからの電流は、第１又は第２の予め選択された塩基のいずれかの存在によって増加し、第２のメディエーターの電流は、第２の予め選択された塩基の存在によって増加する。最も簡単な分析で、第２のメディエーターに関する電流増強があれば、これを第２の予め選択された塩基の量を決定するために使用する。次いで、第１のメディエーターで観察された電流増強からこの量を減算する。第１のメディエーターに関する残りの電流増強は、第１の予め選択された塩基の存在に起因すると考えられる。

実際には、第１のメディエーターに関する電流への、第２の予め選択された塩基の貢献は、第２のメディエーターへの、第２の予め選択された塩基の貢献より低い可能性がある。これは、ボルタンメトリックスイープで、第１のメディエーターより先に第２のメディエーターが酸化される場合、第１のメディエーターが酸化される前に、第２の予め選択された塩基の一部が酸化され、多少の第２の予め選択された塩基は、第１のメディエーターにより酸化されないままであるために生じる。この作用は、標準検量線で決定することができ、これを使用して、第１のメディエーターからの電流増強を、適切な塩基濃度の組合せに割り当てることができる。

予め選択された塩基又は標識（たとえば第３、第４の）からのシグナルを用いた解析を、上述と同様の方法で実施することができる。

Ｆ．標的結合の計量
本明細書に記載の方法は、核酸及びタンパク質標的及び他の結合性物質の定量的検出に特に適している。本セクションに記載の事例では、メディエーターにより結合される標的と関連した標識の酸化に関する速度定数は、サイクリックボルタモグラムから、デジタル・シミュレーションによって決定することができる。ほとんどの条件で、この反応は、二次反応速度論に従い、したがって、速度＝ｋ［メディエーター］［標識］で表される。ここで、ｋは、個々の標識に特有の速度定数であり、［メディエーター］はメディエーターの濃度であり、［標識］は標識の濃度である。ｋ及び［メディエーター］が既知であれば、標識の量、及びしたがって標的の量を決定することができる。実際には、被検サンプルを加えた電極で観察される電気化学的シグナルの増強を使用して、電極に結合した標識（及び標的）の量が直接得られるように、標識を含有する標準溶液の異なる量で得られる電流増強に関する検量線を構築する。次いで、この量を、被検サンプル中に存在する標的の量に直接関係させる。

Ｇ．核酸増幅方法
本発明の方法は、ハイブリダイズされたＤＮＡを生成するためにＤＮＡサンプルをオリゴヌクレオチドプローブに接触させるステップを含むため、ある種の用途では、プローブと接触させる前にＤＮＡを増幅することが望ましい場合がある。さらに、１つ以上の予め選択された塩基を、増幅ステップで使用されるプライマーに含めるか、又は予め選択された塩基の三リン酸塩を増幅混合物に使用する、すなわち、グアノシン−５’−三リン酸の代わりに７−デアザグアノシン−５’−三リン酸を増幅反応で使用するかのいずれかによって、合成の予め選択された塩基を標的に導入するために、増幅方法を使用することができる。

選択された、又は標的の核酸配列の増幅は、任意の適当な方法で実施することができる。一般に、Ｄ．Ｋｗｏｈ ａｎｄ Ｔ．Ｋｗｏｈ，Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８，１４−２５（１９９０）を参照されたい。適当な増幅技術の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＮＡ増幅の場合、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を含む）、リガーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅、転写を基本とする増幅（Ｄ．Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７（１９８９）参照）、自律的配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、すなわち「３ＳＲ」）（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４−１８７８（１９９０）参照）、Ｑ．β．レプリカーゼシステム（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２（１９８８）参照）、核酸配列に基づく増幅（すなわち「ＮＡＳＢＡ」）（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２（９），１（１９９２）参照）、修復連鎖反応（又は「ＲＣＲ」）（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ、上掲参照）、及びブーメランＤＮＡ増幅（又は「ＢＤＡ」）（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ、上掲参照）などが挙げられるが、この限りではない。増幅生成物に組み込まれる塩基は、天然の塩基であっても（増幅の前又は後に修飾される）修飾塩基であってもよく、この塩基は、後続の電気化学的検出ステップを最適化するように選択することが可能である。増幅のための技術は周知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，８００，１５９号、及び米国特許第４，９６５，１８８号、Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６（１９９２），Ｒ．Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２９２（１９９１）に記述されている。

Ｈ．アッセイ形式
本発明でサンプルを接触させ、次いで結合相互作用を検出する一般的な方法は、従来のサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、又は直接標的検出によるアッセイを含むがその限りではない任意の適当なアッセイ形式で実施することができる。これらのアッセイは、免疫学的アフィニティ、又は受容体とリガンドとの相互作用、タンパク質とタンパク質との相互作用、核酸と核酸との相互作用、又は核酸とタンパク質との相互作用に基づくアフィニティをベースとしてもよい。本発明でバインダーとして使用することができるタンパク質に関する細胞受容体としては、輸送タンパク質に関する受容体（すなわち、トランスフェリン受容体）（Ｔｅｓｔａ，Ｕ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．，１９９３，４，２４１）、ホルモン／成長因子に関する受容体（すなわち、上皮成長因子、インスリン、神経成長因子）（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ，１９９０，６１２０３；Ｂａｘｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，２０００，２７８，Ｅ９６７）、及び黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン等のホルモン類に関するＧ−タンパク質結合受容体（Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇ，Ｔ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ．，１９９９，１５１１８１）などがあるが、この限りではない。細菌起源の受容体（Ｍｏｄｕｎ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１４４ １００５；Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ，Ａ．Ｂ．ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４３ １２３）及びウイルス起源の受容体（Ｂｅｌｌａ，Ｊ．ら、Ｊ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，１９９９，１２８ ６９；Ｄｏｍｉｎｇｏ，Ｅ．ら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１９９９，６２１６９）も本発明で使用することが可能である。細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）を使用して、ＥＣＭ結合性タンパク質を検出することができる（Ｎａｊｊａｍ，Ｓ．ら、Ｃｙｔｏｋｎｅ，１９９７，９ １０１３）。ＤＮＡを、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合メンバー、たとえば、転写因子（アクティベーター、レプレッサー、又はレギュレーター）として固定化することができる（ＭｃＧｏｗｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６７ ６６３Ａ）。結合相互作用の介在電気化学的検出を使用して、タンパク質とタンパク質との相互作用及び他の生物学的相互作用に及ぼす影響に有望な薬剤を評価することも可能である。したがって、本明細書に記載の技術は、様々な薬物標的と薬物との相互作用に応用することができる創薬のための多用途の結合アッセイを提供する。本明細書で使用される用語「標的タンパク質」は、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチド類、糖タンパク質フラグメント及びリポタンパク質フラグメントを含む。

１．サンドイッチ。簡単に記載すると、サンドイッチアッセイ形式の場合、手順は結合対の第１のメンバー（すなわち、抗体、受容体、又はＤＮＡ）で電極を修飾するステップと、標的タンパク質又は標的物質を含有しても含有しなくてもよいサンプルを加えるステップと、次いで第２の結合メンバーを加え、未結合の試薬を除去するために洗浄し、メディエーターを加えるステップとからなる。電気化学的反応測定を実施し、対照に比して増強されたサイクリックボルタンメトリー又はクロノアンペロメトリーシグナルは、標的タンパク質又は標的物質がサンプル中に存在することを示す。

この形式では、固相に固定化された第１のバインダー、たとえば、標的複合体を形成するための抗体、抗体フラグメント、受容体タンパク質又はＤＮＡによる捕捉、続いて、３員標的複合体を形成するための、標識された第２のバインダーにより捕捉される標的の結合により、サンプル中の標的が検出される。好ましい実施形態では、第２のバインダーは、内因性標識（すなわち、電気化学的に活性なアミノ酸）のみを含み、またサンプル中に標的が存在することは、標的複合体によって生じる電流増加から明白である。対照的に、標的を含有しないサンプルでは、複合体形成が起こらない、したがって、専ら固相固定化バインダー中の内因性標識のみによって電流が発生するため、有意に低い電流が発生する。

