WO2023054231A1 - 電気化学測定用混合試薬 - Google Patents

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WO2023054231A1
WO2023054231A1 PCT/JP2022/035600 JP2022035600W WO2023054231A1 WO 2023054231 A1 WO2023054231 A1 WO 2023054231A1 JP 2022035600 W JP2022035600 W JP 2022035600W WO 2023054231 A1 WO2023054231 A1 WO 2023054231A1
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WO
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reagent
mixed
reagents
signal
electrochemical measurement
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/035600
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English (en)
French (fr)
Inventor
宇内 光安
達也 北原
Original Assignee
日東電工株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage

Definitions

  • the present invention relates to a mixed reagent for electrochemical measurements.
  • Electrochemical methods, etc. are used to detect samples such as multiple types of metals and microorganisms contained in solutions such as rivers, groundwater, water supply and sewage.
  • a method of detecting a specimen contained in a liquid sample using an electrochemical measurement method there is a method of using a reagent that reacts with the specimen.
  • an electrode holding dithizone is brought into contact with a sample solution containing copper ions, and dithizone and copper ions are mixed. After the complex is formed, dithizone is oxidized by applying a predetermined voltage to the electrodes, and the current generated between the electrodes due to the oxidation of dithizone is detected to selectively detect and quantify copper ions.
  • Chemical analysis methods have been proposed (see, for example, Cited Document 1).
  • the electrochemical analysis method described in Patent Document 1 has the problem that only copper ions can be detected, and multiple kinds of metal ions such as heavy metal ions contained in the sample solution cannot be detected at the same time.
  • the electrochemical analysis method described in Patent Document 1 requires time for copper ions and dithizone to react to form a complex, so there is a problem that metal ions cannot be easily detected in a short time. there were.
  • One aspect of the present invention is an electrochemical method that can detect multiple types of specimens easily and simultaneously in a short time even if the liquid sample contains multiple types of specimens in the inspection of a liquid sample using an electrochemical measurement method.
  • An object of the present invention is to provide a mixed reagent for measurement.
  • One aspect of the mixed reagent for electrochemical measurements according to the present invention includes a plurality of types of reagents having different oxidation-reduction potentials, and the oxidation-reduction potential difference between one reagent and the other reagent is 0.2 V or more. be.
  • One aspect of the mixed reagent for electrochemical measurement according to the present invention is a liquid sample test using an electrochemical measurement method, in which a plurality of types of specimens are easily detected even if the liquid sample contains a plurality of types of specimens. They can be detected simultaneously in a short time.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of oxidation-reduction potential;
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing an oxidation-reduction potential difference;
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of classification of reagents;
  • 1 is a diagram showing electrochemical measurement results of a mixed reagent of Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing electrochemical measurement results of the mixed reagent of Comparative Example 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing electrochemical measurement results of the mixed reagent of Example 2-1 and the reagents contained in the mixed reagent;
  • FIG. 10 is a diagram showing electrochemical measurement results of the mixed reagent of Example 2-2 and the reagents contained in the mixed reagent;
  • FIG. 10 is a diagram showing electrochemical measurement results of a mixed reagent of Example 2-3 and a reagent contained in the mixed reagent;
  • FIG. 10 is a diagram showing electrochemical measurement results of a mixed reagent of Comparative Example 2-1 and a reagent contained in the mixed reagent;
  • FIG. 10 is a diagram showing electrochemical measurement results of a mixed reagent of Comparative Example 2-2 and a reagent contained in the mixed reagent;
  • FIG. 10 shows electrochemical measurement results of the mixed reagent of Example 2-4 after 10 minutes and 60 minutes.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-1 and the current value when detecting Cu 2+ ;
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-1 and the current value when detecting Cu 2+ ;
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Cu 2+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R01.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Cu 2+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R04.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-1 and the current value when Fe 3+ is detected.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Fe 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R02.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Fe 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R04.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value in Example 3-2; FIG.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-2 and the current value when Fe 3+ is detected.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-2 and the current value when Escherichia coli bacteria are detected.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-2 and the current value when detecting Fe 3+ and Escherichia coli.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value in Example 3-3;
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-3 and the current value when detecting Cu 2+ ;
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-3 and the current value when Fe 3+ is detected.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-3 and the current value when both Fe 3+ and Cu 2+ are detected.
  • FIG. 4 is a diagram showing a mixed reagent and the relationship between the potential and current value of the reagent contained in the mixed reagent.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Al 3+ ;
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Cd 2+ ;
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Al 3+ and Cd 2+ .
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Al 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R06.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Cd 2+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R06.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Al 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R010.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the Cd 2+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R010.
  • the mixed reagent according to this embodiment contains a plurality of types of reagents with different oxidation-reduction potentials, and the oxidation-reduction potential difference between one reagent and the other reagent is 0.2 V or more.
  • the mixed reagent according to the present embodiment contains a plurality of reagents having an oxidation-reduction potential difference of 0.2 V or more. It can be specified with high accuracy. By using the mixed reagent according to the present embodiment, it is possible to easily and simultaneously detect multiple types of specimens having oxidation-reduction potentials at substantially the same positions as those of multiple types of reagents in a short time.
  • the oxidation-reduction potential is the oxidation-reduction peak current of square wave voltammetry (SWV) obtained when the reaction between an electrode and a reagent is measured by changing the potential, as shown in FIG. value (peak potential). Since the maximum value of the redox peak current value increases in proportion to the concentration of the reagent, the content of the reagent may be appropriately adjusted so that the maximum value of the peak current can be easily identified.
  • SWV square wave voltammetry
  • a small amount of the mixed reagent according to the present embodiment and the electrolyte are put into the cell for electrochemical measurement.
  • a predetermined amount e.g., 25 mL
  • a reagent-containing solution containing a mixed reagent and an electrolyte is placed in a cell for electrochemical measurement, and with a potentiostat connected to the electrode, the reagent-containing solution is brought into contact with the electrode for electrochemical measurement.
  • Electrochemical measurements measure the reaction between an electrode and a mixed reagent in a reagent-containing solution by varying the potential. Thereby, multiple types of reagents contained in the mixed reagent are detected.
  • the liquid temperature of the reagent-containing solution may be appropriately adjusted to an arbitrary temperature (eg, 25°C).
  • the electrodes are not particularly limited, and common electrodes used in electrochemical measurements can be used.
  • electrodes with screen-printed working, counter and reference electrodes, diamond electrodes, and the like can be used.
  • electrochemical measurements can be performed by dropping a reagent-containing solution onto the three electrodes with a potentiostat connected to the screen-printed working, counter, and reference electrodes. good.
  • an electrode made of carbon may be used as the working electrode
  • a Pt electrode may be used as the counter electrode
  • an electrode made of Ag/AgCl may be used as the reference electrode.
  • electrochemical measurement can be performed by dropping a reagent-containing solution onto the diamond electrode while a potentiostat is connected to the electrode.
  • the potentiostat is also not particularly limited, and a potentiostat commonly used in electrochemical measurements may be used. Control of the potential is not particularly limited, and may be performed by controlling a potentiostat with software.
  • a measurement method a general method in electrochemical measurement can be used, but it is preferable to use SWV, which can easily identify the oxidation-reduction peak current value.
  • the redox potential difference refers to the potential difference between the redox potential of one reagent and the redox potential of another reagent.
  • the specimen refers to metal ions such as heavy metal ions, microorganisms, and the like.
  • Heavy metal ions include Fe 3+ , Cu 2+ and the like.
  • Escherichia coli, lactic acid bacteria, and the like can be used as microorganisms.
  • a liquid sample may contain multiple different types of metal ions, microorganisms, or the like. That is, a plurality of different types of metal ions may be contained, a plurality of different types of microorganisms may be contained, or a plurality of different types of metal ions and microorganisms may be contained.
  • the oxidation-reduction potential difference is 0.2 V or more, and is more preferably 0.25 V or more, more preferably 0.30 V or more, because the position of the oxidation-reduction potential of each reagent can be easily distinguished while having a wide range of reagent selection. More preferred.
  • any component can be used as the reagent as long as it is a component used for detecting the sample, and any component can be used as appropriate according to the type of sample.
  • reagents for example, the reagents shown in Tables 1 and 2 below can be used. Tables 1 and 2 show the peak potential of each reagent. The peak potential of each reagent may vary slightly depending on the measurement conditions such as the concentration of the reagent, the concentration of the mixed reagent, the temperature, the type of electrode, and the like. The peak potential of each reagent shown in Tables 1 and 2 is the SWV result when 0.5 mM of each reagent is dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer of pH 7 and carbon paste screen-printed electrodes are used.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of classification of reagents.
  • the reagents are a first reagent with a peak potential of less than -0.4 V, a second reagent with a peak potential of -0.4 V or more and less than 0.4 V, and a peak potential of 0 It can be classified into a third reagent with a peak potential of 0.4 V or more and less than 0.6 V, a fourth reagent with a peak potential of 0.6 V or more and less than 1.2 V, and a fifth reagent with a peak potential of 1.2 V or more.
  • the form of the reagent can be adjusted as appropriate, and may be solid such as powder or liquid.
