JP2002510032A

JP2002510032A - 電気化学的アッセイの改良又は電気化学的アッセイに関する改良

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Publication number: JP2002510032A
Application number: JP2000522444A
Authority: JP
Inventors: ポーター・ロバート，アンドリユー; バドリー・ロバート，アンドリユー
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-23
Publication date: 2002-04-02
Also published as: AU757800B2; US20040020791A1; EP1032825A1; US6551495B1; CA2311165A1; AU1248999A; CA2311165C; WO1999027356A1

Abstract

(57)【要約】試料中の対象分析物の存在を検出するための装置用の部品であって、ある化学成分がその上に固定化されている電気伝導性固体支持材を含む部品であり、該化学成分が電気活性部分（その電気活性部分に対して特異的結合活性を持つ結合パートナーの、その電気活性部分への結合により、検出可能な様式で直接変調されうる電気化学的特性を持つもの）を含む部品、ならびにその部品を含む装置と対象分析物の存在を検出する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明はとりわけアッセイ法とアッセイ装置に関する。

【０００２】（発明の背景）本発明は一般に電気化学的アッセイに関する。このようなアッセイでは、試料
中の対象分析物の存在が、検知部（センサ）装置の電気化学的特性の測定可能な
変化を引き起こす。典型的に、電気化学的アッセイは、それぞれ電位差か電流の
変化を測定する「電位差測定型」と「電流測定型」に分類される。

【０００３】多くの電気化学的アッセイが記述されている。例えば酵素電極は生理学的試料
中のグルコース、尿素、アミノ酸などの生体分子の直接測定に使用されている。
これらの酵素電極は、電位差測定装置または電流測定装置の表面に固定化された
選択的酵素層を含み、その測定装置は、当該酵素の基質がこの反応性薄膜中に拡
散してくるにつれてその固定化層で生成する生成物の定常状態濃度を検知する。

【０００４】別のアッセイではＮａｆｉｏｎ（商標）（Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔｄｅＮ
ｅｍｏｕｒｓａｎｄＣｏ．社）薄膜を使用する。Ｎａｆｉｏｎ（商標）は、
小さい親水性陽イオンより大きい疎水性陽イオンが陽イオン交換によってポリマ
ー中に蓄積する傾向があるという選択透過性を持つ、ポリアニオン性パーフルオ
ロホスホネートイオノマーである。

【０００５】ＬｉｍｏｇｅｓとＤｅｇｒａｎｄ（１９９３ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ６５，１０５４−１０６０）はＮａｆｉｏｎ（商標）被覆電極を
使ってアンフェタミンの存在を検出するモデル系を記述した。このアッセイは試
料中のアンフェタミンが既知量の標識アンフェタミンとアンフェタミン特異抗体
への結合に関して競争するという競争免疫アッセイの形をとった。競争剤アンフ
ェタミンは酸化還元標識であるコバルチセニウムで標識された。

【０００６】このアッセイの基本原理は、いったん抗体が結合すると、生成するアンフェタ
ミン／抗体複合体のサイズが大きいために、標識アンフェタミンがＮａｆｉｏｎ
（商標）薄膜から排除されるというものである。それゆえ、試料中に高濃度のア
ンフェタミンが存在すると、イオン交換してＮａｆｉｏｎ（商標）薄膜中に取り
込まれうる遊離の標識アンフェタミンが多くなる。したがって、薄膜でのコバル
チセニウム標識の酸化または還元に対応する電流は、導入された試料中のアンフ
ェタミンの濃度に比例する。

【０００７】この種のアッセイには重大な欠点があり、それゆえに広く採用されることはな
かった。とりわけこれは、Ｎａｆｉｏｎ（商標）被覆電極による検出が可能にな
るまでに、相当数の反応段階の実行を必要とする。ＬｉｍｏｇｅｓとＤｅｇｒａ
ｎｄによって開示されたアッセイ器具は、使い捨てでも再使用可能でもない検知
部を含む。

【０００８】違う種類の電気化学的アッセイでは、ＳｏｌｓｋｙとＲｅｃｈｎｉｔｚ（１９
７９Ｓｃｉｅｎｃｅ２０４，２３０８；１９８１Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａ
ｃｔａ１２３，１３５）が記述したように「抗体応答膜電極」の使用を含む。
その抗体応答膜はポリ塩化ビニルマトリックス内のイオノフォア（クラウンエー
テル）からなり、そのイオノフォアは膜の表面からハプテンが突き出すようにハ
プテンにコンジュゲート化された。その膜は従来の電位差測定膜電極の先端部に
取り付けられた。ハプテンに特異的な抗体を含有する試料を添加すると、抗体が
ハプテンに結合し、それが何らかの未知の方法でイオノフォアの電気化学的特性
を変化させて、膜を横切る電位差を変える。

【０００９】この装置の作動の仕方はわかっていないが、そのことが、この装置への改良の
設計を合理的に不可能にしている。また、付随する検出系は大きく扱いにくくて
容易には再使用できない。

【００１０】ＷＯ８９／１１６４９は、電気活性ポリマー層を含み、その層内に対象分析物
への結合特異性を有する抗体分子が封入されている電気化学的アッセイ用の装置
を開示している。抗体に対する対象分析物の結合は、その装置を取り巻く環境か
らその電気活性ポリマーの周辺の空間への対イオンの流動を抑制し、したがって
酸化還元反応に際してポリマーへの又はポリマーからの電子流を抑制する。ポリ
マーへの直接的な結合パートナーの結合によって影響されるポリマーの電気化学
的特性の開示はない。

【００１１】ＷＯ９５／２９１９９は同様の仕組みを持つ電極を開示しており、そこでは、
電気活性ポリマーに取り付けられた化学成分への結合パートナーの結合が、ポリ
マーの電気化学的特性に間接的に影響を及ぼしうる。電気活性ポリマーそのもの
への結合特異性を持つ結合パートナーの開示はない。同様の仕組みがＥＰ０２３
９９６９に開示されている。

【００１２】ＷＯ９３／２５９０７は、対象抗原と、限られた量の抗体への結合に関して競
争する酸化還元標識を有する誘導体化された抗原が関わる競争アッセイ系を開示
している。過剰の酸化還元標識抗原は静電気的にポリマー被覆薄膜に結合してそ
の薄膜を横切る酸化還元電位を変化させ、それは従来の方法で測定される。その
ポリマー層は電気活性ではなく、本質的に不導性である。

【００１３】ＥＰ０４０２９１７はＷＯ８９／１１６４９に開示されている原理とよく似た
原理に基づいて作動するバイオセンサーを開示しており、電気活性界面活性剤被
膜を持つ導電性表面が特異的結合対の一方のメンバーの包含によって修飾されて
いる。対象分析物はその特異的結合対の他方のメンバーである。その特異的結合
対のメンバー相互の結合が対イオンの移動を遮断する。電気活性界面活性剤への
直接的な結合が関与する結合事象はない。

【００１４】ＷＯ９７／２７４７４は対象分析物の存在を決定する方法を開示しているが、
そこでは電極が特異的結合対の一メンバーでコーティングされる。対象分析物（
これはその特異的結合対の相応するメンバーである）の不在下では、電気活性酸
化還元分子が電極に接近して電極に電子を与えたり、電極から電子を受け取るこ
とができる。この過程は酸化還元分子が電極に接近するのをさえぎる対象分析物
によって抑制される。このように、結合パートナーの電気活性分子へのその電気
化学的特性を変更するような直接的結合は開示されていない（本明細書で言及す
る文書はすべて参考として本明細書に組込まれる）。

【００１５】本発明は、改良されたタイプの電気化学的アッセイの提供、具体的には使い捨
てで取り扱いが簡単なアッセイ装置の基礎を形成するのに好適なものを提供する
ことを目的とする。

【００１６】（発明の要約）第一の側面において、本発明は、試料中の対象分析物の存在を検出する方法で
あって、電気活性部分（その電気活性部分に対して特異的結合活性を持つ結合パ
ートナーの、その電気活性部分への結合により、検出可能な様式で直接変調され
うる電気化学的特性を持つもの）を有する化学成分がその上に固定化されている
電気伝導性固体支持材を用意し；試料中の対象分析物の存在の結果として、その
結合パートナーをその化学成分の電気活性部分と接触させるという各段階を含む
方法を提供する。

【００１７】第二の側面において、本発明は、試料中の対象分析物の存在を検出する装置の
部品であって、化学成分がその上に固定化されている電気伝導性固体支持材を含
んでなり、その化学成分が電気活性部分（その電気活性部分に対して特異的結合
活性を持つ結合パートナーの、その電気活性部分への結合により、検出可能な様
式で直接変調されうる電気化学的特性を持つもの）を含んでなる部品を提供する
。

【００１８】本発明の方法は対象分析物の存在または不在を示すように定性的に使用できる
。また好ましくは、本方法は存在する分析物の量（相対的単位または絶対的単位
での量）を示すように定量的に使用することもできる。典型的に、生物学的分子
（すなわち生物中に存在する分子または生物によって産生される分子）が最も興
味深い対象になるだろうが、あらゆる種類の物質が対象分析物になりうることは
明らかだろう。生物学的分子には、核酸（ＤＮＡとＲＮＡまたはそのキメラ、炭
水化物、酵素、抗原、アレルゲン）、ホルモン（タンパク質類とステロイド類の
両方）、とりわけヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、エストロン−３
−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、プロゲステロン−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）、黄
体ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの性および生殖ホル
モン、ならびに疾患マーカーと診断指標（例えば抗体）などがある。また対象分
析物は、細菌、ウイルス、酵母、真菌類などの粒子であってもよい。

【００１９】本発明の利点の一つは、これにより、従来の比色法ではアッセイできない濁っ
た試料でもアッセイを行ないうることである。濁った試料または濁る可能性のあ
る試料の例には、血清、全血、飲食物試料（例えば乳）、微生物の濁った増殖物
を含む試料などがある。

【００２０】本明細書において、化学成分の「電気活性部分」とは、その化学成分が酸化還
元反応を受ける時に電荷を供与および／または受容できる部分と定義される。典
型的に、本アッセイで変調される電気化学的特性は一般的には１またはそれ以上
の酸化還元電位になるだろう。本電気活性部分は、アッセイ条件下に酸化または
還元を受けうる１またはそれ以上の基を含むことができ、それらの基の任意の１
またはそれ以上の酸化還元電位は、その電気活性部分への結合パートナーの結合
によって変調される。好都合なことに、１またはそれ以上の変化した酸化還元電
位は、当業者に知られている電位差測定法または電流測定法によって検出できる
。電流測定的検出法（例えばクロノアンペロメトリー）は電位差測定法よりも一
般に測定しやすい結果を生成するので、これらを使用することが好ましい。

【００２１】電気活性部分の電気化学的特性の変調は、特定の電位差で電気伝導性固体支持
材に又は電気伝導性固体支持材から移動する電荷の量を決定することによって検
出および／または測定されることが好ましい。電荷は電気活性部分と電気伝導性
固体支持材の間を電子および／またはイオンおよび／または他の荷電粒子の移動
によって動かされる。

【００２２】化学成分の電気活性部分と結合パートナーとは特異的結合対のメンバーである
と都合が良い。結合パートナーは免疫グロブリンまたはその化学成分に対する特
異的結合活性を保っているその有効部分を含んでなるものが有利である。したが
って免疫グロブリンの有効部分として、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ _２、及び重鎖可変領域（Ｈｃｖ、例えばラマとラクダから入手できるもの）また
は前記部分の任意の１またはそれ以上を含んでなるキメラ分子が挙げられる。好
都合なことに、結合パートナーはモノクローナル抗体技術を使って調製したり、
結合パートナーをコードする核酸配列の適当なライブラリー（例えばファージデ
ィスプレーライブラリー）からの選択と単離によって調製することができ、これ
らは共に当業者にはよく知られている。

【００２３】化学成分の電気活性部分は本質的な免疫原であるか、少なくとも適当な担体分
子（例えばウシ血清アルブミンや植物ペプチド誘導体など）に結合すれば免疫原
（すなわちハプテンである）として作用できるものが好都合である。これは、そ
の化学成分に対して特異的結合活性を持ち、本発明の方法で結合パートナーとし
て作用しうる免疫グロブリン（またはその有効部分）の作製を容易にする。

【００２４】一般に化学成分は、典型的に、適度に疎水性の有機分子を電気活性部分として
含むだろう。例として有機金属化合物（コバルチセニウム、フェロセンなど）や
複素芳香族化合物（カルバゾール類、ピロール類、フラン類、チオフェン類など
）が挙げられる。望ましくは、典型的に、電気活性部分は、酸化および／または
還元を容易に受けうる１またはそれ以上の基を含むだろう（ここで酸化は電子の
除去とみなされ、還元は電子の付加とみなされる）。

【００２５】酸化または還元は通常、荷電した物体の生成をもたらし、その効果はその成分
中の電子軌道の共役系（「非局在化電子」）によって安定化されうる。したがっ
て、本アッセイの条件では、その化学成分が非局在化電子の共役系を含むことが
好ましい。そのような化学成分の具体例にはピロール類、フラン類、チオフェン
類と、それらの類似体および／または多量体がある（例えばＤｉａｚら，１９７
９Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｐ６３５、Ｎｉｚｉｕｒ
ｓｋｉ−Ｍａｎｎら，１９９３Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，８８７
、Ｗａｌｔｍａｎら，１９８４Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８，４３４３に記
述されているものなど）。各窒素、酸素および硫黄原子の非結合電子は電子軌道
の共役系に寄与する。好ましい成分はＮ−アルキルカルバゾールとその類似体（
単量体型、二量体型または多量体型）である。図１Ａ−Ｄは、それぞれピロール
、フラン、チオフェンおよびカルバゾールモノマーの一般構造を示す。一般に、化学成分は固体支持材（例えばアッセイ用ディップスティックや毛管
充填（ｃａｐｉｌｌａｒｙｆｉｌｌ）室など）に固定化されることが望ましい
。化学成分は固体支持材の電気伝導性部分に固定化することが好ましく、その電
気伝導性部分は例えば金、白金または他の導電性金属、金属酸化物、炭素／グラ
ファイト、ケイ素またはケイ酸塩の細いストリップを含みうる。

