JP3847745B2 - 核酸ハイブリッド形成の電気化学的検出 - Google Patents
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Description
本発明の工程はハイブリッド形成DNAを生産するためにオリゴヌクレオチドプローブへDNA試料を接触することを含むので、プローブと接触する前にDNAを増幅するための一定の適用が望ましい。選択された、若しくは目的の核酸配列の増幅は適当な手段により実施されうる。一般には、D. Kwoh及びT. KwohのAm. Biotechnol. Lab. 8巻の14−25頁(1990年)を参照のこと。適当な増幅技術の例は、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応(RNAに対する、逆転写酵素連鎖反応を含む)、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写酵素増幅(D,Kwoh他のProc. Natl. Acad Sci. USA 86巻の1173−1177頁(1989年)を参照)、自己支持配列複製(若しくは”3SR”)(J. Guatelli他のProc. Natl. Acad. Sci. USA 87巻の1874−1878頁(1990年)を参照)、Qβレプリカーゼシステム(P. Lizardi他のBiotechnology 6巻の1197−1202頁(1988年)を参照)、核酸配列ベース増幅(若しくは”NASBA”)(R. LewisのGenetic Engineering News 12(9)巻の1頁(1992年)、修復連鎖反応(若しくは”RCR”)(R. Lewisの上記のものを参照)、及びブーメランDNA増幅(若しくは”BDA”)(R. Lewisの上記のものを参照)を含む。適用生成物中に取り込まれる塩基は天然又は改良された塩基(増幅の前若しくは音に改良された)であり、続く電気化学的検出段階を最適にするために選択される。
上記のように、本発明の製造方法はDNAのハイブリッド形成の検出に有用である。製造方法の第一段階はハイブリッド形成DNAを形成するためにDNA試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドプローブは約4若しくは6の塩基と約80若しくは100の塩基若しくはそれ以上までとの間からなり、より好ましくは約8と約15塩基との間からなる何れかのプローブでありうる。オリゴヌクレオチドプローブは、この分野で良く知られる技術に従い広く多様な塩基配列の何れかを有して調製される。オリゴヌクレオチドプローブの調製に適当な塩基は、アデノシン、シトシン、グアニン、ウラシル、及びチミン等の天然に産するヌクレオチド塩基;並びに8−オキソ−グアニン、6−メルカプトグアニン、4−アセチルシチジン、5−(カルボキシヒドロキシエチル)ウリジン、2’−O−メチルシチジン、5−カルボキシメチルアミノ−メチル−2−チオリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’−O−メチルプスードウリジン、β,D−ガラクトシルケオシン、2’−O−メチルグアノシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、1−メチルアデノシン、1−メチルプスードウリジン、1−メチルグアノシン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアノシン、2−メチルアデノシン、2−メチルグアノシン、3−メチルシチジン、5−メチルシチジン、N6−メチルアデノシン、7−メチルグアノシン、5−メチルアミノメチルウリジン、5−メトキシアミノメチル−2−チオウリジン、β,D−マンノシルケオシン、5−メトキシカルボニルメチルウリジン、5−メトキシウリジン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデノシン,N−((9−β−D−リボフラノシル−2−メチルチオプリン−6−イル)カルバモイル)トレオニン、N−((9−β−D−リボフラノシルプリン−6−イル)N−メチル−カルバモイル)トレオニン、ウリジン−5−オキシアセチック アシッド メチルエステル、ウリジン−5−オキシアセチック アシッド、ウィブトキソシン(wybutoxosine)、プスードウリジン、ケオシン、2−チオシチジン、5−メチル−2−チオウリジン、2−チオウリジン、2−チオウリジン、5−メチルウリジン、N−((9−β−D−リボフラノシルプリン−6−イル)カルバモイル)トレオニン、2’−O−メチル−5−メチルウリジン、2’−O−メチルウリジン、ウィブトシン(wybutosine)、及び3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン等の天然に存在しない又は”合成”のヌクレオチド塩基から選択される。