サンドイッチアッセイの第２の好ましい実施形態では、第１の好ましい実施形態によって発生する電流は、標的複合体上の第２のバインダーを認識して４員複合体を作る第３のバインダーの付加により増強される。これは、古典的イムノアッセイにおける二次バインダーの使用に類似している。最初の２実施形態（上記）に好ましいメディエーターは、約１．０５Ｖの電位を有するＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺又は０．６５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を有するＯｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺である。

サンドイッチアッセイ形式の第３の好ましい実施形態では、第２のバインダー又は第３のバインダーは、オリゴヌクレオチド類、タンパク質、ペプチド類、又は低い酸化還元電位（Ａｇ／ＡｇＣｌに対しておよそ＜０．６Ｖ）を有する修飾アミノ酸を含有するペプチド類等の標識で共有結合的に標識されている。これらの低電位に適合するメディエーター、たとえばＯｓ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺は、低電位標識と共に使用される。加えて、第２のバインダー又は第３のバインダーは、やはり低電位を有するある種の電子供与体化合物で標識されていてもよい。各アッセイで、第２のバインダー又は第３の各バインダーに対して、異なる予め選択された塩基が選択される多様なアッセイを実施できるように、各検体用の第２のバインダー及び第３のバインダーは、ある特定の検体に対応する予め選択された塩基によって選択することができる。

本発明では、本検出方法の上記配列ステップの代替法は、固定化された第１のバインダーに標的が結合する前に第２のバインダーの結合が起こるように、固定化された第１のバインダーに混合物を暴露する前に、サンプルを第２のバインダーと混合することである。

２．競合。競合アッセイ形式では、標的は、固定化バインダーへの結合に関して、標識された標的と競合する。たとえば、ホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ鎖は、チロシンに富むペプチド又はグアニンを含有するオリゴヌクレオチドで標識することができ、また、ｈＣＧのβ鎖に特異的なウサギ抗体に結合することが証明されている。サンプル中のｈＣＧの検出は、β鎖特異的抗体に関する、ｈＣＧと標識されたβ鎖との競合によって可能である。このシナリオでは、標的ｈＣＧが存在しなければ電気化学的シグナルが高く、固定化ｈＣＧβ鎖特異的抗体に関して、標的ｈＣＧが、標識されたβ鎖と競合すれば、電気化学的シグナルが減少する。同様の方法で、固定化バインダーに結合した標識された代理標的を、被検サンプル中に存在する標的で置き換え、結果として電気化学的シグナルを減少させることが可能である。競合形式は、薬物、ステロイド類及びビタミン類等の小分子の結合相互作用を検出するのに特に適する。

３．直接。直接標的検出アッセイでは、標識された第２のバインダーを加えないこと以外は、サンドイッチアッセイの場合と同じステップである。この場合、標的タンパク質そのものが、電気化学的に活性であるという特性を有し、標的の直接的な介在電気化学的検出を可能にするため、標識された第２のバインダーは必要ではない。このアプローチは、特に巨大タンパク質（すなわち、≧１５０ｋＤ）、たとえば、多くのアミノ酸を含有し、したがって、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ⁺²等のメディエーターとの触媒的酸化還元反応により単独でかなりの電気化学的電流を発生することができる、抗体又は他のグロブリン等に使用することができる。

４．固定化された標的物質のための競合アッセイ。この形式では、標的物質又は代理標的物質が電極表面上に固定化され、サンプル（標的物質を含んでも含まなくてもよい）及び標識されたバインダー（内因性又は外因性のいずれか）に暴露される。この技術分野、たとえば、創薬で通常に使用される通り、代理標的物質は、標識されたバインダーに対して、標的物質より低い結合親和性を有する。本発明のこの実施形態では、サンプル中に標的物質が存在しなければ、標識されたバインダーが固定化された代理標的物質に結合するため、電気化学的シグナルが高く、標識されたバインダーに関して、サンプル中に存在する標的物質が固定化代理標的物質と競合すれば、電気化学的シグナルが減少する。

５．結合相互作用アッセイ。この形式では、結合対のメンバーである第１のバインダーが電極表面上に固定化される。固定化されたバインダーは、第１のバインダーと第２のバインダーとの間の結合相互作用に及ぼす被検サンプルの影響を決定するために、被検サンプル及び結合対のメンバーである第２のバインダーに暴露される。被検サンプルは、２種のバインダーの結合を促進するか、阻害するか、又は結合に影響しない物質を含んでもよい。たとえば、被検サンプルが、２種のタンパク質が互いに結合するのを防ぐ薬物候補物質を含むこともあり、被検サンプルが、結合相互作用を増強する薬物候補物質を含むこともあり得る。したがって、結合相互作用に対して有する作用を決定するために、このアッセイ形式を使用して、潜在的な薬物化合物をスクリーニングすることができる。被検サンプルが結合相互作用に影響を及ぼす作用様式としては、バインダーの１つの結合のブロック又は増強及び結合部位の構造変化の誘導などがあるが、この限りではない。触媒を介した電気化学反応を使用して、物質の有無を検出することに意図がある上記アッセイ形式では、触媒を介した電気化学反応を使用して、結合対のメンバー間の結合相互作用に及ぼす物質の影響を検出するように、結合相互作用アッセイ形式がデザインされる。

Ｉ．電極構造及び装置。
上述の方法に従って、核酸中の予め選択された塩基を電気化学的に検出するのに有用な電極は、（ａ）上に形成された作用表面を有する導電性基材、及び（ｂ）作用表面に接続された非導電性（たとえばポリマー）層を含む。ポリマー層は、第１の結合対、第２の結合対、第３の結合対、又は第４（等々）の結合対のメンバーを（たとえば、疎水性相互作用又は任意の他の適当な結合技術によって）結合するものであり、遷移金属錯体透過性である（すなわち、遷移金属錯体が、ポリマーに結合した核酸に移動できる）。既知の技術に従って、結合対のメンバー（たとえば、プローブ又は「バインダー」）を非導電層上に固定化することが可能である。導電性基材は、半導体基材を含む金属性基材であってもよく、非金属性基材であってもよい（たとえば、金、グラッシーカーボン、インジウムドープ酸化スズ等々）。導電性基材は、一端に形成された作用表面を有する細長い形状、片面に形成された作用表面を有するフラットシート等の、任意の物理的形態をとることができる。非導電層は、ポリマー層を作用表面に固定すること、電極上でポリマー溶液を蒸発させること、又は電子重合による等の任意の適当な方法で、作用表面に接続することが可能である。代表的な非導電性材料としては、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ（ビニルピリジン）、シラン類又はポリシラン類等のポリマー、及び他の材料、たとえば、ストレプトアビジン、アビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及び抗体などがある。非導電層の厚さは重要ではないが、１００Åから１、１０、又は１００μｍまでであってもよい。上述の方法の本質的に全てにおいて、この電極を使用することが可能である。

上述の技術の利点は、超小型電子装置で実施できることである。上述の方法における核酸種の電気化学的検出に有用な超小型電子装置は、対抗する第１の面及び第２の面、第１の面上の導電性電極（上述の通りに、それに接続された非導電層がある又はない）、及び導電性電極に隣接した第１の面上、又は電極上の非導電層上に固定化されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを有する超小型電子基材含む。さらに、捕捉プローブは、そのプローブで、又はそのプローブにハイブリダイズされた標的核酸で、起きている酸化還元反応が、隣接する電極で検出されるように、隣接する電極に十分近い距離（たとえば、約０．１、１、又は２ｍｕから、約５０、１００、５００又はｌ０００ｍｕまで）をあけて配置されていてもよい。

好ましい実施形態では、超小型電子装置は、第１の対向する面上の、複数の離れた電極、及び各離れた電極の近傍に固定化された複数の離れた捕捉プローブを有する。互いに異なる複数の離れたプローブが、それぞれ関連付けられた電極を備えることにより、様々な異なるハイブリダイゼーション事象を検出することができる、１つの小型装置が提供される。装置を接続することができるか、さもなければ、本明細書に記載の方法の検出ステップ及び決定ステップを実施するために必要な電子装置と作動可能に関連させることができるように、各電極は適当な接触子に電気的に接続されている。