【００２６】固体支持材への化学成分の固定化はいくつかの方法で達成しうる。本発明者ら
は、一つの方法が、固体支持材を適当な化学成分前駆体の溶液中に置き、次にそ
の固体支持材での化学成分のｉｎｓｉｔｕ形成を起こさせることであることを
見出した。典型的に、このような方法は、固体支持材での前駆体モノマーの重合
を起こさせて、固体支持材上に化学成分の網目様の被膜を形成させるという形を
とりうる。

【００２７】また、より好ましくは、介在「ペンダント」鎖部分（好ましくは支持表面上に
単層として自己集合しうるもの）を使って、化学成分を固体支持材上に固定化し
てもよい（例えばＳａｂａｔｉｎｉおよびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９８７Ｊ
．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９１，６６６３−６６６９；ｖｏｎＶｅｌｚｅｎら，
１９９４Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，３５９７−３５９８；Ｃｈｉ
ｄｓｅｙら，１９９０Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，４３０１−４３
０６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら，１９８８Ｎａｔｕｒｅ３３２，４２６−４
２９に記述されている方法など）。その鎖部分は化学成分の構成部分を形成する
とみなしうる。

【００２８】ペンダント部分またはペンダント分子の使用は、それが電気活性部分を電極の
電気伝導性表面から引き離すので好ましい（それと同時に、好ましくは、例えば
非局在化電子系によって電気伝導度が保たれるが、必ずしもそうではない）。ペ
ンダント部分は典型的におおむね線状である。好ましいペンダント部分は、置換
されていても非置換でもよいアルキル基またはアルケニル基（典型的に３〜１４
個、好ましくは５〜１２個の炭素原子を含む）である。

【００２９】ある態様では、アルキルまたはアルケニルペンダント基が、スルフヒドリル基
またはチオール基を介して電極に取り付けられるが、他の化学的結合も同様に好
適でありうる。

【００３０】ペンダント基またはペンダント部分を使用するもう一つの利点は、それらが得
られる結果の再現性に有害な影響をもちうる「ピンホール」（電極の導電性層の
表面にある軽微な不整）を埋めるのに役立つことである。電極に取り付けられた
過剰のペンダント分子を含む（すなわち全てのペンダント基が必ずしも電気活性
部分につながれてはいない）ことも好ましいだろう。余分なペンダント基の存在
は単層の安定性と剛性を向上させ、それが本発明の方法／装置を最適化すると考
えられる。特定の態様で本発明者らは、電気活性部分３に対してペンダント部分
４の比率が最適な結果をもたらしうることを見出した。余分なペンダント分子は
電気活性部分に取り付けられたペンダント部分と同一である必要はなく、したが
って余分なペンダント「スペーサー」分子を故意に導入しうる。そのようなスペ
ーサー分子は化学成分のペンダント部分（例えばアルキルまたはアルケニル）に
類似する性質を持つものが好都合だろうが、結合パートナーが電気アッセイ部分
に結合しようとしたときにそのスペーサー分子が立体障害を引き起こす可能性を
避けるために、その鎖長は化学成分のペンダント部分より長くはなく、あるいは
短いだろう。

【００３１】本アッセイ方法は、対象分析物が、結合パートナーが結合する化学成分の電気
活性部分と同一である必要がないものであることが非常に好ましい。この方法で
は、そのアッセイの最後の段階として電気活性部分への結合により検出可能なシ
グナルを生成させるだけで、電気活性部分に特異的な結合パートナー（典型的に
、免疫グロブリン）を使って任意の対象分析物の存在が検出されるように本アッ
セイ法を適合させることができる。この好ましい特徴は、例えば、以下に説明す
るように競争型または置換型の手法を使って得ることができる。

【００３２】したがって、好ましい態様では、その結合パートナーが、第一および第二の特
異的結合活性を含む結合体として存在する。第一の特異的結合活性は、前述した
化学成分の電気活性部分に対するものである。第二の特異的結合活性は典型的に
、対象分析物に対するものであるか、またはそれ自身が対象分析物に対して特異
的結合活性を有する分子（免疫グロブリンなど）に対するものであって、対象分
析物の存在はその結合体を固体支持材から置換することになる。本結合体はさら
なる特異的結合活性を有してもよいが、それらは本発明の実施には必ずしも必須
でない。

【００３３】結合体は、二重特異性抗体または「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」もしく
は他の二重特異性免疫グロブリンフラグメント（例えば双頭型ｓｃＦｖ、双頭型
ＨＣＶまたはｓｃＦｖおよび／またはＨＣＶフラグメントを含んでなるキメラ分
子）であると好都合である。また結合体は、それぞれ第一および第二の特異的結
合活性を有する第一および第二結合パートナーをそこに取り付ける非結合成分を
含んでもよい。これらの結合パートナーは従来の免疫グロブリン分子、例えば単
一特異性抗体またはその有効結合フラグメント（例えばｓｃＦｖなど）を含み得
る。非結合成分は、そこに取り付けられる第一および第二結合パートナーにとっ
て十分に大きく適当な化学的特性を持つ任意の物質でありうる。非結合成分は、
例えばペプチド、ポリペプチド、リポソーム、またより好都合には、ラテックス
ビーズなどの粒子でありうる。免疫グロブリンをラテックスビーズに取り付ける
方法は当業者によく知られている。

【００３４】好都合には、試料中の対象分析物の存在の結果として結合パートナーを電気活
性部分と接触させる工程は、試料の導入に先立って結合パートナーが遊離できる
ように固定化された固体支持材からの結合パートナーの置換または放出を引き起
こす分析物によって達成される。分析物は典型的に、結合パートナーを遊離でき
るように固定化する手段となっている固体支持材上の結合部位から結合パートナ
ーを置換するか、その固体支持材上の結合部位への結合に関して結合パートナー
と競争する。

【００３５】したがって特定の態様では、本アッセイ法は、そこに化学成分が固定化される
第一固体支持材と、そこに対象分析物の類似体が固定化される第二固体支持材（
これは第一固体支持材の異なる部分であってもよいし、個別の部品であってもよ
い）の使用を伴う。この類似体は、結合体の第二特異的結合活性がその類似体に
（その親和性が対象分析物より低いものであるとしても）結合するようなもので
ある。したがって、本アッセイの実施に先立って、結合体は第二固体支持材にそ
の第二特異的結合活性により可逆的に固定化される。

【００３６】遊離の対象分析物が存在する場合、その分析物は、第二特異的結合活性による
結合体への結合に関して、固定化された類似体と競争するだろう。典型的に、分
析物に対する結合体の親和性は、もし対象分析物が試料中に存在するならその結
合体が第二固体支持材から置換されるように、類似体に対する親和性よりも強い
。次に、置換された結合体は、第一特異的結合活性により、第一固体支持材上に
固定化された化学成分の電気活性部分と自由に反応して、その電気活性部分の電
気化学的特性を前述のように検出可能な様式で変調させる。

【００３７】したがって好ましい態様では、分析物が存在すれば、たとえそれが低濃度であ
っても、結合体を類似体から置換することになるように、類似体と対象分析物の
それぞれの結合親和性の間に親和性の相違がある。もう一つの選択肢として、結
合親和性には相違がなくてもよく、その場合は、例えば対象分析物が類似体より
高い有効濃度で試料中に存在するなどの理由で、結合体が競争によって類似体か
ら置換される。

【００３８】置換された結合体は、とりわけ第一支持材と第二支持材がごく近く（例えば５
μｍ〜５ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜１ｍｍ）にある場合、第二固体支持材から
第一固体支持材に向かって拡散させうる。もう一つの選択肢として、結合体を多
孔性媒体に沿って又は多孔性媒体を通して毛管現象によって輸送するか、例えば
ＷＯ９１／０５２６２に記述されているように、流動性試料（例えば血液や尿な
どの体液）の流動によって輸送してもよい。また妥当であれば、第二固体支持材
から放出された結合体を含む流動体を第一固体支持材に押し出すために、ポンプ
手段（例えばシリンジポンプや蠕動ポンプなど）を備えてもよい。

【００３９】わずかに類似する様式での対象分析物の類似体の使用は、例えばＥＰ０３
２４５４０とＰＣＴ／ＥＰ９５／０４５１８に開示され、教示されている。対
象分析物が典型的に、ペプチドまたはポリペプチドもしくはステロイドホルモン
などの生物学的分子になることは当業者には理解されるだろう。対象分析物の類
似体はエピトープ模倣体、すなわち、そこに結合パートナーが結合する分析物の
結合部位と同様に挙動する、一般的には合成された（典型的に、対象分析物より
小さい）短いペプチドなどの分子であることが好都合である。分析物と好適な類
似体の例はＥＰ０３２４５４０とＰＣＴ／ＥＰ９５／０４５１８に開示さ
れている。上述した態様は、とりわけＷＯ９１／０５２６２とＥＰ０３８３
３１３に開示されている既知の置換／競争型アッセイの変形である。

【００４０】さらなる態様では、結合体は、その第二特異的結合活性が対象分析物に対する
抗体への結合活性であるようなものである。例えばこの結合体は、対象分析物の
類似体からなり、その類似体は対象分析物に特異的な抗体によって比較的ゆるく
結合され、その抗体が第二固体支持材上に固定化されるものでありうる。もう一
つの選択肢として、結合体は、固定化抗体の結合部位に特異的な抗イディオタイ
プ抗体からなってもよい。いずれにせよ、試験試料中の対象分析物の存在が第二
固体支持材からの結合体の置換を引き起こすことになるように、固定化抗体は結
合体よりも分析物に対して強い親和性を持つことが（必須ではないが）好都合で
ある。次に、置換された結合体は、上に概論したように、その第一特異的結合活
性によって第一固体支持材に自由に結合できるようになる。

【００４１】固体支持材上に抗体を固定化する方法は当業者にはよく知られている。ＧＨ
ｅｒｍａｎｓｏｎが「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，１９９６）に有用な解説を記述している。典型
的に、固定化抗体は追加された官能基によって共有結合される。好都合なことに
、分析物に対する抗体は、固体支持材上に固定化された更なる抗体特異的抗体へ
の結合によって固定できる。第一固体支持材は典型的に、電極を含むだろう。第
二固体支持材はアッセイで日常的に使用されるものなら何でもよく、例えば合成
プラスチック材料、マイクロタイターアッセイプレート、ラテックスビーズ、フ
ィルター、ガラス製またはプラスチック製スライド、ディップスティックなどが
ある。第二固体支持材は可湿性の表面を持つと有利である。

【００４２】本発明の第二の側面の部品は、１９９７年１１月２１日に出願された我々の同
時係属欧州特許出願第９７３０９４０９．７号に開示するタイプのアッセイを実
施するために使用すると便利である。この部品は、他の部品（例えばアッセイ結
果の読取装置として働く独立したシグナル検出手段）と共に使用し、それらとや
りとりするための、比較的安価で使い捨て又は取り替えが可能な部分という形を
とるかもしれない。もう一つの選択肢として、この部品を、さらに大きな装置の
構成部分として提供してもよい。

【００４３】第三の側面として、本発明は、第二の側面である部品を含んでなるアッセイ装
置を提供する。この装置はさらに次の１またはそれ以上を含むと便利である：試
験用試料を受ける受容手段；化学成分の電気活性部分に対して特異的結合活性を
持つ結合パートナー；化学成分の電気活性部分の電気化学的特性の変調を検出す
るための検出手段；検出手段から出力されたデータを処理するためのデータ処理
手段；およびアッセイ結果を好ましくは数値の形で表示するためのデータ表示手
段。

【００４４】本アッセイ装置は試料受容手段の一部として毛管充填反応室を含むと好都合で
あろう。好ましい態様では、その小室が、好ましい方法の第一および第二固体支
持材によって少なくとも部分的に規定される。本発明での使用に適合させうる毛
管充填装置は例えば米国特許第５，１４１，８６８号に教示されている。

【００４５】第四の側面において、本発明は、上に定義した装置で使用する部品であって、
化学成分の電気活性部分に対して特異的結合活性を有する結合パートナーが遊離
できるように固定化されている固体支持材を含んでなり、その結合パートナーは
対象分析物の存在下に固体支持材から置換され、電気活性部分への結合パートナ
ーの結合が電気活性部分の電気化学的特性を検出可能な様式で直接的に変調させ
る部品を提供する。本発明の第二の側面である部品の場合と同様に、この部品も
、他の部品（例えばアッセイ結果の読取装置として働く独立したシグナル検出手
段）と共に使用し、それらとやりとりするための、比較的安価で使い捨て又は取
り替え可能な部分として供給したり、さらに大きな装置の構成部分として供給し
うる。

【００４６】第五の側面において、本発明は、図１３に示す構造を持つ電気活性部分を含ん
でなる化学成分を提供する。ここでＲ_１とＲ_２は独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｃ_１−Ｃ _１４アルキル、アリール、アルケニルまたはアルコキシ（すべて任意に置換され
ていてもよい）；ハライド；アミド；またはアミンであり、さらにその複素芳香
環構造は一つ又はそれ以上の位置がアルキル、アリール、アルケニルまたはアル
コキシ基（すべてそれら自体が任意に置換されていてもよい）、酸基（有機酸ま
たは無機酸基）、ハライド、アミドまたはアミンで置換されていてもよい。

【００４７】Ｒ_１はアルキル、好ましくはエチル、プロピルまたはブチルであり、Ｒ_２は好
ましくはＣ_１−Ｃ_１２アルキル、より好ましくはＣ_４−Ｃ_８アルキル、最も好ま
しくはＣ_６アルキルであれば有利である。一般的には、Ｒ_１とＲ_２が同一でない
ことが好ましい。好ましい態様ではＲ_２が、チオール、カルボキシル、アミド、
アミン、ハライド、アルデヒド、ケトン、エポキシドまたはスクシンイミド基も
しくはこの成分の他の物体（例えば固体表面）へのカップリングを容易にする他
のタンパク質カップリング剤（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，１９９６
）に記載されているもの）などといった（好ましくは末端に位置する）反応性置
換基を含む。好ましい態様では、その化学成分が、３，３（Ｎ−［６−チオール
ヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカルバゾールである。