  • the mixed reagent according to the present embodiment may contain a plurality of reagents mixed in a state such as powder, may contain a plurality of reagents in a liquid state, or may contain a reagent in a state such as a solid. , and a reagent in a liquid state.
  • the mixed reagent according to the present embodiment may be in any suitable form according to the forms of the plurality of reagents.
  • the mixed reagent according to the present embodiment may be in a state in which a solution obtained by dissolving the plurality of reagents in a solvent is encapsulated in a capsule or the like.
  • a solution in which each reagent is dissolved in a solvent may be enclosed in a capsule for each reagent, and a plurality of capsules may be mixed together.
  • the capsule may be dissolved or broken during use so that the reagents can come into contact with the specimen.
  • a plurality of types of reagents may have the same oxidation-reduction potential as when each reagent is in a single state while suppressing interaction.
  • the single state means a state in which the mixed reagent contains only one reagent.
  • the interaction between multiple types of reagents should be suppressed when these reagents are mixed or after a predetermined time has passed since mixing.
  • the absolute value of the first signal change rate (
  • the first signal of one reagent obtained when electrochemically measuring 10 minutes after mixing a plurality of types of reagents is used as a reference, and electrochemically measuring 60 minutes after mixing a plurality of types of reagents.
  • the value obtained by multiplying the value obtained by subtracting the ratio of the second signal of one reagent to the first signal (second signal / first signal) from 1 and multiplying it by 100 ((1-(second signal / first 1 signal)) ⁇ 100) is defined as the second signal change rate.
  • the absolute value of the second signal change rate (
  • At least one of the multiple types of reagents reacts with the specimen to change the oxidation-reduction current value obtained in the electrochemical measurement.
  • a redox current value generated when one reagent interacts with a sample is proportional to the amount of the sample. Therefore, the specimen can be quantified from the amount of change in the oxidation-reduction current value that occurs when at least one reagent among the plurality of reagents reacts with the specimen.
  • At least one of the multiple reagents preferably acts specifically with the specimen to change the oxidation-reduction current value obtained when electrochemically measured.
  • a peak potential obtained when one sample is electrochemically measured has a specific peak potential for each sample. If one reagent specifically acts on a specific sample, the peak potential of the one reagent changes, so the type of sample can be specified.
  • a detection method for detecting multiple types of specimens contained in a liquid sample using the mixed reagent according to this embodiment will be described.
  • a small amount of the mixed reagent according to the present embodiment is placed in a cell for electrochemical measurement.
  • a predetermined amount for example, 25 mL
  • the liquid sample containing the mixed reagent is placed in a cell for electrochemical measurement, and the liquid temperature is adjusted to 25°C.
  • the potentiostat connected to the electrodes the liquid sample containing the mixed reagent is brought into contact with the electrodes for electrochemical measurement.
  • Electrochemical measurements measure the reaction between an electrode and a mixed reagent in a liquid sample by varying the potential. This makes it possible to detect specimens having peaks at substantially the same positions as those of the respective mixed reagents.
  • the maximum value of the peak current increases or decreases in proportion to the concentration of the specimen, it is also possible to measure the concentration of the specimen.
  • a liquid sample containing a mixed reagent may be dropped onto the electrode for electrochemical measurement, or the electrode may be placed in a potentiostat while the tip of the electrode is immersed in the liquid sample. may be connected to perform electrochemical measurements.
  • the liquid sample may be subjected to a centrifugal separator or the like to concentrate or separate the mixed reagent and the specimen in the liquid sample.
  • the mixed reagent according to the present embodiment contains a plurality of types of reagents with different oxidation-reduction potentials, and uses reagents that have an oxidation-reduction potential difference of 0.2 V or more between one reagent and another reagent. As a result, even if the current-potential curve peaks such as the SWV of each of the multiple reagents contained in the mixed reagent partially overlap, the positions of the redox potentials of the respective reagents can be identified. Therefore, the mixed reagent according to the present embodiment can detect multiple types of specimens contained in a liquid sample when detecting multiple types of specimens contained in a liquid sample using an electrochemical measurement method. can be detected simultaneously.
  • the mixed reagent according to the present embodiment for example, when the specimen is a metal ion, the metal ion can be detected in about 10 minutes, and when the specimen is a microorganism, the microorganism can be detected in about 30 minutes. can. Therefore, the mixed reagent according to the present embodiment can detect a plurality of specimens contained in a liquid sample in a short time, so that the time required for detection can be shortened. Therefore, the mixed reagent according to the present embodiment can detect multiple types of specimens contained in a liquid sample in a short period of time.
  • the mixed reagent according to the present embodiment does not require a process or the like for concentrating the liquid sample, it is possible to reduce stirring equipment for stirring the liquid sample containing the specimen. Therefore, by using the mixed reagent according to the present embodiment, it is possible to reduce the equipment load and work load required for detection, so that multiple types of specimens contained in a liquid sample can be detected easily and in a short time. .
  • the mixed reagent according to the present embodiment even if a liquid sample contains a plurality of types of specimens, it is possible to easily detect a plurality of types of specimens in a short time in the examination of a liquid sample using an electrochemical measurement method. can be detected at the same time.
  • the absolute value of the first signal change rate (
  • one reagent can be prevented from being affected by other different reagents, for example, for at least 10 minutes, so that one reagent can maintain an electrochemical signal substantially equivalent to that in a single state. Therefore, even if multiple types of reagents are mixed, the electrochemical signal of one reagent can be stably maintained. Therefore, if the mixed reagent according to the present embodiment is used, even if the liquid sample contains a plurality of types of specimens in the test of the liquid sample, the detection accuracy of the plurality of types of specimens contained in the liquid sample decreases. can be suppressed.
  • the absolute value of the second signal change rate can be 20% or less.
  • one reagent can be prevented from being affected by other different reagents for a long period of time, for example, one hour or more. can maintain almost the same electrochemical signal as Therefore, even when a plurality of types of reagents are mixed for 10 minutes or longer, the state in which the plurality of reagents are inhibited from interacting with each other can be stably maintained for a longer period of time. Therefore, by using the mixed reagent according to the present embodiment, it is possible to suppress the decrease in detection accuracy of multiple types of specimens contained in the liquid sample over a longer period of time.
  • the mixed reagent according to the present embodiment can change the oxidation-reduction current value obtained in electrochemical measurement by causing at least one reagent among a plurality of reagents to act on the sample. Since at least one reagent among a plurality of reagents reacts with the sample to change the electrochemical signal, the sample can be easily quantified from the magnitude of the change in the current value of the electrochemical signal. Therefore, the mixed reagent according to the present embodiment can simultaneously detect and quantify a plurality of types of specimens from the amount of change in the oxidation-reduction current value.
  • the mixed reagent according to the present embodiment can change the oxidation-reduction current value obtained in electrochemical measurement by causing at least one reagent among a plurality of types of reagents to specifically act on the specimen. .
  • the electrochemical signal changes, so the specific specimen can be easily identified by the change in the current value of the electrochemical signal. can. Therefore, the mixed reagent according to the present embodiment can simultaneously detect and identify multiple types of specimens from changes in the oxidation-reduction current value.
  • the mixed reagent according to the present embodiment can obtain the amount of change in the oxidation-reduction current value by specifically acting a plurality of types of reagents on the specimen, so that detection and identification of a plurality of types of specimens can be obtained. and quantification can be performed simultaneously.
  • the mixed reagent according to the present embodiment has the properties as described above. It can be effectively used for inspection of metal ions and microorganisms contained in.
  • Example 1 (Preparation of mixed reagent) Of the reagents shown in Table 3 above, 4 kinds of reagents (reagent R01, reagent R02, reagent R03, and reagent R04) were placed in an electrochemical measurement cell at 0.5 mM each and mixed to prepare a mixed reagent.
  • Electrochemical measurement The electrochemical measurement of the reagent was performed using a configuration in which a 910PSTAT mini (potentiostat) manufactured by Metrohm was connected to screen-printed electrodes DRP150 manufactured by the same manufacturer (one measurement per sheet). For control, PSTAT Software attached to the potentiostat was installed in a PC, and electrochemical measurement was performed in Square Wave Voltage (SWV) mode as a measurement method.
  • SWV Square Wave Voltage
  • Example 1 since the peak potential difference between the respective reagents was separated by 0.2 V or more, the signals could be separated.
  • Example 1 In Example 1, the procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the reagents contained in the mixed reagent were changed to the following two types of reagents among the reagents shown in Table 3 above. The results of electrochemical measurement of the mixed reagent of Comparative Example 1 are shown in FIG. The content of each reagent was 0.5 mM. (type of reagent) ⁇ Comparative Example 1: Reagent R04, Reagent R05
  • the peak potential difference was less than 0.2 V, and the signals overlapped, making identification difficult.
  • Example 2 [Examples 2-1 to 2-3, Comparative Examples 2-1 and 2-2] (Preparation of mixed reagent)
  • mixed reagents were prepared by changing the reagents contained in the mixed reagent to the following 2 to 4 types of reagents among the reagents shown in Table 3 above.
