JP2000505890A

JP2000505890A - 液体媒質中のアナライトの測定

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Publication number: JP2000505890A
Application number: JP9526705A
Authority: JP
Inventors: ウィルナー、イタマー; カッズ、ユージーニー; コーエン、イェール; ブロンダー、ロン
Original assignee: イッサム・リサーチ・デベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブリュー・ユニバーシティー・オブ・エルサレム
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2000-05-16
Also published as: US6214205B1; IL116921A; EP0876602B1; WO1997027474A1; AU1207197A; AU705417B2; CA2244214A1; NZ324815A; DE69712866D1; ATE218207T1; DE69712866T2; EP0876602A1; IL116921A0

Abstract

(57)【要約】アナライトの存在、および任意にその濃度の電気化学的測定において、認識ペアの一方のメンバーを固定化した電極と、前記一方のメンバーおよび前記アナライトからなる認識ペアとを利用する。前記媒質中おけるアナライトの存在下においては、前記アナライトと前記固定化されたメンバーとの間の複合体である対合複合体が形成される。この電極は電気化学的装置の一部を形成し、該装置はまた、少なくとも一つの第一のレドックス分子および少なくとも一つの第二のレドックス分子をも含んでおり、前者は電極と後者との間で電子を移動させる。対合複合体が形成されると電子移動は阻害され、電気的応答の変化が前記媒質中における前記アナライトの存在を示す。

Description

【発明の詳細な説明】液体媒質中のアナライトの測定〔発明の分野〕本発明は、一般には、液体媒質中におけるアナライトの存在および任意に該物質の濃度を測定する試験の分野に関する。より詳細には、本発明は、アナライトの存在下で起きる電極の電気的応答の変化によってアナライトが測定されるような試験に関する。〔従来技術〕背景として本発明に関連すると思われる従来技術は、下記のもので構成されている。 1. Electrochemical Sensors in Immunological Analysis，Ngo， T.T.，Ed.;Plenum Press:New York and London，1987． 2. Bresler，H.S.;Lenkevich，M.J.;Murdock，J.F.;Newman， A.L.;Roblin，R.O．in Biosensor Design and Application， Mathewson，P.R.;Finley，J.W.，Eds.;ACS Symp．Ser．511， Amer．Chem．Soc.，Washington，DC，1992，pp.89-104． 3. U.S．Patent No．4,728,828． 4. U.S．Patent No．4,822,566． 5. U.S．Patent No．5,057,430． 6. U.S．Patent No．4,893,957． 7. Canadian Patent No．1,256,944． 8. Canadian Patent No．1,259,374． 9. Weber，S.G.;Purdy，W.C.，Anal Lett．1979，12，1-9． 10．Doyle，J.M.;Wehmeyer，K.R.;Heineman，W.R.;Halsall， H.B．in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis， Ngo，T.T.，Ed.;Plenum Press:New York and London，1987， pp.87-102． 11．Di Gleria，K.;Hill，H.A.O.;McNeil，C.J.;Green，M.J.， Anal．Chem.，1986，58，1203-1205． 12．Di Gleria，K.;Hill，H.A.O.;Chambers，J.A.，J． Electroanal．Chem．1989，267，83-91． 13．Chambers，J.A.;Walton，N.J.,J.Electroanal．Chem．1988， 250，417-425． 14．Wright，D.S.;Halsall，H.B.;Heineman，W.R．in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis，Ngo， T,T.，Ed.;Plenum Press:New York and London，1987， pp.117-130. 15．Tang，H.T.; Halsall，H.B.;Heineman，W.R．Clin．Chem． 991，37，245-248． 16．Wehmeyer，K.R.;Halsall，H.B.;Heineman，W.R.;Volle， C.P.;Chen，C.，Anal．Chem．1986，58，135-139． 17．Aizawa，M.，in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis，Ngo，T.T.，Ed.;Plenum Press:New York and London．1987，pp.269-291． 18．Franconi，C.;Bonori，M.;Orsega，E.F.;Scarpa，M.;Rigo， A.，J．Pharm．Biomed．Anal．1987，5，283-287． 19．Uditha de AlWis，W.;Wilson，G.S.，Anal．Chem．1985，57， 2754-2756． 20．Tsuji，I.;Eguchi，H.;Yasukouchi，K.;Unoki，M.; Taniguchi，I.，Biosens．Bioelectron．1990，87-101． 21．Gebauer，C.R.，in Electrochemical Sensors in Immunological Analysis，Ngo，T.T.，Ed.;Plenum Press:New York and London，1987，pp.239-255． 22．Niwa，M.;Mori，T.;Nishio，E.;Nishimura，H.;Higashi， N.，J．Chem．Soc.，Chem．Commun．1992，547-549． 23．Willner，I.;Rubin，S.;Cohen，Y.，J．Amer．Chem．Soc． 1993，115，4937-4938． 24．Willner，I.;Blonder，R.;Dagan，A.，J．Amer．Chem．Soc． 1994，116，9365-9366． 25．European Patent Applicatiotn，Publication No．668,502． 26．Riklin，A.，Katz，C.，Willner，I.，Stocker A.，BUckmann, A.F.，Nature，1995，376，672． 27．Morris，D.L.，Buckler，R.T.，in Methods in Enzymolgy， V．92，Part E(Eds．J.J．Langone，H.，Van Vunakis)，Acad． Press，N.Y．1983，pp.415-417．