【００４８】本発明の第五の側面の化学成分は、本発明の第二の側面の部品が形成されるよ
うに、電気伝導性固体支持材に都合よく固定化できる。

【００４９】第六の側面において、本発明は、上に定義した第五の側面である化学成分に対
して結合特異性を持つ分子を提供する。より具体的には、この分子は、当該化学
成分の電気活性複素芳香環部分に対する結合特性を有することが好ましい。この
分子は免疫グロブリン分子またはその化学成分への結合特性を保っているその有
効部分を含むものが好都合であり、そのような部分には例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、
Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ＨＣＶまたは前述した部分の任意の一つ又はそれ以上を含む
キメラ分子などがある。好ましい態様では、この分子は少なくとも２つの結合特
異性、すなわち上述のように化学成分に対する第一の結合特異性と、対象分析物
に対する又は対象分析物に対する抗体（もしくはその有効抗原結合部分）に対す
る第二の結合特異性とを含むだろう。本発明の第六の側面に従う分子が、本発明
の第一の側面の方法を行なう際に結合パートナーとしての使用に都合よく適して
いること、および／または、本発明の第４の側面に従う部品が得られるように固
体支持材上に遊離できるように都合よく固定化しうることは、読者には明らかだ
ろう。

【００５０】以下に、本発明を例証的な例として、また添付の図面に関連して説明する。

【００５１】（実施例）実施例１この実施例は本発明のアッセイがどのように実施されうるかを示す例に関する
。

【００５２】図２を参照として、電気伝導性第一固体支持材１０が設けられ、その上に化学
成分１２が固定化される。化学成分１２は、化学成分１２の自己集合性単層が第
一支持材１０の上に形成されるように、「ペンダント」部分１４によって第一固
体支持材に取り付けられる。

【００５３】また第二固体支持材１６も設けられ、その上には対象分析物２０の類似体１８
が固定化される。結合パートナー２２は類似体１８を介して第二固体支持材１６
に遊離できるように固定化される。結合パートナー２２は第一特異的結合活性と
第二特異的結合活性（それぞれ２４および２４’と表す）を持つ二重特異性抗体
である。第一特異的結合活性２４は化学成分１２に対する活性である。第二特異
的結合活性２４’は対象分析物２０に対する比較的高い結合親和性であり、類似
体１８に対する比較的低い結合親和性も付与する。

【００５４】したがって、対象分析物２０を含む試料を導入すると、結合パートナー２２は
第二支持材１６から特異的に置換され、第二結合活性２４によって化学成分１２
に自由に結合できるようになる。化学成分１２への結合パートナー２２の結合は
化学成分１２の検出可能な電気化学的特性（例えば酸化還元電位）を、相違（例
えば電荷、電流または電位差の相違）が第一支持材１０で検出されるように、直
接変調させる。

【００５５】第一および第二固体支持材１０、１６は、アッセイを行なう時に試験試料をそ
の中に導入する毛管充填室の一部を形成すると好都合である。第二固体支持材１
６から置換された結合パートナー２２の物理的分離は、直ちに拡散によって受動
的に第一支持材１０に輸送されるだろう。

【００５６】実施例２本発明方法の別の態様を図３に図解する。図３では、機能的に同等なものは、
図２で使用したものと同じ参照番号で示している。実施例１の場合と同様に、そ
の配置は毛管充填アッセイ装置用に構成すると便利である。

【００５７】図３に図解する態様では、化学成分１２が上述のように第一固体支持材１０に
固定化される。第二固体支持材１６は、対象分析物２０に特異的な多数のモノク
ローナル抗体分子１８で覆われている。

【００５８】結合パートナー２２は抗体分子部分２４とミモトープ部分２４’からなる融合
タンパク質である。ミモトープ部分２４’はモノクローナル抗体１８によって認
識されるエピトープのペプチド「模倣体」（したがって「ミモトープ」）である
。しかし抗体１８の結合親和性は、ミモトープ２４’に対する親和性より分析物
２０に対する親和性の方がかなり（例えば１０〜１００倍）高い。したがって対
象分析物の存在は固体支持材１６から結合パートナー２２を置換する。次にアッ
セイは図２に図解した態様について記述したように進行する。

【００５９】図３に示す態様はいくつかの点で好ましいかもしれない。結合パートナー２２
は、それが化学成分１２に結合する時に、分析物２０に結合していないが、これ
は結合パートナー２２が化学成分１２の電気化学的特性を変調させる様式を分析
物２０の存在がもたらしうるという点で望ましいだろう。

【００６０】ただ一つの化学成分１２を使って、任意の対象分析物の検出に使用できるよう
に本発明のアッセイ方法を変更しうることは、当業者には理解されるだろう。結
合パートナー２２の第一結合活性２４を同一に保ったまま、関連する分析物の存
在に反応して置換が起こるように、ミモトープ部分２４’（図３）または第二結
合活性２４’（図２）を変更できる。

【００６１】また当業者は、たとえ結合パートナーが類似体１８（実施例１）または抗体１
８（実施例２）に対する親和性よりも強い親和性を対象分析物に対して持たなく
ても、遊離の対象分析物の濃度が第二固体支持材からの結合パートナーの置換を
引き起こすのに足りるという「競争」型アッセイとしても実施例１と２を実施し
うることを理解するだろう。

【００６２】実施例３−抗カルバゾールモノマー抗体の製造と有機溶媒におけるポリマー型カルバゾール電極表面でのその電気化学的特徴この実施例は、電気めっきによってカルバゾール電気活性化学成分で被覆した
、有機溶媒（例えばジクロロメタン）中での安定な電極の調製に関する。特に断
らない限り、全ての試薬は市販されているものであり、米国Ａｌｄｒｉｃｈ社か
ら購入した。

【００６３】３．１Ｎ−（６−ヘキサン酸）カルバゾールの合成カルバゾール（３．３４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を水酸化ナトリウム（４．８ｇ）
と共に水（２０ｍｌ）とトルエン（２０ｍｌ）の混合物に加えた。二相を混合す
るためにセチルトリメチルアンモニウムブロミド（１．４６ｇ、１４ｍｍｏｌ）
を界面活性剤として加えた。これに６−ブロモヘキサン酸（５．９ｇ、３０ｍｍ
ｏｌ）を加え、その溶液を４８時間還流させておいた。得られた溶液をジエチル
エーテル（３×５０ｍｌ）で洗浄して有機相を除去した。次に溶媒を回転蒸発で
除去した。

【００６４】生成物をジエチルエーテル：ガソリン（６：４）によるシリカゲル（酸性）で
のクロマトグラフィーにかけ、溶出液を２ｍｌずつ集めて生成物の存在をＴＬＣ
で調べ、ＵＶ蛍光で検出した。ＩＲ：３５００−２５００（ブロード）ＯＨ（酸
）、３０００、２８００（シャープ）三級アミン、１７５０Ｃ＝Ｏ（酸）、１
５００三級アミン。^１ＨＮＭＲ：（ＣＤＣｌ_３）１０．１０（Ｈ，ｍ，ＯＨ）
、８．０６（２Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）、７．６２（６Ｈ，ｔ，Ｊ６．３５，ＡｒＨ
）、４．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ８．８２，ＣＨ_２）、２．１５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ _２）、１．７５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２）、１．５６（４Ｈ，ｍ，ＣＨ_２）。ｍ／ｚ
２８１．２（ｍ^＋）１８０．１Ｎ−メチルカルバゾール陽イオン。

【００６５】この化合物中の酸基は、様々な目的で行なわれるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）や植物タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの担体分子へのカップリングを容易に
する。

【００６６】３．２ＰＰＤへのＮ−（６−ヘキサン酸）カルバゾールの取り付けによる免
疫原の調製抗カルバゾール抗体（カルバゾールの電気化学的特性を変調させるための結合
パートナーとして有用）を調製するには、Ｎ−（６−ヘキサン酸）カルバゾール
をより大きな担体分子にカップリングする必要があった。このカルバゾール化合
物は抗体反応を惹起するにはそれだけでは小さすぎるからである。ＰＰＤを担体
分子として選択した。

【００６７】ＰＰＤ（植物ペプチド誘導体）をカップリングするための反応混合物は、ＭＥ
Ｓ緩衝液［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（塩水パック）］（１ｍｌ
）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（４０
ｍｇ）を溶解することによって調製した。この溶液の半分（５００μｌ）をとり
、ＤＭＦ（５００μｌ）に溶解した。これにＤＭＦ（１００ｍｇ／ｍｌ、２０ｍ
ｇ）中のＮ−（６−ヘキサン酸）カルバゾールを加えた。この混合物を撹拌し、
沈殿の何らかの徴候が起こるかどうか注意深く観察した。沈殿が現れたら、少量
のＤＭＦをその溶液に加えて、その沈殿を再溶解した。この反応溶液にＰＰＤ（
５００μｌ）をゆっくり加え、暗所で２４時間撹拌した。この時間の後、その反
応混合物をリン酸緩衝食塩水に対して２４時間透析した。このＮ−（６−ヘキサ
ン酸）カルバゾールＰＰＤとＰＰＤのみについて、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社
モデル５０５０蛍光光度計で蛍光計スキャンを行なった（２００〜４００ｎｍ）
。ピークはＰＰＤについては２００ｎｍと３９０ｎｍ、ＰＰＤカルバゾールにつ
いては２００、２７０、２９２、３２９、３３５、３４５、３５０および３９０ｎｍに認められた。これにより、カルバゾールが担体分子に有効にカップリング
されたことが明らかになった。

【００６８】３．３カルバゾールに対する抗体の作成カルバゾールに対するポリクローナル抗体をウサギで作成した。バックグラウ
ンド免疫を確定するために免疫化前血液試料を採取した。そのウサギにフロイン
ト完全アジュバントと共にカルバゾール／ＰＰＤ試料（１ｍｇ／ｍｌ）を４ヶ所
に注射し（各部位に２５０ｍｌ）、１週間後に免疫化後血液を採取した。１ヵ月
後に二回目の免疫化をフロイント不完全アジュバントとカルバゾール／ＰＰＤ試
料（再び４ヶ所）で行なった。二回目の免疫化後採血は１週間後に行なった。三
回目の採血は二回目の採血の１ヶ月後に（追加免疫なしで）行なった。免疫化の
部位は脊柱の両側、前面で２ヶ所、背面で２ヶ所とした。採血は辺縁耳静脈から
行なった。血液を凝固させ、後述のようにＢＳＡ結合カルバゾールで被覆したプ
レートを使って、血清を抗体活性についてＥＬＩＳＡで試験した。ＢＳＡコンジ
ュゲートの使用によってハプテンによるプレートの被覆が容易になると共に、抗
体の作成に使用したもの（ＰＰＤ）とは異なる担体分子を使用することにより、
そのＥＬＩＳＡで検出される抗体がいずれも抗担体反応ではなく抗ハプテン反応
によるものであることが保証された。

【００６９】３．４ＢＳＡＮ−（６−ヘキサン酸）カルバゾールの合成Ｎ−（６−ヘキサン酸）カルバゾール（ＤＭＦ中１００μｇ／ｍｌを５０μｌ
）をＮ−メチルモルホリン（１０μｌ）に加えた。これにクロロギ酸イソブチル
（１０μｌ）を加え、氷で５分間冷却した。次にその混合物（４７μｌ）をＢＳ
Ａの溶液（２μｌ、水５００μｌとＤＭＦ１００μｌ中ＢＳＡ６．７ｍｇの保
存溶液から採取）に移し、４時間撹拌した。その試料を透析チューブに移し、Ｐ
ＢＳに対して４８時間、ＰＢＳ溶液を１回交換して透析した。これにより、Ｎ−
（６−ヘキサン酸）カルバゾール対ＢＳＡの比が１５０：１になった。蛍光光度
計スキャン：ＢＳＡ２８５ｎｍ、ＢＳＡカルバゾール２８５、３２９、３３５
、３４５、３５２、３８０（有効なカップリングが起こっていることを示す）。

【００７０】３．５ＢＳＡＮ（６−ヘキサン酸）カルバゾール被覆プレートを用いたＥ
ＬＩＳＡＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水０．１５％、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ社）、
各ウェルに２００ｍｌ）中で、マイクロタイタープレートを、炭酸ナトリウム緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．６）に調製したＢＳＡＮ（６−ヘキサン酸）カルバ
ゾール（１０ｍｇ／ｍｌ）で感作し、３７℃で１時間インキュベートした。次に
そのプレートを空にして、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次にそのプレートを脱脂粉
乳［Ｍａｒｖｅｌ（登録商標）］の１％溶液（ＰＢＳＴ中）各ウェルにつき２０
０ｍｌでブロックし、インキュベートした（３７℃で１時間）。この時間の後、
プレートを空にし、先と同様にＰＢＳＴ中で３回洗浄した。次に血清を一定範囲
の希釈率でプレートに加えた（１５０ｍｌ）。これを再びインキュベートした（
３７℃で１時間）。次にそのプレートを先と同様にＰＢＳＴ中で洗浄し、ヤギ抗
ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社）の１／１０００希釈液を各ウェルに加えた（１５０ｍｌ）。これを
３７℃で１時間放置し、そのプレートを先と同様にＰＢＳＴ中で洗浄した。

【００７１】酵素基質は、緩衝溶液（５ｍｌ）（ジエチルアミン、ｐＨ９．８、塩化マグネ
シウム５０：１）中に調製したパラニトロフェノールホスフェート（Ｓｉｇｍ
ａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）（１錠）の溶液とした。この基質溶液（１５０
ｍｌ）を各アッセイウェルに加え、室温で１時間以上発色させた。結果をＤｙｎ
ａｔｅｃｈ製モデルＭＲ７０００プレートリーダー、Ｗ／Ｌモード：二重、試験
フィルター：４０５ｎｍ、参照フィルター５７０ｎｍで読み取った。その結果（
簡略のためデータは省略した）から、追加免疫後に有意な抗ハプテン反応が起こ
ることと、抗ハプテン抗体レベルが１／３２００またはそれ以上の希釈率でのみ
バックグランド（対照）レベルに達することが示された。