  • Example 2-1 Reagent R01, Reagent R02, Reagent R04 ⁇ Example 2-2: Reagent R01, Reagent R02, Reagent R06 ⁇ Example 2-3: Reagent R01, Reagent R02, Reagent R04, Reagent R07 ⁇ Comparative Example 2-1: Reagent R01, Reagent R08 ⁇ Comparative Example 2-2: Reagent R01, Reagent R09
  • the first signal of each reagent contained in the mixed reagents of Examples 2-1 to 2-3 and the single signal of each reagent obtained when the reagent is in a single state was roughly consistent with
  • the first signal of each reagent contained in the mixed reagents of Comparative Examples 2-1 and 2-2 and the single signal of each reagent obtained when the reagents are in a single state Some of them were almost the same as the one signal, but others were significantly different.
  • the first signal change rate with respect to a single signal of the first signal of reagent R01 is about ⁇ 8.9%, and the first signal change rate of reagent R02 is about 1.4%, and the first signal change rate for reagent R04 was about -0.34%.
  • the first signal change rate for reagent R01 was about ⁇ 8.9%
  • the first signal change rate for reagent R02 was about 1.4%
  • reagent The first signal change rate for R06 was about -7.6%.
  • the first signal change rate for reagent R01 was about ⁇ 8.9%
  • the first signal change rate for reagent R02 was about 1.4%
  • reagent The first signal change rate for R04 was about -0.34% and the first signal change rate for reagent R07 was about 3.3.
  • the first signal change rate for reagent R01 was about -74%
  • the first signal change rate for reagent R08 was about 3.2%.
  • the first signal change rate for reagent R01 was about -75%
  • the first signal change rate for reagent R09 was about -6.9%.
  • Example 2-4 Preparation of mixed reagent
  • a mixed reagent was prepared by changing the reagents contained in the mixed reagent to the following two types of reagents among the reagents shown in Table 3 above. ((type of reagent)) ⁇ Example 2-1: Reagent R02, Reagent R09
  • Example 2-4 (Calculation of signal change rate) ((Calculation of signal change rate after mixing reagent for 60 minutes))
  • the mixed reagent of Example 2-4 was electrochemically measured 10 minutes and 60 minutes after mixing the two kinds of reagents in the same manner as described above.
  • the signal of the mixed reagent obtained when the electrochemical measurement was performed 60 minutes after mixing the reagents was used as the second signal.
  • FIG. 11 shows the electrochemical measurement results after 10 minutes and 60 minutes after the mixed reagent was applied.
  • the content of the mixed reagent was 0.25 mM.
  • the first signal and second signal of each reagent contained in the mixed reagent of Example 2-4 were substantially the same.
  • the second signal change rate for reagent R02 was 1.7%
  • the second signal change rate for reagent R09 was -7.2%.
  • Example 3-1 (Preparation of mixed reagent) As in Example 2-1, three types of reagents (reagent R01, reagent R02, and reagent R04) out of the reagents shown in Table 3 were mixed to prepare a mixed reagent.
  • the mixed reagent was dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and evaluated. Two types of metal ions were used as analytes. Copper ions (Cu 2+ ) and iron ions (Fe 3+ ) were used as two types of metal ions. Metal ions were prepared by diluting a 1000 ppm standard solution with 50 mM sodium phosphate buffer to the specified concentration. Electrochemical measurement was performed 10 minutes after mixing the standard solution containing metal ions with the 50 mM sodium phosphate buffer containing the mixed reagent.
  • FIG. 12 shows the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-1 and the current value when detecting Cu 2+ .
  • the reagent R01 contained in the mixed reagent was able to detect Cu 2+ with substantially the same high sensitivity regardless of the copper ion concentration of 0.1 ppm, 1 ppm and 10 ppm.
  • FIG. 13 shows the relationship between the Cu 2+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R01. As shown in FIG. 13, the higher the Cu 2+ concentration , the higher the current value of the reagent R01. was done. Moreover, FIG. 14 shows the relationship between the Cu 2+ concentration and the amount of change in the current value of the reagent R04. As shown in FIG. 14, even if the concentration of Cu 2+ is changed, the current value of the reagent R04 hardly changes, confirming that the reagent R04 hardly reacts with Cu 2+ .
  • FIG. 15 shows the relationship between the potential of the mixed reagent of Example 3-1 and the current value when Fe 3+ is detected.
  • reagent R01 was able to detect Fe 3+ with substantially the same high sensitivity regardless of the iron ion concentration of 0.05 mM, 0.5 mM, 1 mM and 5 mM.
  • FIG. 16 shows the relationship between the Fe 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R02. As shown in FIG. 16, the higher the Fe 3+ concentration, the lower the current value of the reagent R02, confirming that the higher the Fe 3+ concentration, the more reactions such as oxidation-reduction with the reagent R02. was done. Moreover, FIG. 17 shows the relationship between the Fe 3+ concentration and the amount of change in the current value of the reagent R04. As shown in FIG. 17, the current value of reagent R04 hardly changed even when the concentration of Fe 3+ was changed, confirming that reagent R04 hardly reacted with Fe 3+ .
  • Example 3-2 Of the reagents shown in Table 3, two types of reagents (reagent R02 and reagent R06) were mixed to prepare a mixed reagent, and Fe 3+ and Escherichia coli bacteria were used as samples. -1 was performed in the same manner.
  • FIG. 18 shows the relationship between the potential and current value of the mixed reagent of Example 3-2
  • FIG. 19 shows the relationship between the potential and current value of the mixed reagent of Example 3-2 when Fe 3+ is detected.
  • FIG. 20 shows the relationship between the potential and current value of the mixed reagent of Example 3-2 when detecting Escherichia coli bacteria
  • FIG. 21 shows the relationship when Fe 3+ and Escherichia coli bacteria are detected. shows the relationship between the potential and the current value of the mixed reagent of Example 3-2.
  • the mixed reagent containing reagents R02 and R06 can detect Fe 3+ , and as shown in FIGS.
  • the mixed reagent containing reagents R02 and R06 can detect Escherichia coli bacteria. 18 and 21, it was confirmed that the mixed reagent containing reagents R02 and R06 can detect both Fe 3+ and Escherichia coli.
  • Example 3-3 (Preparation of mixed reagent) Example 3-1 was carried out in the same manner as in Example 3-1, except that Cu 2+ and Fe 3+ were used as specimens.
  • FIG. 22 shows the relationship between the potential and current value of the mixed reagent of Example 3-3
  • FIG. 23 shows the relationship between the potential and current value of the mixed reagent of Example 3-3 when detecting Cu 2+
  • FIG. 24 shows the relationship between the potential and the current value of the mixed reagent of Example 3-3 when detecting Fe 3+
  • FIG. 25 shows the relationship when detecting both Cu 2+ and Fe 3+ shows the relationship between the potential and the current value of the mixed reagent of Example 3-3.
  • the mixed reagent containing reagents R01, R02 and R04 can detect Cu 2+ , and as shown in FIGS.
  • the mixed reagent containing reagents R01, R02 and R04 It was confirmed that Fe 3+ can be detected, and as shown in FIGS. 22 and 25, the mixed reagent containing reagents R01, R02 and R04 can detect both Cu 2+ and Fe 3+ .
  • Example 4-1 (Preparation of mixed reagent)
  • the reagents contained in the mixed reagent were changed to the following two types of reagents among the reagents shown in Table 3 above, and Cu 2+ and Fe 3+ were used as specimens. It was carried out in the same manner as in Example 3-1.
  • Table 4 shows the type of specimen, the type of reagent, and whether or not the specimen was detected. When the sample was detected with the reagent, it was indicated as ⁇ in Table 4, and when the sample was not detected with the reagent, it was indicated with ⁇ in Table 4. (type of reagent) ⁇ Example 4-1: Reagent R01, Reagent R02
  • Example 4-2 In Example 4-1, the reagents contained in the mixed reagent were changed to the following two types of reagents among the reagents shown in Table 3 above, and Fe 3+ and Escherichia coli bacteria were used as specimens. , was carried out in the same manner as in Example 4-1. Escherichia coli bacteria were detected as follows. Table 5 shows the type of specimen, the type of reagent, and whether or not the specimen was detected. When the sample was detected by the reagent, it was indicated as ⁇ in Table 5, and when the sample was not detected by the reagent, it was indicated as ⁇ in Table 5.
  • Example 4-2 Reagent R02, Reagent R06 (Detection of Escherichia coli bacteria (Escherichia coli culture conditions, signal waveform evaluation)) E. coli (NEB5 ⁇ ) was cultured in LB liquid medium overnight at 37° C., washed twice with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) (6000 rpm for 5 minutes), and diluted to a final concentration of 1 ⁇ 10 9 . adjusted to When evaluating the reactivity, the mixture was mixed with the mixed reagent and allowed to stand for 30 minutes, after which the electrochemical measurement was performed.
  • Reagent R02, Reagent R06 Detection of Escherichia coli bacteria (Escherichia coli culture conditions, signal waveform evaluation)
  • E. coli (NEB5 ⁇ ) was cultured in LB liquid medium overnight at 37° C., washed twice with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) (6000 rpm for 5 minutes), and diluted to a final concentration
  • Example 4-3 In Example 4-1, the reagents contained in the mixed reagent were changed to the three types of reagents shown below among the reagents shown in Table 3 above, and Fe 3+ and Escherichia coli bacteria were used as specimens. , was carried out in the same manner as in Example 4-1.