オリゴヌクレチドのバックボーンは、DNA、RNA(RNAはDNAより好ましくないが)、カルボサイクル等の改良糖、及びフルオロ及びメトキシ等の2’置換を含む糖を含んで使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つ、若しくは全てのヌクレオチド間結合ホスフェート残基が、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート及びホスホラミデート等(例えば、一つおきのヌクレオチド間結合ホスフェート残基が記載されたように改良される)の改良されたホスフェートであるオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはP. Nielsen他のScience 254 巻の1497−1500頁(1991年)に記載されたように”ペプチド核酸”である。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも一部が少なくともDNA試料の配列の公知の一部の結合することのできる配列を保持することのみが必要である。それは、異なる塩基配列を有する数多くのオリゴヌクレオチドプローブとDNA試料を結合する幾つかの応用(例えば、二若しくはそれ以上の目的核酸が試料中に有る場合、又は単一の目的核酸が”サンドイッチ”分析中で二若しくはそれ以上のプローブにハイブリッド形成される場合)において望ましい。
DNA(若しくは核酸)試料は当業者に知られた適当な方法でオリゴヌクレオチドプローブと接触される。例えば、DNA試料は溶液中に溶解され、ハイブリッド形成を許す条件の下、DNA試料を含む溶液中にオリゴヌクレオチドプローブを溶解することによりオリゴヌクレオチドプローブと接触される。適当な条件は当業者にとって公知であり(例えば、Falkow他へのアメリカ特許第4,358,535号及び同様の物を記載する他のアメリカ特許例を参照のこと)、高い塩濃度条件を含む。他に、DNA試料は固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブと共に溶液中に溶解され、DNA試料はその上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブを有する固体支持体をDNA試料を含む溶液中に浸すことによりオリゴヌクレオチドプローブと接触される。
ハイブリッド形成段階は酸化段階に進むとき、ハイブリッド形成の後、ハイブリッド形成DNA(若しくは核酸)は酸化還元反応でオリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基の酸化をすることのできる適当な酸化剤と反応される。所定の塩基は、選択された酸化剤との反応で酸化を受けるオリゴヌクレオチドプローブ中の天然に産するか又は合成のヌクレオチド塩基でありうる。所定の塩基は、所定の塩基が対にされないときに比べて対にされるときに独特の酸化速度を示す。所定の塩基は、4種の天然発生の塩基のそれぞれと対にされるとき、独特の酸化速度を示す。一般に、5’−モノヌクレオチド(例えば、5’−デオキシリボヌクレオチド又は5’−リボヌクレオチド)の塩基は触媒反応を使用して検出可能な104M−1s−1以上の速度定数を示す。適当な所定の塩基の例は、限定はされないが、グアニン、アデノシン、8−オキソ−グアニン、及び8−オキソ−アデノシン、8−ブロモ−グアニン、グアノシン、キサントシン、ウィオシン、プスードウリジン、6−メルカプトグアニン、8−メルカプトグアニン、2−チオキサンチン、6−チオキサンチン、6−メルカプトプリン、2−アミノ−6−カルボキシメチル−メルカプトプリン、2−メルカプトプリン、6−メトキシプリン、2−アセチルアミノ−6−ヒドロキシプリン、6−メチルチオ−2−ヒドロキシプリン、2−ジメチルアミノ−6−ヒドロキシプリン、2−ヒドロキシプリン、2−アミノプリン、6−アミノ−2−ジメチルアリル−プリン、2−チオアデニン、8−ヒドロキシアデニン、8−メトキシアデニンを含む。典型的には、所定の塩基は、グアニン、アデノシン、6−メルカプトグアニン、8−オキソ−グアニン、及び8−オキソ−アデニンからなる群より選択され、グアニンは現在好ましい天然に産する所定の塩基であり、6−メルカプトグアニンが現在好ましい合成による所定の塩基である。