〔発明の背景〕免疫検定法は、その特異性および高感度の故に、日常の臨床プラクティス、並びに環境汚染物質の分析および食品の品質分析のような、他の種々の用途で広範に使用されている。このような試験は、抗原と抗体との間の特異的な結合に基づいている。結合の電気化学的検出に基づく免疫検定は、少なからぬ研究および開発活動における中心的な課題であった(Ngo,T.T.,Ed．1987)。電気化学的免疫検定で検出されるのは、キャパシタンス変化のような、抗体／抗原の結合の結果としての電極／溶液界面の電気的特性における変化である(Bresler,et al,1992)。キャパシティー親和性センサが、米国特許第4,728,822号、同第4,822,566号、同第5,057, 430号および同第4,893,957号、並びにカナダ特許第第1,256,944号および同第1,2 59,374号に開示されている。他の電気化学的免疫検定法は、抗原／抗体複合体の形成の結果としての、電流または電圧応答における変化に基づいている。このような方法は、抗体または抗原に付着したレドックスプローブの存在を必要とし、かかる電気化学的試験における応答は、アナライトと、レドックスラベルされた抗体もしくは抗原との間での、電極に固定化された相補的メンバー対に対する拮抗的結合の結果である。このような方法は極めて鋭敏といえるものではなく、レドックスラベルされた分子の電流による検出は、マイクロモル範囲に制限される (Weber, et al.,1979;Doyle et al.,1987)。より最近の研究では、裸電極を使用し、またレドックス反応を酵素的増幅システムと組み合わせることによって(DiGleria et al,1986;Di gleria et al,1988)、感度の改善が可能になることが示された。同様のアプローチを使用し、且つレドックスポリマーで修飾した電極を用いることによって、より鋭敏な免疫検定がもたらされた(Chambers,et al,1988)。別のアプローチには、電気化学的信号を増幅させるために、抗原もしくは抗体と生体触媒物質（通常はレドックス酵素）とを直接的に共有結合させることが含まれる。多くの研究は、抗原もしくは抗体上の酵素ラベルによって分析的に発生した、NADPH(Wright,et al,1987;Tang,et al,1991)、フェノール(Wehmeyer,et a l,1986)、0₂(Aizawa et al,1987;Franconi,etal,.1987)、H₂O₂(Uditha,et al.,1 985;Tsuji,et al,1990)、NH₃（Gebauer,1987）等のような電気的活性種の、電流若しくは電圧による検出を利用している。この方法の高感度は、放射免疫検定の感度に匹敵するものである。しかし、抗原／抗体種の如何なるラベリングも伴わない電気的技術は、更に魅力的なものである。このような方法は、電極表面に固定された単分子層を通過するレドックス分子の透過性を、電流により検出することに基づいている。抗原単分子層は、該抗原に対して高い結合親和性を有する抗体を用いた同じ電極反応よりも、可溶化レドックスプローブに対して、更に高い透過性を与える（図１を参照のこと）(Niwa,et al.,1992;Willner,et al,1993;Willner et al,1994;Europe an Patent application No.668502)。〔発明の一般的説明〕本発明の目的は、液体媒質中におけるアナライト（該物質は認識ペアの一方のメンバーである）の存在および任意にその濃度を測定するための、電気化学的方法および装置を提供することである。本発明の更なる目的は、このような方法および装置において使用するための電極を提供することである。本発明の他の目的は、以下の説明から明らかになるであろう。本発明の方法および装置では、媒質中におけるアナライトの存在によって、電気的応答の変化の増大がもたらされる。以下で用いる「電気的応答」の用語は、電極の電流／電圧挙動、例えば一定の印加電圧等の下での電流応答または電極の電荷流を言う。この電気的応答は、交流または直流条件の下で、電流または電荷流を計測することによって測定することができる。本発明の方法および装置における電気的応答は、電極と、少なくとも二つのレドックス分子により形成された電子移動連鎖との間での電子移動の結果である。「レドックス分子」の用語は、電子を供与または受容することにより、その酸化還元状態を変化させることができる分子を言う。レドックス分子は、電極とレドックス分子との間、或いは二つのレドックス分子の間で電子を移動できる電子メディエータであってもよい。また、レドックス分子は、その酸化還元状態が変化すると触媒的に活性になり、続いて基質に作用する触媒分子であってもよく、この場合、該基質は化学的に異なった生成物に変化する。触媒的に活性なレドックス分子の非制限的な一例は、レドックス酵素である。本発明によれば、以下で更に説明するように、アナライトが試験媒質中に存在するときの最終的な結果は、電子移動の変化の減少、従って電極の電気的応答における変化である。上記のように、検出されるアナライトは、認識ペアの一方のメンバー物質、即ち、該物質が属するペアの他方のメンバーに対して特異的に結合する物質である。認識ペアは、例えば、抗原／抗体、リガンド／レセプター、糖／レクチン、ビオチン／アビジン、酵素／基質、相補的配列をもったオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド／タンパク、およびオリゴヌクレオチド／細胞である。本発明の方法および装置において、一つの認識ペアは、試験装置の一部を形成しており、電極に固定化される。該電極をアナライト（当該ペアの他方のメンバー）を含有する媒質に露出すると、これら二つのメンバーは相互に結合され、結果的にアナライトは電極に結合される。本発明は、その第一の側面において、液体媒質中におけるアナライトの存在を測定するための電気化学的装置を提供する。この装置は、少なくとも一つの第一のレドックス分子および少なくとも一つの第二のレドックス分子（前記第一の分子は、前記電極と前記第二の分子との間で電子を移動させる）と；認識ペアの一方のメンバー（前記アナライトは該認識ペアの他方のメンバーである）が表面に固定された電極であって、これにより前記媒質中の前記アナライトは対合した複合体（該複合体は固定化されたメンバーと前記アナライトとの間の複合体である）を形成する電極とを具備し；前記対合した複合体の形成は、電子移動およびその結果としての当該システムの電気的応答の変化を阻害し、これにより前記媒質中のアナライトの存在を示すものである。本発明の一実施例に従えば、第一および第二のレドックス分子は、個別的な分子であり、例えば、一方は電極表面に固定され、他方は周囲の媒質中を自由に動き回る。或いは、これら二つのレドックス分子は、例えば化学的リンカー分子によって相互に複合体化されてもよく、或いは、該複合体は、好ましくは電極の周囲の媒質中を自由に動き回ってもよい。電気的応答の変化は媒質中にアナライトが存在することを示すが、この変化の大きさは、所望に応じ、媒質中のアナライトの濃度を測定するための尺度として用いることができる。アナライトの濃度が高いときは大量の対合した複合体が形成され、従って、電気的応答に大きな変化を生じることが理解されるであろう。本発明は、もう一つの側面において、液体媒質中におけるアナライトの存在を測定するための電気化学的方法を提供する。