JPH05507195A - 基質再生型バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 基　バイ　セン　一 本発明は、特に、ただし非限定的にシアン化物の感知に用いられる基質再生型バ イオセンサーに基づく検出の方法及び装置に係わる。シアン化物を検出し、その 濃度を測定する方法は様々なものが考案されており、それらの中には高感度比色 法、電気化学的分析法、並びに原子吸光分析及びコンピュータ援用パターン識別 のように精巧な機器類を必要とする諸方法が含まれる。しかし、シアン化物の精 製または揮発を要する操作の多くには、シアン化物を検出測定するうえでの問題 点が幾つか内在する。そのうえ、はとんどの方法が特異性の欠如と干渉の問題と を免れない。連続的な監視の方法に物理学的技術を応用することがなおめられて いる。

シトクロム酸化酵素の生化学的活性に対するシアン化物の毒性に基づくシアン化 物用バイオセンサーが研究されている。ミトコンドリアの電子伝達系の末端成分 であるシトクロム酸化酵素に結合することによって、シアン化物は電子伝達をブ ロックし、従って呼吸値における電子流を停止する。

シトクロム酸化酵素の電気化学的活性を監視することにより、電流が阻止される ことがらシアン化物、硫化物及びアジ化物のような毒性化合物の存在を検出し得 る。シトクロム酸化酵素に基づくような酵素阻害センサーは、信号が電子伝達限 定的でなく酵素限定的であるという前提で機能し、即ち該センサーは酵素活性の 変化に感応する。

残念ながら、酵素阻害センサーは酵素及び特異的酵素阻害物質の非特異的変性の 影響を被り、前記変性は酵素から発せられる信号を酵素阻害物質が存在しない場 合も漸次減少させ、またセンサーの寿命を制限する。そのうえ、基質使用の結果 、基質が尽きるとバイオセンサーが故障しかねない。

即ち、シアン化物のような毒素の濃度を検出測定する方法であって、上述の諸方 法の欠点を克服するか、少なくとも緩和する方法が必要とされている。従って本 発明は、酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度を検出測定する方法であって 、 （ａ）　前記毒素と結合するとその電子伝達活性を阻害されるペルオキシダーゼ 、カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択した酵素を環境中に存在させるス テップ、（ｂ）　前記酵素を酸化する過酸化水素を環境中に存在させるステップ 、 （ｅ）　酸化した酵素を電子伝達物質で還元し、その過程で電子伝達物質を酸化 するステップ、 （ｄ）　電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及び程度によって阻害毒素 の存在及び濃度を検出するステップを含む方法を提供する。

電子伝達物質の再生能力は酵素の電子伝達物質酸化能力に依存するので、両者の 間には相関関係が成り立つ、酵素の電子伝達活性が電気的に能動的または受動的 な干渉体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓ）に阻害されて低下する酵素限定的な系で は、酸化された電子伝達物質は比較的少量しか元の還元状態へと再生されないと いう結果がみられる。従って、電子伝達物質は酵素の電子伝達活性を阻害する毒 性を有する化合物用の検出器の基盤を成す、電子伝達物質の再生レベルの低下を 見いだすことによって検出を行ない、また電子伝達物質の再生が酵素阻害によっ て影響される程度を、存在する酵素阻！物質の濃度の指標とする。

好ましくは、酵素はペルオキシダーゼとする。

好ましい環境は、溶解した酸素から過酸化水素が生じるような水性の環境であり 、過酸化水素は酵素の酸化レベルが上昇すると実質的に還元されて水となる。環 境は有機性等とすることも可能だが、いずれにしても、外部の供給源から追加し なくともよいだけの過酸化水素を生じさせる十分なプロトン及び溶解酸素を用意 し得る環境が好ましい。

好ましくは、酸素の過酸化水素への還元は一次電極において生起させ、電子伝達 物質の再生は二次電極において生起させる。−次電極での過酸化水素発生の速度 は印加電圧によって制御する。を子伝達物質再生の結果として二次電極に生じる 電流は酵素の触媒状態を示唆し、従って毒素による阻害のレベルを示唆する。