k/kss=exp(−βΔr)
に従い評価されえて、ここで、Δrは一本鎖と比較した二重鎖における距離の変化であり、kssは一本鎖DNA試料における所定の塩基の酸化に対する速度定数である。即ち、所定の塩基と酸化剤の間のトンネング距離は各塩基対合に対して及び不対DNAに対して異なる。従って、電子移動速度定数は対となった(若しくは不正対合された)塩基の同一性を示す。電子移動に対する駆動力が再配列エネルギ(λ)より大きくないとすると、反応物の接近と結合された仕事項で補正された、駆動力に対するRTlnkのプロットは、マーカス理論に従い、1/2の傾きを持つ直線を形成する。マーカス理論に基づくと、絶対速度定数は以下の式:
k=νexp[−β(r−r0)]exp[−(ΔG+λ)2/4λRT]
に従い計算されえて、ここで、νは拡散律速における速度定数(1011M−1s−1)であり、rは活性化された錯体中の反応物と生成物の間の距離であり、r0は反応物と生成物の最も近接した距離であり、βは介在する媒体の影響である。上記のように、所定の塩基はハイブリッド形成DNAの内部に取り込まれているので、このことは電子が超えて酸化剤へとトンネリングすべき有限の距離を負わせる。即ち、rはr0と等しくない。水に対するβは約3A−1である。βに対するこの比較的大きな値は、電子移動速度定数における大きな変化がトンネリング距離のとても小さな変化によってもたらされるであろうことを示す。所定の塩基と、所定の塩基と対にされた塩基との間のDNAのコンフォメーションは所定の塩基と対にされた塩基に依存し、所定の塩基と対にされた塩基は電子が所定の塩基と酸化剤の間をトンネリングしなければならないトンネリング距離に影響する。トンネリング距離と所定の塩基と対にされた特定の塩基の間の相関がそのために確立される。
酸化還元反応の生起は当業者に知られた適当な手段に従い検出される。例えば、酸化還元反応の生起は、酸化還元反応の生起を示す電気的信号における変化を観測するための検出電極を使用して検出される。典型的には、酸化剤とハイブリッド形成DNAの間の電子移動に対して敏感な検出電極が反応ハイブリッド形成DNA及び酸化剤を含む溶液と接して設置される。一般に、参照電極及び補助電極もまた検出電極と共にその溶液中と接して設置される(殆どの電流は補助電極を通る)。適当な検出電極は当業者によく知られ、例えばガラス状カーボン電極又はインディウム チン オキサイド電極を含む。同様に、適当な参照電極もまた当業者によく知られ、例えば銀/塩化銀電極を含む。
本発明は、(a)オリゴヌクレオチドプローブは独特の酸化電位を有する所定の合成塩基を含み、ハイブリッド形成DNAを形成するためにDNA試料を該オリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と、(b)オリゴヌクレオチドプローブは所定数の所定の合成塩基を有し、ハイブリッド形成DNAを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の合成塩基を酸化することのできる遷移金属錯体等の酸化剤と反応する段階と、(c)酸化還元反応を検出する段階と、(d)検出された酸化還元反応の反応速度を測定する段階と、(e)所定の合成塩基と対にされた塩基を同定する段階とからなるDNAの配列決定方法も提供する。
本発明はまた、本発明の方法を実施するのに有用な装置を提供する。一のかかる例証としての装置が図3に模式的に示される。一般に、装置は多数のDNA試料容器10からなる。駆動アセンブリ11は多数のDNA試料容器を運ぶ試料取扱手段として配される。液体貯蔵器12、供給ライン13及びバルブ14は各DNA試料容器にオリゴヌクレオチドプローブを配達するためのオリゴヌクレオチドプローブ配達手段として配され、対応する液体貯蔵器15、供給ライン16及びバルブ17は多数のDNA試料容器のそれぞれに遷移金属錯体を配達するための酸化剤配達手段として配される。駆動装置21及びプローブ22を含むプローブアセンブリ20は酸化還元反応を検出するための酸化還元反応検出手段として配される。操作中、DNA試料は試料容器10中に事前堆積される。駆動アセンブリ11はその後、試料容器10を連続的にオリゴヌクレオチドプローブ配達手段及びそれぞれの試薬をその中に配達するための酸化剤配達手段の下方に輸送する。試薬配達後、それぞれの試料容器は駆動手段によりプローブ22の下方の位置まで進められ、プローブ22は酸化還元反応の検出のために駆動装置21により試料容器中に前進される。サイクリックボルタモグラムに実施に必要な付加電極がプローブ22とともに運ばれる。多様な構成要素の操作及びデータの収集は一般用途のコンピュータ上をランするソフトウェアプログラム等の適当なコントローラ30を用いて実施される。