この方法は：ａ）認識ペアの一方のメンバー（該認識ペアの他方のメンバーは前記アナライトである）が表面に固定され、任意に、第一のレドックス分子（該分子は電極と第二のレドックス分子との間で電子を移動させることができる）を固定した電極を準備することと；ｂ）前記電極を前記液体媒質と接触させることにより、該媒質中における前記アナライトの存在によって対合した複合体（これは前記電極の表面に固定されたメンバーと前記アナライトとの間の複合体である）の形成を生じさせることと；ｃ）前記電極を前記第二のレドックス分子と接触させ、前記第一のレドックス分子が前記電極に固定されていないときは、前記第一のレドックス分子とも接触させることと；ｄ）前記電極に通電することによって、前記電極と前記第二のレドックス分子との間で、前記第一のレドックス分子の媒介により電子が移動して電気的応答が生じ、電極を前記媒質に露出させた後の電気的応答の変化によって、前記媒質中における前記アナライトの存在が示されることとを具備する。本発明はまた、上記方法および装置のための有用な電極を提供する。本発明は、広範な媒質中のアナライトを試験するために有用である。これらには、体液、水性サンプル、食品サンプル等が含まれる。この試験されるアナライトは、試験すべき媒質中に元々存在する物質、例えば、生物学的液体中のホルモンであってもよく、組織内に隠された固体基質中に元々含まれているアナライト等であってもよいが、該アナライトを含有するサンプルは、先ず、アナライトが試験すべき媒質中に溶解するように処理される。このアナライトはまた、試験すべき媒質中に元々は存在せずに、他の物質が関与する反応の結果として入ってくる物質であってもよく、このような場合のアナライトの測定は、他の物質を測定するための間接的な手段として働く。本発明の方法および装置には、電極と、前記第一および第二の分子を含む少なくとも二つのレドックス分子とからなる電子移動連鎖が存在する。上記で指摘したように、本発明の幾つかの態様に従えば、二つの分子を相互に連結することが可能である。アナライトが存在しないとき、電極は固定化されたメンバーを含む薄い単分子層を有しており、従って、連鎖に沿った実質的に障害のない電子移動が存在する。アナライトが固定化されたメンバーに結合し、分子複合体が電極表面に形成されると、単分子層が厚くなり、結果的に電子移動連鎖が減損して、電極の電気的応答が減少する。本発明の一態様に従えば、前記第一のレドックス分子は、前記第二のレドックス分子への電子の移動に際し、前記第二のレドックス分子を１以上の生成物に変換する反応を誘起する触媒的に活性な分子である。本発明の他の態様に従えば、前記第一のレドックス分子は電気的メディエータであり、前記第二のレドックス分子は触媒的に活性な分子である。この態様に従えば、電気触媒的レドックスプロセスにおいて生成物に変換される第３の分子（基質）も与えられる。この場合、電子の連鎖には二つのレドックス分子および基質が含まれている。上記二つの態様において、前記第一のレドックス分子は、前記固定化されたメンバーと共に電極に固定化してもよい。電子移動を生じさせるために、溶液中を自由に動き回っている第二のレドックス分子は、固定化された第一のレドックス分子へと拡散し、且つこれと接触しなければならない。アナライトを含む媒質への電極の露出に続いて、電極表面に対合した複合体が形成され、電極表面の単分子層が厚くなり、固定化された第一のレドックス分子への第二のレドックス分子の拡散に対する障壁ができて、電子移動連鎖の減損が生じる。本発明の更なる態様に従えば、第一および第二のレドックス分子は、固定化されたメンバーにアナライトが結合する前に複合体化される。該複合体は自由に拡散して、電子移動を可能にするように電極表面に十分近接することができる。対合した複合体が電極表面に形成されると、レドックス複合体は電極表面に到達することができず、その結果として電子移動は減損され、電気的応答が減少する。〔図面の簡単な説明〕図１は、ヨーロッパ特許出願公報第668,502号に開示された従来技術の装置を摸式的に表した図である。図１Ａは、対合した複合体が形成される前の、装置および電気的応答を示している。図１Ｂは、対合した複合体が形成された後の、装置および電気的応答を示している。図２は、−実施例に従う装置を一般的に示す図であり、その電極は、固定化メンバーおよび固定化された触媒活性レドックス分子を含んだ混合単分子層である。図２Ａは、アナライトに露出する前の装置を示している。図２Ｂは、アナライトに露出され且つ対合複合体が形成された後の装置を示している。図３は、固定化されたメンバーおよび固定化された電子メディエータレドックス分子を含む混合単分子層を電極に担持させた、本発明の他の実施例に従う装置を一般的に示す図である。図３Ａは、アナライトに露出する前の装置を示している。図３Ｂは、アナライトに露出され且つ対合複合体が形成された後の装置を示している。図４は、二つのレドックス分子（一方は電子メディエータ分子であり、他方は触媒活性レドックス分子である）が複合体化され、または相互に結合された、本発明の他の態様に従う装置の一般的な説明図である。図４Ａは、アナライトに露出される前の装置を示している。図４Ｂは、電極がアナライトに露出され、且つ対合複合体が形成された後の装置を示している。図５は、シスタミン被覆金電極を、２，６−ジニトロフェノールリジンおよびミクロペルオキシダーゼからなる混合単分子層で修飾する方法を示している。図５Ａは、修飾の順序を示している。図５Ｂは、ミクロペルオキシダーゼ（ＭＰ）の構造を示している。図６は、図５に示したようにして得られた電極上の第一のレドックス分子（ＭＰ）と、第二のレドックス分子（Ｓ₂Ｏ₈ ^-2）の電気触媒的還元における機能を示している。図６Ａは、抗体に露出される前の、電極の機能および電流応答の模式図を示している。図６Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電極の電流応答の模式図を示している。図７は、図５および図６に示した修飾金電極を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）および0.1Ｍ Na₂SO₄を含有する対照溶液中での結果；（ｂ）50mM Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈の存在下での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。電圧走査速度は- 10mv/s；温度は-25℃である。図８は、シスタミン被覆金電極を、２，６−ジニトロフェノールリジンおよびＰＱＱからなる混合単分子層で修飾する方法を示している。図９は、図８に示したようにして得られた修飾電極の機能を示しており、ここでは第一のレドックス分子、即ちＰＱＱが、第二のレドックス分子であるNADPH を酸化する電気触媒として作用する。図９Ａは、抗体に露出される前の装置および電流応答の模式図を示している。図９Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電流応答の模式図を示している。図１０は、図８および図９に示した修飾金電極を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.1Ｍ Tris-HCl緩衝液（pH7.0）を含有する対照溶液中での結果；（ｂ）10mM ADPHおよび20mMカルシウム+2の存在下での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。電圧走査速度は２mv/s；温度は25℃である。図１１は、異なった抗体濃度を用いて図１０（ｃ）の方法で行った実験における、電流と抗体濃度との間の関係を示している。図１２は、２，６−ジニトロフェノールリジンおよびフェロセン基からなる混合単分子層を用いた、シスタミン被覆金電極の修飾の方法を示している。