好ましくは、水溶液は酸素を大気か、またはいずれか他の供給源から、−次電極 が基質の過酸化水素を連続的に発生し、かつ二次電極が電子伝達物質の再生を保 証するように吸収し得る。酸素供給源が大気である場合は水溶液を緩衝すること が好ましい、この種のセンサーは従って自律的であり得、恒常的な保守及び補充 を必要としない。

酵素の触媒活性はその基質にきわめて特異的であるので、に非常に敏感であり得 る。従って、本発明の方法は化合物の検出において非常に特異的にすることがで き、その除用いる酵素は、検出を必要とする化合物が酵素の活性に対して有する 阻害作用との関連で選択する。更に、酵素に対して高い毒性を示す化合物はより 低い毒性を示す化合物に比べてより深刻な影響を酵素活性に及ぼし、従って電子 伝達物質の再生にもより多く影響するので、より容易に検出できる。

本発明のバイオセンサーは、主に気相中の毒素に用いるべく企図されている。し かし、毒素は、最終的に酵素活性を阻害し得るのであれば、気相中でなく液相ま たは固相中に存在してもよい。

用いる酵素を固定すれば、酵素の触媒活性をより良く制御し、かつバイオセンサ ーの寿命を延長するうえで好都合である。酵素を一次電極に固定することによっ て二次電極へのタンパク質付着を防止し得、かつ酵素を特定の地点に限定配置す ることで触媒活性をより良く制御することが可能となる。酵素を二次電極に固定 した場合は、−次電極に固定した場合に起こりがちなフェリジニウムの減少が制 限されるという利点が得られる。場合によっては、酵素を一次及び二次電極以外 のいずれかの地点に固定することが好ましくなり得る。

酵素の固定によって電極の効率も上昇し得、即ちバイオセンサーの検出部の小型 化が可能となる。

酵素の固定は、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）リンカ−を用いて行な い、それによってアミノ酸が電極に直接付着するのを回避する。この措置は酵素 の変性を低減するという利点を有し得る。

好ましくは酵素をＢＳ＾に、予めＮａ１Ｏｎで酸化した炭水化物分子を介して結 合させる。炭水化物の付着には、酵素の活性部位への基質の拡散を制限してしま う危険が減少するようにして酵素を固定できるという利点が有る。そのうえ、酵 素の大型の炭水化物複合体は多数の固定化部位を有し得、このことは酵素を電極 上で不動化及び安定化する一助となる。　ＢＳＡリンカ−は、酵素を還元電位か ら保護するタンパク質クッションを創出するという更に別の利点を有し、その際 ＢＳ＾リンカ−は電極表面の電気化学特性（ｐＨ変化など）のためにＭ衝性のミ クロ環境を整え、また電子伝達物質が電極において直接還元されるのを防止する 。

くわえて、検出系に電子伝達物質を別途添加しなくともよいように、電子伝達物 質をペルオキシダーゼであり得る酵素に結合させることも可能である。それによ って、電極と、酵素と、電子伝達物質とが互いに結合したより一体的な検出系を 開発することが可能となる。を子伝達物質としてアミノフェロセンを固定するこ とは、酵素と結合した炭水化物基を過ヨウ化ナトリウムで酸化し、かつアミノフ ェロセンと反応させてシッフ塩基を形成することによって達成し得る。不安定な 上記イミンは、次いでホウ水素化ナトリウムで還元する。

本発明の発明者は、シアン化物を検出しなければならない場合、酵素はセイヨウ ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましいことを発見した。　ＨＲＰは、固 定すると非常に安定となり、また高純度製剤として市販されているという点で有 利である。

■ＲＰバイオセンサーの全酵素反応は、次のように表わすことができる。

（１）　Ｏｚ＋２ｅ＋２Ｈ’　→Ｈ２Ｏ２Ｋ。

（２）　Ｈ２０□＋［ｌＲＰ　→　化合物１＋Ｉ（２０に２ （３）化合物１＋Ｄ（ｒｅｃｌ）　−化合物２＋Ｄ（ｏｘ）Ｋ。

（４）化合物２＋　Ｄ（ｒｅｄ＞　−＝　ＨＲＰ＋　Ｄ（ｏｘ）　＋　ＨｚＯ（ ５）　Ｄ（ｏｘ）＋ｅ　＋Ｄ（ｒｅｄ）化合物１はＨＲＰの酸化形態で、静止状 態より二つ高い酸化状態に有る。この酵素を電子伝達物質［Ｄ（ｒｅｄ）］で還 元して化合物２とし、その後静止状態とする。