  • Table 6 shows the type of specimen, the type of reagent, and whether or not the specimen was detected. When the sample was detected by the reagent, it was indicated by ⁇ in Table 6, and when the sample was not detected by the reagent, it was indicated by ⁇ in Table 6. (type of reagent) ⁇ Example 4-3: Reagent R02, Reagent R04, Reagent R06
  • Example 5 (Preparation of mixed reagent) As in Example 1, two types of reagents (reagent R06 and reagent R010) among the reagents shown in Table 3 were mixed to prepare a mixed reagent.
  • the diamond electrode and voltammetry cell were cleaned each time the reagent was electrochemically measured. After washing the diamond electrode and the voltammetry cell four times with distilled water, 10 cycles of cyclic voltammetry (CV) ⁇ 2 V were performed with 2 mL of 0.1 mM sulfuric acid added. Finally, the diamond electrode and the voltammetric cell were again washed four times with distilled water and co-washed with 1 mL of sodium phosphate buffer.
  • CV cyclic voltammetry
  • the mixed reagent was dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and evaluated. Two types of metal ions were used as analytes. Aluminum ions (Al 3+ ) and cadmium ions (Cd 2+ ) were used as two types of metal ions. Metal ions were prepared by diluting a 1000 ppm standard solution with 50 mM sodium phosphate buffer to the specified concentration. Electrochemical measurement was performed 10 minutes after mixing the standard solution containing metal ions with the 50 mM sodium phosphate buffer containing the mixed reagent.
  • FIG. 26 shows the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value of the reagent contained in the mixed reagent when electrochemical measurement was performed before the sample was mixed with the 50 mM sodium phosphate buffer containing the mixed reagent. As shown in FIG. 26, peaks of current values are observed at different positions for reagent R06 and reagent R010 contained in the mixed reagent. Since the signal potential of the mixed reagent may change depending on the material of the electrode, the signal obtained with the carbon paste screen-printed electrode may differ from the signal obtained with the diamond electrode.
  • the peaks of the current values of the reagent R06 and the reagent R010 can be seen at different positions, so that it can be used for the detection of the specimen.
  • FIG. 27 shows the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Al 3+ .
  • the mixed reagent could detect Al 3+ with substantially the same high sensitivity regardless of the concentration of Al 3+ being 25 ppm, 50 ppm and 100 ppm.
  • FIG. 28 shows the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Cd 2+ . As shown in FIG. 28, at Cd 2+ concentrations of 50 ppm and 100 ppm, the mixed reagent could detect Cd 2+ with substantially the same high sensitivity.
  • FIG. 29 shows the relationship between the potential of the mixed reagent and the current value when detecting Al 3+ and Cd 2+ .
  • the mixed reagents were able to detect Al 3+ and Cd 2+ with substantially the same high sensitivity. Therefore, it can be said that Al 3+ and Cd 2+ can be simultaneously detected as different analytes by a mixed reagent containing reagent R06 and reagent R010.
  • FIG. 30 shows the relationship between the Al 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R06
  • FIG. 31 shows the relationship between the Cd 2+ concentration and the amount of change in current value of reagent R06.
  • the current value of the reagent R06 increases as the Al 3+ concentration increases, confirming that reactions such as redox reactions with the reagent R06 occur more frequently as the Al 3+ concentration increases. was done.
  • the current value of the reagent R06 hardly changed regardless of the Cd 2+ concentration . It was confirmed that there was no change.
  • FIG. 32 shows the relationship between the Al 3+ concentration and the amount of change in the current value of reagent R010
  • FIG. 33 shows the relationship between the Cd 2+ concentration and the amount of change in current value of reagent R010.
  • the aspect of embodiment of this invention is as follows, for example. ⁇ 1> containing multiple types of reagents with different oxidation-reduction potentials, A mixed reagent for electrochemical measurement, wherein the oxidation-reduction potential difference between one reagent and the other reagent is 0.2 V or more. ⁇ 2> The first signal of the one reagent obtained by electrochemical measurement 10 minutes after mixing the plurality of reagents is electrochemically measured when the one reagent is in a single state.
  • ⁇ 3> Based on the first signal of the one reagent obtained by electrochemical measurement 10 minutes after mixing the plurality of reagents, A value obtained by multiplying a value obtained by subtracting the ratio of the second signal of the one reagent to the first signal from 1 and multiplying by 100 obtained by electrochemical measurement after 60 minutes after mixing the plurality of types of reagents is the second When the signal change rate is The mixed reagent for electrochemical measurements according to ⁇ 2>, wherein the absolute value of the second signal change rate is 20% or less.
  • the mixed reagent for electrochemical measurement according to one. ⁇ 5> At least one of the plurality of reagents reacts specifically with the specimen, thereby changing the oxidation-reduction current value obtained in electrochemical measurement ⁇ 1> to ⁇ 4>