図１３は、図１２に示したようにして得られた修飾電極の機能を示しており、ここでフェロセンは第一のレドックス分子として作用し、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は第二のレドックス分子として作用し、グルコースは基質として作用する。図１３Ａは、電極を抗体に露出させる前の装置および電流応答の模式図を示している。図１３Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電流応答の摸式図を示している。図１３Ｃは、遊離の、即ち非固定化フェロセンモノカルボン酸を添加した際の、図１３Ａに示したのと同様の電流応答の機能を示している。図１４は、図１２および図１３に示した修飾金電極を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を含有する対照溶液中での結果；（ｂ）５mg/mlのＧＯＤおよび50mMグルコースを更に含有する同様の溶液中での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。（ｄ）（ｃ）と同様であるが、0.5mMフェロセンモノカルボン酸を添加したときの結果。電圧走査速度は２mv/s;温度は35℃である。図１５は、金電極を修飾して単一成分２，６−ジニトロフェノールリジンの単分子層を得る方法を示している。図１６は、グルコースオキシダーゼ酵素（ＧＯＤ）を、複数のランダムに位置するフェロセン基に「電気的に連結」する方法を示している。図１７は、図１５に示した電極と、図１６に示すようにして調製された「電気的に連結された」ＧＯＤとを含む装置の機能を示している。図１７Ａは、電極を抗体に露出させる前の装置および電流応答の模式図を示している。図１７Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電流応答の模式図を示している。図１７Ｃは、遊離のフェロセンモノカルボン酸を添加した後の、図１７Ａの電気的応答の回復を示している。図１８は、図１７に示した修飾金電極を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を含有する対照溶液中での結果；（ｂ）５mg/mlの「連結された」ＧＯＤおよび50mMグルコースを含有する同様の溶液中での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。（ｄ）（ｃ）と同様であるが、0.5mMフェロセンモノカルボン酸を添加した溶液中での同じ電極の結果。電圧走査速度は２mv/s；温度は35℃である。図１９は、種々の抗体濃度の抗体溶液中で６分間インキュベートした後に、図１５（ｃ）のようにして行われた実験における電気触媒的電流の変化を示している。図２０は、フェロセン基に共有結合したＦＡＤ類縁体（FAD-Fc）の調製における最後の合成ステップを示している。図２１は、ＧＯＤアポ酵素の調製と、図２０に示したようにして得たＦＡＤ− Ｆｃを用いることによるその再構成を示している。図２２は、図１５に示した電極を具備する装置の機能と、図２１に示したようにして得た再構成酵素を示している。図２２Ａは、電極を抗体に露出させる前の装置および電流応答の摸式図を示している。図２２Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電流応答の模式図を示している。図２２Ｃは、遊離のフェロセン分子を添加した際の、電気的応答の回復を示している。図２３は、図２２に示した修飾金電極を用いて得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を含有するバックグラウンド溶液中での結果；（ｂ）ＦＡＤ−Ｆｃで再構成された５mg/mlのＧＯＤおよび50mMグルコースを含有する同様の溶液中での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。（ｄ）（ｃ）と同様であるが、0.5mMフェロセンモノカルボン酸を添加した溶液中での結果。電圧走査速度は２mv/s；温度は35℃である。図２４は、図１５の単一成分の２，６−ジニトロフェノールリジン単分子層で被覆された修飾電極を具備する装置、並びにＤ−アラニン、およびＦＡＤ−Ｆｃで再構成されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）の機能を示している。図２４Ａは、電極を抗体に露出させる前の装置および電流応答の模式図を示している。図２４Ｂは、抗体に露出され且つ対合複合体が形成された後の、装置および電流応答の模式図を示している。図２４Ｃは、遊離のフェロセンモノカルボン酸を添加した後の、図２４Ａで得られる電気的応答の回復を示している。図２５は、図２４に示した装置において得られたサイクリックボルタンメトリーの結果を示している。（ａ）0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を含有するバックグラウンド溶液中での結果；（ｂ）ＦＡＤ−Ｆｃで再構成された５mg/mlのＧＯＤおよび50mMグルコースを含有する同様の溶液中での結果；（ｃ）50mg/mLの抗ジニトロフェノール抗体を含有する溶液中で修飾電極を2 0分インキュベートした後の、同じ溶液中での結果。（ｄ）（ｃ）と同様であるが、0.5mMフェロセンモノカルボン酸を添加した溶液中での同じ電極の結果。電圧走査速度は２mv/s；温度は35 ℃である。〔発明の詳細な説明〕以下、添付の図面に示す非限定的な特定の実施例を参照して、本発明を説明する。この特定の説明は、本発明の範囲に何らかの限定加えることを意図するものではなく、単に、本発明を実施する様式を例示するに過ぎないことが理解されるであろう。本発明に従えば、結合ペアのメンバー（電極に固定される）を含む単分子層で被覆された電極が用いられる。この電極は、媒質中のアナライト（固定化メンバーを含む結合ペアの他方のメンバー）の測定のために用いられる。本発明の幾つかの実施例に従えば、電極上に固定化される層は、実質的に前記固定化メンバーのみからなる。本発明の他の実施例に従えば、電極表面の固定化された分子の層は、前記固定化メンバーおよび固定化されたレドックス分子の両者を含む混合層である。本発明を理解するために、先ず図１を参照して説明するが、これはヨーロッパ特許出願第668,502号に記載された従来技術の装置を示している。この装置において、電極２は、複数の固定化メンバー４からなる単分子層で被覆される。該装置は、更に、酸化状態（Rox）または還元状態（Rred）の何れかであり得るレドックス分子（Ｒ）を含んでいる。電極に通電すると、電極とレドックス分子との間で電子が移動し、電子移動のタイプに応じて、装置は酸化経路または還元経路で進行する。電極の電気的応答は、右側に模式的に示されている。アナライト（この例では図１Ｂに示すように抗体６である）を含有する媒質に電極を露出させると、電極上で固定された対合複合体が形成され、これによって固定化された単分子層が厚くなり、電極表面へのレドックス分子の拡散が阻害される。こうして拡散が減損されるため、右側の模式図に見られるように、電気的応答は小さくなる。この従来技術の装置において、電子移動の変化には、電極とレドックス分子との間の１段階移動が関与している。これとは明確に異なって、本発明によれば、電子移動経路は少なくとも二つの電子移動ステップを含んでいる。このように電子移動の連鎖が長いと、不完全な固定化された単分子層構造の結果として、感度は増大し、不正確さは減少する。本発明の増大した感度は、特に、一方のレドックス分子が電極に固定され、他方が相対的に高分子量をもった比較的大きな分子である場合に現れる。本発明による方法の一般的な利点は、従来技術に比較して、信号／バックグラウンド比が顕著に増幅されることである。本発明による一つの好ましい実施例の模式図が、図２に示されている。