ここではまた、RNAハイブリッド形成検出法、RNA配列決定法及びRNA不正対合検出法が開示される。かかる方法の実施に有用なRNAは、限定は去れないがリボソームRNA、転移RNA若しくは病原RNA(例えば、レトロウイルス、HIV−1他等のRNAウイルスから得られたRNA)を含む。本発明の第一の様相は、従って、(a)ハイブリッド形成RNAを形成するためにRNA試料をオリゴヌクレオチドプローブと接触する段階と;(b)該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも一つの所定の塩基を有し、ハイブリッド形成RNAを、酸化還元反応で該オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と;(c)酸化還元反応を検出する段階と;(d)所定の塩基での検出された酸化還元反応からハイブリッド形成RNAの存在又は不存在を決定する段階とからなるハイブリッド形成RNAを検出する方法である。
既に特に記載された方法において、金属錯体は一本の及び二本鎖のDNA又は核酸から電気化学的電流を得るために使用される。グアニン等の所定の塩基は電気的信号を与え、この信号は二重鎖DNAに対してよりはるかに弱い。かかる方法は高い構造的感応を有効に示し、単一塩基不正対合を識別することができる。かかる方法はそのため、DNAの配列決定に対し特に有用である。しかし、かかる方法の二つの欠点は:(a)プローブの鎖からハイブリッドへ進む上で負の信号があること、及び(b)信号の増幅が無いことである。以下の技術はこれらの問題の解決を提供する。加えて、以下の技術は診断的な分析に対し特に有用であり、核酸の定量的な検出に対し特に有用である。
上記セクションHに記載された方法の一つの不利な点は、オリゴヌクレオチドプローブが好ましくは実質的な数の所定の塩基(例えば、グアニン)を含まないことである。この問題に対する解決は、プローブの鎖の中でグアニンと置換し(即ち、グアニンのように、他の塩基が核酸二重鎖の中で示すよりも高い結合親和性を持つ塩基)、適当な反応条件下で酸化剤により酸化されることのない代用塩基を使用することである。グアニンが所定の塩基である場合のかかる代用塩基の例はイノシン及び7−デアザ−グアニンである。
上記セクションHに記載された方法の別の実施例は所定塩基の付加的なものを提供するためにターミナルトランスフェラーゼを用いて目的核酸を伸長することを含む。図7に示されるように、かかる方法は、(a)オリゴヌクレオチドプローブはターミナルトランスフェラーゼによる伸長のために遮断される終端を有し、ハイブリッド形成核酸を形成するために目的核酸と特異的に結合する該オリゴヌクレオチドプローブに試験試料を接触する段階と;(b)オリゴヌクレオチドプローブを、所定の塩基からなる目的核酸の伸長生成物を生成するためにターミナルトランスフェラーゼの存在下で所定の塩基を含む溶液に接触する段階と;(c)オリゴヌクレオチドプローブを、酸化還元反応で所定の塩基を酸化する遷移金属錯体に接触する段階と;(d)酸化還元反応の存在若しくは不存在を検出する段階と;(e)所定の塩基での検出された酸化還元反応から試験試料中の目的核酸の存在若しくは不存在を決める段階とからなる。試験試料は好ましくは検出段階の前でオリゴヌクレオチドプローブから分離され、より好ましくは上記段階(a)と(b)の間でプローブから分離される。分離は固定されたプローブの使用により実施され、又はそのプローブは上記セクションHで記載されたように溶液中に自由に備えられる。
上記セクションHの方法の別の実施例は、図8に模式的に示される所謂”サンドイッチ”分析である。サンドイッチ分析において、目的核酸は捕獲プローブ、目的核酸、及び信号プローブからなる3つの(又はそれ以上の)部分のハイブリッドの一部である。
オリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基の存在はグアニンの酸化から生成される背景信号の存在下であっても検出される。不正対合の検出は、4つの自然の塩基(A,T/U,C及びG)の存在下でオリゴヌクレオチドプローブ中の所定の塩基を検出する能力に依存するからである。そのため、所定の塩基は他の4つの塩基より素早く酸化されうるものでなければならない。