電子伝達物質は好ましくはメタロセン化合物である。理想的には、電子伝達物質 はフェロセンまたはフェロセン類似体である。フェロセンの利点は、二次電極に おいて容易に還元できること、及び還元形態で安定であることである。

そのうえ、フェロセンは光やｐａｌに感応しない。

フェロセンの特に有用な特徴は、多くの類似体の合成を可能にする構造を有する ことであり、従ってフェロセンは、特定酵素に対して電気的に活性な電子供与体 とすることができる。　ＢＲＰと共に用いるうえで好ましいフェロセン誘導体は 、ヒドロキシメチルフェロセン、モノカルボキシレートフェロセン、ジメチルア ミノメチルフェロセン及び１．１′−ジカルボキシレートフェロセンである。

過酸化水素発生のために一次電極において還元電流を用いることにより、再生フ ェロセンは、二次電極の陰極電流に表われる酵素酸化を経てのみ生じる。

検出及び測定は、二次電極電流の抑制を定常状態の速度論でか、または結合方程 式で解析することによって実施し得る。

系のｐａｌは検出方法に適した酵素活性のための限界値以内に選択するべきであ り、ＩＩＲＰを用いる場合はｐｌ’！５〜８が好ましい。理想的なｐＨは、酵素 が最も安定となる７である。

系の作業可能温度は５〜４０℃であり得るが、系の温度を前記範囲の中程から上 限の値に近付けると、化学平衡をより迅速に達成できるので好ましい。

１（ＲＰに基づく上述のような水性系を用いれば、二次電極におけるフェロセン 再生電流の抑制によって、シアン化物のサブマイクロモル濃度（ｐｐｂ）を最適 条件下に検出し得る。

導入シアン化物の検出に掛かる典型的応答時間は１秒未満である。シアン化物検 出速度を制限する要因は、気相力）ら水相中への拡散である。

シアン化物のＨＲＰへの結合が可逆的反応であるため、本発明のセンサーはシア ン化物の検出に繰り返し用し）ることができ、また本発明によるセンサーはその 固有の安定性ゆえに、６力月を越える長期にわたって安定に作動させ得る。

本発明はまた、酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度を検出測定するバイオ センサーも提供し、このセンサーは （ｉ）　過酸化水素発生手段と、 （ｉｉ）　ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択され た酵素と、 （ｉｉ）を子伝達物質と、 （ｉｖ）　電子伝達物質再生手段と を含む。

上記バイオセンサーは基質再生を利用する本発明の検出測定方法に則って機能す るので、先に述べた本発明方法の様々な例はバイオセンサー自体に関連付けて適 用可能であり、従ってそれらを細部まで繰り返して説明する必要は無い。

好ましい酵素はペルオキシダーゼである。特に好ましい酵素はセイヨウワサビペ ルオキシダーゼである。

過酸化水素は好ましくは、酵素及び電子伝達物質を含有する溶液から発生される 。溶液は水性であることが好ましい。

電子伝達物質は好ましくはメタロセン化合物であり、理想的にはフェロセンまた はフェロセン類似体である。

好ましくは、過酸化水素発生手段及び電子伝達物質再生手段は電極である。用い られる電極システムは回転リング−ディスク電極（ＲＲＤＥ＞であり得る。ある いは他の場合には、噛み合い型（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ　ｔｙｐｅ）や マイクロバンド型の電極を用いることも可能である。噛み合い型電極を用いるこ とは、該電極が高い集電効率を有する点で有利である。

ＲＲＤＥではディスクが一次電極を構成し、好ましくは少なくとも表面が酸化炭 素から成る。酸化炭素電極が用いられた場合、ＢＳΔは電極にカルボジイミド活 性化によって固定され得る。電極への溶液移送はディスクの回転速度によって制 御され、その際溶液は実質的にディスクの回転運動によってディスクから二次電 極リングへと移送される。