プローブは、既知の技術によって、超小型電子基材上の適切な位置に選択的に固定化することが可能である。たとえば、ピラング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）らに付与された米国特許第５，４０５，７８３号を参照されたい。超小型電子基材は、半導体材料（たとえば、ケイ素）であってもよく、従来の超小型電子技術を使用して加工することができる非半導体材料（たとえば、ガラス）であってもよい。電極は、金属であってもよく、多結晶ケイ素等の非金属導電性材料であってもよい。電極は、デポジションエッチング等の従来の超小型電子加工技術を使用して形成することができる。様々な適当な超小型電子構造及び製作技術は、当業者に周知である。たとえば、Ｓ．Ｍ．Ｓｚｅ，ＶＬＳＩ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８３）；Ｓ．Ｋ．Ｇｈａｎｄｈｉ，ＶＬＳＩ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（１９８３）を参照されたい。

下記の実施例は、本発明を説明するために記載されており、本発明を制限するものと解釈すべきではない。以下の実施例において、ｂｐは塩基対を意味し、ｃＤＮＡはコピーＤＮＡを意味し、μｇはマイクログラムを意味し、ＯＲＦはオープン・リーディングフレームを意味し、ｍｉｎは分を意味する。

材料及び方法
材料。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、チャペルヒル（Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）にあるノースカロライナ大学ラインバーガー・コンプレヘンシブ・キャンサー・センター（Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）のヌクレイック・アシッド・コア・ファシリティ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から購入し、さらなる精製はされていなかった。水は、ミリキュー（ＭｉｌｌｉＱ）精製システム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で生成した。緩衝調合液用試薬は、ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）又はマリンクロット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）から購入した。シーケム ＬＥ アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＬＥ ａｇａｒｏｓｅ）は、ＦＭＣ バイオプロダクツ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）から購入した。［Ｒｕ（ｂｐｙ）₃］Ｃｌ₂は、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入し、メタノールからの再結晶により精製した。［Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃］Ｃｌ₂（Ｍｅ₂ｂｐｙ＝４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）及び［Ｆｅ（ｂｐｙ）₃］Ｃｌ₂は、前述（ＤｅＳｉｍｏｎｅ ａｎｄ Ｄｒａｇｏ（１９７０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２：２３４３−２３５２；Ｍａｂｒｏｕｋ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔｏｎ（１９８６）Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２５：５２６−５３１）の通りに調製した。未修飾のｄＮＴＰは、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、７−デアザ類似体は、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）から入手した。

器具類。溶液の濃度は全て、ヒューレット・パッカード ＨＰ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ）８４５２ダイオード・アレイ分光光度計を使用して、分光光度法で決定した。使用した吸光計数は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺にはε₄₅₂＝１４６００Ｍ^-1ｃｍ^-1、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺にはε₅₂₄＝８４００Ｍ^-1ｃｍ^-1、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺にはε₄₅₈＝１７０００Ｍ^-1ｃｍ^-1であった（Ｆｏｒｄ−Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｕｔｉｎ（１９６１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３：１８３０−１８３４；Ｍａｂｒｏｕｋ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔｏｎ（１９８６）Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２５：５２６−５３１）。オリゴヌクレオチドに関する吸光計数は、ストランド濃度で核酸濃度を与える、最近傍式（nearest neighbor equation）を使用して算出した（Ｆａｓｍａｎ（１９７６）ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ））。

ポリメラーゼ連鎖反応。反応混合物各１００μｌは、鋳型１．２ｎｇ、ｄＡＴＰ／７−デアザ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ／７−デアザ−ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各２００μＭ、プライマー（上流プライマー及び下流プライマー又は上流プライマー及び中間プライマー；プライマー配列については図６．２参照）各５４００ｎＭ、ＭｇＣｌ₂ ２ｍＭ、５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、及びＴａｑポリメラーゼを含む１×緩衝液を含んでいた。ＰＣＲＳｐｒｉｎｔサーモサイクラー（ハイベイド（Ｈｙｂａｉｄ））を用いて、初期変性ステップ９４℃で３分間、続いて下記のプロフィールで４０サイクル、９４℃で１分間の変性、６３℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で４５〜６０秒間の伸張で、増幅を実施した。７２℃で５分間の最終伸張ステップを、増幅の最後に含めた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用し、製造会社の説明書に従って、ＰＣＲ産物を精製した。

制限消化。各制限酵素消化は、３〜８μｌの精製ＰＣＲ産物及び１×ＮＥＢ緩衝液４を含んでいた。反応を、１０ＵのＳｍａＩの存在下、２５℃で、又は２．５ＵのＣｌａＩ又はＮｓｐＩの存在下、３７℃で、１時間インキュベートした。結果として生じたフラグメントを、２％のアガロースゲル上、１００Ｖで１〜２時間、サイズ別に分けた。ゲルを臭化エチジウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で染色し、ＣＣＤカメラ（スペクトロライン（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ））を使用して可視化した。ΦＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡラダー（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））との比較によって、ＤＮＡフラグメントのサイズを推定した。

ＤＮＡ固定化。ＩＴＯ電極を、２−プロパノール中で１５分間超音波処理し、ＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。１００ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、ｐＨ６．８中に所望の濃度のＰＣＲ産物３μｌを含有する溶液を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２７μｌに加えた。結果として得られた溶液を電極の中心に移し、定湿度チャンバ内で１時間インキュベートした。次いで電極を、ＭｉｌｌｉＱ水で２回、１ＭのＮａＣ１で１回、及びＭｉｌｌｉＱ水で３回（各洗浄、３分）洗浄し、風乾した。

蛍光イメージ。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））及び５’−［γ−³²Ｐ］−ｄＡＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して、ＤＮＡ溶液の一部を５’−［³²Ｐ］−標識したこと以外は、ボルタンメトリー実験の場合と同様に、蛍光イメージ用ＩＴＯ電極を作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ））。ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ−５０ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎｓ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に続いてエタノール沈殿を使用して、未反応の５’−［γ−³²Ｐ］−ｄＡＴＰを、標識されたオリゴヌクレオチドから除去した。Ｇ−５０マイクロカラムにサンプルを加える前に、３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ７、３００μｌで１回洗浄し、続いて、３００μｌの水で２回洗浄することにより、酢酸ナトリウムを製造会社により供給された緩衝液と交換した。供給された緩衝液中の成分（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１５％Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ／ＩＣＰ Ｂｉｏｃｉｄｅ保存料）が固定化されたＤＮＡの量を減少させるため、このステップは重要であった。放射標識−ＤＮＡ−修飾電極を、蛍光イメージャー・スクリーン上で一晩露出し、Ｓｔｏｒｍ ８４０システム（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を使用して、走査した。電極の周りに集まった等積正方形の体積積分を実施することにより、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェア（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））で定量化を実施した。

ボルタンメトリー。０．３２ｃｍ²の幾何学面積を有するスズドープ酸化インジウム（ＩＴＯ）作用電極（デルタ・テクノロジーズ（Ｄｅｌｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｐｔワイヤー補助電極、及びＡｇ／ＡｇＣ１参照電極（サイプレス・システムズ（Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を備えた、１区画セル（Ｗｉｌｌｉｓ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ（１９９０）Ｊ；Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９４：８２４１−８２４６）を用いたＥＧ&Ｇ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７３Ａポテンシオスタット／ガルバノスタット使用して、サイクリックボルタモグラムを収集した。ＤＮＡ修飾電極のボルタモグラムは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７中、各金属錯体の２５μＭ溶液の存在下、１０Ｖ／秒で、０〜１．３Ｖまでとった。ＤＮＡを含まない、清浄なＩＴＯ電極を用いた緩衝液のみのボルタモグラムを、バックグラウンド除去に使用した。

実験結果
ポリメラーゼ連鎖反応。ペニシリン結合性タンパク質５（ＰＢＰ５）をコードするＥ．Ｃｏｌｉ ｄａｃＡ遺伝子（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｄ９０７０３）を、２組のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型として使用した。上流プライマー及び中間プライマーを用いた増幅で、３３０ｂｐのフラグメントが生じ、上流プライマー及び下流プライマーの組合せで、１２００ｂｐの生成物が生じた（図２）。この方法を使用して合成される８種のＰＣＲ産物を、表１に列挙する。ＰＣＲ産物２、４、６、及び８では、天然のグアニン及びアデニンは、７−デアザと未置換プリンが３：１の比率で、それらの７−デアザ類似体で置き換えられている（表１）。この比率は、天然のプリンを用いた場合に匹敵する収率でＰＣＲ産物を与えることが、早期の研究で証明されている（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９８６９；Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｒｏｌｉｎｇ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５５−６１）。ＰＣＲ産物３及び５の場合と同様（表１）、天然のグアニン又はアデニンの７−デアザ損傷部による完全置換は可能であったが、収率は大幅に損害を受けた。収率損失は、前報（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９８６９；Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｒｏｌｉｎｇ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５５−６１）と一致した。