のプリン置換基である。オリゴヌクレオチドプローブは意図されたその結合の相手に従い、望みのように前記式の多数の塩基(例えば、1、2若しくは3から5,10,若しくは15まで又はそれ以上)を含みうる。かかるオリゴヌクレオチドプローブの特定例、及びその調製に有用なヌクレオチドは、式II:
ここで:
R1はHO−P(O)(OH)−O−,ヌクレオチド、若しくはオリゴヌクレオチドであり;
R2は−H,ヌクレオチド、若しくはオリゴヌクレオチドであり;
R3は−H,−OH,ハロ(例えば、フロロ、クロロ)、アルコキシ(例えば、メトキシ又はエトキシ等のC1−C4アルコキシ)、アミノ、若しくはアジド;
R4は−O−又は−CH2−、である
の化合物である。
上記の方法に従う核酸中の所定の塩基の電気化学的検出に有用な電極は、(a)その上に作用表面を有する導電性基板と;(b)作用表面に接続された高分子層とからなる。高分子層は核酸に結合するものであり(例えば、疎水性相互作用又は何れか他の適当な結合技術)遷移金属錯体に対し浸透性である(即ち、遷移金属錯体は高分子と結合された核酸へ移動できる)。導電性の基板は金属基板又は半導体基板を含む非金属基板である(例えば、金、ガラス状カーボン、インジウムのドープされた酸化スズ、他)。導電性基板は、その端に形成された作用表面を有する伸長プローブ、又はその一の側面に形成された作用表面を有するフラットシート等のいずれかの物理形態をとる。高分子層は、作用表面への高分子層のクランプ、電極上への高分子溶液の蒸着、又は電解高分子化による等、何れかの適当な手段により作用電極に接続される。例となる高分子は、限定はされないが、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、及びポリ(ビニルピリジン)を含む。高分子層の厚みは重要ではないが、100オングストローム(A)から1,10、若しくは100μmでも可能である。その電極はセクションA−Mに記載された全ての方法で実質的に使用されうる。その結果、一般に、本発明は核酸を検出する方法を提供し、該核酸は少なくとも一の所定の塩基を含み、その方法は、(a)電極はその上に形成された作用表面と該作用表面に接続された上記の高分子層を有する導電性基板からなり、該核酸を含む試料を該電極に接触する段階と;(b)該核酸を、酸化還元反応で所定の塩基を酸化することのできる遷移金属錯体と反応する段階と;(c)該電極を通る電流の流れを測定することにより酸化還元反応を検出する段階と;(d)所定の塩基での検出された酸化還元反応から該核酸の存在又は不存在を決定する段階とからなる。
上記技術の利点はそれらが超小型電子装置を用いて実施されることである。上記の方法における核酸種の電気化学的検出に有用な超小型電子装置は、第一及び第二の反対の面を有する超小型電子基板と;該第一の面上の導電性電極と;該導電性電極に隣接して該第一の面上に固定されたオリゴヌクレオチド捕獲プローブとからなる。捕獲プローブは、プローブで、又はそのプローブにハイブリッド形成された目的核酸で生じる酸化還元反応が隣接電極で検出されるように、隣接電極に十分近く配置される。
一回のボルタンメトリースイープの間に観測される金属錯体の酸化された形によるDNAの酸化の多数回のターンオーバーにより生成された接触強化を用いた、ウシサイモスDNAを伴う及び伴わないRu(bpy)3 2+のサイクリックボルタモグラムが図1に示される。図1では、均一な線は700mMのNaCl/50mMのリン酸ナトリウム緩衝液中、25mV/sでの50μMのRu(bpy)3 2+のスキャンを表し、点線は50μMのRu(bpy)3 2+と3.0mMの(ヌクレオチド)ウシサイモスDNAのボルタモグラムを表す。DNAの拡散係数(即ち、2.0×10−7cm2/s)は金属錯体のそれ(8.0×10−6cm2/s)に比べすっと小さいため、DNA結合レドックス対のボルタンメトリーは結合された及び結合されない形態に関する方形図によって分析されるべきである。この現象は一般に結合形態に対して劇的に減少した電流をもたらすが;しかし、十分に高いイオン強度(〔Na+=0.8M〕)では、金属錯体の結合は電流応答に影響するためには弱すぎる。この場合、電流は単純なEC’の機構によって分析される。
Ru(bpy)3 3++DNA→Ru(bpy)3 2++DNAox(C’)
サイクリクボルタモグラムは、DIGSIMTMデータ分析パッケージを使用し、背景を差引されたものと、完全な電流−電位曲線をフィットすることにより分析された。入力パラメータは、全て分離実験において決められた金属錯体に対するE1/2及び金属錯体に対する拡散係数であった。そのため、フィッティングから得られた唯一のパラメータは式2に対する二次の速度定数k=9.0×103M−1s−1であった。この同じ速度定数は広い範囲の掃引速度で決められた。