  • ⁇ 6> The mixed reagent for electrochemical measurement according to ⁇ 4> or ⁇ 5>, wherein the specimen is a metal ion or a microorganism.

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Abstract

本発明に係る電気化学測定用混合試薬は、酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、一の前記試薬と他の前記試薬との間の酸化還元電位差が０．２Ｖ以上である。

Description

電気化学測定用混合試薬
　本発明は、電気化学測定用混合試薬に関する。
　河川、地下水、上下水道等の溶液中に含まれる複数種の金属及び微生物等の検体の検出には、電気化学的方法等が用いられている。電気化学的測定法を用いて液体試料に含まれている検体を検出する方法として、検体と反応する試薬を用いる方法がある。
　電気化学的測定法に試薬を用いて液体試料に含まれている検体を検出する方法として、例えば、銅イオンを含む試料溶液にジチゾンが保持された電極を接触させて、ジチゾンと銅イオンとの錯体を形成させた後、電極に所定の電圧を印加してジチゾンを酸化し、ジチゾンの酸化に起因して電極間に生じる電流を検出することで、銅イオンを選択的に検出及び定量する電気化学的分析方法が提案されている（例えば、引用文献１参照）。
日本国特開２０１３－１１３７２６号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の電気化学的分析方法では、銅イオンしか検出できず、試料溶液中に含まれる複数種類の重金属イオン等の金属イオンを同時に検出できない、という問題があった。また、特許文献１に記載の電気化学的分析方法では、銅イオンとジチゾンが反応して錯体を形成させるための時間が必要であるため、金属イオンを短時間で簡易に検出できない、という問題があった。
　そのため、液体試料に含まれる複数種の検体の検出に電気化学的測定法の更なる利用を図るためには、液体試料に含まれる複数種の検体を簡易に短時間で同時に検出できる試薬の開発が重要である。
　本発明の一態様は、電気化学的測定法を用いた液体試料の検査において、液体試料に複数種の検体が含まれていても、複数種の検体を簡易に短時間で同時に検出できる電気化学測定用混合試薬を提供することを目的とする。
　本発明に係る電気化学測定用混合試薬の一態様は、酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、一の前記試薬と他の前記試薬との間の酸化還元電位差が０．２Ｖ以上である。
　本発明に係る電気化学測定用混合試薬の一態様は、電気化学的測定法を用いた液体試料の検査において、液体試料に複数種の検体が含まれていても、複数種の検体を簡易に短時間で同時に検出できる。
酸化還元電位の説明図である。 酸化還元電位差を示す説明図である。 試薬の分類の一例を示す図である。 実施例１の混合試薬の電気化学測定結果を示す図である。 比較例１の混合試薬の電気化学測定結果を示す図である。 実施例２－１の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を示す図である。 実施例２－２の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を示す図である。 実施例２－３の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を示す図である。 比較例２－１の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を示す図である。 比較例２－２の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を示す図である。 実施例２－４の混合試薬の１０分後及び６０分後における電気化学測定結果を示す図である。 Ｃｕ２＋を検出する際の、実施例３－１の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｃｕ２＋濃度と、試薬Ｒ０１の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ｃｕ２＋濃度と、試薬Ｒ０４の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－１の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋濃度と、試薬Ｒ０２の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋濃度と、試薬Ｒ０４の電流値の変化量との関係を示す図である。 実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Escherichia coli菌を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋及びEscherichia coli菌を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｃｕ２＋を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｆｅ３＋及びＣｕ２＋の両方を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ａｌ３＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ｃｄ２＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ａｌ３＋及びＣｄ２＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す図である。 Ａｌ３＋濃度と、試薬Ｒ０６の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ｃｄ２＋濃度と、試薬Ｒ０６の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ａｌ３＋濃度と、試薬Ｒ０１０の電流値の変化量との関係を示す図である。 Ｃｄ２＋濃度と、試薬Ｒ０１０の電流値の変化量との関係を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本明細書において数値範囲を示す「～」は、別段の断わりがない限り、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。
　本発明の実施形態に係る電気化学測定用混合試薬（以下、単に「混合試薬」という。）について説明する。本実施形態に係る混合試薬は、酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、一の試薬と他の試薬との間の酸化還元電位差を０．２Ｖ以上とするものである。
　本実施形態に係る混合試薬は、酸化還元電位差が０．２Ｖ以上になる複数の試薬を含み、それぞれの試薬の酸化還元電位におけるピーク電流の重なりを抑えることで、それぞれの試薬の酸化還元電位を精度良く特定できる。本実施形態に係る混合試薬を用いることで、複数種の試薬の酸化還元電位と略同等の位置に酸化還元電位を有する、複数種の検体を簡易に短時間で同時に検出できる。
　なお、酸化還元電位とは、図１に示すように、電位を変化させて電極と試薬との間の反応を測定した際に得られる矩形波ボルタンメトリー（Square Wave Voltammetry：ＳＷＶ）の酸化還元ピーク電流値における電位（ピーク電位）をいう。酸化還元ピーク電流値の最大値は、試薬の濃度に比例して高くなるため、試薬の含有量は、ピーク電流の最大値が特定し易くなるように、適宜調整してよい。
　本実施形態に係る混合試薬の電流電位を測定する際、本実施形態に係る混合試薬と電解質とを電気化学測定用のセルに少量入れる。混合試薬と電解質を含む試薬含有溶液を電気化学測定用のセルに所定量（例えば、２５ｍＬ）入れて、そして、電極にポテンショスタットを接続した状態で、試薬含有溶液を電極に接触させて電気化学測定を行う。電気化学測定では、電位を変化させて、電極と試薬含有溶液中の混合試薬の間の反応を測定する。これにより、混合試薬に含まれる複数種の試薬を検出される。
　電気化学測定を行う際、試薬含有溶液の液温は、適宜任意の温度（例えば、２５℃）に調整して行ってよい。
　電極は、特に限定されず、電気化学測定に用いられる一般的な電極を用いることができ、例えば、作用電極、対極及び参照電極がスクリーン印刷された電極及びダイアモンド電極等を用いることができる。
　スクリーン印刷された電極を用いる場合、作用電極、対極及び参照電極がスクリーン印刷された電極にポテンショスタットを接続した状態で、試薬含有溶液を３つの電極の上に滴下して電気化学測定を行えばよい。ＳＷＶの条件として、作用電極にカーボンからなる電極を用い、対極にＰｔ電極を用い、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌからなる電極を用いてよい。
　ダイアモンド電極を用いる場合、電極にポテンショスタットを接続した状態で、試薬含有溶液をダイアモンド電極の上に滴下して電気化学測定を行えばよい。
　ポテンショスタットも、特に限定されず、電気化学測定において一般的に使用されるポテンショスタットを用いてよい。電位の制御は、特に限定されず、ソフトウェアによりポテンショスタットを制御することにより行ってもよい。測定方法としては、電気化学測定における一般的な方法を用いることができるが、酸化還元ピーク電流値が容易に特定できるＳＷＶで行うことが好ましい。
　酸化還元電位差は、図２に示すように、一の試薬の酸化還元電位と他の試薬の酸化還元電位との間の電位差をいう。
　検体とは、重金属イオン等の金属イオン、微生物等をいう。重金属イオンとしては、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋等を挙げられる。微生物としては、Escherichia coli菌、乳酸菌等を用いることができる。液体試料には、複数の異なる種類の金属イオン又は微生物等が含まれてよい。即ち、複数の異なる種類の金属イオンが含まれていてもよいし、複数の異なる種類の微生物が含まれていてもよいし、複数の異なる種類の金属イオンと微生物が含まれていてもよい。
　酸化還元電位差は、０．２Ｖ以上であり、試薬の選択の幅を持ちつつ、各試薬の酸化還元電位の位置が容易に区別できる点から、０．２５Ｖ以上がより好ましく、０．３０Ｖ以上がさらに好ましい。
　試薬は、検体の検出用に用いられる成分であればよく、検体の種類に応じて適宜任意の成分を用いることができる。試薬としては、例えば、下記表１及び表２に示す試薬を用いることができる。表１及び表２には、それぞれの試薬のピーク電位を示す。なお、それぞれの試薬のピーク電位は、試薬の濃度、混合試薬の濃度、温度、電極の種類等、測定条件に応じてピーク電位が多少前後する場合がある。表１及び表２に示す、それぞれの試薬のピーク電位は、０．５ｍＭの各試薬をＰＨ７の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに溶解し、カーボンペーストのスクリーン印刷電極を使用した際のＳＷＶ結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試薬は、ピーク電位の大きさに応じて、複数の試薬に分類できる。図３は、試薬の分類の一例を示す図である。図３に示すように、例えば、試薬は、ピーク電位が－０．４Ｖ未満である第１試薬と、ピーク電位が－０．４Ｖ以上０．４Ｖ未満である第２試薬と、ピーク電位が０．４Ｖ以上０．６Ｖ未満である第３試薬と、ピーク電位が０．６Ｖ以上１．２Ｖ未満である第４試薬と、ピーク電位が１．２Ｖ以上である第５試薬とに分類できる。