【００７２】３．６ヘキサキス［６−（２）−（３）−（カルバゾール−９−イル）ヘキ
シル］β−シクロデキストリンの合成有機溶媒中での金または白金表面の電気めっきによって、電極をキャストする
ために、上のカルバゾール含有化合物を調製した。β−シクロデキストリンは研
究室では容易に入手でき、これを含めることで電極上でのカルバゾール含有化合
物の網目様被膜の形成が容易になると考えた。

【００７３】水素化ナトリウム（０．１５ｇ、８０％５ｍｍｏｌ）をはかりとり、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）に加えた。このＤＭＦ溶液に撹拌
しながらβ−シクロデキストリン（０．５６７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をゆっくり
加え、１０分間放置して完全に溶解させた。その混合物に９−（６−ブロモヘキ
シル）カルバゾール（１．２５ｇ、４ｍｍｏｌ）を加え、室温で４８時間撹拌し
た。

【００７４】その粗生成物混合物にジエチルエーテル（２００ｍｌ）を加え、振とうしたと
ころ、混和しない層が残った。次に有機層を取り出して、水を加えた。次にこれ
を９０分間撹拌しておき、さらに３０分間沈降させた。次に生成物を濾過し、ほ
ぼ乾燥させ、完全に乾燥するまで減圧でデシケーター中に放置した（０．７８ｇ
、５９．２％）。^１ＨＮＭＲ４００ｍｈｚ（ＤＭＳＯ）：８．１０（２Ｈ，
ｍ，４および５位，ＡｒＨ）、７．３６（４Ｈ，ｍ，２、３、６、７位，ＡｒＨ
）、７．１０（２Ｈ，ｍ，１および８位，ＡｒＨ）、５．８−５．７（非置換β
−シクロデキストリン中の二級アルコール）、４．８１（芳香族プロトン１Ｈ，
ＯＣＨＯ，１位βシクロデキストリン）、４．５（非置換β−シクロデキストリ
ン中の一級アルコール）、４．３６（２Ｈ，ｍ，Ｎ−ＣＨ_２）、４．１６（２Ｈ
，ｍ，Ｒ−Ｏ−ＣＨ _２−ＣＨ_２）、３．６１−３．２８（５Ｈ，ｍ，β−シクロ
デキストリンの脂肪族プロトン）、１．６１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２（ペンダント）
）、１．３２（６Ｈ，ｍ，３ＣＨ_２（ペンダント））。ｍ／ｚ（ＦＡＢ^＋）（ヘ
キサ置換誘導体に相当するイオンが質量スペクトル中で最も強かった）１４０７
（カルバゾイル−ヘキシル）βＣＤ＋Ｎａ、１６５６（カルバゾイル−ヘキシル
）_２βＣＤ＋Ｎａ、１９０６（カルバゾイル−ヘキシル）_３βＣＤ＋Ｎａ、２１
５８（カルバゾイル−ヘキシル）_４βＣＤ＋Ｎａ、（カルバゾイル−ヘキシル） _５ βＣＤ＋Ｎａのピークなし、２６２８（カルバゾイル−ヘキシル）_６βＣＤ、
２６７６（カルバゾイル−ヘキシル）_６βＣＤ＋２Ｎａ（Ｍ^＋）、２６６４２
×（カルバゾイル−ヘキシル）_６βＣＤ＋３Ｎａ^２＋。

【００７５】３．７ヘキサキス［６−（２）−（３）−（カルバゾール−９−イル）ブチ
ル］β−シクロデキストリンの合成比較のために、上記３．６に記述したものとよく似た化合物を、ヘキシルペン
ダント部分ではなくブチルペンダント部分を使って調製した。調製法は基本的に
上記と同じとした。

【００７６】３．８有機溶媒中で電気めっきするための一般的サイクリックボルタンメト
リー−実験の詳細サイクリックボルタンメトリーはＢｒｙａｎｓフラットベッドＸ−Ｙレコーダ
ー（モデルＡ２５０００）とＰｒｉｎｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎスキャニングポテンシオスタット（モデル３６
２）で、またＥＧ＆Ｇモデル２７３ＡＰｒｉｎｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈポテンシオスタット／ガルバノスタットで行なった。（データ
の処理にはＥｃｈｅｍとＬｏｔｕｓ１−２−３を使用）。

【００７７】電気化学セルは２５ｍｌの丸底フラスコからなり、偽または擬似参照電極とし
て銀線を、また対電極としてアルミニウム棒を使用した。作用電極はきれいな金
または白金線からなった。電解質溶液は、ヘキサフルホロリン酸テトラブチルア
ンモニウムの０．１Ｍ乾燥ジクロロメタン（塩化カルシウムで乾燥）溶液からな
った。カルバゾールβ−シクロデキストリンモノマー（０．０１ｇ）を電解質溶
液（１０ｍｌ）に溶解した。次に３つの電極をポリマー溶液に入れ、作用電極上
でポリマー薄膜を生成させるために、１回または２回のサイクリックボルタンメ
トリースキャン（毎秒１５０ｍＶで０ボルトから１．５ボルトに達した後０ボル
トに戻る）を記録した。次に電極をきれいな電解質溶液（ヘキサフルオロリン酸
テトラブチルアンモニウムの０．１Ｍ乾燥ジクロロメタン溶液）（１０ｍｌ）の
入ったきれいなフラスコに移し、約７回のスキャンを行なうか、ポリマー薄膜が
安定したスキャンを示すまでスキャンした。ポリマーは金または白金線上に安定
に形成され、その電極を分析に使用できた。

【００７８】３．９ＥＩＡ電極アッセイ以前に行なったＥＬＩＳＡはモノマーとしてマイクロタイタープレート上に提
示されたカルバゾールへの抗体の結合に関するものであったが、電気めっきした
電極ではカルバゾールは二量体として存在する。そこで、同じ抗体が電極上に存
在する二量体型カルバゾールにまだ結合するかどうかを決定するために、ＥＩＡ
電極アッセイを行なった。

【００７９】上述のようにサイクリックボルタンメトリーを行なうことにより、ジクロロメ
タン中で電極をキャストした。それらの電極を１０分間乾燥させ、ＰＢＳＴ中に
様々な血清希釈率で抗カルバゾール血清に浸し（２５０μｌ）、３７℃で１時間
インキュベートした。この時間の後、電極をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、ティッシ
ュペーパー上で乾燥した。次に電極をヤギ抗ウサギアルカリフォスファターゼコ
ンジュゲート（１／１０００、２５０μｌ）に浸し、１時間インキュベートした
（３７℃）。この時間の後、電極を先と同様にＰＢＳＴ中で洗浄し、次いで、Ｅ
ＬＩＳＡについて記述したようにパラニトロフェノールホスフェート基質溶液（
２５０μｌ）に浸し、１時間後に測色した。

【００８０】その結果（簡略のためデータは省略した）は、免疫化前の採血で得た対照血清
と比較して有意な量の抗カルバゾール抗体が電極に結合したことを明らかに示し
た。

【００８１】３．１０サイクリックボルタンメトリーとクロノアンペロメトリーによる抗
カルバゾール抗体の効果の電気化学的研究上述（３．８）のように電極をジクロロメタン中でキャストした。最後のサイ
クリックボルタモグラムを作成し、記録した。これらの電極を１０分間風乾した
。ウサギ抗カルバゾール血清を様々な濃度に希釈し、各溶液（２５０μｌ）に電
極を１０分間加えた。電極を取り出し、ＰＢＳＴ中で洗浄し、ティッシュペーパ
ーで乾燥した。二回目のサイクリックボルタモグラムを行なって最初のものと比
較したところ、明らかに相違が認められた。結果の例を図４Ａ（前採血）と４Ｂ
（免疫血清、抗カルバゾール抗体を含有する）に示す。

【００８２】図４ＡはｍＶに対するｍＡのグラフを示す。太いプロットは血清の不在下で得
られる軌跡であり、細いプロットは免疫化前血清を添加した場合に得られる軌跡
である。血清の存在がピーク高を著しく減少させることが明らかにわかる。図４
Ｂはポリマーのみで得られる結果（血清の不在下、濃いプロット）と、抗カルバ
ゾール抗体を含有する免疫血清の存在下で得られる結果（細いプロット）を示す
同様のグラフである。抗カルバゾール抗体の効果は、両方の酸化ピークの高さを
増加させること（一方は他方よりも程度が大きい）であり、これはより大きい負
の値（すなわちカルバゾールからの電子の喪失）によって示される。（同様の実
験を短い方の（ブチル）ペンダント部分カルバゾール含有成分を用いて行なった
。結果は不鮮明になり、ブチルペンダント部分が、おそらくは短すぎてカルバゾ
ール成分への結合を促進できないために、最適ではないことが示唆された。

【００８３】抗体以外の血清タンパク質の非特異的効果が最小になるように、プロテインＡ
アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＰＲＯＳＥＰＡ、ガラスビーズ上
に固定化されたプロテインＡ、ＰｏｒｔｏｎＰｒｏｄｕｃｔｓ社から入手）を
使って、従来の技術で抗体画分を血清から分離した。カラムを０．１Ｍクエン酸
塩（ｐＨ３．４）で処理することによってＩｇＧ画分を溶出し、０．５ｍｌずつ
集めた。それらを希薄な水酸化ナトリウム液で中和した。溶出試料をオンライン
ＵＶスキャナーで評価した（３６０ｎＭ）。総ＩｇＧ濃度をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ社Ｌａｍｂｄａ１６ＵＶＤＭスキャナーで２４０ｎｍから３５０ｎｍ
まで測定した。測定は２８０ｎｍで行ない、ピーク吸収をベールの法則（Ａ＝ε
ｃｌ）に入れた（ここでＩｇＧの定常領域の吸収係数（ε）は０．５１である）
。

【００８４】次に、プロテインＡ処理したＩｇＧ濃縮材料を用いてサイクリックボルタンメ
トリー実験を繰り返した。本質的に同様の結果が得られた。

【００８５】サイクリックボルタンメトリーにより、電極へのカルバゾール特異ＩｇＧの結
合は酸化ピーク高を増加させるが、そのような結合はカルバゾール成分の酸化還
元電位も低下させることが明らかになった。サイクリックボルタンメトリーなど
の電位差測定法より電流測定法の方が適切で、使いやすいと決定された。したが
ってさらなる分析はクロノアンペロメトリー（すなわち、ある期間にわたって固
定した電圧の適用）によって行なった。この方法は時間（秒またはミリ秒）に対
する電流（Ｉ）のグラフを作成するために使用でき、その曲線下面積は総クーロ
ン電荷を与える。これは、電子は既知のクーロン電荷（１．６０２×１０^−１９）を持ち、したがって実験中にカルバゾールと電極の間で輸送された電子の総数
を決定できるので、とりわけ有用である。

【００８６】時間に対するクーロン電荷のプロット（例えば図８に示すようなもの）から、
ベースラインスキャンと実験スキャンの間の差ΔＱを計算できた。図５は、免疫
血清から調製された様々な濃度のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）について、総酸化電子流
量（ΔＱによって測定されるもの、単位はμＣ）の増加を示す棒グラフである。
対照免疫化前血清を用いた場合、電子流量の変化は観察されなかった。

【００８７】実施例４−水性条件下カルバゾール二量体単層電極表面でのウサギポリクローナル抗カルバゾールモノマー抗体の電気化学的特徴づけ試料の大半は実際問題として水性であるだろうから、対象分析物の存在の検出
に使用される電極は水中または水性環境で安定であるほうがよい。本発明者らは
、先の実施例に記述した電極が水中ではあまり安定でないことを見出した。そこ
で、電気活性成分が電気めっきとｉｎｓｉｔｕでの「キャスト」によって形成
されるのではなくて、導電性表面に共有結合された代替電極を調製することにし
た。また、より均一で規則正しい表面（抗体の結合が容易になる）を提示するた
めに、自己集合性単層を形成させうる化合物を使用することにした。

【００８８】４．１Ｎ−（６−ブロモヘキシル）カルバゾールの形成カルバゾール（１．６７ｇ、１０ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（５ｇ）、水
（５ｍｌ）、トルエン（１０ｍｌ）およびセチルトリメチルアンモニウムブロミ
ド（０．７ｇ、２ｍｍｏｌ）の混合物を室温で撹拌した。これに１，６−ジブロ
モヘキサン（２．３ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を滴下した（図６、第１段階）。これ
を１７０℃で４時間、撹拌、還流した。

【００８９】その混合物を冷まし、まずジクロロメタン（５０ｍｌ）を添加し、次に水で洗
浄（１００ｍｌ×３）することによってきれいにした。次に有機層を取り出し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に有機層を濾過し、回転蒸発でジクロロメタ
ンを除去した。粗製試料をシリカゲル（ジエチルエーテル／ヘキサン２：８）で
分離し、第二スポットを採取して、減圧下に濃縮した（収量１．０９ｇ、３３％
）。化合物の構造は質量分析で確認した（３２９Ｍ＋イオン；２４９Ｂｒの
喪失；１８０Ｎ−メチルカルバゾールイオン；１６７カルバゾール；１５２カ
ルバゾールからの窒素の喪失；６９と５５、それぞれアルキル鎖に由来するＣ_５Ｈ_９イオンとＣ_４Ｈ_７イオン）。

【００９０】４．２３，３−（Ｎ−［６−ブロモヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカ
ルバゾールの形成電極の電気めっきは単量体型および二量体型カルバゾール体の両方を含む表面
を生成すると思われた。不確実な点を除くには、この実施例の最初に二量体型カ
ルバゾール体を調製することが望まれた。