本発明の非限定的な例を、添付図面を参照しつつ以下に詳述する。

第１図は２個の作用電極を用いるＨＲＰ活性監視の説明図である。

第２図は回転リング−ディスク電極の表面で生起する第１、　図の反応を示す。

第３図は、リングをＯｖに維持し、走査速度を０．ＩＶ／ｓとし、電極（ディス ク）回転速度を４ｃｐｓとし、かつ０．３ｍＭのしドロキシメチルフェロセンと 、１．２５μ台のＨＲＰと、０．ＩＭのにＣ１と、０．０５Ｍの緩衝液にＨＰＯ ４（ｐ［１７）とを存在させた時にリング−ディスク電極の一次及び二次電極で 得られる電流のグラフである。

第４図は、ＩＪのしドロキシメチルフェロセンと、２．５μＮのＨＲＰとが存在 し、かつ０．１Ｖ／ｓのディスク電位掃引においてディスク電位が−１，２ｖと なった時に一次電極（ディスク）回転速度が二次電極（リング）電流に及ぼす影 響を示す。

第５図はフェロセンの酵素酸化を電流測定手段及び分光測光手段で測定した結果 を示す、電流測定解析では１．２５μＨのＨＲＰと０．３ｍＭのしドロキシメチ ルフェロセンとを存在させ、分光測光アッセイでは１．２５μにのＨＲＰと０． ５ｍＭのヒドロキシメチルフェロセンと、１０蒙ＨのＨ２Ｏ２とを存在させた。

緩衝液としてｐＦＩ３〜５．５の酢酸塩と、ｐＨ５〜７，５のリン酸カリウムと 、ｐＨ７〜９のＴｒｉｓとを５０ｍＭずつ用いた。

第６図はシアン化カリウム導入後に残存する部分的リング電流を示す、ヒドロキ シメチルフェロセン０．３ｍＭ、ＨＲＰ　２゜５μＮ、ディスク電位−１，２ｖ 、ディスク掃引０．１Ｖ／ｓ、及びリング電位ＯＶ、電流はシアン化物添加後に １公開平衡化を行なってから測定した。

第７図は、第４図に示したデータを方程式％式％ を用いて５ｃａｔｃｈｃａｒｄ解析した結果を示す１点は５回の測定の平均値を 表わし、標準偏差を加えて表示されている。Ｋ。

は、５０％阻害に必要なシアン化物の自由濃度である。

第８図は、１．２５μＨのＨＲＰと、０．３ｄのヒドロキシメチルフェロセンと の存在下にディスク電位によって法定される様々なＨ２Ｏ２発生速度において測 定した、シアン化物に関する阻害定数を示す。

第９図は閉ループ型シアン化物センサーを示す。

第１図及び第２図に関して、双対作用電極系（１）は回転リング−ディスク電極 （ＲＲＤＥ）を含み、この電極の回転ディスクは一次電極（２）を、またリング は二次電極（３）を構成する。

−次電極（２）はガラス状炭素ディスクとして形成され、かつアラルダイト（登 録商標）またはＫｅｉＦによって密に包囲されており、前記ディスクの直径は０ ．７ｃｍである。二次電極（３）は白金リングとして形成され、かつやはりアラ ルダイトまたはＫｅｉＦによって密に包囲されており、この電極は０．７５ｅ裁 の内径と０．８Ｃ鵬の外径とを有し、０．０５ｅ−スペーサーによってディスク から隔てられている６両電極は０．３μ霞酸化アルミニウムのスラリーで研磨さ れ、その後水浴中で音波処理される。装置のその他の構成要素については図面を 参照せずに説明する。

場合によってはコンピューター制御される画電極アナログポテンシオスタット（ 図示せず）が、作用電極（２）及び（３）の電位を制御するのに用いられる。デ ィスク電極（２）は電位掃引のための三角波発生器（図示せず）と接続されてお り、リング電極（３）は定ＤＣ［圧源と接続されている。電極の回転はＵｒｓａ ｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ回転装置によって制御される。電位はいずれも、対極 として用いられる、１　ｃ　ｍ、”白金網を具備した飽和カロメル電極（ＳＣＥ ）との関連で採用される。