　試薬の形態は、適宜調整可能であり、粉体等の固体でもよいし、液体でもよい。
　本実施形態に係る混合試薬は、複数の試薬を粉末等の状態で混合して含んでいてもよいし、複数の試薬を液体の状態で含んでいてもよいし、固体等の状態の試薬と、液体の状態の試薬との両方を混合して含んでいてもよい。
　このとき、本実施形態に係る混合試薬は、複数の試薬の形態に応じて適宜任意の形態としてよい。例えば、複数の試薬が粉末等の固体である場合、本実施形態に係る混合試薬は、複数の試薬を溶媒に溶解した溶液をカプセル等に内包した状態としてもよい。また、それぞれの試薬ごとにそれぞれの試薬を溶媒に溶解した溶液をカプセルに内包して、複数のカプセルを混ぜた状態で含んでもよい。なお、複数の試薬をカプセルに内包した状態では、使用時に試薬が検体と反応できないため、使用時には、カプセルが溶解するか破壊して試薬が検体と接触できるようにしてよい。
　複数種の試薬は、それぞれ相互作用を抑えつつ、それぞれの試薬が単一状態である場合と同等の酸化還元電位を有してよい。なお、単一状態である場合とは、混合試薬が一の試薬のみを含む状態をいう。
　複数種の試薬同士の相互作用は、これらの試薬が混合された時点、又は混合してから所定時間経過後において抑えられていればよい。
　本実施形態では、液体試料中で複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる一の試薬の第１シグナルの、一の試薬が単一状態である場合に電気化学測定して得られる一の試薬の単一シグナルに対する比（第１シグナル／単一シグナル）を１から減じた値に１００を乗じた値（（１－（第１シグナル／単一シグナル））×１００）を第１シグナル変化率とする。この時、第１シグナル変化率の絶対値（｜第１シグナル変化率｜＝｜（１－（第１シグナル／単一シグナル））×１００｜）は、４０％以下であることが好ましく、より好ましくは３７％以下であり、さらに好ましくは３５％以下である。第１シグナル変化率の絶対値が上記の好ましい範囲内であれば、試薬同士の相互作用がより適切に抑えられる。
　本実施形態では、複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる一の試薬の第１シグナルを基準とし、複数種の試薬を混合して６０分後に電気化学測定した際に得られる一の試薬の第２シグナルの上記の第１シグナルに対する比（第２シグナル／第１シグナル）を１から減じた値に１００を乗じた値（（１－（第２シグナル／第１シグナル））×１００）を第２シグナル変化率とする。この時、第２シグナル変化率の絶対値（｜第２シグナル変化率｜＝｜（１－（第２シグナル／第１シグナル））×１００｜）は、２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１８％以下であり、さらに好ましくは１５％以下である。第２シグナル変化率の絶対値が上記の好ましい範囲内であれば、複数の試薬同士の相互作用が抑えられた状態をより長く維持できる。
　複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬は、検体と作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化することが好ましい。一の試薬が検体と作用した際に生じる酸化還元電流値は、検体の量に比例する。そのため、複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬が検体と作用した際に生じる酸化還元電流値の変化量から検体を定量できる。
　複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬は、検体と特異的に作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化することが好ましい。一の検体を電気化学測定した際に得られるピーク電位は、それぞれの検体毎に特定のピーク電位を有する。一の試薬が特定の検体と特異的に作用すれば、一の試薬のピーク電位が変化するため、検体の種類を特定できる。
　本実施形態に係る混合試薬を用いて、液体試料に含まれる複数種の検体を検出する検出方法について説明する。本実施形態に係る混合試薬を電気化学測定用のセルに少量入れる。そして、複数種の検体を含む液体試料を電気化学測定用のセルに所定量（例えば、２５ｍＬ）入れて液温度２５℃に調整する。そして、電極にポテンショスタットを接続した状態で、混合試薬を含む液体試料を電極に接触させて電気化学測定を行う。電気化学測定では、電位を変化させて、電極と液体試料中の混合試薬の間の反応を測定する。これにより、それぞれの混合試薬と略同じ位置にピークを有する検体を検出できる。
　また、ピーク電流の最大値は、検体の濃度に比例して高くなるか低くなるため、検体の濃度を測定することもできる。
　なお、電気化学測定を行う際、混合試薬を含む液体試料を電極の上に滴下して電気化学測定を行ってもよいし、液体試料に電極の先端部を浸漬させた状態で電極をポテンショスタットに接続して、電気化学測定を行ってもよい。
　また、電気化学測定を行う前に液体試料を遠心分離機等にかけて液体試料中の混合試薬と検体を濃縮又は分離等の前処理を経て電気化学測定を行ってもよい。
　本実施形態に係る混合試薬は、酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、一の試薬と他の試薬との間の酸化還元電位差が０．２Ｖ以上となる試薬を用いる。これにより、混合試薬に含まれる複数種の試薬のそれぞれのＳＷＶ等のような電流－電位曲線のピークの一部が重なっても、それぞれの試薬の酸化還元電位の位置を特定できる。よって、本実施形態に係る混合試薬は、電気化学的測定法を用いて液体試料中に含まれている複数種の検体を検出する際に、液体試料中に含まれている複数種の検体を同時に検出できる。
　また、本実施形態に係る混合試薬は、例えば、検体が金属イオンである場合には、金属イオンは約１０分程度で検出でき、検体が微生物である場合には、微生物は約３０分で検出できる。よって、本実施形態に係る混合試薬は、液体試料に含まれる複数の検体を短時間で検出できるため、検出に要する時間を短くすることができる。よって、本実施形態に係る混合試薬は、液体試料中に含まれている複数種の検体の検出を短時間で行うことができる。
　さらに、本実施形態に係る混合試薬は、液体試料を濃縮するための工程等が不要になるため、検体を含む液体試料を撹拌するための攪拌設備を削減できる。よって、本実施形態に係る混合試薬を用いれば、検出に要する設備負担と作業負担を軽減できるため、液体試料中に含まれている複数種の検体の検出を簡易かつ短時間で行うことができる。
　よって、本実施形態に係る混合試薬を用いれば、電気化学的測定法を用いた液体試料の検査において、液体試料に複数種の検体が含まれていても、複数種の検体を簡易に短時間で同時に検出できる。
　本実施形態に係る混合試薬は、第１シグナル変化率の絶対値（｜第１シグナル変化率｜）を４０％以下にできる。この場合、一の試薬は異なる他の試薬により影響を受けることを、例えば、少なくとも１０分間抑えることができるため、一の試薬は単一状態である場合と略同等の電気化学シグナルを維持できる。そのため、複数種の試薬が混合されても、一の試薬の電気化学シグナルは安定して維持できる。よって、本実施形態に係る混合試薬を用いれば、液体試料の検査において、液体試料中に複数種の検体が含まれている場合でも、液体試料中に含まれる複数種の検体の検出精度の低下を抑えることができる。
　本実施形態に係る混合試薬は、第２シグナル変化率の絶対値（｜第２シグナル変化率｜）を２０％以下にできる。この場合、一の試薬は異なる他の試薬により影響を受けることを、例えば、1時間以上の長時間抑えることができるため、それぞれの試薬は、複数種の試薬が１０分間混合された状態の時と略同等の電気化学シグナルを維持できる。そのため、複数種の試薬が１０分以上混合された時でも、複数の試薬同士が相互に作用を受けることが抑えられた状態をより長時間安定して維持できる。よって、本実施形態に係る混合試薬を用いれば、液体試料中に含まれる複数種の検体の検出精度の低下をさらに長時間にわたって抑えることができる。
　本実施形態に係る混合試薬は、複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬を、検体と作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値を変化させることができる。複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬が検体と反応することで、電気化学シグナルが変化するため、この電気化学シグナルの電流値の変化の大きさから、検体を容易に定量できる。よって、本実施形態に係る混合試薬は、酸化還元電流値の変化量から、複数種の検体の検出と定量を同時に行うことができる。
　本実施形態に係る混合試薬は、複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬を、検体と特異的に作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値を変化させることができる。複数種の試薬のうちの少なくとも一の試薬が特定の検体と特異的に反応することで、電気化学シグナルが変化するため、この電気化学シグナルの電流値の変化により、特定の検体を容易に同定できる。よって、本実施形態に係る混合試薬は、酸化還元電流値の変化から、複数種の検体の検出及び同定を同時に行うことができる。
　また、本実施形態に係る混合試薬は、複数種の試薬を、それぞれ検体と特異的に作用することにより、酸化還元電流値の変化量を得ることができるため、複数種の検体の検出、同定及び定量を同時に行うことができる。
　以上の通り、本実施形態に係る混合試薬は、上記のような特性を有することから、環境中の検体、例えば、飲料水、河川、地下水、上下水道、プール等から環境検査のため採取した水に含まれる金属イオン及び微生物等の検査に有効に用いることができる。
　以下、実施例及び比較例を示して実施形態を更に具体的に説明するが、実施形態はこれらの実施例及び比較例により限定されるものではない。
［試薬の準備］
　下記表１に示す試薬を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例１＞
（混合試薬の作製）
　上記表３に示す試薬のうち、４種類の試薬（試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０３、試薬Ｒ０４）を電気化学測定用のセルにそれぞれ０．５ｍＭ入れて混合して、混合試薬を作製した。
（電気化学測定）
　試薬の電気化学測定は、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製の９１０ＰＳＴＡＴ　ｍｉｎｉ（ポテンショスタット）に同メーカーのスクリーン印刷電極ＤＲＰ１５０（１枚につき１測定)を接続した構成として行った。制御は、ポテンショスタット付属のＰＳＴＡＴ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ をＰＣにインストールし、測定方法としてＳｑｕａｒｅ　Ｗａｖｅ　Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ（ＳＷＶ）モードでの電気化学測定を行った。実施例１の混合試薬の電気化学測定結果を図４に示す。
　図４に示すように、実施例１では、それぞれの試薬同士のピーク電位差が０．２Ｖ以上離れているため、シグナルの分離が可能であった。
［比較例１］
　実施例１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す２種類の試薬に変更したこと以外は、実施例１と同様にして行った。比較例１の混合試薬の電気化学測定結果を図５に示す。それぞれの試薬の含有量は、０．５ｍＭとした。
（試薬の種類）
・比較例１：試薬Ｒ０４、試薬Ｒ０５
　図５に示すように、ピーク電位差が０．２Ｖ未満であり、シグナルが重なるため、識別が困難であった。
＜実施例２＞
［実施例２－１～２－３、比較例２－１、２－２］
（混合試薬の作製）