７−デアザグアニン又は７−デアザアデニンが認識配列に組み込まれているとき、大部分の制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡバックボーンを切断しない（Ｇｒｉｍｅら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２７９１；Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｒｏｌｉｎｇ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５５−６１）。この加水分解からの保護は、ＤＮＡ二重鎖の修飾部位における局所立体構造の変化に起因すると仮定されてきた（Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｒｏｌｉｎｇ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５５−６１）。もう１つの可能性は、認識にはグアニン又はアデニンのＮ７との接触が重要であるため、酵素が、修飾された損傷部を含むＤＮＡに対して、低下したアフィニティを有することである（Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｒｏｌｉｎｇ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５５−６１）。７−デアザプリン部位における加水分解からの保護を、修飾された損傷部の、ＰＣＲ産物への組み込みを確認するための道具として使用することができる。

酵素ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、及びＮｓｐＩに関する制限部位のおおよその位置を、図２に図式的に示す。天然のプリン類を含有する、３３０ｂｐ及び１２００ｂｐの両ＰＣＲ産物の消化は、修飾された損傷部を含むＰＣＲ産物の消化の場合に予測されるフルサイズ生成物からゲルで分離することができる、より短いフラグメントを生じる結果となる。３種のエンドヌクレアーゼの全てが、それらの認識配列中にグアニンを有するため（図３Ａ）、７−デアザグアニンの場合に、ＤＮＡバックボーンが、全３種の酵素による切断から保護されることが予測された。他方では、アデニンはＳｍａＩの認識配列中になく（図３Ａ）、そのため、７−デアザアデニンを含むＰＣＲ産物は、このエンドヌクレアーゼによって切断されるが、ＣｌａＩ及びＮｓｐＩによる加水分解から保護されるはずである。

本研究で合成された全８種のＰＣＲ産物（表１）に制限消化を実施し、代表的な消化産物を図３Ｂ〜Ｅに示す。天然のグアニン及びアデニンを含むＰＣＲ産物１では、全３種の酵素による完全なＤＮＡ切断が見られた。（図３Ｂ）。予想通り、７−デアザグアニン含有ＰＣＲ産物２は、全３種のエンドヌクレアーゼ（図３Ｃ）による消化から保護されたが、７−デアザアデニンを含有するＰＣＲ産物４は、ＳｍａＩのみで切断された（図３Ｄ）。最後に、ＰＣＲ産物６は、両７−デアザプリンを含み、ＳｍａＩでわずかに加水分解されるに過ぎなかった（図３Ｅ）。従って、制限消化は、修飾された損傷部がＰＣＲ産物に組み込まれる、直接証拠を提供する。

ＤＮＡ固定化。リン酸バックボーンと金属酸化物との相互作用により、核酸をＩＴＯ表面に直接結合することによって、ＰＣＲ産物の固定化が達成された（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ，Ｐ．Ｍ．；Ｔｈｏｒｐ，Ｈ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，３７６４−３７７０．））。定湿度のチャンバ内で、管理された時間、インキュベーションすることにより、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８の９：１溶液からＤＮＡを沈殿させた。水及び塩による徹底的な洗浄で、表面上に強く固定化されなかった過剰なＤＮＡを除去する。オリゴヌクレオチド、及びＤＮＡポリマー中のグアニンの酸化（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ，Ｐ．Ｍ．；Ｔｈｏｒｐ，Ｈ．Ｈ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０００，７２，３７６４−３７７０）。

個々のＰＣＲ産物。ＩＴＯ表面修飾の程度を、放射標識ＰＣＲ産物に暴露された電極の蛍光イメージによって決定した。固定化された核酸の量と共に、電極表面に使用したＤＮＡの量から決定される個々のＰＣＲ産物の固定化効率を、表２にまとめる。プリンヌクレオチド組成及びＤＮＡ長さに関係なく、１時間のインキュベーションにより、２０〜３０％の固定化効率が得られた。核酸鎖は、リン酸バックボーンを介して金属酸化物表面と相互に作用するため、修飾塩基の存在は、電極修飾の程度に影響を与えないと考えられた。この結果は、固定化核酸の量を標準化する必要なしに、異なる修飾ＤＮＡ塩基の、サイクリックボルタンメトリーにおける電流増強の直接比較を可能にするため、特に重要である。

比較的短いインキュベーション時間の場合、ＤＮＡの長さは、固定化効率に影響しないようであった。より長いフラグメントは、それぞれの個別の鎖上により多くのリン酸基を有し、従って、より高いアフィニティで金属酸化物に結合するはずである。他方では、より短いフラグメントは、電極表面上のより小さい面積を占拠するため、より多数のより短いフラグメントを固定化することが可能である。明らかに、これらの２つの対立する作用は、１時間インキュベーションの間に互いに相殺され、異なるサイズのＤＮＡ分子で、類似した程度の電極修飾が生じる結果となる。

インキュベーション時間が１時間から４時間に増加すると、３３０ｂｐのＤＮＡフラグメントでは、固定化効率が２０〜３０％から５０％に上昇する結果となった（表２）。上昇は直線的ではなく、反応の時間的経過中に、固定化されたＤＮＡの量の飽和を示すこの系の速度論的研究と一致していた（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ，Ｐ．Ｍ．；Ｔｈｏｒｐ，Ｈ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，３７６４−３７７０）。より短いインキュベーション時間の場合と同様、ＰＣＲ産物のプリンヌクレオチド組成は、ＩＴＯ表面に結合される核酸の量に影響を及ぼさなかった。

ＰＣＲ産物の混合物。３３０ｂｐ及び１２００ｂｐのＰＣＲ産物をＩＴＯ表面上に共に固定化し、２成分のそれぞれによる電極修飾の程度を、蛍光イメージで決定した（表３）。同一のヌクレオチド濃度又はストランド濃度のいずれかで、２種のフラグメントの混合物に、電極を暴露した。１２００ｂｐのフラグメントは、各個別のＤＮＡ鎖上により多くのリン酸基が存在するため、３３０ｂｐのＰＣＲ産物に比して、ＩＴＯ表面に対して増強されたアフィニティを示した。電極に適用されるヌクレオチドの量が減少したとき、３３０ｂｐのＰＣＲ産物１及び４の固定化効率が低下し、３３０ｂｐ及び１２００ｂｐのフラグメントのストランド濃度が等しくなった。ＩＴＯ表面に付着したより短いフラグメントの量が減少することにより、電極表面上のより多くの結合部位が、より長いＰＣＲ産物に利用できるようになったため、同時に、ＰＣＲ産物８の固定化効率が上昇した。

ボルタンメトリー。ＰＣＲ産物に組み込まれた７−デアザプリン損傷部の電気化学的検出は、介在サイクリックボルタンメトリーで達成された。高走査速度のＤＮＡ修飾ＩＴＯ電極で、異なる酸化還元電位による金属錯体メディエーターの混合物のボルタモグラムを得た。他の文献で詳細に論じられている理由から、ＤＮＡが電極表面上に固定化され、触媒が溶液中にある場合、高走査速度は必須である（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ（２０００）インジウムスズ酸化物に吸着されたグアニンの触媒的酸化。Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，ＮＣ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）；Ａｒｍｉｓｔｅａｄ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐ（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．近刊）。