電子移動に対する駆動力が再配列エネルギ(λ)よりも有意に小さいとすると、駆動力に対するRT ln k のプロットは(反応物の接近と結合された仕事項に対し補正された場合) 、1/2の傾きをもつ直線を形成する。異なるレドックス電位を持つ多数のMetal(bpy)3 3+誘導体によるDNAの酸化に対する速度定数は、以下の表1に示される。
k=νexp[−β(r−ro)]exp[−(ΔG+λ)2/4λRT]
によって分析されえて、ここで、νは拡散律速における速度定数(1011M−1s−1)であり、rは活性化された錯体中の反応物と生成物の間の距離であり、r0は反応物と生成物の最も近接した距離であり、βは介在する媒体の影響を示す。二重らせんの内部へのグアニンドナーの取込みは、電子が超えて結合金属錯体へトンネリングすべき有限の距離、即ちr≠r0、を負わせる。しかし、グアニン5’−モノホスフェート(GMP)が電子受容体として用いられるとすると、金属錯体を伴うグアニンの直接拡散が可能である(r=r0)。Fe(bpy)3 3+及びGMPに対し、ストップドフローにより測定された速度定数は2.6×103M−1s−1である。関連の反応に対して知られたλの値は1−1.5eVの範囲内にあり、1.1±0.1Vのグアニン+/0連結に対するΔGを与える。
表1.Ru(bpy)3 2+によるDNAオリゴマー中のグアニンの酸化に対する速度定数
b 溶媒を通るトンネリングの確立された距離。β(H2O)=3Å1及びkSS=1.8×105M−1S−1で、k/kSS=exp[−βΔr]に従い計算された距離。
c 速度定数はグアニン濃度に相関するので、GG不正対合に対して観測された速度は一つのグアニンを含む他のオリゴマーに関して規格化された。
k/kss=exp(−βΔr)
に従い計算されえて、ここで、Δrは一本鎖と比較した二重鎖における距離の変化である。この分析から、完全にハイブリッド化された二重鎖に対するΔrは1.7Åである。
サイクリックボルタモグラムはインジウム チン オキサイド (ITO)作用電極(面積=0.32cm2),Pt−ワイヤ対極、及びAg/AgCl参照電極を使用して取得された。図5で、0.70MのNaClを含む50mMのNa−ホスフェート緩衝液(pH7)中に溶解された25μMのRu(bpy)3 2+及び75μMのオリゴヌクレオチドを含む試料が25mV/sでスキャンされた。図5において、(A)はオリゴヌクレオチド未添加であり、(B)は75μMのd〔5’−TTTTATACTATATTT〕を伴い、(C)はBとd〔5’−GGGAAATATAGTATAAAAGGG〕とからの75μMのオリゴマーのハイブリッドを伴う。作用電極はスズでドープされた酸化インジウムであり、参照電極はAg/AgClであり、対極はPtワイヤである。Cからのハイブリッドの二次構造は図中に示される。図6で、700mMのNaCl及び50mMのNa−ホスフェート緩衝剤(pH=6.8、〔Na+=780mM〕)を含む緩衝水溶液中に溶解された50μMのRu(bpy)3 2+及び0.3mMの5’−GMP若しくは5’−IMPの何れかを含む試料が2.5mV/sで0.0Vから1.4Vまでスキャンされた。Ru(bpy)3 2+の不存在下でのモノヌクレオチドのスキャンは明確な酸化電流を示さなかった。新たにきれいにされたITO電極が各実験のために使用され、緩衝液のみの背景スキャンが引き続きのスキャンから差し引かれた。二次のグアニン酸化速度定数がDIGSIMTMソフトパッケージを使用して二段階機構にサイクリックボルタンメトリーのデータをフィッティングすることにより決められた。酸化速度以外の全てのパラメータは同じ電極での金属錯体単独のボルタモグラムから決められた。5’−GMPはSigmaから購入され、5’−IMPはU.S.Biochemicalから購入され、両方とも更なる精製無しに使用された。オリゴヌクレオチドはUNC Department of Pathology において調製され、モノヌクレオチドを除去するために3000−分子量のカットオフフィルターを通された。純粋さは逆相HPLCにより評価された。濃度は、Fasman,G.D. のCRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology; Vol.1, 1975年、CRC Press, ボカラトン、フロリダ州に記載されるように、260nmでの光吸収から決められた。図5のハイブリッドは90°C5分間の相補鎖の加熱及び2時間にわたる250°Cまでのゆっくりした冷却により調製された。