　実施例１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す２種類～４種類の試薬に変更して、混合試薬を作製した。
（（試薬の種類））
・実施例２－１：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０４
・実施例２－２：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０６
・実施例２－３：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０４、試薬Ｒ０７
・比較例２－１：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０８
・比較例２－２：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０９
（シグナル変化率の算出）
（（試薬の１０分混合後におけるシグナル変化率の算出））
　２種類～４種類の試薬を水中に所定量入れて混合して１０分後に、上記実施例１と同様にして混合試薬を含む水溶液を用いて電気化学測定を行った。同様に、３種類の試薬をそれぞれ水中に０．１６ｍＭ又は０．２０ｍＭ入れて、それぞれの試薬を含む水溶液を用いて電気化学測定を行った。試薬を混合して１０分後に電気化学測定を行った時に得られた混合試薬のシグナルを第１シグナルとした。実施例２－１～２－３、比較例２－１、２－２の、それぞれの、混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電気化学測定結果を図６～図１０に示す。なお、それぞれの試薬及び混合試薬の含有量は、実施例２－１及び２－２では０．１６ｍＭとし、実施例２－３では０．１ｍＭとし、比較例２－１及び２－２では０．２５ｍＭとした。
　図６～図８に示すように、実施例２－１～２－３の混合試薬に含まれる各試薬の第１シグナルと、試薬が単一状態である場合に得られる各試薬の単一シグナルとは略一致していた。一方、図９及び図１０に示すように、比較例２－１及び２－２の混合試薬に含まれる各試薬の第１シグナルと、試薬が単一状態である場合に得られる各試薬の単一シグナルとは一部が略一致していたが、他では大きくズレていた。
　図６に示すように、実施例２－１では、試薬Ｒ０１の第１シグナルの単一シグナルに対する第１シグナル変化率は約－８．９％であり、試薬Ｒ０２の第１シグナル変化率は約１．４％であり、試薬Ｒ０４の第１シグナル変化率は約－０．３４％であった。
　図７に示すように、実施例２－２では、試薬Ｒ０１の第１シグナル変化率は約－８．９％であり、試薬Ｒ０２の第１シグナル変化率は約１．４％であり、試薬Ｒ０６の第１シグナル変化率は約－７．６％であった。
　図８に示すように、実施例２－３では、試薬Ｒ０１の第１シグナル変化率は約－８．９％であり、試薬Ｒ０２の第１シグナル変化率は約１．４％であり、試薬Ｒ０４の第１シグナル変化率は約－０．３４％であり、試薬Ｒ０７の第１シグナル変化率は約３．３であった。
　図９に示すように、比較例２－１では、試薬Ｒ０１の第１シグナル変化率は約－７４％であり、試薬Ｒ０８の第１シグナル変化率は約３．２％であった。
　図１０に示すように、比較例２－２では、試薬Ｒ０１の第１シグナル変化率は、約－７５％であり、試薬Ｒ０９の第１シグナル変化率は約－６．９％であった。
［実施例２－４］
（混合試薬の作製）
　実施例１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す２種類の試薬に変更して、混合試薬を作製した。
（（試薬の種類））
・実施例２－１：試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０９
（シグナル変化率の算出）
（（試薬の６０分混合後におけるシグナル変化率の算出））
　上記と同様に２種類の試薬を混合してから１０分後及び６０分後のそれぞれにおいて、実施例２－４の混合試薬の電気化学測定を行った。なお、試薬を混合して６０分後に電気化学測定を行った時に得られた混合試薬のシグナルを第２シグナルとした。混合試薬の１０分後及び６０分後における電気化学測定結果を図１１に示す。なお、混合試薬の含有量は、０．２５ｍＭとした。
　図１１に示すように、実施例２－４の混合試薬に含まれる各試薬の第１シグナルと第２シグナルとは略一致していた。試薬Ｒ０２の第２シグナル変化率は１．７％であり、試薬Ｒ０９の第２シグナル変化率は－７．２％であった。
＜実施例３＞
［実施例３－１］
（混合試薬の作製）
　実施例２－１と同様、上記表３に示す試薬のうち、３種類の試薬（試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０４）を混合して、混合試薬を作製した。
（２種類の金属イオンの検出）
　混合試薬の電気化学測定を行う際は、混合試薬を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）に溶解させ、評価を行った。検体として、２種類の金属イオンを用いた。２種類の金属イオンとして銅イオン（Ｃｕ２＋）と鉄イオン（Ｆｅ３＋）とを用いた。金属イオンは、１０００ｐｐｍ標準液を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで指定濃度まで希釈したものを使った。金属イオンを含む標準液を混合試薬を含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに混合してから１０分後に電気化学測定を行った。
　図１２は、Ｃｕ２＋を検出する際の、実施例３－１の混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図１２に示すように、銅イオンの濃度が０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍのいずれの場合でも、混合試薬に含まれる試薬Ｒ０１は略同等に高感度でＣｕ2+を検出できた。
　図１３は、Ｃｕ２＋濃度と、試薬Ｒ０１の電流値の変化量との関係を示す。図１３に示すように、Ｃｕ２＋濃度が大きくなるほど、試薬Ｒ０１の電流値は増大していることから、Ｃｕ２＋濃度が大きいほど試薬Ｒ０１との酸化還元等の反応が多く起きていることが確認された。また、図１４は、Ｃｕ２＋濃度と、試薬Ｒ０４の電流値の変化量との関係を示す。図１４に示すように、Ｃｕ２＋の濃度を変えても試薬Ｒ０４の電流値は殆ど変化しないことから、Ｃｕ２＋に試薬Ｒ０４は殆ど反応しないことが確認された。
　図１５は、Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－１の混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図１５に示すように、鉄イオンの濃度が０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び５ｍＭのいずれの場合でも、試薬Ｒ０１は略同等に高感度でＦｅ３＋を検出できた。
　図１６は、Ｆｅ３＋濃度と、試薬Ｒ０２の電流値の変化量との関係を示す。図１６に示すように、Ｆｅ３＋濃度が大きくなるほど、試薬Ｒ０２の電流値は低下していることから、Ｆｅ３＋濃度が大きいほど試薬Ｒ０２との酸化還元等の反応が多く起きていることが確認された。また、図１７は、Ｆｅ３＋濃度と、試薬Ｒ０４の電流値の変化量との関係を示す。図１７に示すように、Ｆｅ３＋の濃度を変えても試薬Ｒ０４の電流値は殆ど変化しないことから、Ｆｅ３＋に試薬Ｒ０４は殆ど反応しないことが確認された。
［実施例３－２］
　上記表３に示す試薬のうち、２種類の試薬（試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０６）を混合して、混合試薬を作製し、検体としてＦｅ３＋とEscherichia coli菌とを用いたこと以外は、実施例３－１と同様にして行った。
　図１８は、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図１９は、Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図２０は、Escherichia coli菌を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図２１は、Ｆｅ３＋及びEscherichia coli菌を検出する際の、実施例３－２の混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図１８及び図１９に示すように、試薬Ｒ０２及びＲ０６を含む混合試薬は、Ｆｅ３＋を検出でき、図１８及び図２０に示すように、試薬Ｒ０２及びＲ０６を含む混合試薬は、Escherichia coli菌を検出でき、図１８及び図２１に示すように、試薬Ｒ０２及びＲ０６を含む混合試薬は、Ｆｅ３＋及びEscherichia coli菌の両方を検出できることが確認された。
［実施例３－３］
（混合試薬の作製）
　実施例３－１において、検体としてＣｕ２＋及びＦｅ３＋を用いたこと以外は、実施例３－１と同様にして行った。
　図２２は、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図２３は、Ｃｕ２＋を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図２４は、Ｆｅ３＋を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示し、図２５は、Ｃｕ２＋及びＦｅ３＋の両方を検出する際の、実施例３－３の混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図２２及び図２３に示すように、試薬Ｒ０１、Ｒ０２及びＲ０４を含む混合試薬は、Ｃｕ２＋を検出でき、図２２及び図２４に示すように、試薬Ｒ０１、Ｒ０２及びＲ０４を含む混合試薬は、Ｆｅ３＋を検出でき、図２２及び図２５に示すように、試薬Ｒ０１、Ｒ０２及びＲ０４を含む混合試薬は、Ｃｕ２＋及びＦｅ３＋の両方を検出できることが確認された。
＜実施例４＞
［実施例４－１］
（混合試薬の作製）
　実施例３－１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す２種類の試薬に変更して、検体としてＣｕ２＋及びＦｅ３＋を用いたこと以外は、実施例３－１と同様にして行った。検体の種類と、試薬の種類及び検体の検出の有無とを表４に示す。なお、試薬により検体が検出された場合は、表４中、○と示し、試薬により検体が検出されなかった場合は、表４中、×と示した。
（試薬の種類）
・実施例４－１：試薬Ｒ０１、試薬Ｒ０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、試薬Ｒ０１と試薬Ｒ０２により、２種類の金属イオンとしてＣｕ２＋及びＦｅ３＋を同時に同定できることが確認された。
［実施例４－２］
　実施例４－１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す２種類の試薬に変更して、検体としてＦｅ３＋及びEscherichia coli菌を用いたこと以外は、実施例４－１と同様にして行った。Escherichia coli菌の検出は、以下の通り行った。検体の種類と、試薬の種類及び検体の検出の有無とを表５に示す。なお、試薬により検体が検出された場合は、表５中、○と示し、試薬により検体が検出されなかった場合は、表５中、×と示した。
（試薬の種類）
・実施例４－２：試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０６
（Escherichia coli菌の検出（Escherichia coli菌の培養条件、シグナル波形評価））
　大腸菌（ＮＥＢ５α）はＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で洗浄を２回実施した後(６０００ｒｐｍを５分)、最終濃度が１×１０9になるように調整した。反応性評価を行う際は混合試薬と混合させ、３０分放置した後、電気化学測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５より、試薬Ｒ０２とＲ０６により、１種類の金属イオンとしてＦｅ３＋と、微生物としてEscherichia coli菌を同時に同定できることが確認された。