７−デアザグアニンを用いたＰＣＲ産物。グアニン（１）、３：１の７−デアザグアニン：グアニン（２）、及び７−デアザグアニン（３）を含有する、３３０ｂｐのＰＣＲ産物で修飾したＩＴＯ電極を、初期セットのボルタンメトリー研究で使用した。ＤＮＡ修飾電極を用いた、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+（Ａｇ／ＡｇＣｌに対してＥ_1/2＝０．８３Ｖ）及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+（Ａｇ／ＡｇＣｌに対してＥ_1/2＝１．０５Ｖ）の等モル混合物の代表的なボルタモグラムを、図４Ａに示す。予想通り、ＰＣＲ産物１の存在下、金属錯体によるグアニンの触媒的酸化のため、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺波で、大きい電流増強が確認された。Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピークにおける僅かな電流増強は、低い酸化還元電位を有する錯体によるグアニンの酸化に関する、緩慢な速度定数を表す。

ＰＣＲ産物２及び３中の、天然のグアニンを７−デアザ類似体で置き換えることにより、酸化波の僅かな増加を招いた。Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+は、かなりの程度まで７−デアザグアニン損傷部と反応するのに十分に強力な酸化剤であった（Ｅ_1/2＝０．７５Ｖ）（Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４１３−４２５；Ｙａｎｇ，Ｉ．Ｖ．；Ｔｈｏｒｐ，Ｈ．Ｈ．Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００１，４０，１６９０−１６９７．）。事実、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+に類似した酸化還元電位（Ｅ_1/2＝０．８６Ｖ）を有する、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+とオリゴヌクレオチドの７−デアザグアニンとの反応は、溶液中のオリゴヌクレオチドでも電極表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドでも、速かった。電極表面上に固定化されたｚＧ損傷部の数は、オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物で類似しているため、オリゴヌクレオチドに比して、固定化ＤＮＡポリマーでは７−デアザグアニンの反応性が減少していたようである。本研究における、減少した電流増強は、触媒の分解にも原因があろう。酸化された鉄の錯体は、本質的にルテニウムの錯体より安定性が低く、核酸の存在によって自己酸化過程が触媒される可能性があり、ポリアニオンへの結合は、金属の局所濃度を上昇させ、分解を促進する可能性がある。ポリマーＤＮＡの存在下で、ＲｕＯＨ²⁺錯体と、ＲｕＯ²⁺形及びＲｕＯＨ²⁺形との不均化が増強されることは、先に証明されている（Ｗｅｌｃｈら（１９９７）Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３６：８１２−４８２１）。

グアニンが７−デアザグアニンで置き換えられるとき、鉄波（iron wave）における電流の増加は、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+のピーク電流の大幅な減少を伴う。電流増強の減少は、グアニンが７−デアザ類似体で置き換えられるような、グアニン数の減少に起因する。天然のグアニンを含まないＰＣＲ産物で修飾された電極上のルテニウム波における残留電流増強は、一部のｚＧ損傷部を、ルテニウムとの反応に利用できるままにしておく、鉄と７−デアザグアニンとの不完全反応に起因する公算が高い。この結果は、多数のｚＧ塩基を含むオリゴヌクレオチドにおけるＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+との反応後の、７−デアザグアニンとＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+との残留反応性に関する我々の観察結果に似ている。

３セットの独立した実験からの、２金属錯体に関する平均ピーク電流のヒストグラムを、図４Ｂにプロットする。より多いｚＧ損傷部がＰＣＲ産物に組み込まれたとき、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波における電流増強はより顕著になったが、ＰＣＲ産物１、２、及び３に関するピーク電流は、互いに誤差範囲内であった。再現性を高めるために、天然グアニン（７）又は７５％の７−デアザグアニン（８）のいずれかを用いて、１２００ｂｐのＰＣＲ産物を合成した。全ての７−デアザ−ｄＧＴＰが存在する条件下で、鋳型ＤＮＡの１２００ｂｐ部分を増幅することは能率的であるため、全ての７−デアザグアニンを含むＰＣＲ産物は、この研究から除外した。より長いＤＮＡポリマー中に、より多数のｚＧ損傷部が存在することにより、より多い電流増強を招く可能性がある。触媒の分解に関連する問題を緩和するために、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺もＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺と置き換えた。

ＰＣＲ産物７又は８で修飾したＩＴＯ電極でとった、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の代表的なボルタモグラムを図５Ａに示し、３セットの独立した実験からの、２金属錯体に関する平均ピーク電流のヒストグラムを図５Ｂにプロットする。Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+の酸化波における電流増強の傾向は、３３０ｂｐフラグメントのものと類似していた（図４）。しかし、ＩＴＯ表面上のより高濃度の反応性ヌクレオチドのため、１２００ｂｐＰＣＲ産物で、より大きくかつより多い再現可能なピーク電流が確認された。従って、より長いＤＮＡポリマーでは、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+によって、７−デアザグアニン損傷部を再現可能に検出することができる。生物学的に関係のある配列の大部分は少なくとも１ｋｂ長であるため、より大きいＤＮＡ分子で、総体的電流及び再現性が高まることは有利である。

７−デアザアデニンを含むＰＣＲ産物。Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の等モル混合物のサイクリックボルタモグラムは、アデニン（１）、３：１ ７−デアザアデニン：アデニン（４）、及び７−デアザアデニン（５）を含む３３０ｂｐのＰＣＲフラグメントで修飾したＩＴＯ電極でとった（図６Ａ）。ＰＣＲ産物１で修飾した電極による、ルテニウムピークの電流増強は、グアニンの触媒的酸化が原因であった。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+は、グアニンのほかにも７−デアザアデニンを酸化することができるため、ｚＡ損傷部をＤＮＡポリマーに導入したとき、ルテニウム波における電流増強がより顕著になった（Ｂａｉｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００１）近刊）。Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+の酸化還元電位は、７−デアザアデニンの酸化を達成するほど十分に高くなく、鉄波における電流増強をきたさなかった。ＰＣＲ産物４に比して、ＰＣＲ産物５におけるより多数の７−デアザアデニン損傷部は、より多い電流につながらず、電流応答の飽和を示す。これは、固定化グアニンの濃度が上昇するにつれて電流が飽和する、天然のグアニンとＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+との反応に似ている（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐ（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．近刊））。

２つの因子が、Ｇ核酸塩基及びｚＡ核酸塩基の両者を含むＤＮＡ分子の反応性増強に寄与する公算が高い。１つは、反応性部位数の増加であり、これは事実上、基材濃度の上昇である。もう１つの可能性がある一因は、反応性部位間の距離の減少である。グアニンの１電子酸化により生じるラジカル・カチオンが、ＤＮＡ中で比較的短い距離を移動できることは、十分に証明されている（Ｂｉｘｔｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１７１３−１１７１６；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：８３５３−８３５８）。ＤＮＡ軸に沿った電荷移動による、反応性グアニンと７−デアザアデニン部位との間の増進した相互作用は、両損傷部を含むＤＮＡ分子で観察される、より顕著な電流増強をきたす可能性がある。

３セットの電極からの電流の、平均ピーク電流のヒストグラム（図６Ｂ）から、７−デアザアデニン損傷部は、天然のグアニン核酸塩基に起因する電流に比して、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波におけるより顕著な電流増強によって、再現可能に検出できることが明らかに分かる。電流増強はかなり大きく、また飽和に達すると考えられるため、ＩＴＯ表面に使用されるＤＮＡ量減少の影響を調査した。２１０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物１又は４で修飾したＩＴＯ電極でとったＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の代表的なボルタモグラムを図７Ａに示し、３セットの独立した実験からの、２種の金属錯体に関する平均ピークのヒストグラムを図７Ｂにプロットする。予想通り、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピークにおける電流増強は大きさが減少するが、さらに重要なことには、７−デアザアデニンを含まないＰＣＲ産物及び７５％の７−デアザアデニンを含むＰＣＲ産物は、低い基材濃度でさえも、容易に区別することができる。

７−デアザアデニン及び７−デアザグアニンを含むＰＣＲ産物。７−デアザグアニン及び７−デアザアデニンの同時検出に関する初期の研究は、天然プリンの７５％がそれらの７−デアザ類似体で置換されたＰＣＲ産物６で実施された。ＩＴＯ電極と７５０ｐｍｏｌヌクレオチドＤＮＡとの１時間のインキュベーションの結果、７−デアザアデニン及び天然のグアニンの酸化により、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波ではかなりの電流増強が確認されたが、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピークでは電流増強は確認されなかった（データ示さず）。この観察結果は、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピークにおける電流増強が小さかった（図４）、７−デアザグアニンを含む３３０ｂｐフラグメント（２及び３）に関する結果と一致していた。ｚＧ損傷部の濃度を高めるために、両７−デアザプリンを含む１２００ｂｐのＰＣＲ産物を作ろうとしたが、このフラグメントの合成は困難かつ非能率的であった。代わりに、ＰＣＲ産物６のインキュベーション時間を１時間から４時間に増加することによって、固定化された７−デアザグアニンの濃度上昇が達成された。インキュベーション時間をより長くした結果として、固定化効率が２０〜３０％から５０％に上昇し（表２）、これは、次には、より大きい電流増強につながるはずである。