電極（２）、（３）は容量５〜１０−１の電気化学的セル内に装入されており、 前記セルは温度調整用の水ジャケットを具備し、かつ水浴から水を供給されてい る。電極は、溶液の抵抗を最小限とするように配置されている。使用時、フェロ センモノカルボキシレートを用いた実験によって集電効率を測定したところ０． １６となり、この値は予想値に一致した。

Ｂｉｏｚｙｍｅ社から高純度製剤（ＲＺ＞３．０）として得られるセイヨウワサ ビペルオキシダーゼ（［１ＲＰ）の純度を、ＳＯＳゲル電気泳動によって測定し た。酵素の濃度は９０，０００８−’ｃｍ−’の消衰係数を用いて、４０３ｎｍ での吸光から測定した。　Ｋｏｄａｋ社から得られるしドロキシメチルフェロセ ンは、重量に基づき所望の濃度とした。溶解酸素を１１ｉｎｋｅｒ法で測定した ところ２４０μＮとなり、この値はノモグラムから得られる値に一致した。

実験は総て２２℃で実施した。

ガラス状炭素ディスクを、Ｂｏｕｒｄｉ！ｆａｎ、　Ｊ、３ｍ、　Ｃ’ｈｅｓｉ 、　Ｓｏｅ、　１０６．　！１９．４７０１−４７０６．１９８４に述べられて いるような、化学的技術と電気化学的技術との組み合わせによって活性化した。

ディスクを３０秒間＋２．２ｖに維持し、その間白金りに ングを−０，２■に維持した。！極を０．５８　Ｎｈｏ４溶液（ｐＨ７）中に移 し、白金リングを−０，３■と＋１．０■との間でのサイクリングによって、安 定なボルタモダラムが得られるまで数時間クリーニングした。その後、ディスク をカルボジイミド［０，ＩＭ酢酸ナトリウムＩ！衝液（ｐＨ５，０＞中に０．Ｉ Ｍ存在コで活性化したく１時間）。脱イオン水で洗浄後、電極を、Ｓｉｇ＋＋＋ ａ社から得られるウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ １１５．ｏ）に２０ｍｇ／ａ＋Ｉの量で溶解させた溶液に２時間浸漬した。ＨＲ Ｐのグリコシド部分をＮａｌ０＜［０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ＊中に８１１ＩＭ存在 （ｐＨ８，３）］で２時間酸化し、未反応の８１１１０４を、エタンジオールを 過剰に添加してからこのタンパク質をセファデックスＧ−２５カラムに通すこと によって除去した。　ＢＳ＾改変電極を酸化ペルオキシダーゼ溶液に浸漬し、０ ゜ＩＭ重炭酸ナトリウムＭ衝液（ｐＨ９，ｏ）中で２時間低速で回転した。その 結果得られた、ＢＳ＾を［ｉＲＰに連結するイミン結合を５−ｇ／■ｌ　ＨＩＬ Ｂ！！４溶液１００ｍ１で１時間還元し、この還元を１回繰り返した。電極を０ ．１Ｍ　ＮｄＰＯ４中テ回ｔし、カッリングＧ、：　−０，３Ｖト＋１．０％’ との闇でのサイクリングを２時闇施して、弱く吸収されたタンパク質の離脱を助 長した。

酵素改変電極を比色法によって、ペルオキシダーゼ活性について解析した。電極 をアッセイ混合物に浸漬し、いかなる拡散制限も克服する速度（＞２０ｒｐｍ） で回転した。単一波長において、吸光度の変化を分光光度計で監視した。このよ うに、電極を、固定したタンパク質の量ではなく活性に関して試験した。固定酵 素の、その活性に基づいて決まる量は約ｚｘ　１０−”ｓｏ！／ｃ＋ｍ２で、こ れは他の固定法によって得られる濃度に類似する。