［実施例４－３］
　実施例４－１において、混合試薬に含まれる試薬を、上記表３に示す試薬のうち、下記に示す３種類の試薬に変更して、検体としてＦｅ３＋及びEscherichia coli菌を用いたこと以外は、実施例４－１と同様にして行った。検体の種類と、試薬の種類及び検体の検出の有無とを表６に示す。なお、試薬により検体が検出された場合は、表６中、○と示し、試薬により検体が検出されなかった場合は、表６中、×と示した。
（試薬の種類）
・実施例４－３：試薬Ｒ０２、試薬Ｒ０４、試薬Ｒ０６
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６より、試薬Ｒ０２と試薬Ｒ０４と試薬Ｒ０６により、１種類の金属イオンとしてＦｅ３＋と、微生物としてEscherichia coli菌を同時に同定できることが確認された。
＜実施例５＞
（混合試薬の作製）
　実施例１と同様、上記表３に示す試薬のうち、２種類の試薬（試薬Ｒ０６、試薬Ｒ０１０）を混合して、混合試薬を作製した。
（電気化学測定）
　混合試薬の電気化学測定には、ダイアモンド電極を用いたボルタンメトリーセル（ＨＸ－２２０、北斗電工社製）を使用した。
　ダイアモンド電極及びボルタンメトリーセルは、試薬を電気化学測定するたびに洗浄した。ダイアモンド電極及びボルタンメトリーセルを蒸留水で４回洗浄した後、０．１ｍＭ硫酸を２ｍＬ加えた状態でCyclic Voltammetry （ＣＶ）±２Ｖを１０サイクル回した。最後に、再びダイアモンド電極及びボルタンメトリーセルを蒸留水で４回洗浄し、１ｍＬのリン酸ナトリウムバッファーで共洗いを行った。
　混合試薬を２ｍＬ滴下し、Ｓｑｕａｒｅ　Ｗａｖｅ　Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ（ＳＷＶ）モードで電気化学測定を行なった(スキャンレート：０．１Ｖ／ｓ、電位：±２Ｖ)。混合試薬を測定する度に、ダイアモンド電極及びボルタンメトリーセルは硫酸で繰り返し洗浄した。
（２種類の金属イオンの検出）
　混合試薬の電気化学測定を行う際、混合試薬を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）に溶解させ、評価を行った。検体として、２種類の金属イオンを用いた。２種類の金属イオンとしてアルミニウムイオン（Ａｌ３＋）とカドミウムイオン（Ｃｄ２＋）とを用いた。金属イオンは、１０００ｐｐｍ標準液を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで指定濃度まで希釈したものを使った。金属イオンを含む標準液を混合試薬を含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに混合してから１０分後に電気化学測定を行った。
　なお、混合試薬を含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに検体を混合する前に電気化学測定した時の混合試薬と、混合試薬に含まれる試薬の電位と電流値との関係を図２６に示す。図２６に示すように、混合試薬に含まれる試薬Ｒ０６と試薬Ｒ０１０とはそれぞれ異なる位置に電流値のピークが見られる。電極の材料によって混合試薬のシグナル電位は変わる場合があるため、カーボンペーストのスクリーン印刷電極で得られるシグナルは、ダイアモンド電極で得られるシグナルとは異なる場合がある。試薬Ｒ０６と試薬Ｒ０１０を含む混合試薬では、試薬Ｒ０６と試薬Ｒ０１０の電流値のピークがそれぞれ異なる位置に見られるため、検体の検出に用いることが可能である。
　図２７は、Ａｌ３＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図２７に示すように、Ａｌ３＋の濃度が２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの何れでも、混合試薬は略同等に高感度でＡｌ３＋を検出できた。
　図２８は、Ｃｄ２＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図２８に示すように、Ｃｄ２＋の濃度が５０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍでは、混合試薬は略同等に高感度でＣｄ２＋を検出できた。
　図２９は、Ａｌ３＋及びＣｄ２＋を検出する際の、混合試薬の電位と電流値との関係を示す。図２９に示すように、アルミニウムイオン及びカドミウムイオンの濃度がいずれも５０ｐｐｍでは、混合試薬は略同等に高感度でＡｌ３＋及びＣｄ２＋を検出できた。よって、試薬Ｒ０６と試薬Ｒ０１０とを含む混合試薬により、異なる検体としてＡｌ３＋及びＣｄ２＋を同時に検出できるといえる。
　図３０は、Ａｌ３＋濃度と、試薬Ｒ０６の電流値の変化量との関係を示し、図３１は、Ｃｄ２＋濃度と、試薬Ｒ０６の電流値の変化量との関係を示す。図３０に示すように、Ａｌ３＋濃度が大きくなるほど、試薬Ｒ０６の電流値は増大していることから、Ａｌ３＋濃度が大きいほど試薬Ｒ０６との酸化還元等の反応が多く起きていることが確認された。一方、図３１に示すように、Ｃｄ２＋濃度の大きさに関わらず、試薬Ｒ０６の電流値は殆ど変化しなかったことから、Ｃｄ２＋と試薬Ｒ０６との酸化還元等の反応の大きさは略変わらないことが確認された。
　図３２は、Ａｌ３＋濃度と、試薬Ｒ０１０の電流値の変化量との関係を示し、図３３は、Ｃｄ２＋濃度と、試薬Ｒ０１０の電流値の変化量との関係を示す。図３２に示すように、Ａｌ３＋濃度が大きくなっても、Ａｌ３＋濃度が５０ｐｐｍ以上では試薬Ｒ０１０の電流値は略変動しなかったことから、Ａｌ３＋濃度が大きくなっても試薬Ｒ０１０との酸化還元等の反応はある程度の量までしか大きくならないことが確認された。一方、図３３に示すように、Ｃｄ２＋濃度が大きくなるほど、試薬Ｒ０１０の電流値は増大していることから、Ｃｄ２＋濃度が大きいほど試薬Ｒ０１０との酸化還元等の反応が多く起きていることが確認された。
　図３０～図３３に示すように、ダイアモンド電極を用いて電気化学測定した結果、試薬Ｒ０６はＡｌ３＋イオンに強く反応し、試薬Ｒ０１０はＣｄ２＋に強く反応した。よって、検体に含まれるＡｌ３＋濃度は試薬Ｒ０６のシグナルの変動率から算出し、検体に含まれるＣｄ２＋濃度は試薬Ｒ０１０のシグナルの変動率から算出できることが確認された。
　混合試薬に含まれる試薬Ｒ０６によりＡｌ３＋が検出されるが、図２７に示すように、Ａｌ３＋により混合試薬に含まれる試薬Ｒ０１０のシグナルも若干変動する傾向がある。一方、図２８に示すように、Ｃｄ２＋では混合試薬に含まれる試薬Ｒ０６のシグナルは略変化しない。このため、図２９に示すように、検体にＡｌ３＋及びＣｄ２＋が同時に含まれる場合、Ａｌ３＋は試薬Ｒ０６のシグナル増加量から求めると共に、混合試薬のシグナルの増加量からＡｌ３＋によって生じた試薬Ｒ０１０のシグナルの増加量を減ずる。これにより、混合試薬のシグナルの増加量からＣｄ２＋によって生じた試薬Ｒ０１０のシグナルの増加量を高精度に求めることができる。
　よって、試薬Ｒ０６及び試薬Ｒ０１０を含む混合試薬を用いて、検体に含まれるＡｌ３＋及びＣｄ２＋を検出する際、混合試薬のシグナルの増加量から試薬Ｒ０１０のシグナルの増加量を減ずることで、検体に含まれるＡｌ３＋及びＣｄ２＋の検出精度を向上できるといえる。
　以上の通り、実施形態を説明したが、上記実施形態は、例として提示したものであり、上記実施形態により本発明が限定されるものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の組み合わせ、省略、置き換え、変更などを行うことが可能である。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると共に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
　なお、本発明の実施形態の態様は、例えば、以下の通りである。
＜１＞　酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、
　一の前記試薬と他の前記試薬との間の酸化還元電位差が０．２Ｖ以上である電気化学測定用混合試薬。
＜２＞　前記複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第１シグナルの、前記一の試薬が単一状態である場合に電気化学測定して得られる前記一の試薬の単一シグナルに対する比を１から減じた値に１００を乗じた値を第１シグナル変化率とした時、
　前記第１シグナル変化率の絶対値が、４０％以下である＜１＞に記載の電気化学測定用混合試薬。
＜３＞　前記複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第１シグナルを基準とし、
　前記複数種の試薬を混合して６０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第２シグナルの前記第１シグナルに対する比を１から減じた値に１００を乗じた値を第２シグナル変化率とした時、
　前記第２シグナル変化率の絶対値が、２０％以下である＜２＞に記載の電気化学測定用混合試薬。
＜４＞　前記複数種の試薬のうちの少なくとも前記一の試薬は、検体と作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化する＜１＞～＜３＞の何れか一つに記載の電気化学測定用混合試薬。
＜５＞　前記複数種の試薬のうちの少なくとも前記一の試薬は、検体と特異的に作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化する＜１＞～＜４＞の何れか一つに記載の電気化学測定用混合試薬。
＜６＞　前記検体が、金属イオン又は微生物である＜４＞又は＜５＞に記載の電気化学測定用混合試薬。
　本出願は、２０２１年９月２９日に日本国特許庁に出願した特願２０２１－１５９９６１号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０２１－１５９９６１号の全内容を本出願に援用する。

Claims (6)

  1. 　酸化還元電位が異なる、複数種の試薬を含み、
    　一の前記試薬と他の前記試薬との間の酸化還元電位差が０．２Ｖ以上である電気化学測定用混合試薬。
  2. 　前記複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第１シグナルの、前記一の試薬が単一状態である場合に電気化学測定して得られる前記一の試薬の単一シグナルに対する比を１から減じた値に１００を乗じた値を第１シグナル変化率とした時、
    　前記第１シグナル変化率の絶対値が、４０％以下である請求項１に記載の電気化学測定用混合試薬。
  3. 　前記複数種の試薬を混合して１０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第１シグナルを基準とし、
    　前記複数種の試薬を混合して６０分後に電気化学測定した際に得られる前記一の試薬の第２シグナルの前記第１シグナルに対する比を１から減じた値に１００を乗じた値を第２シグナル変化率とした時、
    　前記第２シグナル変化率の絶対値が、２０％以下である請求項２に記載の電気化学測定用混合試薬。
  4. 　前記複数種の試薬のうちの少なくとも前記一の試薬は、検体と作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化する請求項１に記載の電気化学測定用混合試薬。
  5. 　前記複数種の試薬のうちの少なくとも前記一の試薬は、検体と特異的に作用することにより、電気化学測定した際に得られる酸化還元電流値が変化する請求項１に記載の電気化学測定用混合試薬。
  6. 　前記検体が、金属イオン又は微生物である請求項４に記載の電気化学測定用混合試薬。
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