この実施例に従えば、電極１０は、該電極に固定された単分子層１２を有しており、この単分子層は固定化メンバー１４および触媒レドックス分子１６を含んでいる。触媒分子１６は、電極１０との間で電子を交換することにより、その酸化還元状態を変化させることができる。その酸化還元状態が変化すると、該分子は触媒的に活性になり、その際にレドックス分子Ｒの酸化還元状態の変化を誘導する。電極１０は、電源１８および対向電極２０を含む電気回路の一部を形成する。加えて、電気化学的装置における慣習として、典型的には、該装置は参照電極、例えば飽和カロメル電極（図示せず）をも含んでいる。図２Ｂは、電極をアナライト分子２２（例えば抗体であってもよい）に露出した後の装置を示しており、該分子は、結合すると固定化された対合複合体２４の形成をもたらし、固定化された触媒レドックス分子１６へと向かうレドックス分子の拡散に対する障壁を与える。結局、電子移動連鎖における減損と、装置の電気的応答の顕著な低下が生じる。しかし、単分子層には幾つかの「ピンホール」が存在するから、電極の表面へのレドックス分子の幾らかの拡散は可能であり、従って、アナライト２２の固定化メンバー１４への飽和結合の後であっても、幾らかの電気的応答は残存する。図３および図４には、二つの他の好ましい実施例が記載されている。説明を容易にするために、これらの実施例における同様の要素には図２で使用したのと同様の番号を付してあるので、夫々の部材の機能説明については図２を参照されたい。図３のシステムにおいて、電極１０の表面に固定された単分子層２５は、固定化メンバー１４と電子メディエータレドックス分子２６とを含んでいる。メディエータ分子２６は、電極１０と可溶性の触媒活性レドックス分子２８（例えば酵素であってもよい）との間で電子を移動させることができる。電極１０に通電すると、電子は電極と分子２８との間で移動し、結果として、分子２８は、基質Ｓが生成物Ｐに変換される反応またはその逆反応（レドックス反応の方向に依存する）を触媒する。適正な電子移動は、分子２８が電極メディエータ分子２６に近接するような、分子２８の電極表面への拡散に依存する。アナライト２２が結合して対合複合体が形成されると、大きさを想定すれば、分子２８の電極表面への拡散が妨げられ、結局、電子移動における減損を生じ、装置の電気的応答は顕著に減少して殆どゼロになる。次に、図４を参照して説明する。この実施例において、電極１０上の単分子層３０は、実質的に固定化メンバー１４のみからなる。触媒活性分子３２は、電子メディエータレドックス分子３４に結合または複合体化し、これらは一緒になって複合体３６を形成する。複合体３６が電極１０の表面に近づくと、電子メディエータ分子３４は、電極に通電したときに、電極１０と分子３２の触媒中心との間で電子を移動することができる。酸化還元状態が変化すると、分子３２（例えば酵素であってもよい）は、基質が生成物に変化４する反応（または逆反応）を触媒する。アナライト分子２２が固定化メンバー１４に結合すると、図４Ｂに示すように、複合体３６の電極表面への拡散が阻害され、従って、電極１０と分子３２との間の電子移動が妨げられ、従って、装置の電気的応答が低下する。装置の電気的応答は、電極を適切な電圧に充電することにより、或いはサイクリックボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー等の種々の電気化学的方法によって直接測定してもよい。しかし、他の手段、例えば、電荷流を測定することによって、電気的応答を測定することも可能である。更に、反応によって生成物が形成される場合は、同時に、生成物の蓄積速度を測定することにより、電気的応答を間接的に測定することが可能である。この電極は、導電性物質、例えば金、プラチナ、銀、外表面に官能化アルコキシシランを有する酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）のような導電性ガラスで作成またはコートすればよく、ＩＴＯ電極のシラン処理は、例えば該電極をアルゴン雰囲気中で、乾燥トルエン中の３−アミノプロピルトリエトキシシランと共に還流し、次いでオーブン中で乾燥することにより行えばよい。固定化メンバーまたは固定化されたレドックス分子は、連結基によって電極の表面に固定化すればよく、これは典型的には下記の一般式（Ｉ）を有している。Ｚ−Ｒ¹−Ｑ（Ｉ）ここで、Ｚ電極材料が上記金属のうちの一つである場合には、前記金属と化学的に会合、結合または化学吸着することができる硫黄含有部分を表し；電極材料がガラスである場合は、前記ガラスと会合、結合または化学吸着することができるメトキシシラン残基またはアルコキシシラン残基を表し；Ｒ¹ 連結基を表し；Ｑ固定化メンバーまたは前記第一のレドックス分子中の部分と共有結合を形成できる官能基である。電極が金属の場合のＺは、例えば、チオール基もしくはジスルフィド基、またはスルホネートもしくはサルフェート基がら得られる硫黄原子であることができる。Ｒ¹は、共有結合であってもよく、ペプチド若しくはポリペプチドであってもよく、または非常に広範囲の適切な基（例えばアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、フェニル含有鎖）等であってもよい。Ｒ¹の特定の例は、化学結合、または下記の式(IIａ)、(IIｂ)、(IIｃ)または( IIｄ)である。ここで、Ｒ²またはＲ³は、同じか若しくは異なって、直鎖または分岐鎖のアルキレン、アルケニレン、アルキニレンであることができ；ＡおよびＢは、同じか若しくは異なって、ＯまたはＳであることができ；Ｐｈは、例えばＳＯ₃ ^-またはアルキル基からなる群から選択された一以上のメンバーで任意に置換されたフェニル基である。Ｑは、例えば認識ペアのメンバーのカルボキシル残基に結合することができる官能基（例えばアミン基）、認識ペアのメンバーのアミン残基に結合できるカルボキシル基；認識ペアのメンバーのアミン残基に結合できるイソシアネート基、イソチオシアネート基またはアシル基；またはタンパク若しくはポリペプチドのヒドロキシ残基に結合できるハロゲン基であることができる。特定の例は、−ＮＨ²−ＣＯＯＨ；−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ；Ｎ＝Ｃ＝Ｏ；または−Ｒ^a−ＣＯ−Ｇの式を有するアシル基［ここで、Ｇは水素、Ｃｌのようなであり；Ｒ^aおよびＲ^bは独立にＣ₁〜Ｃ₁₂アルキル、アルケニル、または任意に例えばハロゲンによって置換される鎖を含んだフェニルである］である。連結基の特定の例は、下記の式（III）〜（VII）で示されるものである。ここで、ｎは１〜６の整数である。本発明の装置の感度は、大きな分子または分子の基と結合または複合体化するアナライト分子（以下、ときには「複合化したアナライト」という）を使用することによって増大することができる。固定化メンバーへの結合、即ち、複合体化した被検分子はレッドックス分子が電極材料に接近するのを立体的に妨害する。一実施例によれば、これは、大きな分子に結合したアナライトまたは分子の複合体、例えばアナライト抗体に対する抗抗体、蛋白アナライトに対する抗体等を使用することによって達成される。他の実施例では、アナライトが固定化メンバーに結合された後に、結合したアナライトに結合できる試薬を電極に作用し、これにより該試薬はアナライトと複合体を形成して立体障害を生じさせる。立体障害を増大させるためには、初期複合体の形成後に、電極を、固定化されたアナライトに既に結合しまたは複合体化した試薬と結合または複合体化する抗試薬、例えば抗抗体と反応させる。これによって複合体のサイズは増大し、従って立体障害が増大する。