この例は、レドックス不活性なプローブ鎖を提供するためにグアニンの代用である改良塩基として7−デアザ−グアニンが使用される以外は、上記例4と実質的に同じ方法で実施される。
ナイロンフィルムは、電気化学セル中に適合し、溶液に晒されるITO電極の一部を覆うように直径およそ6mmの円形形状に切断された。
実験は、ベーカースイースト(Bakers Yeast)(Sigmaから入手)からのtRNAがウシサイモスDNAの代わりに使用される以外は、例6に記載されたように実施される。ナイロンフィルムのディスクは例6に記載されたようにtRNAの溶液に浸漬された。
RNAの定量検出のために、DNA(若しくはRNA,PNA,若しくは他の代わりのバックボーン)プローブが固体支持体上に固定される。プローブはプローブ鎖中のグアニンの代わりのイノシン又は7−デアザ−グアニンの置換によりレドックス不活性となるように改良される。固定されたプローブはその後、目的RNA(例えば、HIV又はヘパタイチスCからのもの)の溶液と接触される。固体表面はその後、RNAの鎖とハブリッド形成されたレドックス不活性な、固定されたプローブを含む。固体表面はそれからRu(bpy)3 2+の溶液と接触され、媒介物質のサイクリックボルタモグラムが測定される。接触電流はハイブリッド形成結果を示し、電流の大きさは鎖中の知られたグアニンの数を基に結合されたRNAの鎖を定量するために用いられる。
方法は例3記載のように実施される。図14中に4つ置かれたサイクリックボルタモグラムは、5’−Gによる電流が5’−GGGに対するものよりはるかに小さい5’−GGに対するものに比べ、はるかに小さいことを示す。この電流におけるとても大きな増加はGG及びGGG配列を含む一本鎖と二重鎖の両方に対して観測される。図15に示されるように、同じ鎖に対するGの追加による電流の増加は、Gが点々と配置されるとするとずっと小さいため、電流の増加は単純にGの数の増加によるものではない。GGGの5’−Gは単一のGよりはるかに容易に酸化されるので、GではなくGGGを酸化することのできる(より低いレドックス電位を持つ)媒介物質を選択することが可能である。
6−メルカプトグアノシン5’−モノホスフェート(6−S−GMP)の二ナトリウム塩
が購入により入手可能な6−メルカプトグアノシン(Sigmaから)のリン酸化により調製される。リン酸化は、M. Yoshikawa他のBull. Chem. Soc. Jpn 42巻の3505頁(1969年)の製法に従いPOCl3を使用して行なわれる。6−S−GMPの二ナトリウム塩はボルタンメトリー分析の前にHPLCにより精製される。サイクリックボルタモグラムは、イノシン−5’−モノホスフェートの例のように高いイオン強度で実施される。作用電極は6−S−GMPの直接酸化を防ぐために表面に取り付けられたハイボンドN+ナイロン膜を有するITOである。対極はPtワイヤである。参照電極はAg/AgClである。掃引速度は25mV/sである。
ナイロン膜(ハイボンドN+,アマシャム、480−600μg/cm2)が、直径およそ6mmの円形状に切断される。そのナイロンディスクは水中のポリシチジリック アシッド(Sigmaから入手可能)の濃縮溶液中に置かれ、1時間の間浸漬される。ディスクはその後ポリシチジリック アシッド(poly〔C〕)溶液から移動され、パラフィルム上に置かれて乾燥される。ディスクは乾燥するに従い、追加の15μlのpoly〔C〕溶液がそのフィルムに3つの5μlアリコットにより添加される。ディスクは完全に乾燥される。乾燥されたナイロンディスクはその後、浸漬工程の間に強く結合されないpoly〔C〕を除去するために低濃度の塩の緩衝液(50mMのNa−ホスフェート、pH=6.8,〔Na+〕=80mM)中、洗浄される。
図20はナイロンフィルム上のDNAの固定の前(A)及び後(B)に取り付けられた該ナイロンフィルムを持つガラス状カーボン電極のサイクリックボルタモグラム(又は”CV”)を示す。
Claims (27)
- 超小型電子基板と、
該基板上の導電性酸化還元検出電極と、
該検出電極と隣接し、非導電性層にて固定化された特異結合対の第一の要素であって、サンプル中に存在する特異結合対の第二の要素と反応可能である前記第一の要素とからなり、
前記検出電極に電位を印加すると生じる酸化還元反応が検出可能である、結合対の要素の電気化学的検出に有用である超小型電子装置。 - 前記超小型電子基板はサンプル容器を有し、該容器は該導電性酸化還元検出電極と該固定化された第一の要素とを有する、請求項1に記載の超小型電子装置。
- 前記超小型電子基板は、複数の導電性酸化還元検出電極と、複数の固定化第一の要素とを有する前記容器を具有する、請求項2に記載の超小型電子装置。