【００９１】そこで４．１項で得たＮ−［ブロモヘキシル］カルバゾール（１ｇ、３ｍｍｏ
ｌ）をとり、氷酢酸（Ａｃｒｏｓ社）（７５ｍｌ）と過塩素酸（Ａｃｒｏｓ社）
（７０％ｗｗ、８ｍｌ）に溶解した。粉砕したＮ−エチルカルバゾール（０．８
ｇ、４ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加え、次に２，３−ジクロロ−５，６−ジシア
ノ−ｐ−ベンゾキノン（３ｇ、１３ｍｍｏｌ）を加えた（図６、第２段階）。そ
の混合物を１時間撹拌したところ、二量体カルバゾールの緑色沈殿物が得られ、
それを濾過した。母液をフラスコに戻し、終夜放置した。試料を再び濾過し、合
わせたろ液をアセトン（２００ｍｌ）に溶解した。その混合物に亜二チオン酸ナ
トリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社）の飽和水溶液（５００ｍｌ）を加え、それを終夜
撹拌した。その溶液は暗緑色から茶淡黄色に変わった。

【００９２】次にその反応混合物をジクロロメタン（１００ｍｌ×４）で洗浄して生成物を
取り出した。次に有機層を少量の水（２５ｍｌ×４）で洗浄した。次に有機相を
無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去した（粗製混合物１
．５ｇ、収率８３．３％）。化合物の構造は質量分析で確認した（５２２Ｍ＋
イオン；４２２ＨＢｒの喪失；３８８Ｎ−エチル二量体；３２９Ｎ（６−
ブロモヘキシル）カルバゾールイオン；１７９Ｎ−メチルカルバゾールイオン
；１２９カルバゾールからのベンゼン環の喪失；９７Ｃ_６Ｈ_１１Ｎイオン、
８３Ｃ_６Ｈ_１１イオンおよび６９Ｃ_５Ｈ_９イオン）。

【００９３】４．３３，３（Ｎ−［６−チオールヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカ
ルバゾールこの段階では電極の金表面への共有結合を容易にするためにチオール基の付加
を行なう。

【００９４】上記４．２で得た粗製試料（１．５ｇ）をエタノール９５％（２５ｍｌ）とＤ
ＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、そこにチオ尿素（Ａｌｄｒｉｃｈ社）（０．２５ｇ
、３．３ｍｍｏｌ）を加えた（図６、第３段階）。これを還流（６時間）した後
、冷却して終夜撹拌した。ＤＭＦとエタノールを回転蒸発によって除去した。

【００９５】粗生成物のシリカゲルでの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）から、精製はま
ずジクロロメタンで不純物を除去し、生成物をＤＭＦでカラムから溶出すること
によって達成できることが示唆された（図６、第４段階）。生成物が得られたら
直ちにＤＭＦを回転蒸発によって除去した。

【００９６】試料をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、還流した。還流しながら水酸化ナトリウ
ム（１５ｍｌ中０．３ｇ）を滴下した（図６、第５段階）。次にこれを還流して
おき（４時間）、冷ました。その反応溶液を濾過して沈殿物を除去した。次にそ
の試料を氷冷し、蒸留水（４００ｍｌ）をその溶液に加えた［この材料の一部を
分離し、回転蒸発によって濃縮して３，３（Ｎ−［６−ナトリウムメルカプタン
ヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカルバゾール塩を得て、それを下記４．５
に記述するようにコンジュゲートの調製に使用した］。

【００９７】３，３（Ｎ−［６−チオールヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカルバゾー
ル生成物を沈殿させるために、濃硫酸（１０ｍｌ）を滴下した（図６、第６段階
）。次にその生成物を５ｍｍフィルターを通して濾過し、デシケーター（乾燥し
たインジケーターシリカゲルを乾燥剤とする）に置き、減圧下に３日間放置した
（０．２２ｇ、９４％、純度４％）。

【００９８】図６は３，３（Ｎ−［６−チオールヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカル
バゾールを調製するために使用した反応図式の概略図である。第１段階はジブロ
モヘキサンとの反応を示し、第２段階はＮ−［ブロモヘキシル］カルバゾールの
氷酢酸、過塩素酸および２，３−ジクロロ−５，６ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン
との反応を示す。第３段階はチオ尿素との反応を示す。第４段階は所望の塩、３
，３（Ｎ−［イソチオウロニウムヘキシル］カルバゾールのＴＬＣ精製を表す。
第５段階と第６段階はそれぞれ水酸化ナトリウムおよび硫酸との反応を表す。

【００９９】４．４３，３（Ｎ−［６−チオールウンデシル］カルバゾール）Ｎ−エチル
カルバゾールの形成より長い（ウンデシル、Ｃ_１１）ペンダント部分を含む点以外は基本的に上記
と同じ化合物を調製した。合成法は、ジブロモヘキサンの代わりに１−１１ジブ
ロモ−ウンデカン（０．７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を使用した点以外は、４．２と４
．３に記述した方法と基本的に同じとした。

【０１００】４．５ヘキシルカルバゾール二量体を含むコンジュゲートの形成先に調製したポリクローナル抗血清（３．３）は単量体型カルバゾールに対し
て生じさせたものであり、二量体型のこれら化合物を必ずしも認識するとは限ら
ないので、抗体の生産とＥＬＩＳＡ試験のために、二量体型カルバゾール化合物
のコンジュゲートを調製した。したがって下記のように、カルバゾール二量体を
使って、免疫化用にはキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とのコンジ
ュゲートを調製し、またウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とのコンジュゲートを調
製した。

【０１０１】（ｉ）ＫＬＨ（キーホールリムペットヘモシアニン）カルバゾールコンジュゲ
ートの形成マレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ社、２ｍｇ）をＰＢＳ（リン酸緩衝食
塩水）（２００μｌ）に溶解した。これに３，３（Ｎ−［６−ナトリウムメルカ
プタンヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカルバゾール（ＰＢＳ２００μｌ中
２ｍｇ）を加え、その混合物をＲｅａｃｔｉＶｉａｌ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社
）中、室温で撹拌した。次にその試料をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ社）透析カセットにてＰＢＳで２時間透析した。次にＰＢＳを換えて、試料
を室温で終夜透析しておいた。次に試料を取り出してＰＢＳで２．５ｍｌにし、
ＰＤ１０カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社）にのせて、カラムから３．５ｍｌのＰＢＳに
溶出させた。試料体積を遠心濾過によって減らした。測定したＵＶスキャンは、
担体タンパク質に５０〜６０個のカルバゾール二量体が結合していることを示し
、利用できる部位の半分が満たされていることを示した。このＫＬＨコンジュゲ
ートは基本的に３．３に記述したように免疫化に使用した。

【０１０２】（ｉｉ）ＢＳＡカルバゾールコンジュゲートの形成ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社、８ｍｇ）をＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解し、その溶液に
ＤＭＳＯ（２５μｌ）中のＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジ
ルジチオ］プロピオネート）（２．１ｍｇ）を加え、室温でインキュベートし、
撹拌した（１時間）。その混合物を取り出してＰＢＳ中２．５ｍｌにし、ＰＤ１
０カラムにのせた。次にその試料を３．５ｍｌのＰＢＳでカラムからとりだした
。その試料をＲｅａｃｔｉＶｉａｌ（商標）に入れ、そこに３，３（Ｎ−［６−
ナトリウムメルカプタンヘキシル］カルバゾール）Ｎ−エチルカルバゾール（Ｐ
ＢＳ２００ｍｌ中４ｍｇ）を加え、室温で終夜撹拌した。次にその試料をＳｌｉ
ｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社）透析カセットにてＰＢＳで２時間透析
した。次にＰＢＳを換え、試料を室温で終夜透析しておいた。次に試料を取り出
し、２．５ｍｌにし、ＰＤ１０カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社）にのせ、そのカラムか
ら３．５ｍｌ量に溶出させた。測定したＵＶスキャンは担体タンパク質に５〜８
個のカルバゾール二量体が結合していることを明らかにし、利用できる部位の半
分が満たされていることを示した。（マレイミド活性化ＯＶＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社
、２ｍｇ）から出発し、基本的に同じ方法を使ってオボアルブミン［ＯＶＡ］コ
ンジュゲートを調製し、時々、ＢＳＡコンジュゲートの代わりにＯＶＡコンジュ
ゲートを使用した）。

【０１０３】基本的に先に記述したように、このＢＳＡコンジュゲートを使ってＥＬＩＳＡ
プレートを被覆した。ＢＳＡコンジュゲートで被覆したＧｒｅｉｎｅｒ製マイク
ロタイタープレートを使って行なったＥＬＩＳＡにより、ＫＬＨコンジュゲート
に対して生成した抗体が二量体型カルバゾール分子にうまく結合したことが実証
された（簡略のためデータは省略した）。

【０１０４】４．６金表面での３，３（Ｎ−（６−チオールヘキシル）カルバゾール）Ｎ
−エチルカルバゾールの形成金電極表面を研磨によってきれいにした。研磨したスクリーン印刷平板電極（
３ｍｍ×７ｍｍ）を３，３（Ｎ−（６−チオールヘキシル）カルバゾール）Ｎ−
エチルカルバゾールの溶液（ＤＭＦ中約０．０１Ｍ）に沈めることによって単層
を形成させた。これを室温で暗所に２４時間放置した。電極を取り出し、ジクロ
ロメタンで洗浄した後、きれいなジクロロメタンに入れて暗所に室温で終夜浸漬
した。

【０１０５】また一部の実験では、単層が、３，３（Ｎ−（６−チオールヘキシル）カルバ
ゾール）Ｎ−エチルカルバゾール溶液とチオールアルカン（典型的にＣ_４分子）
の混合物に電極を浸すことによって形成させたスペーサーペンダント分子（電気
活性部分を持たないもの）からなった。

【０１０６】４．７３，３（Ｎ−（６−チオールヘキシル）カルバゾール）Ｎ−エチルカ
ルバゾール単層の電気化学電気化学はＥＧ＆Ｇモデル２７３ＡＰｒｉｎｃｅｔｏｎＡｐｐｌｉｅｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈポテンシオスタット／ガルバノスタットを使って行ない、その
ようにして得たデータをＥｃｈｅｍとＬｏｔｕｓ１−２−３を使って処理した
。

【０１０７】（ｉ）有機溶媒での電気化学ジクロロメタン電気化学は、偽または擬似参照電極としての銀線、対電極とし
てのアルミニウム棒および作用電極としての金表面上の単層からなるセルで行な
った。電解質溶液は、ヘキサフルホロリン酸テトラブチルアンモニウムの０．１
Ｍ乾燥ジクロロメタン溶液からなった。電極を保存溶液から取り出し、ジクロロ
メタンで濯いだ。次に電極を乾燥ジクロロメタンに入れ、暗所にて室温で終夜浸
漬しておいた。

【０１０８】その電極を窒素気流で乾燥した。単層の電気化学を調べるために、電極を乾燥
ジクロロメタンと電解質としてのヘキサフルオロリン酸テトラブチルアンモニウ
ム（０．１Ｍ）を含むセルに移した。そのセルは、銀偽参照電極と対電極として
のアルミニウム棒を含んだ。サイクリックボルタモグラム（１００ｍＶ／秒、０
〜１．１〜０Ｖ）を、安定で再現性のあるスキャンが得られるまで繰り返した
。単層のサイクリックボルタモグラムは、電気めっきカルバゾールポリマーサイ
クリックボルタモグラムとは異なることがわかった。純粋な二量体型単層は、キ
ャスト電極で観察される二ピークボルタモグラム（実施例３に記述）ではなく、
単酸化還元ピーク過程をもたらした。

【０１０９】（ｉｉ）水性条件での電気化学次のように、作用電極を何段階かのアセトニトリル：水混合液を通してから、
（電気化学的分析を水溶液環境で行なうために）水溶液中に設置した。電極をア
セトニトリル中に１５分間浸漬した。その後、電極を取り出し、８ｍｌの溶液を
採取して、２ｍｌの溶液を捨てた。その溶液をＭｉｌｌｉＱ水で１０ｍｌにし
、電極をアセトニトリル：水混合液に戻して１５分間浸漬した。このアセトニト
リル：水混合液の２ｍｌを捨てＭｉｌｌｉＱ水で１０ｍｌにする工程を４回繰
り返し、各回１５分間浸漬した。次にアセトニトリル：水混合液を捨て、電極を
水流で濯ぎ、最後にきれいなＭｉｌｌｉＱ水に１５分間浸漬した。これは純粋
なアセトニトリルから純粋な水まで全部で６回の浸漬期間になる。これは、電極
を水性環境に漸進的に順化させ、従ってより安定な単層を形成させることにより
、サイクリックボルタモグラムを改善する効果をもった。

【０１１０】水性環境での電気化学は図１４に概略を示す配置を持つセルで行なった。図１
４に関して、セルは１００ｍｌのガラスビーカー（５０）に形成され、Ｓｕｒｅ
Ｆｌｏｗ（商標）（英国Ｏｒｉｏｎ社）Ａｇ／ＡｇＣｌ（内側）−ＫＣｌ（外
側）参照電極（５２）、きれいなコイル状白金対電極（５４）および単層が結合
している金作用電極（５６）からなった。電解質溶液（５８）は（特に断らない
限り）脱イオン水中のヘキサフルオロリン酸ナトリウムとした（理解しやすいよ
うに図１４では各部品の電気接続を省略した）。作用単層電極をこのセルに入れ
、１００ｍＶ／秒で０から０．６Ｖまで次に−０．１Ｖまでそして０Ｖに戻るサ
イクリックボルタモグラムを作成した。安定したサイクリックボルタモグラムが
得られるまでスキャンを反復（およそ６回）した。

【０１１１】前述のように、次に、電流効果を観察し測定できるように、分析の方法をクロ
ノアンペロメトリーに変えた。安定で再現性のあるスキャンが形成されてベース
ラインを与えるまでアッセイを再び繰り返した。