上記でのべた方法で装置の感度を増大させることにより、電極の電気的応答における変化は、極く少数のアナライト分子だけが電極に結合した後にも測定することができる。〔実施例〕次に、以下の実施例において本発明を更に説明する。これらの実施例においては、電極を抗原であるジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む単分子層で被覆した後、これに抗ＤＮＰ抗体を結合させた。これは、電極の表面に固定化できる無数の抗原のみの実施例であることが分かるであろう。更に、抗体／抗原認識ペアは、本発明に従って利用できる種々の他のこのようなペアの一例であることは明らかであり、この認識ペアの一方は電極に固定化され、他方は分析されるアナライトである。上記の一般的な説明は、以下の具体的な実施例に示した他の特定の試薬、酵素、触媒、レドックス分子等に関しても同様に真実である１．電極の特徴付けおよび電気化学的セットアップ全ての変形および測定について、金電極（略0.2cm²の幾何学的領域を有する直径0.5mmのＡｕワイヤ）を用いた。0.5Ｍ H₂SO₄中で記録されたサイクリックボルタモグラムを用いて、修飾の直前に電極表面の純度を測定した。電極表面における酸化層の電気化学的還元に関するカソードピークをインテグレートすることにより、実際の電極表面積および粗さの計数を、同じサイクリックボルタモグラムから評価した。電気化学的測定は、パーソナルコンピュータ（EG＆G research electrochemis try software model 270/250）に接続したポテンショスタット（EG＆G VersaSta t）を用いて行った。全ての測定は、作業電極としての化学的に修飾された電極と、ガラスフリットにより絶縁されたガラス状炭素補助電極と、ルギン(Luggin) キャピラリーで作業容積に連結された飽和カロメロ電極（ＳＣＥ）とを具備した、３コンパートメントの電気化学的セルの中で行った。全ての電圧は、この参照電極（ＳＣＥ）に基づいて記録される。アルゴンバブリングを用いて、電気化学的セルの中の溶液から酸素を除去した。測定の間に、セルの回りのジャケットに水を循環させることにより、セルの温度を測定した。２．電極修飾における予備工程２．１電極表面の洗浄以前の有機層を除去し、裸の金属表面を形成するために、２m KOH溶液中で１時間沸騰させることにより電極を処理し、次いで水で濯ぎ、濃硫酸中に保存した。更に修飾を行う直前に、電極を水で注ぎ、濃硝酸中に10分間浸漬し、次いで再度水で濯いだ。２．２シスタミンを用いた電極の修飾正常な裸の金電極を、水中の0.02Ｍシスタミン（2,2'-ジアミノジエチルジスルフィド、アルドリッチ社）の溶液中に２時間浸漬した(図１５に示した手順の第一ステップを参照のこと)。次いで、この電極を水で十分に注いで過剰のシスタミンを除去した。３．抗原成分および触媒（電子移動メディエータ）成分からなる混合単分子層を有する電極３．１抗原としてのジニトロベンゼン誘導体および触媒としてのミクロペルオキシダーゼシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、３mMの2,6-ジニトロフェニルリジン(抗原として)、１mMの触媒ミクロペルオキシダーゼＭＰ-11(アルドリッチ社)、およびカップリング剤として働く10mMの 1-エチル-3-(3-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC、アルドリッチ社）を含有する0.01Ｍ HEPES緩衝液（pH7.3）中に１時間浸漬した。次いで、この修飾電極を水で十分に濯ぎ、その表面から未結合の物理的に吸着された成分を除去した。この修飾スキームは図５に示されている。サイクリックボルタモグラムは、0.1Ｖ／ｓの電圧走査速度で、０Ｖ〜0.6Ｖのポテンシャル窓で取り、また、固定化されたミクロペルオキシダーゼの電気化学的に可逆的なレドックスプロセスを用いて、電極表面上におけるその表面密度を測定した。得られた約3・10^-11 の値は、ミクロペルオキシダーゼ単独で形成した単一成分単分子層で得られた値の略半分であった。電極４０が固定化された2,6-ジニトロフェニルリジン分子４２（三角形はジニトロフェニル(DNP)部分を表す）およびミクロペルオキシダーゼ分子（MP）を含むとき、得られた電極の機能は図６に見ることができる。電極４２が通電されると、電子はMP分子へと移動され、結果的にＭＰ分子はＳ₂Ｏ₈ ^-2のＳＯ₄ ^-2への還元を触媒する。次いで、電極に固定化されたDNA分子に結合する抗DNP抗体に電極を曝すと、図６Ｂに見られるように、電極の表面上の単分子層は厚くなり、固定されたMP分子へのＳ₂Ｏ₈ ^-2およびＳＯ₄ ^-2の拡散、並びに該MP分子からの拡散をそれぞれ阻害する。その結果、抗体が結合した後は、装置の電気的応答は低下する。この装置で得られたサイクリックボルタモグラム（25℃で）は、図７に示されている。曲線ｂは、50mM K₂S₂O₈(その後ミクロペルオキシダーゼにより電気的に還元される)、0.001Ｍリン酸緩衝液および0.1Ｍ Na₂SO₄の存在下で得られたサイクリックボルモグラムを示している。曲線ａは、比較のために、K₂S₂O₈の不存在下で取ったサイクリックボルタモグラムを示している。曲線ａと曲線ｂとの間の、カソード電流の顕著な増大はK₂S₂O₈の電気触媒的還元の結果である。曲線ｃは、曲線ｂのサイクリックボルタモグラムと同じ条件下ではあるが、50mg/ml DNP 抗体（モノクローナルマウスIgE抗DNP、シグマ社、セントルイス）を含有する溶液に電極を20分間浸漬し、次いで水で濯いで過剰の抗体を除去した後に得られたサイクリックボルタモグラムを示している。電気触媒的なカソード電流の顕著な減少は、電極の表面に結合した抗体のブロック硬化によって生じる。対照実験、即ち、非特異的に吸着されたタンパク(例えばアルブミン)、またはミクロペルオキシダーゼのみ（抗原ナシ）でコートされた電極の場合は、抗DNP 抗体に露出させた後にも、カソード電流には如何なる低下も生じなかった。３．２抗原としてのジニトロベンゼン誘導体および触媒としてのピロロキノリンキノンシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、３mMの2,6-ジニトロフェニルリジン(抗原として)、１mMの触媒ピロロキノリンキノン(PQQ)(アルドリッチ社)、およびカップリング剤を与える10mM 1-エチル-3-(3-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC、アルドリッチ社）を含有する0.01Ｍ HEPES緩衝液（pH7.3）の中に、１時間浸漬した。次いで、この修飾電極を水で十分に濯ぎ、その表面から未結合の物理的に吸着された成分を除去した。この修飾スキームは、図８に示されている。サイクリックボルタモグラムは、0.05Ｖ／ｓの電圧走査速度で、+0.1Ｖ〜-0.5Ｖのポテンシャル窓で取り、また、固定化されたPQQの電気化学的に可逆的なレドックスプロセスを用いて、電極表面上におけるその表面密度を測定した。得られた約3・10^-11mol・cm^-2の値は、PQQ単独で形成した単一成分単分子層で得られた値よりも略４倍小さかった。得られた電極の機能を図９に示す。図６の電極と同じ部品には、同じ参照番号を付してある。その完全な説明については図６の説明を参照されたい。この例では、図６に示した例とは異なり、触媒はPQQであり、こえはNADPHがNADP+に酸化される際の還元において触媒的に活性になる。NADPHは比較的大きな分子であり、抗体４４が固定化された抗原４２に結合すると、固定化されたPQQへのNADPHの接近は、図６の例におけるK₂S₂O₈の拡散阻止よりも遥かに効率よく阻止される。