第１図及び第２図に示した［ｌＲＰの電極触媒活性は典型的には、ペルオキシダ ーゼ及びヒドロキシメチルフェロセン媒介物質を含有する緩衝溶液に回転リング −ディスク電極を浸漬することによって評価した。を極を一定速度で回転し、そ れによって、ディスク電極に向かい、その後更にリングへと向かう物質の移動を 制御した。ガラス状炭素ディスクにカソード電位掃引を、０．ＩＶ／ｓで適用し た。白金リングをＯｖの一定電圧に維持し、ディスク電位に従属してリングに発 生する電流を測定した。ペルオキシダーゼによって発生されるリング電流を測定 する前に、電極浸漬に続いてリング電流（背景電流）を安定化したく約５分間） 、その後、酵素によって酸化された媒介物質の還元がもたらすカソードリング電 流を、分子状酸素の部分的な還元を惹起するディスク電位において測定した。触 媒電流を、ディスク電位Ｏｖで起きる正味の還元電流と定義した。

リング電極においてみられる還元電流の実際のプロフィールは、酵素及び基質の 濃度、並びにディスクの回転速度、ディスクにおける掃引速度、及びリングの電 位の関数である。この還元電流の強さは、酵素によって発生されるフェリジニウ ム（酸化されたフェロセン）の、実際にリングに到達する部分にも依存する。

第３図は、リング電流をディスク電位の関数として表わしたグラフである。実線 はリングにおけるフェロセンの還元を示し、点線はディスクにおける酸素の還元 を示す（×１Ｏ−２）。ディスクがよりカソード的になるにつれて、リングでは 別個のファラデー活性領域が実現する。まず、水平である線（ａ）は、フェロセ ンによって媒介される電気的活性がリングに存在しないことを示している。　− ０，３Ｖよりも小さい負電位（ｂ）では、ディスクでの還元が進むほどカソード リング電流は強まる。この電流強化はディスクでの過酸化水素発生に正比例する 。過酸化物発生速度が上昇するにつれて、リング電流の強さは酵素の反応速度に よって制御されるようになる。即ち、区域（ｃ）では酵素反応速度が電流プロフ ィールを支配し、フェリジニウムからのフェロセン再生によって生じる電流はＨ ＲＰの酵素反応速度によって支配される。

表Ｉに掲げた数種のフェロセンを、ＨＲＰ還元のための媒介物質として機能する 能力について試験した。　ＨＲＰ　２．５μ台及びディスク電位−１，２■にお いて得られる、フェロセンの構造と酸化還元電位とに従属するリング電流が明示 される。

表■中、Ｅｐ＋ｚ２は酸化還元電位であり、このデータは発生される電流と酸化 還元電位との間に関連性が無く、従って介物質として選択されるべきでないとい うことを明示してフェロセン誘導体　Ｅ９１／２　電流　相対電流（０，５ａ＋ Ｍ）　（ｍＶ）　（ｍ＾）（％）ヒドロキシメチル　２１０　３．８　１００フ エロセン モノカルボキシレート　２９５　０．６４　１７フエロセン ジメチルアミンメチル　４９０　０．２２　６フエロセン １．１−ジカルボキシレート　４２０　０．１０　３フエロセン １１ＲＰ、ヒドロキシメチルフェロセン、過酸化水素及び緩衝液の存在下にフェ ロセン酸化速度を測定する分光測光アッセイを実施し、吸光度変化の速度をＰｈ １ｌｉｐｓ　Ｐｏ　８７２０分光光度計を用いて３３０ｎｍにおいて゛監視した 。

回転速度がリング電流に及ぼす影響を測定したところ、回転速度を上げるとリン グ電流が弱まることが判明した。

第４図に示した条件下では、２ｃｐｓの回転速度において最強の電流が得られた 。回転速度が２ｃｐｓ未溝の時のリング電流は集電効率の低下によって複雑化し た。

電流は、酸素還元によって制限される反応速度の優位性が向上することによって も弱まった。従ってほとんどの実験を、リングに向かう良好なフェリジニウム流 と、溶液中での酵素反応にとって十分な遷移時間との両方が得られる４ｃｐｓの 回転速度で実施した。