【０１１２】４．３水性条件で単層を分析物検出器として使用すること上述のように水性条件で安定させた電極を、単層表面を傷つけないように気を
つけながら、ティッシュペーパーで乾燥した。次に試験試料または対照試料（抗
カルバゾール抗体を含むものまたは含まないもの）を電極表面にピペッティング
し（２５μｌ、０．１４ｍｇ／ｍｌ総Ｉｇ）、電極を室温で１５分間平坦な表面
に放置した。その後、電極を振って水気を飛ばし、水流で洗浄した。次に電極を
セルに戻し、クロノアンペロメトリースキャンをベースラインスキャンと同じ条
件で測定した。比較が可能なように２つの試料を使用した。一方の試料（対照）
は抗カルバゾールＩｇＧを含まないもの（免疫化前血清試料）、他方の試料は関
連する抗カルバゾールＩｇＧを含むもの（抗体試料）である。したがって免疫化
前血清試料は陰性対照試料であり、一方、抗体試料はカルバゾールへの関連抗体
の結合に由来する効果を示すことが予想された。

【０１１３】結果は、予想通り、陰性対照スキャンが図７に示すように減少したピーク値を
与えることを示している。図７は時間に対するｍＣのグラフを示す。ベースライ
ンプロットは１、免疫前血清の存在下に得られたプロットは２と記している。逆
に、免疫抗カルバゾール抗体で処理した電極の複製試料は、それぞれ７．７３ｍ
Ｃ（図８）と７．１８ｍＣ（図９）増加したピーク高さを持つスキャンを示した
。図８と図９では、やはり、ベースラインプロットは１、抗体存在下の実験プロ
ットは２と記している。

【０１１４】実施例５−もう一つの電極表面の調製（フェロセニルカルボニルオキシ）ウンデシルチオールの製造上述の物質を、固体支持材に取り付けるもう一つの電気活性化学成分として使
用するために合成した。フェロセンカルボン酸（３．４５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を
ヘプタン（５０ｍｌ）と塩化オキサリル（９．５ｇ、７５ｍｍｏｌ）に溶解し、
１時間撹拌した。次にその反応混合物を加熱して、残りのカルボン酸を溶解し、
さらに４５分間撹拌した。溶媒を減圧下に濃縮して過剰の塩化オキサリルを除去
した。ヘプタン（３０ｍｌ×２）を加え、減圧下に濃縮して、残留している痕跡
量の塩化オキサリルがすべて確実に除去されるようにした。これにより、生成し
たフェロセンカルボン酸塩化物は暗赤色化合物として残った。

【０１１５】フェロセンカルボン酸塩化物を１１−ブロモウンデカノール（３．４６ｇ、１
３．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３ｇ、３０ｍｍｏｌ）と共にジクロ
ロメタン（１５０ｍｌ）に溶解し、室温で２日間撹拌した。その反応混合物をジ
クロロメタンを溶媒としてシリカゲルで分離した。得られた生成物は１１−（フ
ェロセニルカルボニルオキシ）ウンデカンブロミドだった。

【０１１６】ナトリウムハイドロサルフェート水和物（ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｇｅｎｓ
ｕｌｐｈａｔｅｈｙｄｒａｔｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社、１ｇ×２０ｍｍｏｌ）
を粉砕してＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌した。これに１１−（フェ
ロセニルカルボニルオキシ）ウンデカンブロミド（０．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を
加え、１時間還流（６０℃）して（フェロセニルカルボニル）ウンデシルチオー
ルを得た。

【０１１７】また、この電気活性ハプテンに対する抗体の生成と試験を容易にするために、
ＫＬＨとＢＳＡを用いてフェロセニルカルボニルウンデカン化合物のコンジュゲ
ートを調製した。ＫＬＨコンジュゲートは、ＫＬＨをカルバゾール化合物の代わ
りに（フェロセニルカルボニルオキシル）ウンデシルチオール（２ｍｇ、５０μ
ｌＤＭＳＯ／１５０μｌＰＢＳ）と反応させた点以外は、基本的にカルバゾ
ール化合物（４．５（ｉ））について先に記述したように調製した。同様に、Ｂ
ＳＡコンジュゲートはちょうど（４．５（ｉｉ））に記述したようにして、ただ
しカルバゾール化合物の代わりにフェロセニル化合物を使って調製した。

【０１１８】抗カルバゾール抗体（３．３）の生産について上に記述したように、ＫＬＨコ
ンジュゲートを使ってウサギで抗（フェロセニルカルボニルオキシル）ウンデシ
ル抗体を生成させ、先に記述したように（３．５）、ＢＳＡコンジュゲート被覆
マイクロタイタープレートでのＥＬＩＳＡによって試験した。その結果（簡略の
ために省略）は、よいハプテン特異的反応が得られることと、追加免疫したウサ
ギから得られるポリクローナル血清が１／１０００を超える血清希釈率でバック
グラウンドより高い抗ハプテンＥＬＩＳＡ反応を与えることを示した。

【０１１９】実施例６カルバゾール二量体の単層への抗カルバゾール抗体の結合を電気化学的アッセ
イによって直接うまく検出できることが実証されたので、本発明者らは、この原
理に基づいて、対象分析物エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）用アッセイ
の発明に着手した。このようなアッセイの策定の第一段階は、二重特異性抗Ｅ３
Ｇ／抗カルバゾール抗体構築体の調製だった。

【０１２０】６．１ｓｃＦｖ４１５５抗Ｅ３Ｇ抗体フラグメントの単離基本的にＷａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ１９８９３４１，５４４）が記述して
いるようにして、Ｅ３Ｇに対する特異性を持つｓｃＦｖをコードするＤＮＡをハ
イブリドーマ細胞株４１５５から単離し、大腸菌発現プラスミドｐＨＥＮに組み
立てた。活性な対応抗体フラグメントを、修飾Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク
質との融合タンパク質としてのファージディスプレイによって単離した。ｓｃＦ
ｖは、そのＶＬのＣ末端を、精製用のポリヒスチジン残基を含有するペプチド配
列と検出用の二次抗体（抗ヒドロフィルＩＩ）によって認識される配列で標識さ
れた。（抗体抗ヒドロフィルＩＩはＥＰ０４５６７９０に開示されていて
、それを得る方法もそこに示されているが、そこではこの抗体が「抗親水性テー
ル」と呼ばれている）。得られた構築体のＤＮＡ配列を配列番号１として添付の
配列表に示す。コードされているポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２とし
て添付の配列表に示す。

【０１２１】６．２抗カルバゾールＨＣＶフラグメントＨＣＶ３とＨＣＶ２４の単離抗カルバゾールＨＣ−Ｖドメインをコードする遺伝子を、基本的に下記のよう
に単離した。それらの遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩとＢｓｔＥＩ
Ｉを使って標準的分子生物学的手法により、Ｍ１３ファージディスプレイプラス
ミドに遺伝子ＩＩＩ融合物としてクローニングした。以下に簡単に説明する。

【０１２２】（ｉ）ラマＨＣ−Ｖドメインをコードする遺伝子フラグメントの単離担体ＰＰＤにカップリングしたカルバゾール（免疫化１回あたり２５０〜５０
０μｇ）を使ってラマを２〜４週間間隔で８回免疫化した。最後の免疫化の５日
後に、約２００ｍｌの血液試料を採取し、濃縮リンパ球集団をフィコール（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）不連続勾配遠心分離で得た。それらの細胞から、全ＲＮＡを
酸チオシアン酸グアニジン抽出によって（例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｎｓｋとＳａ
ｃｃｈｉ（１９８７）が記述している方法で）単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成（
Ａｍｅｒｓｈａｍ第一鎖ｃＤＮＡキットを使用）後に、ＨＣ−Ｖフラグメントと
、長いまたは短いヒンジ領域の一部をコードするＤＮＡフラグメントを、特異的
プライマーＶ_Ｈ−２Ｂ、Ｌａｍ−０７およびＬａｍ−０８を用いるＰＣＲによっ
て増幅した：ＰｓｔＩＶ_Ｈ−２Ｂ５’−ＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ−３’ （
配列番号３）Ｓ＝ＣおよびＧ、Ｍ＝ＡおよびＣ、Ｒ＝ＡおよびＧ、Ｗ＝ＡおよびＴＬａｍ−０７ＨｉｎｄＩＩＩ５’−ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴ
ＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＧ−３’ （配列番号４）Ｌａｍ−０８ＨｉｎｄＩＩＩ５’−ＡＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴ−３’ （配列番号５）そのＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩ（アミノ酸Ｌ−ＱをコードするＨＣ−Ｖド
メインのコドン４および５と一致する）とＢｓｔＥＩＩ（ＨＣ−Ｖ遺伝子フラグ
メントの３’末端に位置し、アミノ酸配列Ｑ−Ｖ−Ｔと一致する）で消化した後
、３００〜４００ｂｐの長さを持つＤＮＡフラグメント（ＨＣ−Ｖドメインをコ
ードするが、最初の３コドンと最後の３コドンを欠く）をゲル電気泳動とアガロ
ースゲルからの単離によって精製した。これらＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩフラグメ
ントを修飾ｐＨＥＮ系ファージディスプレーベクターに挿入して、ＨＣＶ遺伝子
をＭ１３の遺伝子ＩＩＩにＨＩＳ６−ｍｙｃ配列を介して連結した。このライ
ブラリーをエレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換
して２．７×１０^６個の形質転換体を得た。

【０１２３】（ｉｉ）アフィニティーパンニングを用いたカルバゾール結合性ＨＣＶフラグ
メントの選択２ＴＹ／Ａｍｐ／グルコース１５ｍＬと抗カルバゾールライブラリー５０μＬ
から出発して先端にＨＣＶフラグメントを発現するファージを調製し、培養物が
対数期（Ａ_６００＝０．３〜０．５）に達するまで生育した。Ｍ１３Ｋ０７ヘル
パーファージを加え、その培養を振とうせずに３７℃で３０分間インキュベート
した。感染細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞ペレットを２００ｍＬ
の２×ＴＹ／Ａｍｐ／Ｋａｎに再懸濁した。３７℃で終夜インキュベートした後
、細胞を遠心分離によって除去した。ファージを次のＰＥＧ沈殿法によって上清
から単離した：１／５量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール８
０００、２．５ＭＮａＣｌ）を加え、よく混合し、氷水中に１時間放置する；
ファージ粒子を８０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によってペレットにする；
そのファージペレットを水２０ｍＬに再懸濁し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液４ｍＬを
加える；混合し、氷水中に１５分間放置する；ファージ粒子を５０００ｒｐｍで
１５分間の遠心分離によってペレットにする；そのファージペレットを２％Ｍａ
ｒｖｅｌを含むＰＢＳ２ｍＬに再懸濁する。

【０１２４】炭酸緩衝液（１００ｍｇ／ｍｌ）中のＯＶＡ−カルバゾール１ｍｌを使って３
７℃で終夜被覆したＮｕｎｃイムノチューブ（５ｍＬ）をＰＢＳで３回洗浄し、
２％Ｍａｒｖｅｌを含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。１ｍＬのフ
ァージ懸濁液をそのチューブ（と対照チューブ）に加え、ときおり振とうしなが
ら室温で２時間インキュベートした。チューブをＰＢＳ−Ｔで２０回、次いでＰ
ＢＳで２０回洗浄することにより、未結合のファージを除去した。結合したファ
ージを１ｍＬの溶出緩衝液（０．１ＭＨＣｌ／グリシンｐＨ２．２／１ｍｌ／
ｍＬＢＳＡ）で溶出した。室温で１５分後に、２Ｍトリス６０ｍＬを加えるこ
とによって、その混合物を中和した。９ｍＬの対数期大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ
を加えることによって溶出したファージを回収した（また溶出したファージ１０
μｌを使って対数期大腸菌Ｄ２９ＡＩも感染させた）。また、４ｍＬの対数期大
腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅもイムノチューブに加えた。どちらの培養物も振とうせず
に３７℃で３０分間インキュベートすることで感染させた。その画分をプールし
、１０^−１〜１０^−６の連続希釈液を２ＴＹ／Ａｍｐ／グルコース選択プレート
に撒いた。

【０１２５】選択実験の結果チューブ１本あたりのファージ投入量１０^１３対照チューブから回収されたファージ５×１０^４ＯＶＡ−カルバゾール被覆プレートから回収されたファージ３×１０^６（ｉｉｉ）特異的カルバゾール結合性ＨＣ−Ｖドメインの単離ＨＩＳ６ｍｙｃテールを持つ可溶性ＨＣ−Ｖフラグメントを製造するために、
１回目のパンニング後に得られた個々のコロニー（大腸菌Ｄ２９ＡＩ株中）を、
１ウェルあたり２００μｌの２ＴＹ／Ａｍｐ／グルコース培地を含有する９６ウ
ェルマイクロタイタープレートで生育した。培養物がＯＤ_６００＝０．５に到達
したら直ちに、それらの培養物のうち１５０μｌをＶ底９６ウェルプレートに移
し、細胞を遠心分離によってペレットにした。その大腸菌細胞ペレットを２００
μｌの２ＴＹ／Ａｍｐ／ＩＰＴＧに再懸濁し、２５℃で終夜（振とうしながら）
インキュベートした。上清中の特異的カルバゾール結合ＨＣ−Ｖフラグメントの
存在は次のように決定した。

【０１２６】炭酸緩衝液中のＯＶＡ、ＢＳＡ、ＯＶＡ−カルバゾールまたはＢＳＡ−カルバ
ゾール（１００μｇ／ｍｌ）で感作したマイクロタイタープレートをＰＢＳ−Ｔ
で１回洗浄し、１ウェルにつき２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ中
１％ＢＳＡ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、大腸菌上清を等
体積のブロッキング緩衝液と混合した。これらの試料のうち５０μＬを感作した
マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。抗体フラグメントを３７℃で１
時間抗原に結合させた。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することにより、未結合のＨＣＶ
を除去した。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体Ｎｒ４１１１の１μｇ／ｍＬ溶液（ブ
ロッキング緩衝液中）１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することにより、未結合の抗体をすべて除去し
た。アルカリ性ホスファターゼ結合抗マウス抗体の適当な希釈液（ブロッキング
緩衝液中）１００μＬを各ウェルに加えた（３７℃で１時間インキュベート）。
ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することにより、未結合のコンジュゲート化抗体をすべて
除去した。各ウェルに１００ｍＬの基質溶液（１Ｍジエタノールアミン／１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２中１ｍｇ／ｍｌｐＮＰＰ）を加えることにより、アルカリ性ホス
ファターゼ活性を検出した。