この装置で得られたサイクリックボルタモグラムが図１０に示されている(全て25℃で行った)。曲線ｂは、10mM NADPH(これはPQQによって電気触媒的に酸化される基質である)、20mM Ca⁺(これはPQQによる NADPHの電気酸化のプロモータである)、0.1Ｍ TRIS-HCl緩衝液（pH7.0）の存在下で得られたサイクリックボルモグラムを示している。曲線ａは、比較のために NADPHの不存在下で得たものであり、曲線ｂの大きなカソード電流は、NADPHの電気触媒酸化の結果であることを示している。３．１と同じ抗DNP抗体溶液線中に2 0分間電極を浸漬した後に、NADHの電気触媒酸化における完全な阻害が生じた(曲線c)。図１１は、アノード電気触媒電流が抗体濃度に依存し、抗体濃度が増大すると飽和に近づくことを示している。３．３抗原としてのジニトロベンゼン誘導体および電子移動メディエータとしてのフェロセンユニットシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、３mMの2,6-ジニトロフェニルリジン(抗原として；アルドリッチ社)、フェロセンユニットとカルボキシル基との間に長いスペーサを有する１mMのフェロセンカルボン酸誘導体（電子移動メディエータとして）、およびカップリング剤として働く10mM 1-エチル- 3-(3-ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC、アルドリッチ社)を含有する0.01Ｍ HEPES緩衝液（pH7.3）の中に、１時間浸漬した。次いで、この修飾電極を水で十分に濯ぎ、その表面から未結合の物理的に吸着された成分を除去した。この修飾スキームは、図８に示されている。サイクリックボルタモグラムは、 0.1Ｖ／ｓの電圧走査速度で、-0.1Ｖ〜+0.55Ｖのポテンシャル窓で取り、また、固定化されたフェロセンの電気化学的に可逆的なレドックスプロセスを用いて、電極表面上でのその表面密度を測定した。得られた約2.5・10^-11mol・cm^-2の値は、フェロセン単独で形成した単一成分単分子層で得られた値よりも略４倍小さかった。次に、上記の電極を具備した装置を示す図１３を参照して説明する。この装置は、固定化されたフェロセン分子および抗原５２を含んだ固定化層５１を有する電極５０を具備している。この装置は更に、グルコースを酸化してグルコン酸を生じる反応を触媒できる、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）５４を具備している。通常の条件下において、ＧＯＤは電極に接近することができ、これによりＧＯＤと第一のレドックス分子（固定化されたフェロセン）との間の電子移動が可能になり、このような移動に際して、ＧＯＤは酸化反応を触媒し、右側に示した模式的サイクリックボルタノグラムに示されるように比較的大きな電気的応答が生じる。抗体５６が抗原５２に結合すると、固定化されたフェロセン分子へのＧＯＤ分子の接近は阻止され、結果的に電子移動およびグルコースの酸化はなくなる。これによって、右側のサイクリックボルタモグラムに図式的に示すように、非常に小さい電気的応答が生じる。遊離のフェロセンモノカルボン酸分子をシステムに添加することによって、図１３Ｃに示すように、電子移動連鎖を修復することができる。このようなシステムで得られるサイクリックボルタモグラム（35℃）が、図１４に示されている。曲線ｂのサイクリックボルタモグラムは、５mg/mlのグルコースオキシダーゼ(ＧＯＤ、アスペルギルス・ニガー由来、EC1.1.3.4、シグマ社 )、50mMグルコース（ＧＯＤによって電気触媒的に酸化される基質)、0.01Ｍリン酸緩衝液および0.1Ｍ Na₂SO₄の存在下で得られたものである。グルコースの不存在下で得られた曲線ａと比較すれば、アノード電流の非常に大きな増加が、ＧＯＤによるグルコースの塩基触媒酸化の結果であることが分かる。このバイオ触媒プロセスは、可溶化ＧＯＤから電極への電子移動を容易にするフェロセンユニットの存在下でのみ生じる。修飾電極を、50mg/mlの抗DNP抗体を含有する溶液中に 20分間浸漬すると、アノード電流は全体的になくなる(曲線c)。これは、グルコースの電気触媒酸化が抗体単分子層によって完全に阻止されたことを示している。曲線ｄから分がるように、可溶化フェロセンモノカルボン酸（アルドリッチ社）を5・10^-3の濃度で添加すると、これは拡散で移動する電子移動メディエータとして働き、アノード電流は殆ど正常に修復される。４．抗原成分のみからなる単分子層をもった電極４.１電極表面の固定化単分子層抗原としてのジニトロベンゼン誘導体、および多くのフェロセンユニットで修飾された可溶化バイオ触媒プローブとしてのグルコースオキシダーゼシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、３mMの2,6-ジニトロフェニルリジン（アルドリッチ社；抗原として）および10mM 1-エチル-3-(3- ジエチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC、アルドリッチ社；カップリング剤として）を含有する0.01Ｍ HEPES緩衝液(pH7.3)の中に３時間浸漬した。次いで、この修飾電極を水で十分に濯ぎ、その表面から未結合の物理的に吸着された成分を除去した。この修飾スキームは、図１５に示されている。グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）におけるリジン残基のアミノ基を、カルボジイミドカップリング剤（ＥＤＣ）の存在下でフェロセンカルボン酸誘導体に結合させ、次いでこの修飾酵素を公知の方法で精製することによって、ＧＯＤを多くのフェロセンユニットで共有結合的に修飾した。この酵素修飾スキームおよび修飾された酵素の構造は、図１６に示されている。上記の電極を具備した装置の機能が図１７に示されている。図１３におけると同様に、正規の条件下では、修飾酵素６４は電極６０に接近することができ、また、電子は酵素のレドックス中心からこれに結合したフェロセン基へ、またそこから電極表面へと移動することができ、こうしてグルコースの酸化が生じる。抗体６６が固定化された抗原６２に結合すると、修飾酵素６４は電極の表面に近接することができず、従って、装置の電気的応答は必然的に全体として排除される。電気的移動の連鎖は、図１７Ｃに示すように、３フェロセンカルボン酸分子を媒質中に添加することによって回復することができる。図１８は、図１７に示した装置で得られたサイクリックボルタモグラムを示している。全てのサイクリックボルタモグラムは35℃で行われた。サイクリックボルタモグラムは、５mg/mlのフェロセン修飾ＧＯＤ、0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7）および0.1Ｍ Na₂SO₄の存在下で得られたものである。このような条件下では、アノード電流は本質的に存在しなかった(曲線c)。グルコースを添加すると(50mM) 、アノード電流は非常に大きく増大した(曲線b)。この電極を抗DNP抗体溶液（50 mg/ml）中に20分間浸漬し、次いで水で濯いだ後に、アノード電流は本質的に完全に排除された(曲線c)。この電気触媒プロセスは、5・10^-3Ｍの遊離のフェロセンモノカルボン酸を添加することによって或る程度回復することができた(曲線d)。図１９は、異なった抗体濃度を用いて上記のように行った種々の実験結果を示しており、これから分かるように、アノード電流の変化は抗体濃度に依存する。４．