ＰＣＲ産物１、４、又は６で修飾したＩＴＯ電極でとったＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムの代表的なセット、及び３つの独立した測定からの平均ピーク電流のヒストグラムを図８に示す。より長いインキュベーション時間の結果として、より顕著な電流増強が生じ、３３０ｂｐフラグメント６における７−デアザグアニン及び７デアザアデニンの同時検出が可能になった。修飾された損傷部の１つを含むＰＣＲ産物の場合と同様に、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピーク電流では、電流増強によって７−デアザグアニンの存在が検出されたが、天然のグアニンのみを含むＰＣＲ産物（１）に比して、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波では、７−デアザアデニンは、より顕著な電流増強をもたらした。これらの、グアニン及び７−デアザアデニン（ＰＣＲ産物１及び４）のより高い濃度でさえも、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピークで、Ｇ及びｚＡの残留酸化による非常に僅かなバックグラウンド電流がみられた。

ＰＣＲ産物の混合物。多数のＤＮＡ配列の同時検出は、図１Ａに図式的に示す通り、グアニン及びアデニンの７−デアザ類似体を含むＰＣＲ産物の共固定化、及び、次のＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の混合物を用いたボルタンメトリーによって達成された。７５％のｚＧ（８）を有する１２００ｂｐフラグメントを、修飾された塩基（１）を含まないか又は７５％のｚＡ（４）を含む３３０ｂｐポリヌクレオチドと共固定化した。７−デアザグアニン及び７−デアザアデニンは、それぞれ、これらの２つのＤＮＡ分子において、良好な感度及び選択性で検出され得ることが既に証明されていたため、生産物８及び４が選択された（図５、６、及び７）。ＰＣＲ産物１は、天然グアニンの酸化に起因するバックグラウンド電流のための対照として、本研究に含められた。

第１セットの実験では、同じヌクレオチド量（７５０ｐｍｏｌ）の２つのＤＮＡ配列で、ＩＴＯ表面を修飾した。これらの電極でとったＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムから、ｚＧ及びｚＡをＰＣＲ産物に組み込むことにより、２つのＤＮＡ配列の同時検出が可能になることが明らかに分かった（図９）。１２００ｂｐフラグメント８は、組み込まれた７−デアザグアニン損傷部のＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+による選択的酸化によって検出された。３３０ｂｐのＰＣＲ産物４は、天然のグアニンに加えて、組み込まれた７−デアザアデニン損傷部の酸化に起因するＲｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波によって検出された。

あるいは、１２００ｂｐフラグメントの７２０ｐｍｏｌヌクレオチド及び３３０ｂｐ ＰＣＲ産物の２００ｐｍｏｌヌクレオチドに相当する、３０ｆｍｏｌという同一ストランド量のＤＮＡ分子の混合物で電極を修飾した。蛍光イメージ試験は、ＩＴＯ表面に付着した、より長いＰＣＲ産物の量の増加を伴うより短いフラグメントでは、２つのフラグメントの相対的濃度の変化は、結果として固定化効率の低下をきたすことを示した（表３）。これらの結果を基に、より多い７−デアザグアニンが電極上に固定化されることによる、Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ^3+/2+波におけるより多い電流増強、及び減少した数の７−デアザアデニンがＩＴＯ表面上に存在することに起因する、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ^3+/2+ピーク電流の減少が予想された。図１０にプロットしたサイクリックボルタモグラム及びピーク電流のヒストグラムは、予測される傾向を示す。さらに重要なことには、２つのＤＮＡ配列は、同一ヌクレオチド濃度で、共固定化されるとき検出されるのと同様に、良好な再現性で検出され得る。

ミスマッチ検出
オリゴヌクレオチド１、そのワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補鎖２、及びミスマッチ（３、４、５）を含む相補鎖は、ＵＮＣ−ＣＨのラインバーガー・キャンサー・センター（Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のヌクレイック・アシッズ・コア・ファシリティ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から入手した。オリゴヌクレオチド１は、第１のメディエーター、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ³⁺によって酸化される、第１の予め選択された塩基、８−オキソアデニン（８ＯＡ）を含む。オリゴヌクレオチド１は、第２のメディエーター、Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ³⁺、及び第１のメディエーター、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ³⁺によって酸化される、第２の予め選択された塩基、８−オキソグアニン（８ＯＧ）も含む。

オリゴヌクレオチド１を、２回エタノール沈殿させ、全ての他のオリゴヌクレオチドを１回エタノール沈殿させてから、電気化学実験で使用した。オリゴヌクレオチドの原液の濃度は、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計を使用して、分光光度法で決定した。電気化学実験用に、９５℃に５分間加熱し、続いて２時間にわたって室温まで冷却することにより、１当量のオリゴヌクレオチド１を、１．１当量のオリゴヌクレオチド２〜５にハイブリダイズした。電気化学用に使用した溶液は、５０μＭ（ストランド）オリゴヌクレオチド１、５０μＭ Ｏｓ（ｂｐｙ）₃Ｃｌ₂及びＦｅ（ｂｐｙ）₃Ｃｌ₂、及び８００ｍＭ ＮａＣ１を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を含んでいた。２５ｍＶ／ｓの走査速度でサイクリックボルタモグラムを収集した。新たに清浄にしたＩＴＯ電極を各実験に使用した。８００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を含む初期走査を、各実験のサイクリックボルタモグラムから除去した。ＩＴＯ電極は、緩衝液中で少なくとも４サイクルにわたって調整してから、バックグラウンド・サイクリックボルタモグラムを収集した。各データ・ポイントごとに少なくとも３実験を実施した。Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェア・パッケージＤｉｇｉｓｉｍ（商標）を使用し、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ １９９５に記載の通りに、デジタル・シミュレーションを実施した。

図１１は、５０μＭのＯｓ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、５０ｍＭのＮａＰｉ中、５０μＭのＦｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、８００ｍＭのＮａＣ１を含む緩衝液（ｐＨ７）を含むオリゴヌクレオチド１のサイクリックボルタモグラムを示す。８０Ｇ（Ｏｓ（ｂｐｙ）₃ ³⁺による）及び８０Ａ（Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ³⁺による）の酸化に関する速度定数を図１２に示す。図に示す通り、シングルストランドの各塩基で大きい速度定数が確認される。８０ＧがＣと対合しているとき、速度定数は最低である。８０ＧがＡにハイブリダイズしているとき、速度定数は、Ｃの速度定数とシングルストランドの速度定数の間で確認される。同様に、８０ＡがＴと対合しているとき、最低の速度定数が確認され、８０ＡがＧと対合しているとき、より高い電流が確認される。ミスマッチに対する速度定数の感度は、他の予め選択された塩基が一致しているか又はミスマッチであるかに左右されない。

前述の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明は、特許請求の範囲及び中に含まれるべき均等物によって説明される。