【０１２７】この方法で、いくつかの特異的抗カルバゾールＨＣ−Ｖフラグメントが単離さ
れたが、その中の２つをそれぞれＨＣＶ３、ＨＣＶ２４と名付けた。ＨＣＶ３の
ＤＮＡ配列とアミノ酸配列を添付の配列表にそれぞれ配列番号６および７として
示す。ＨＣＶ２４のＤＮＡ配列とアミノ酸配列は添付の配列表にそれぞれ配列番
号８および９として示す。これらのフラグメントの抗原結合特異性をＥＬＩＳＡ
で決定したところ、これらのフラグメントが所望の抗カルバゾール結合活性を有
することが明らかになった。

【０１２８】ＨＣＶ−カルバゾール相互作用のチオシアン酸アンモニウム（ＡＴＣ）感受性
（結合強度の相対尺度）は、基本的に上述したようなプロトコールを使って、Ｈ
ＣＶ含有上清と共に様々な濃度のＡＴＣを含めることにより、ＨＣＶ３とＨＣＶ
２４のどちらについても０．５Ｍ（値＝結合シグナルが最大値の５０％であった
ＡＴＣ濃度）と決定された。

【０１２９】６．３抗カルバゾールＨＣＶドメインの発現と精製ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩＨＣＶ３およびＨＣＶ２４遺伝子フラグメントをＰ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換／発現ベクターｐＰＩＣ９にサブクローニングした
。これは２つのクローニング段階を伴い、第一段階では、ファージディスプレー
ベクターｐＵＲ４５３６から得られるＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩＨＣＶ３および
ＨＣＶ２４フラグメントをｐＵＣ．Ｙ−ＨＩＳ２ｔシャトルベクターにサブクロ
ーニングして、それぞれｐＵＣ．Ｙ−ＨＣＶ３−ＨＩＳ２ｔとｐＵＣ．Ｙ−ＨＣ
Ｖ２４−ＨＩＳ２ｔを得た。図１０はプラスミドＹ−ＨＣＶ−ＨＩＳ２ｔ構築体
の地図を示す。次の段階では、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩＨＣＶ−ＨＩＳ２ｔフラ
グメントをこれらの中間体から切り出し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したｐＰ
ＩＣ９に挿入してｐＰＩＣ．ＨＣＶ３−ＨＩＳ２ｔとｐＰＩＣ．ＨＣＶ２４−Ｈ
ＩＳ２ｔを得た。図１１はプラスミドｐＰＩＣ．ＨＣＶ構築体の地図を示す。ｐ
ＰＩＣ．ＨＣＶ３−ＨＩＳ２ｔとｐＰＩＣ．ＨＣＶ２４−ＨＩＳ２ｔの発現産物
のアミノ酸配列を添付の配列表の配列番号１０と１１に示す。

【０１３０】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は基本的にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系の供給者（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が推奨しているとおりに形質転換した。簡単に述べる
と、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５細胞をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２
％ペプトン、１％グルコース）５００ｍｌ中３０℃でＯＤ_６００＝１．４まで終
夜生育した。その細胞を遠心分離し、ペレットを滅菌蒸留水で洗浄してから、Ｋ
ＤＴＴ緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、２５ｍＭＤＴＴ）１００
ｍｌに再懸濁した。３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞をペレットに
し（３分間、３０００ｒｐｍ）、氷冷ＳＴＭ緩衝液（９２．４ｇグルコース／ｌ
、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ_２）１００ｍｌに再懸
濁した。

【０１３１】この緩衝液で５回洗浄した後、細胞ペレットをＳＴＭ緩衝液０．５ｍｌの最終
体積に再懸濁した。Ｈ_２Ｏ２μｌ中のＤＮＡ約２〜５μｇ（ＢｇｌＩＩ消化ｐ
ＰＩＣ構築体；フェノール／クロロホルム抽出と沈殿によって精製したＤＮＡ）
を新しいコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞７０μｌと混合した（氷上）。
細胞をＢｉｏＲａｄＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒで、０．２ｃｍキュベット中１．
５ｋＶ、４００Ω、２５μＦでエレクトロポレートした。エレクトロポレーショ
ンの直後に、１ｍｌのＹＰＤ培地を細胞に加えた。３０℃で１時間の回復後に、
細胞をペレットにし、１Ｍソルビトール２００μＬに再懸濁し、ＭＭ平板（１．
３４％ＹＮＢ、４×１０^−５％ビオチン、１％グルコース、０．１５％寒天）に
撒いた。形質転換細胞によって形成されたコロニー（Ｈｉｓ^＋）は３０℃で４８
時間以内のインキュベーションで視認できた。形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ細胞ＧＳ１１５は基本的にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔ
ｏｒｉｓ発現マニュアルで推奨されているとおりに選択した。Ｈｉｓ^＋形質転換
体を含む平板を使ってＭｕｔ^＋およびＭｕｔ^Ｓ表現型を次のようにスクリーニン
グした：滅菌爪楊枝を使ってコロニーをＭＭ平板（１．３４％ＹＮＢ、４×１０ ^−５％ビオチン、０．５％ＭｅＯＨ、０．１５％寒天）とＭＤ平板の両方に、必
ずＭＭ平板を最初にパッチするようにして、規則正しい模様にパッチした。各構
築体について約１００個の形質転換体を拾った。３０℃で２〜３日平板をインキ
ュベートした後、その平板を採点した。ＭＤ平板上では正常に生育するがＭＭ平
板上ではほとんど成長しないか全く成長しないコロニーをＭｕｔ^Ｓクローンと分
類した。

【０１３２】形質転換され選択されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローンを、以下に概略を記す
プロトコールを用いて、ＨＣＶドメインを発現するように誘導した。ｉ）ＭＤ平
板から得た単コロニーを５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中のＢＭＧＹ（１％酵
母エキス、２％ペプチド、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、１．３４％Ｙ
ＮＢ、４×１０^−５％ビオチン、１％グリセロール）１０ｍｌに接種した；ｉｉ
）その培養物を振とう培養器（２５０ｒｐｍ）中３０℃で、ＯＤ_６００＝２〜８
まで生育した；ｉｉｉ）培養物を２０００ｇで５分間遠心分離し、細胞をＢＭＭ
Ｙ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０
、１．３４％ＹＮＢ、４×１０^−５％ビオチン、０．５％グリセロール）２ｍｌ
に再懸濁した；ｉｖ）培養物を培養器に戻した；ｖ）２４時間後に誘導を維持す
るために２０μＬのＭｅＯＨを培養物に加えた；ｖｉ）４８時間後に細胞を遠心
分離で除去することによって上清を収集した。

【０１３３】個々の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡでアッセイし、単一のＨＣＶドメ
イン産生クローンを使ってこの工程をスケールアップすることにより、より大量
の抗体フラグメントを得た。

【０１３４】培養上清（２００ｍＬ、ｐＨ６〜８）を０．４５μ低タンパク質結合セルロー
スアセテートフィルター（ＮａｌｇｅＮｕｎｃＩｎｔｌ．社）を通して清澄
化し、Ｎｉ−ＮＴＡＳｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（５ｍＬ、英国Ｑｉａｇｅｎ社
）に２ｍＬ／分でのせ、ＰＢＳＡで２８０ｎｍの吸光度がベースラインに達する
まで洗浄した。５カラム体積にわたる０−５００ｍＭイミダゾールの直線的勾配
による溶出の後、ＰＢＳＡで予め平衡化したＧ−２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ベッド
体積１５０ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のカラムに通し、４ｍＬ画分ずつ集め
ることによって、直ちに緩衝液交換した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬ
ＩＳＡでアッセイし、合わせ、小分けして凍結乾燥した。

【０１３５】６．４二重特異性ｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ３およびＨＣＶ２４構築体の構
築ｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ３−ＨＩＳ２ｔおよびｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ２
４−ＨＩＳ２ｔ二重特異性抗体フラグメントの構築は２つのクローニング段階を
伴う。第一段階では、ｓｃＦｖ４１５５のＣ末端とＨＣＶフラグメントのＮ末端
の融合を可能にする柔軟なポリペプチドリンカーをコードする合成ＸｈｏＩ／Ｐ
ｓｔＩフラグメント（ｐＵＲ４１２４：ＶＬ−Ｌｙｓ−合成リンカー−ＶＨ−Ｌ
ｙｓＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩインサートを含有するｐＵＣベクター：ＤＮ
Ａ配列とコードされているアミノ酸配列をそれぞれ添付の配列表の配列番号１２
と１３に示す）を、ＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで開裂したＹ−ＨＣＶ３−ＨＩＳ２ｔと
Ｙ−ＨＣＶ２４−ＨＩＳ２ｔに挿入して、それぞれＹ．ｌｉｎｋ−ＨＣＶ３−Ｈ
ＩＳ２とＹ．ｌｉｎｋ−ＨＣＶ２４−ＨＩＳ２ｔを得た。第二段階では、Ｙ．ｌ
ｉｎｋ−ＨＣＶ−ＨＩＳ２ｔ構築体から得たＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント
をＢｓｔＥＩＩ／ＥｃｏＲＩで開裂したｐＩＣ．ｓｃＦｖ４１５５−ＨＩＳ２ｔ
にＶＬ４１５５コードＢｓｔＥＩＩ／ＸｈｏＩフラグメント（同じベクターから
単離したもの）と共に挿入して、それぞれｐＰＩＣ−ｓｃＦｖ４１５５−ｌｉｎ
ｋ−ＨＣＶ３．ＨＩＳ２ｔとｐＰＩＣ．ｓｃＦｖ４１５５−ｌｉｎｋ−ＨＣＶ２
４．ＨＩＳ２ｔを得た。図１２はプラスミドｐＰＩＣ．ｓｃＦｖ４１５５−ＨＣ
Ｖに基づく構築体の地図を示す。ｐＰＩＣ．ｓｃＦｖ４１５５−ｌｉｎｋ−ＨＣ
Ｖ３．ＨＩＳ２ｔとｐＰＩＣ．ｓｃＦｖ４１５５−ｌｉｎｋ−ＨＣＶ２４．ＨＩ
Ｓ２ｔの発現産物のアミノ酸配列をそれぞれ添付の配列表の配列番号１４と１５
に示す。

【０１３６】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体を、形質転換前にｐＰＩＣＤＮＡをＢｇｌ
ＩＩの代わりにＤｒａＩで消化した点以外は、基本的に６．３に記述したように
単離した。粗製Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ上清を、Ｂｉｏ−Ｒａｄｍｉｎｉ−Ｐｒ
ｏｔｅａｎＩＩシステムを使った１２％アクリルアミドゲルでの分析により、
ｓｃＦｖ−ＨＣＶ融合タンパク質の産生について試験した。Ｅ３Ｇ、カルバゾー
ルおよび二重特異性結合活性は、次のように、ＥＬＩＳＡで示された：（ａ）９
６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＨＣプレート）を３７℃で終夜
活性化し、２００μｌ／ウェルのＯＶＡ−Ｅ３ＧまたはＯＶＡ−カルバゾールコ
ンジュゲートで３７℃で終夜活性化した；（ｂ）ＰＢＳＴで１回洗浄した後、ウ
ェルを１ウェルあたり２００μＬのブロッキング緩衝液と共に３７℃で１時間イ
ンキュベートした（ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中１％ＢＳＡ）；（ｃ）試
験試料の連続希釈液（１００μＬ）を等体積のブロッキング緩衝液と混合し、感
作したＥＬＩＳＡウェルに加えた。プレートを３７℃で１〜２時間インキュベー
トした；（ｄ）ブロッキング緩衝液中の抗ヒドロフィルＩＩモノクローナル（ク
ローンＮｒ４８９０）１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした；（ｅ）ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することによって未結合の抗体を除去し
た；（ｆ）アルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体の適当な希釈液（ブロッキ
ング緩衝液中）１００μＬを各ウェルに加えた（３７℃で１時間インキュベート
）；（ｇ）ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することにより、未結合のコンジュゲート化抗
体を除去した。各ウェルに１００ｍＬの基質溶液（１Ｍジエタノールアミン／１
ｍＭＭｇＣｌ_２中１ｍｇ／ｍｌｐＮＰＰ）を加えることにより、アルカリホ
スファターゼ活性を検出した。

【０１３７】もう一つの選択肢として、二重特異性カルバゾール／Ｅ３Ｇ結合性ＨＣ−Ｖフ
ラグメントの存在を、そのフラグメントをＯＶＡ−カルバゾール被覆プレートに
結合させて、その後のＥ３Ｇ−ＡＰコンジュゲートとのインキュベーションによ
ってＥ３Ｇ結合活性を検出することによって検出した。ＰＢＳＴで１回洗浄した
後、１００μｌ／ウェルのｐＮＰＰ基質（１Ｍジエタノールアミン／１ｍＭＭ
ｇＣｌ_２中の１ｍｇ／ｍＬｐＮＰＰ）を添加することによって、捕捉されたＥ
３Ｇ−ＡＰを検出した。要約すると、その結果は、ｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ３
およびｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ２４二重特異性分子がＥ３Ｇとカルバゾールの
両方に結合できることを示した。

【０１３８】実施例７エストロン−３−グルクロニドのアッセイ望ましい２つの結合特異性を持つ二重特異性免疫グロブリン分子が得られたの
で、本発明者らはＥ３Ｇ対象分析物の存在を本発明に従って決定するアッセイを
行なうことができた。

【０１３９】７．１電気化学的検知層の構築電極は実施例４．６の説明に従って調製した。

【０１４０】７．２電気化学的測定用セルの構築（参照番号は図２に示す整数を指す）厚さ約０．５ｍｍの薄いプラスチックシートのストリップをスペーサーとして
使用し、電極をとりまく電極支持材表面（図２の１０）に両面接着テープで貼っ
た。このようにして深さ０．５ｍｍの小室が金電極の周りに形成され、毛管充填
装置になった。これにより、５０μｌの試料を電極の上に置いてインキュベート
することができた。もう一つのタイプでは、プラスチックのふたを小室の上に設
置するが、２つの末端は開けておいた。検査の結果、その小室を満たすには１０
μｌの液体で足りることと、電気化学的測定を行なうとそのふたがない場合とほ
とんど同じ結果を与えることが示された。