第５図はｐＨがリング電流に及ぼす影響を示しており、この図によればｐｔ１４ の時応答が最大となる。しかし、好ましいｐＨ値として選択したのは７．０で、 なぜならこの値ではリング電流があまり変動せず、しかも酵素の安定性が改善さ れるからである。

！（ＲＰによって発生されるリング電流にシアン化物が及ぼす抑制作用を、定常 条件下に測定した。シアン化物をストック溶液から電気化学的系に添加し、結合 を平衡に達するまで進行させた（約３０秒間）６反応速度が基質の酸化によって 制限される条件下に発生されたリング電流を、ディスクにＯｖと−１，２ｖとの 間でのサイクリングを施すことによって測定した。Ｏｖにおいて起きるリング電 流を減算することによって、■２０□発生領域におけるＢＲＰの触媒活性によっ てもたらされる正味リング電流を決定した。即ち、リング電流は）ＩＲＰのフェ ロセン酸化能力の直接の測定値となる。

第６図は、シアン化物が触媒反応に基づくリング電流に及ぼす影響を示す、リン グ電流の抑制は、全電流の抑制パーセンテージとして表わすことにより標準化で きる。得られる結果は、何よりもまず結合方程式を用いて解析し得る。

シアン化物がＨＲＰと一対一の塩基で結合し、錯体形成は電流の抑制に正比例す ると仮定すれば、 となり、その際（ＣＮｌは酵素阻害物質の自由濃度［（ＣＮ）−（ＣＮ）、　− （ＨＲＰ　−ＣＮ）で、（ＣＮ）ｒは添加シアン化物の総量］であり、また上記 式から（ＨＲＰ　−ＣＮ）＝（［１ＲＰ）ア×抑制％である。

第７図は、典型的な一組のデータの５ｃａｔｃｈｃａｒｄ解析を示す。Ｋ、はシ アン化物に関する見掛けの阻害定数である。阻害曲線からに１を、線形及び非線 形回帰法の両方でめたところ、約２μＨであった。この濃度は５２Ｘ　ＩＦ’ｍ ｇ／ｍｌもしくは５２ｐｐｂに対応する。

第８図は、シアン化物に関する見掛けの阻害定数に、の値とディスク電位の関数 として示す。負数であるディスク電位値がより小さくなるにつれて、Ｋ１の値も 小さくなる。過酸化水素の発生が少ないという条件の下では、リング電流はディ スク電流に比例し、過剰な酵素が存在する。即ち、リング電流は発生する過酸化 物によって決定され、電流抑制は酵素阻害に比例しない、ディスク電位が一〇、 ＳＶを下回ると、シアン化物によるＨＲＰ阻害は最高効率に達する。

改変電極は、ｐＨ７のＩＭリン酸塩Ｍｔ！！液中で保存した場合６力月より長期 にわたって安定なままであることが判明した。

第９図は、閉ループ型シアン化物センサーの一例を示す。

表面積の大きい気体透過膜（４）を通過して、過酸化水素発生に必要な酸素、及 びシアン化物がセンサーに進入する。

これらの気体は溶液に溶解し、溶液はポンプ（５）によって−次電極（２）と二 次電極（３）との間を、矢印で示したよ、うに連続的に移送される。ＨＲＰ（図 示せず）の結合した一次電極は過酸化水素を発生する。二次電極は、過酸化水素 によって酸化されたｔｌＲＰによるフェロセンの酸化によって生じたフェリジニ ウムを検出する。メーター（６）はフェロセンのフェリジニウムへの転換層を、 フェロセンに戻す還元の際に流れる電流によって示す、第三の電極（７）は、未 反応の過酸化物や未還元のフェリジニウム等を探し出す、この電極は一次及び二 次電極の下流に配置されているが、気体透過膜よりは上流に位置する。環境気体 に対して開がれているこの自足型系はＩＩＲＰ酵素活性の阻害によって、シアン 化物または類似の阻害性気体の存在及び濃度を検出し得る。