- 導電性金属を有する導電性基準電極をさらに有する、請求項3に記載の超小型電子装置。
- 導電性金属を有する導電性補助電極をさらに有する、請求項3又は4に記載の超小型電子装置。
- 前記酸化還元反応は各導電性酸化還元検出電極からの電気的接続を介して検出可能である、請求項5に記載の超小型電子装置。
- 特異結合対の複数の第一の要素内の何れかの要素は、複数の第一の要素内の何れかの他の要素と同じ、又は異なる、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 特異結合対の複数の第一の要素内の各要素は複数の第一の要素内の他の要素とは異なる、請求項7に記載の超小型電子基板。
- 該第一の要素は核酸及びタンパク質からなる群から選択された、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 特異結合対の該第一の要素はオリゴヌクレオチド捕捉プローブを含み、該オリゴヌクレオチド捕捉プローブは長さで4乃至100のヌクレオチドである、請求項9に記載の超小型電子装置。
- 酸化還元反応検出器をさらに有する、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 該基板はシリコンである、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 該基板はガラスである、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 該超小型電子装置は一つ以上のサンプル容器を具備する、請求項6に記載の超小型電子装置。
- 何れかのサンプル容器内の特異結合対の複数の第一の要素は、他の何れかのサンプル容器内の複数の第一の要素と同じ、又は異なる、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 各サンプル容器内の特異結合対の複数の第一の要素は他のサンプル容器内の複数の第一の要素と同じである、請求項15に記載の超小型電子装置。
- 特定のサンプル容器内の複数の第一の要素のうちの何れかの要素は該特定のサンプル容器中の他の何れかの要素と同じ、又は異なる、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 特定のサンプル容器内の複数の第一の要素のうちの各要素は、該特定のサンプル容器内の他の何れかの要素とは異なる、請求項17に記載の超小型電子装置。
- 各サンプル容器は超小型基板と、導電性酸化還元検出電極と、特異結合対の固定化第一の要素とを有する、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 該第一の要素は核酸及びタンパク質からなる群から選択された、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 特異結合対の該第一の要素はオリゴヌクレオチド捕捉プローブを有し、該オリゴヌクレオチド捕捉プローブは長さで4ないし100のヌクレオチドである、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 酸化還元反応検出器をさらに有する、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 該基板はシリコンである、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 該基板はガラスである、請求項14に記載の超小型電子装置。
- 各導電性酸化還元検出電極はポテンシオスタットと電気的に接続されており、サンプル容器はサンプルと、電解質溶液とを有し、各検出電極は溶液と電気化学的に接触しており、電位が電極に印加された条件にて、電極と酸化還元電極に関与可能である電気化学的媒体物を含む、請求項16に記載の超小型電子装置。
- 該酸化還元反応を検出する酸化還元反応検出器をさらに有し、サンプルが特異結合対の第二の要素を含む際には、サンプルは特異結合対の第二の要素を含まないときよりも、電流が一層検出可能である、請求項25に記載の超小型電子装置。
- 超小型電子装置は複数のサンプル容器と、各該サンプル容器は電解質溶液を含み、その溶液は電気化学的に接触した該導電性酸化還元検出電極を有し、溶液は電気化学的媒介物を有する、請求項25に記載の超小型電子装置。
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