多数のＤＮＡ配列を同時検出するための方法を示す図である。当該遺伝子を、修飾された塩基の存在下で増幅する。結果として得られるＰＣＲ産物をＩＴＯ表面上に体積させ、修飾された塩基の酸化還元電位に匹敵する酸化還元電位を有する金属錯体のボルタンメトリーによって検出する。 ７−デアザアデニン及び７−デアザグアニンの構造を示す図である。 鋳型としてＥ．ｃｏｌｉ ｄａｃＡ遺伝子を使用して、３３０塩基対及び１２００塩基の対ＰＣＲ産物を作成するために使用される方法の概略図である。プライマー配列：ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＣＧＣ ＴＣ（上流プライマー；塩基対２４２〜２６４）、ＣＧＧ ＧＴＴ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＣＡ Ｔ（中間プライマー；塩基対５５４〜５７２）、及びＴＴＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＣＡ ＴＴ（下流プライマー；塩基対１４３０〜１４５５）。ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、及びＮｓｐＩ制限部位のおおよその位置も示す。 制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ、ＣｌａＩ、及びＮｓｐＩの認識配列を示す図である。 ＰＣＲ産物１の制限消化を示す図である。レーン１は、ΦＸ １７４／ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡラダーであり、レーン２は、制限酵素なしであり、レーン３は、ＳｍａＩであり、レーン４は、ＣｌａＩであり、レーン５は、ＮｓｐＩである。 ＰＣＲ産物２の制限消化を示す図である。レーン１は、ΦＸ １７４／ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡラダーであり、レーン２は、制限酵素なしであり、レーン３は、ＳｍａＩであり、レーン４は、ＣｌａＩであり、レーン５は、ＮｓｐＩである。 ＰＣＲ産物３の制限消化を示す図である。レーン１は、ΦＸ １７４／ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡラダーであり、レーン２は、制限酵素なしであり、レーン３は、ＳｍａＩであり、レーン４は、ＣｌａＩであり、レーン５は、ＮｓｐＩである。 ＰＣＲ産物４の制限消化を示す図である。レーン１は、ΦＸ １７４／ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡラダーであり、レーン２は、制限酵素なしであり、レーン３は、ＳｍａＩであり、レーン４は、ＣｌａＩであり、レーン５は、ＮｓｐＩである。 ５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒で収集した、未修飾のＩＴＯ電極及びＤＮＡ修飾ＩＴＯ電極による、２５μＭ Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。ＩＴＯ表面は、７５０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物１、２、又は３（標準名称については表１参照）で修飾されていた。 ３つの独立した実験からの、２種の金属錯体に関する平均ピーク電流のヒストグラムである。エラーバーは、１標準偏差を示す。 ＤＮＡなし、又は７５０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物７又は８（標準名称については表１参照）で修飾されたＩＴＯ電極による、２５μＭ Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。ボルタモグラムは、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒でとった。 ３つの独立した実験で決定された２つの金属錯体に関する平均ピーク電流と１標準偏差のヒストグラムを示す図である。 ５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒で収集した、未修飾のＩＴＯ電極及びＤＮＡ修飾ＩＴＯ電極による、２５μＭ Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。ＩＴＯ表面は、７５０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物１、４、又は５（標準名称については表１参照）で修飾されていた。 ３つの独立した実験からの、２つの金属錯体に関する平均ピーク電流のヒストグラムを示す図である。エラーバーは、１標準偏差を示す。 ＤＮＡなし、又は２１０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物１、又は４（標準名称については表１参照）で修飾されたＩＴＯ電極による、２５μＭ Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。ボルタモグラムは、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒でとった。 ３つの独立した実験で決定された２つの金属錯体に関する、平均ピーク電流と１標準偏差のヒストグラムを示す図である。 ５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒で収集した、未修飾のＩＴＯ電極及び修飾されたＩＴＯ電極による、２５μＭ Ｒｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。電極を、７５０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物１、４、又は６（標準名称については表１参照）と共に４時間インキュベートした。 ３つの独立した実験で決定された２つの金属錯体に関する平均ピーク電流と１標準偏差のヒストグラムを示す図である。 ＤＮＡなし、又はＰＣＲ産物の混合物で修飾されたＩＴＯ電極による、２５μＭＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺のサイクリックボルタモグラムを示す図である。ＰＣＲ産物８を、同ヌクレオチド量（７５０ｐｍｏｌ）のＰＣＲ産物１又は４と共に共固定化した（ＰＣＲ産物標準名称については、表１参照）。ボルタモグラムは、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒でとった。 ３セットの電極で決定された２つの金属錯体に関する平均ピーク電流と１標準偏差のヒストグラムを示す図である。 ＤＮＡなし、又はＰＣＲ産物の混合物で修飾されたＩＴＯ電極による、２５μＭＲｕ（Ｍｅ₂ｂｐｙ）₃ ²⁺及びＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺の代表的なサイクリックボルタモグラムを示す図である。ＰＣＲ産物８を、同ストランド量（３０ｆｍｏｌ）のＰＣＲ産物１又は４と共に共固定化した（ＰＣＲ産物標準名称については、表１参照）。ボルタモグラムは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中、１０Ｖ／秒でとった。 ３つの独立した実験で決定された２つの金属錯体に関する平均ピーク電流と１標準偏差のヒストグラムを示す図である。 点線は金属錯体のみの場合である。破線は、シングルストランド１の場合である。実線は、その厳密な相補鎖２にハイブリダイズした１の場合である。大きい破線は、８−オキソ−アデニン又は８−オキソ−グアニンに１つ又は２つのミスマッチの塩基を含む、オリゴヌクレオチド３〜５にハイブリダイズした１の場合である。全てのサイクリックボルタモグラムは全て、２５ｍＶ／秒で収集した。 相補鎖における塩基対形成の関数として、１における８−オキソ−アデニン又は８−オキソ−グアニンの酸化の二次速度定数を示す図である。黒色のバーは、８０Ｇに関し、灰色のバーは、８０Ａに関する。速度定数は、前述の通り、デジタル・シミュレーションで決定した。エラーバーは、３つの独立した実験から決定された標準偏差である。

Claims (49)