【０１４１】７．３Ｅ３ＧおよびＥＤ３Ｇコンジュゲートの形成新たに調製したＥＤＣ（１−エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、０．１Ｍ）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、０．０２Ｍ）の溶液
２ｍｌに２．６ｍｇのＥ３ＧまたはＥＤ３Ｇを再懸濁し、室温で１５分間インキ
ュベートすることにより、エストロン３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）またはエスト
ラジオール３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ）オボアルブミンコンジュゲートを調製
した。

【０１４２】そのＥ３ＧまたはＥＤ３Ｇ溶液に、２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ
）を加え、それを一定に撹拌しながら室温で２．５時間インキュベートした。

【０１４３】次に、そのコンジュゲート化したＥ３ＧまたはＥＤ３Ｇオボアルブミン溶液を
０．１％アジ化ナトリウムを含む１Ｌのリン酸緩衝食塩水に対して１６時間透析
した。

【０１４４】７．４免疫化学的表面の構築電極に直面するふた（１６）の表面（典型的にポリカーボネートまたはポリス
チレン）を修飾してアッセイ表面（１８）を形成させた。そのプラスチック表面
をリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中０．５ｍｇ／ｍｌの溶液と共に室温
で２時間インキュベートすることにより、そのプラスチック表面に、上記実施例
７．３のようにオボアルブミンに結合したエストロン−３−グルクロニド（競争
アッセイ用）またはエストラジオール−３−グルクロニド（置換アッセイ用）を
吸着させた。その表面をＰＢＳで濯いで過剰のコンジュゲートを除去し、ホット
ヘアドライヤーで３０秒間乾燥した。次に、その表面を双頭型抗体の溶液（ＰＢ
Ｓ中１００μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートすることにより、
その表面に、実施例６に記載の双頭型抗体ｓｃＦｖ４１５５−ＨＣＶ３（２２）
を装填した。

【０１４５】７．５電気化学的測定用セルの調製実施例４．７（ｉｉ）に記述したように、ふたのないセルで、安定なベースラ
インスキャンを得た。

【０１４６】７．６エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）のアッセイ電極を窒素の気流で乾燥した。過剰の抗体をＰＢＳで表面から濯ぎ落とし、ふ
た（１６）を振って液体を振り落としてから（またある実験では風乾したが、ア
ッセイ結果に目立った影響はなかった）、それを電極室の上に取り付けた。直ち
にその小室を、測定しようとする試料（２０）で満たした。この例では、試料は
ＰＢＳ中に既知の濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）で調製したＥ３Ｇの溶液だった。
Ｅ３Ｇを含有する試料では、双頭型抗体が免疫化学的表面から置換または競争的
に脱離されて、電極表面のカルバゾール二量体基（１２）に結合できるようにな
る。セルは４．７（ｉｉ）に記述したように設置し、２０分間反応させた。

【０１４７】７．７電気化学的反応の測定毛管を振って空にし、蒸留水で洗浄した。次に電解質溶液を毛管充填装置に戻
し、電気的測定値、ここではクロノアンペロメトリーの測定値を（４．７（ｉｉ
）と同様に）測定し、バックグランドスキャンと比較して、実施例３．１０に記
述したようにΔＱ値を計算した。

【０１４８】７．８アッセイ曲線図１５は、添加する分析物Ｅ３Ｇの濃度を増やした８つのセルについてのアッ
セイ曲線（用量反応、Ｅ３Ｇの濃度（単位μｇ／ｍｌ）に対するΔμＱ）である
。典型的な免疫アッセイ曲線形状が見られる。ピーク反応は１０μｇ／ｍｌと２
０μｇ／ｍｌの間のＥ３Ｇ濃度で得られた。２つの重要な対照も図に示されてい
る：ＰＢＳ（Ｃｏｎ２）またはＰＢＳ中のＥ３Ｇ（５０μｇ／ｍｌ）（Ｃｏｎ１
）は、双頭型抗体の不在下で、電気化学的変化を引き起こさなかった。

【０１４９】７．９小室の深さを減らしたアッセイ更なる実験では、両面接着テープのみをスペーサーとして使用することにより
小室の深さを減らし（小室の深さをおよそ１／５、０．１ｍｍ前後にする）、実
質的に上述したようにアッセイを繰り返した。ビーカーをＥ３Ｇ試料溶液（２５
μｇ／ｍｌ）で満たし、その溶液は毛管作用により毛管装置に入った。スキャン
はできるだけ早く（約２０秒後）行ない、その後、約１分間隔でさらなるスキャ
ンを行なった。図１６（時間（単位：秒）に対するμＣ）に示す結果は、極めて
早いシグナルの発生（ΔＱの最大値はわずか１、２分後に得られる）を示し、
この装置が試料のリアルタイムのモニタリングと分析を可能にすることを示して
いる。図１６に関して、（Ａ）はバックグラウンドスキャンであり、（Ｂ）は２
０秒後に得られるスキャン、（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）および（Ｆ）はそれぞれ１、２
、３および４分後に得られるスキャンである。基本的に１、２分後にはスキャン
の形にさらなる変化がなかったことがわかる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜Ｄはそれぞれピロール類、フラン類、チオフェン類およびカルバゾー
ル類の一般構造を示す。

【図２】図２は本発明の方法、部品およびアッセイ装置の概略図である。

【図３】図３は本発明の方法、部品およびアッセイ装置の概略図である。

【図４】図４ＡとＢはサイクリックボルタモグラムの結果を示す。

【図５】図５は様々な濃度のＩｇＧに関するΔＱの棒グラフである。

【図６】図６は、本発明方法の実施と本発明部品の製作での使用に適した化合物を調製
するために使用した反応図式の概略図である。

【図６ａ】図６ａは、本発明方法の実施と本発明部品の製作での使用に適した化合物を調
製するために使用した反応図式の概略図である。

【図７】図７は時間に対するｍＣのグラフである。

【図８】図８は時間に対するｍＣのグラフである。

【図９】図９は時間に対するｍＣのグラフである。

【図１０】図１０は本発明方法での使用に適した試薬を得るのに役立つプラスミド構築体
の概略図である。

【図１１】図１１は本発明方法での使用に適した試薬を得るのに役立つプラスミド構築体
の概略図である。

【図１２】図１２は本発明方法での使用に適した試薬を得るのに役立つプラスミド構築体
の概略図である。

【図１３】図１３は本発明の様々な側面を実施する際に有用な化学成分の概略図である。

【図１４】図１４は様々な電極被膜の電気化学的特性を調べるために使用される電気化学
セルの概略図である。

【図１５】図１５は本発明方法に従ってＥ３Ｇ対象分析物を検出するために使用した本発
明アッセイ装置に関する用量反応曲線を示すグラフである。

【図１６】図１６は時間に対するμＣのグラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月１５日（１９９９．１２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】［式中、Ｒ_１とＲ_２は同一でなく、Ｈ；ＯＨ；Ｃ_１−Ｃ_１４アルキル、アリール
、アルケニルまたはアルコキシ（すべて任意に置換されていてもよい）；ハライ
ド；アミド；またはアミンであり、さらにその複素芳香環構造は一つまたはそれ
以上の位置がアルキル、アリール、アルケニルまたはアルコキシ基（すべてそれ
ら自体が任意に置換されていてもよい）、酸基（有機酸または無機酸基）、ハラ
イド、アミドまたはアミンで置換されていてもよい］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C204 BB04 BB09 CB25 DB01 EB01 FB01 FB02 GB01 4H045 AA11 DA75 FA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学成分がその上に固定化されている電気伝導性固体支持材
を含む部品であって、前記化学成分が電気活性部分（その電気活性部分に対して
特異的結合活性を持つ結合パートナーの、その電気活性部分への結合により、検
出可能な様式で直接変調されうる電気化学的特性を持つもの）を含む、試料中の
対象分析物の存在を検出する装置の部品。
【請求項２】電気伝導性固体支持材が金、白金、金属酸化物、炭素／グラ
ファイト、ケイ素またはケイ酸塩を含む請求項１の部品。
【請求項３】電気化学的特性の変調が化学成分の酸化または還元を伴う請
求項１または２の部品。
【請求項４】電気活性部分が免疫原またはハプテンを含み、結合パートナ
ーが電気活性部分に対する結合特異性を持つ免疫グロブリンまたはその有効抗原
結合部分を含む請求項１、２または３のいずれか一項の部品。
【請求項５】化学成分が適度に疎水性の有機物を含む先行する請求項のい
ずれか一項の部品。
【請求項６】化学成分が非局在化電子の共役系を含む先行する請求項のい
ずれか一項の部品。
【請求項７】化学成分が有機金属化合物または複素芳香族化合物からなる
先行する請求項のいずれか一項の部品。
【請求項８】化学成分が次の化合物の１またはそれ以上を含む単量体、二
量体または多量体を含む先行する請求項のいずれか一項の部品：カルバゾール類、フェロセン類、ピロール類、フラン類およびチオフェン類。
【請求項９】化学成分の電気活性部分がペンダント鎖部分によって電気伝
導性固体支持材から分離されている先行する請求項のいずれか一項の部品。
【請求項１０】ペンダント鎖部分が電気活性部分と電気伝導性固体支持材
の間の電子の輸送を容易にするように、非局在化電子の共役系を含む請求項９の
部品。
【請求項１１】ペンダント鎖部分がアルキル、アルケニル、置換アルキル
または置換アルケニルである請求項９の部品。
【請求項１２】鎖部分が一般式（−ＣＨ_２−）_ｎ（ここでｎは３から１４
まで、好ましくは５から１２まで（両端を含む）の整数である）に従う請求項１
１の部品。
【請求項１３】化学成分が電気伝導性固体支持材上に自己集合性単層を形
成できる分子である先行する請求項のいずれか一項の部品。
【請求項１４】先行する請求項のいずれか一項の部品を含む、対象分析物
の存在を検出するためのアッセイ装置。
【請求項１５】さらに次の１またはそれ以上を含む請求項１４のアッセイ
装置：試験用試料を受ける受容手段；化学成分の電気活性部分に対して特異的結
合活性を持つ結合パートナー；化学成分の電気活性部分の電気化学的特性の変調
を検出するための検出手段；検出手段から出力されたデータを処理するためのデ
ータ処理手段；およびアッセイ結果を表示するためのデータ表示手段。
【請求項１６】固体支持材上に遊離できるように固定化された結合パート
ナーを含み、その結合パートナーが化学成分の電気活性部分に対して特異的結合
活性を有し、かつ、対象分析物の存在下にその固体支持材から放出される請求項
１４または１５のアッセイ装置。
【請求項１７】化学成分の電気活性部分に対して特異的結合活性を有する
結合パートナーが遊離できるように固定化されている固体支持材を含み、その結
合パートナーは対象分析物の存在下にその固体支持材から放出され、電気活性部
分への結合パートナーの結合が電気活性部分の電気化学的特性を検出可能な様式
で直接変調させる請求項１４の装置用の部品。
【請求項１８】試料中の対象分析物の存在を検出する方法であって、電気
活性部分（その電気活性部分に対して特異的結合活性を持つ結合パートナーの、
その電気活性部分への結合により、検出可能な様式で直接変調されうる電気化学
的特性を持つもの）を有する化学成分がその上に固定化されている電気伝導性固
体支持材を用意し；試料中の対象分析物の存在の結果として、その結合パートナ
ーをその化学成分の電気活性部分と接触させるという各段階を含む方法。
【請求項１９】請求項１〜１３のいずれか一項の部品もしくは請求項１４
、１５または１６のいずれか一項のアッセイ装置の使用を含む請求項１８の方法
。
【請求項２０】結合パートナーが結合体として存在し、化学成分の電気活
性部分に対する第一の特異的結合活性と、それとは異なる第二の特異的結合活性
とを含む請求項１８または１９の方法。
【請求項２１】結合パートナーが二重特異性抗体または二重特異性抗原結
合免疫グロブリン部分からなる請求項１８、１９または２０のいずれか一項の方
法。
【請求項２２】図１３に示す構造を持つ電気活性部分を含む化学成分（こ
こで、Ｒ_１とＲ_２は独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｃ_１−Ｃ_１４アルキル、アリール、ア
ルケニルまたはアルコキシ（すべて任意に置換されていてもよい）；ハライド；
アミド；またはアミンであり、さらにその複素芳香環構造は一つまたはそれ以上
の位置がアルキル、アリール、アルケニルまたはアルコキシ基（すべてそれら自
体が任意に置換されていてもよい）、酸基（有機酸または無機酸基）、ハライド
、アミドまたはアミンで置換されていてもよい）。
【請求項２３】Ｒ_１がアルキル、好ましくはエチル、プロピルまたはブチ
ルである請求項２２の化学成分。
【請求項２４】Ｒ_２がＣ_１−Ｃ_１２アルキル、好ましくはＣ_４−Ｃ_８アル
キルである請求項２２または２３の化学成分。
【請求項２５】Ｒ_１またはＲ_２が、末端に位置する反応性置換基チオール
、カルボキシル、アミド、アミン、ハライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド
またはスクシンイミド基もしくはこの成分の他の物体へのカップリングを容易に
する他のタンパク質カップリング剤を含むように置換される請求項２２、２３ま
たは２４の化学成分。
【請求項２６】請求項２２〜２５のいずれか一項の化学成分に対して特異
的結合活性を持つ分子。
【請求項２７】免疫グロブリン分子またはその有効部分を含む請求項２６
の分子。
【請求項２８】少なくとも一つのさらなる特異的結合活性を含み、そのさ
らなる特異的結合活性が対象分析物または対象分析物に向けられた抗体に対する
活性である請求項２６または２７の分子。