２電極表面上の固定された抗原単分子層としてのフルオレセイン誘導体、および可溶化バイオ触媒プローブとしての多くのフェロセンユニットで修飾されたグルコースオキシダーゼシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、５mMのフルオレセインイソシアネート（異性体１、アルドリッチ社；抗原として）を含有する0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH8.9）の中に一晩浸漬した。フルオレセインユニットのシスタミン単分子層への共有結合は、表面のアミノ基とイソシアネート基との間の自然な反応として生じ、チオアミド結合を与えた。次いで、この修飾電極を水で十分に濯ぎ、その表面から未結合の物理的に吸着された成分を除去した。この抗原修飾電極を、適用抗体が抗フルオレヤイン(FITC)モノクローナル抗体（シグマ社）であることだけが異なり、それ以外は４．１で説明したようにして、電気化学的免疫検定のために使用した。全ての電気化学的測定は35℃で行った。得られた結果は、先の実施例４．１で上述したものと極めて類似していた。４．３電極表面上の固定された抗原単分子層としてのジニトロベンゼン誘導体、およびフェロセンユニットに共有結合した半合成ＦＡＤで再構成されたグルコースオキシダーゼシスタミン単分子層を有するように修飾された金電極を、上記と同様にして 2,6-ジニトロフェノールリジンで更に修飾した。ＧＯＤアポ酵素を公知の生化学的手法⁽²⁵⁾によって得た。二つのメチレン基と共に、ＦＡＤ分子から分離された一級アミノ基を含む半合成ＦＡＤ（Ｎ⁶−（２−アミノエチル）−ＦＡＤ）を、カルボジイミドカップリング剤を用いてフェロセンカルボン酸誘導体に共有結合させて、二つの成分の間にアミド結合を生じさせた。このフェロセンユニットと共有結合したＦＡＤ誘導体（FAD-Fc）は、ＧＯＤアポ酵素を再構成するために用いられた⁽²⁷⁾。FAD-Fcを製造する最後の合成ステップ、ＧＯＤアポ酵素の製造、およびFAD-Fcを用いたその再構成は、図２０および図２１にそれぞれ示されている。この電極を具備した装置は、図２２に模式的に示されている。該装置は、基本的には図１７に示した装置と同じであり、従って、同様の成分を指定するためには同様の番号を用いた。唯一の相違は、フェロセン基が酵素に結合するのではなく、ＦＡＤ誘導体に結合されることである。上記の４．２で説明したのと同じ条件下で得られたサイクリックボルタモグラムの結果が、図２３に示されている。図から分かるように、この結果は図１８の結果と質的には同様である。即ち、グルコースが存在しないと実質的に電流は存在せず(曲線a)、グルコースの添加の後にアノード電流は非常に大きく増大し(曲線b)、電極が抗DNP抗体に対する支持になった後には実質的に全ての電流が排除され(曲線c)、次いでフェロセンモノカルボン酸分子の添加の後には電気的応答が回復する(曲線d)。４.４電極表面の単分子層固定化抗原としてのジニトロベンゼン誘導体、およびフェロセンユニットに共有結合した半合成ＦＡＤを用いて再構成されたアミノ酸オキシダーゼこの例は、４．３での実験と殆ど同一であり、唯一異なるのは、再構成されたＧＯＤおよびグルコースの代わりに、FAD-Fcを用いて再構成されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ（AAO、EC1.4.3.3、シグマ社）および対応する基質（D-アラニン）を用いたことである。図２２の装置と本質的に同様であるこの装置は、図２４に示されている(この図では、図２２と同じ参照番号が用いられている)。この装置で得られた結果は図２５に示されており、図２３の結果と質的には同じである。即ち、バックグラウンド(曲線a)、グルコースを添加したとき(曲線b)、抗ＤＰ抗体に露出した後(曲線c)、および可溶性フェロセンモノカルボン酸を添加した後(曲線d)である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９３Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５７ 27/46 ３３６Ｇ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コーエン、イェールイスラエル国、96674 エルサレム、ハイム・ハビブ・ストリート７／28 (72)発明者ブロンダー、ロンイスラエル国、93146 エルサレム、ハラケベット・ストリート 49

Claims

【特許請求の範囲】１．液体媒質中におけるアナライトの存在を測定するための電気化学的装置であって；少なくとも一つの第一のレドックス分子および少なくとも一つの第二のレドックス分子（前記第一の分子は、前記電極と前記第二の分子との間で電子を移動させる）と；認識ペアの一方のメンバー（前記アナライトは該認識ペアの他方のメンバーである）が表面に固定された電極であって、これにより前記媒質中の前記アナライトは対合した複合体（該複合体はこの固定化されたメンバーと前記アナライトとの間の複合体である）を形成する電極とを具備し；前記対合した複合体の形成は、電子移動およびその結果としての当該装置の電気的応答変化を阻害し、これにより前記媒質中のアナライトの存在が示される装置。２．請求項１に記載の装置であって、前記第一のレドックス分子は、前記第二のレドックス分子への電子移動の際に、前記第二のレドックス分子が１以上の生成物に変換される反応を誘起する触媒的に活性な分子である装置。３．請求項１に記載の装置であって、前記第一のレドックス分子は電子メディエータであり、前記第二のレドックス分子は触媒的に活性な分子であり、前記装置は更に、前記第二のレドックス分子により生成物に変換される第三のレドックス分子を具備する装置。４．請求項２または３に記載の装置であって、前記第一のレドックス分子は電極に固定化される装置。５．請求項２または３に記載の装置であって、前記第一および第二のレドックス分子は、相互に複合体化される装置。６．液体媒質中におけるアナライトの存在を測定するための電気化学的方法であって：ａ）認識ペアの一方のメンバー（該認識ペアの他方のメンバーは前記アナライトである）が表面に固定され、任意に、第一のレドックス分子（該分子は電極と第二のレドックス分子との問で電子を移動させることができる）を固定した電極を準備することと；ｂ）前記電極を前記液体媒質と接触させることにより、該媒質中における前記アナライトの存在によって対合した複合体（これは前記電極の表面に固定されたメンバーと前記アナライトとの間の複合体である）の形成を生じさせることと；ｃ）前記電極を前記第二のレドックス分子と接触させ、前記第一のレドックス分子が前記電極に固定されていないときは、前記第一のレドックス分子とも接触させることと；ｄ）前記電極に通電することによって、前記電極と前記第二のレドックス分子との間で、前記第一のレドックス分子の仲介により電子が移動して電気的応答が生じ、電極を前記媒質に露出させた後の電気的応答の変化によって、前記媒質中における前記アナライトの存在が示されることとを具備する方法。７．請求項６に記載の方法であって、前記第一のレドックス分子は、前記第二のレドックス分子への電子移動の際に、前記第二のレドックス分子が１以上の生成物に変換される反応を誘起する触媒的に活性な分子である方法。８．請求項６に記載の方法であって、前記第一のレドックス分子は電子メディエータであり、前記第二のレドックス分子は、第三のレドックス分子が生成物に変換される反応を触媒する触媒的に活性な分子であり、前記ステップ（ｃ）は、前記電極を前記第三のレドックス分子とも接触させることを具備する方法。９．請求項６，７または８に記載の方法であって、前記第一のレドックス分子は前記電極に固定される方法。１０．請求項６，７または８に記載の方法であって、前記第一のレドックス分子および前記第二のレドックス分子は相互に複合体化される方法。