1. （ａ）導電性の酸化還元反応検出電極を提供するステップと、
   （ｂ）第１の標的分子及び第２の標的分子を含むと考えられるサンプルを、前記第１の標的分子及び第２の標的分子が前記検出電極上に付着する条件で、前記検出電極に接触させるステップであって、前記第１の標的分子が第１の予め選択された標識を含み、前記第２の標的分子が第２の予め選択された標識を含み、前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識が異なるステップと、
   （ｃ）前記電極に、（ｉ）前記第１の遷移金属錯体と前記第１の予め選択された標識との間に、第１の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、前記第１の予め選択された標識を酸化する第１の遷移金属錯体と、（ｉｉ）前記第２の遷移金属錯体と前記第２の予め選択された標識との間に、第２の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識を酸化する第２の遷移金属錯体とを、同時に接触させるステップであって、これらの予め選択された標識から、対応する遷移金属錯体への電子移動があり、その結果、触媒回路の一部として、対応する遷移金属錯体の還元形が再生し、第１の酸化還元反応と第２の酸化還元反応が検出可能な異なるシグナルを生じさせるステップと、
   （ｄ）前記第１の酸化還元反応を検出することにより、前記第１の標的分子の存在を検出するステップと、
   （ｅ）前記第２の酸化還元反応を検出することにより、前記第２の標的分子の存在を検出するステップと
   を含む、２つの異なる標的分子を１つの共通電極で検出する方法。
2. 前記サンプルが第３の標的分子を含むと考えられ、前記第３の標的分子が、前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識と異なる第３の予め選択された標識を含み、
   前記接触させるステップ（ｃ）が、前記電極に、（ｉｉｉ）第３の遷移金属錯体と第３の予め選択された標識との間に、第３の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、前記第１、第２及び第３の予め選択された標識を酸化する第３の遷移金属錯体を接触させることをさらに含み、前記第１、第２及び第３の酸化還元反応が異なる検出可能なシグナルを生じさせ、
   （ｆ）前記第３の酸化還元反応を検出することによって、前記第３の標的分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルが第４の標的分子を含むと考えられ、前記第４の標的分子が、前記第１、第２、及び第３の予め選択された標識と異なる第４の予め選択された標識を含み、
   前記接触させるステップ（ｃ）が、前記電極に、（ｉｖ）第４の遷移金属錯体と第４の予め選択された標識との間に、第４の酸化還元反応を引き起こすための酸化還元反応で、前記第１、第２、第３及び第４の予め選択された標識を酸化する第４の遷移金属錯体を接触させることをさらに含み、前記第１、第２、第３及び第４の酸化還元反応が異なる検出可能なシグナルを生じさせ、
   （ｇ）前記第４の酸化還元反応を検出することによって、前記第４の標的分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記接触させるステップ（ｂ）が沈殿により実施される、請求項１に記載の方法。
5. 前記接触させるステップ（ｂ）がアフィニティ結合により実施される、請求項１に記載の方法。
6. 前記遷移金属錯体が、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｆｅ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｏｓ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、及びＲｅＯ₂（ｐｙ）₄ ¹⁺からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識が、アデニン、グアニン、及びそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識が、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、６−メルカプトグアニン、８−オキソグアニン、イソグアニン、７−デアザグアニン、１ヒドロキシイソグアニン、及び８ブロモグアニンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記電極が超小型電子基材により支持される、請求項１に記載の方法。
10. 前記電極がインジウムスズ酸化物を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記標的分子のそれぞれが核酸である、請求項１に記載の方法。
12. 前記核酸のそれぞれを増幅するステップが前記接触させるステップ（ｂ）に先行する、請求項１１に記載の方法。
13. ポリメラーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅、リガーゼ連鎖反応、及び核酸配列に基づく増幅からなる群より選択される増幅反応により前記核酸のそれぞれを増幅するステップが、前記接触させるステップ（ｂ）に先行する、請求項１１に記載の方法。
14. 前記標的分子が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
15. 前記標的分子がタンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の方法。
16. 前記標的分子の一方が核酸であり、前記標的分子の他方がタンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の方法。
17. 前記検出ステップが多段階のクロノアンペロメトリーにより実施される、請求項１に記載の方法。
18. 前記接触させるステップがサンドイッチアッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
19. 前記接触させるステップが競合アッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
20. ．
    前記接触させるステップが直接アッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
21. 前記接触させるステップが固定化された標的物質に関する競合アッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
22. 前記接触させるステップが結合相互作用アッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
23. 少なくとも２種の異なる結合対の、少なくとも２つの異なるメンバーの電気化学的検出に有用な超小型電子装置であって、
    超小型電子基材と、
    前記基材上の導電性の酸化還元検出電極と、
    非導電層上に固定化された第１の特異的結合対の第１のメンバーであって、サンプル中に存在する第１の特異的結合対の第１のメンバーが第２のメンバーと結合し、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、前記第１の結合対の前記第１のメンバーが前記検出電極に隣接している前記第１の特異的結合対の前記第１のメンバーと、
    サンプル中に存在する第２の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、検出電極に隣接している前記第２の結合対の前記第１のメンバーと
    を含み、
    前記第１の結合対の前記第１のメンバーと前記第２の結合対の前記第１のメンバーが異なる装置。
24. サンプル中に存在する第３の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第３の特異的結合対の第１のメンバーであって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、前記検出電極に隣接している前記第３の結合対の前記第１のメンバーをさらに含み、
    前記第１の結合対の前記第１のメンバー、前記第２の結合対の前記第１のメンバー、及び前記第３の結合対の前記第１のメンバーが異なる、請求項２３に記載の装置。
25. 前記第１の結合対の前記第１のメンバー及び前記第２の結合対の前記第１のメンバーがオリゴヌクレオチドである、請求項２３に記載の装置。
26. 前記第１の結合対の前記第１のメンバー及び前記第２の結合対の前記第１のメンバーがペプチド又はタンパク質である、請求項２３に記載の装置。
27. 前記第１の結合対の前記第１のメンバーがオリゴヌクレオチドであり、
    前記第２の結合対の前記第１のメンバーがタンパク質又はペプチドである、請求項２３に記載の装置。
28. 前記超小型電子基材が、前記導電性の酸化還元検出電極と、前記第１の結合対及び第２の結合対の前記固定化された第１のメンバーとを含むサンプル容器を含む、請求項２３に記載の装置。
29. 前記超小型電子基材が、複数の導電性の酸化還元検出電極と、前記第１の結合対及び第２の結合対の複数の固定化された第１のメンバーとを含む前記サンプル容器を含む、請求項２８に記載の装置。
30. 導電性金属を含む導電性参照電極をさらに含む、請求項２９に記載の装置。
31. 導電性金属を含む導電性補助電極をさらに含む、請求項２９に記載の装置。
32. 各導電性酸化還元検出電極からの電気的接続により、前記酸化還元反応が検出可能である、請求項２９に記載の装置。
33. 前記基材がケイ素である、請求項２３に記載の装置。
34. 前記基材がガラスである、請求項２３に記載の装置。
35. 酸化還元反応検出器をさらに含む、請求項２３に記載の装置。
36. 少なくとも２つの異なるハイブリダイゼーション事象を共通電極により検出する方法であって、
    （ａ）超小型電子基材と、
    前記基材上の導電性酸化還元検出電極と、
    サンプル中に存在する前記第１の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第１の特異的結合対の第１のメンバーであって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、前記検出電極に隣接している前記第１の結合対の前記第１のメンバーと、
    サンプル中に存在する第２の特異的結合対の第２のメンバーと結合する非導電層上に固定化された第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、検出電極に電位を印加したとき起こる酸化還元反応が検出可能であるように、前記検出電極に隣接している前記第２の結合対の前記第１のメンバーと、
    を含む装置であって、
    前記第１の結合対の前記第１のメンバー及び前記第２の結合対の前記第１のメンバーが異なり、
    前記第１の結合対の前記第２のメンバーが第１の予め選択された標識を含み、及び前記第２の結合対の前記第２のメンバーが第２の予め選択された標識を含み、
    前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識が異なる装置を提供するステップと、
    （ｂ）前記第１の結合対の前記第２のメンバー及び前記第２の結合対の前記第２のメンバーを含むと考えられるサンプルを接触させるステップと、
    （ｃ）前記基材に、（ｉ）第１の遷移金属錯体と第１の予め選択された標識との間に、第１の酸化還元反応を引き起こす条件で、酸化還元反応において、前記第１の予め選択された標識を酸化する第１の遷移金属錯体と、（ｉｉ）前記第２の遷移金属触媒と第２の予め選択された標識の間に、第２の酸化還元反応を引き起こす条件で、酸化還元反応において、前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識を酸化する、第２の遷移金属錯体とを同時に接触させるステップであって、これらの予め選択された標識から遷移金属錯体への電子移動があり、その結果、触媒回路の一部として、対応する遷移金属錯体の還元形が再生し、前記第１の酸化還元反応と第２の酸化還元反応とが異なる検出可能なシグナルを生じ、
    （ｄ）前記第１の酸化還元反応の検出から、前記第１の結合対の前記第２のメンバーの存在を検出するステップと、
    （ｅ）前記第２の酸化還元反応の検出から、前記第２の結合対の前記第２のメンバーの存在を検出するステップと
    を含む方法。
37. 前記遷移金属錯体が、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｒｕ（Ｍｅ₂−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｆｅ（ｂｐｙ）₃ ²⁺、Ｆｅ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、Ｏｓ（５−Ｃｌ−ｐｈｅｎ）₃ ²⁺、及びＲｅＯ₂（ｐｙ）₄ ¹⁺からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記第１の予め選択された標識及び第２の予め選択された標識が、アデニン、グアニン、及び６−メルカプトグアニンからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
39. 前記第１の結合対の前記第２のメンバー及び前記第２の結合対の前記第２のメンバーが、タンパク質又はペプチドである、請求項３６に記載の方法。
40. 前記第１の結合対の前記第２のメンバー及び前記第２の結合対の前記第２のメンバーがオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
41. 前記第１の結合対の前記第２のメンバーがタンパク質又はペプチドであり、前記第２の結合対の前記第２のメンバーがオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
42. 前記第１の結合対の前記第２のメンバー及び前記第２の結合対の前記第２のメンバーの少なくとも１つがＤＮＡである、請求項３６に記載の方法。
43. 前記接触させるステップの前に前記ＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ＤＮＡサンプルを増幅する前記ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅、リガーゼ連鎖反応、又は核酸配列に基づく増幅により実施される、請求項４３に記載の方法。
45. 前記接触させるステップがサンドイッチアッセイにより実施される、請求項３６に記載の方法。
46. 前記接触させるステップが競合アッセイにより実施される、請求項３６に記載の方法。
47. 前記接触させるステップが直接アッセイにより実施される、請求項３６に記載の方法。
48. 前記接触させるステップが固定化標的物質に関する競合アッセイにより実施される、請求項３６に記載の方法。
49. 前記接触させるステップが結合相互作用アッセイにより実施される、請求項３６に記載の方法。
    

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