本発明に従って生産される検出装置は、連続的な監視を行ない得る。

ｐｓ Ｈ 電流の部分的阻害 Ｌｔｔ 毒素の濃度を酵素阻害を用いて検出測定するバイオセンサー、酵素阻害バイオセ ンサーは非特異的変性及び基質使用の影響を受け、これらはいずれもバイオセン サーの寿命を制限してしまう、この問題は、過酸化水素によって酸化される酵素 を環境中に存在させることによって軽減でき、酸化された酵素はフェロセンのよ うな電子伝達物質によって還元され、その過程で電子伝達物質自体は酸化される 。

電子伝達物質は元の還元状態へと再生可能であり、電子伝達再生の程度によって 毒素による酵素阻害の大きさが分かる。水性媒質中で酸素から過酸化水素が生じ ることと、酸化された電子伝達物質の還元とは電気化学的技術によって可能であ る。酵素を電極に固定すれば、効率が上昇する一方、場合によっては変性が低減 する０本発明のバイオセンサーは、シアン化物のような毒素の環境測定に用いら れ得る。

補装置の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１０月３０日

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度を検出測定する方法であって、 （ａ）前記毒素と結合するとその電子伝達活性を阻害されるペルオキシダーゼ、 カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択した酵素を環境中に存在させるステ ップ、（ｂ）前記酵素を酸化する過酸化水素を環境中に存在させるステップ、 （ｃ）酸化した酵素を電子伝達物質で還元し、その過程で電子伝達物質を酸化す るステップ、 （ｄ）電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及び程度によって阻害毒素の 存在及び濃度を検出するステップを含むことを特徴とする方法。
2. ２．酵素がペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．環境が水性環境であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．水性環境を緩衝することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. ５．酵素の過酸化水素への還元を一次電極において生起させ、電子伝達物質の再 生を二次電極において生起させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．用いる酵素を固定してその触媒活性をより良く制御し、かつバイオセンサー の寿命を延長することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．酵素を一次電極に固定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ８．酵素の固定をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）リンカーを用いて行なうことを 特徴とする請求項７に記載の方法。
9. ９．酵素をＢＳＡに、予めＮａＩＯ４で酸化した炭水化物分子を介して結合させ ることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. １０．酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１ に記載の方法。
11. １１．毒素がシアン化物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. １２．電子伝達物質がメタロセン化合物であることを特徴とする請求項１に記載 の方法。
13. １３．電子伝達物質がフェロセンまたはフェロセン類似体であることを特徴とす る請求項１２に記載の方法。
14. １４．電子伝達物質をヒドロキシメチルフェロセン、モノカルボキシレートフェ ロセン、ジメチルアミノメチルフェロセン及び１，１′−ジカルボキシレートフ ェロセンの中から選択することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. １５．電子伝達物質がヒドロキシメチルフェロセンであることを特徴とする請求 項１４に記載の方法。
16. １６．ｐＨが５〜８であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
17. １７．ｐＨが７であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. １８．系の作業可能温度が５〜４０℃であることを特徴とする請求項１に記載の 方法。
19. １９．酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度を検出測定するバイオセンサー であって、 （ｉ）過酸化水素発生手段と、 （ｉｉ）ベルオキシダーゼ、カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択された 酵素と、 （ｉｉｉ）電子伝達物質と、 （ｉｖ）電子伝達物質再生手段と を含むバイオセンサー。
20. ２０．酵素がペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１９に記載のバイ オセンサー。
21. ２１．酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項２ ０に記載のバイオセンサー。
22. ２２．酵素及び電子伝達物質が水性環境中に存在することを特徴とする請求項１ ９に記載のバイオセンサー。
23. ２３．過酸化水素が酵素及び電子伝達物質を含有する溶液から発生されることを 特徴とする請求項２２に記載のバイオセンサー。
24. ２４．過酸化水素発生手段及び電子伝達物質再生手段が電極であることを特徴と する請求項１９に記載のバイオセンサー。
25. ２５．用いられる電極システムが回転リングーディスク電極（ＲＲＤＥ）である ことを特徴とする請求項２４に記載のバイオセンサー。
26. ２６．特に添付図面を参照して本明細書に述べたような毒素検出測定方法。
27. ２７．特に添付図面を参照して本明細書に述べたようなバイオセンサー。