CN102899418B

CN102899418B - 一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法

Info

Publication number: CN102899418B
Application number: CN201210445958.2A
Authority: CN
Inventors: 樊春海; 闻艳丽; 林美华
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-11-09
Also published as: CN102899418A

Abstract

本发明提供一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，包括：通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；将DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交；加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。该方法可以检测低至10aM的miRNA，从而解决了现有技术中的检测方法需要大量的测试样品的难点。另外，该检测方法的特异选择性强，能够很好区分同族的miRNA的碱基错配。而且与利用单链DNA探针相比，本发明的方法稳定性更高。

Description

一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法

技术领域

本发明属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法。

背景技术

微小RNA（miRNAs）是一类新发现的长度为19-23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢等过程。自从1993年Lee等最早在Caenorhabditis elegan中发现参与调控线虫时序发育的lin-4后，人们对研究这些小分子在动植物基本生命过程中的重要作用产生了极大兴趣。大量的研究表明异常的miRNAs表达水平与人类多种类型的癌症直接相关（Nature Reviews Cancer,2006,6,259-269），并且还发现血清和唾液中的miRNAs可以稳定存在而不被降解（Proc.Natl.Acad.Sci,2008,105,10513-10518），这些性质突显了miRNAs作为癌症早期诊断和无创诊断的标志物的价值和意义。

无论是基础生物学研究还是癌症的早期诊断和筛选都迫切需要定量检测miRNAs的方法，然而由于miRNAs在体内的含量极少，序列短，相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等难点使得miRNAs的检测一直面临很多的技术挑战。Northern blotting一直被公认为是miRNAs检测的标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大（10μg样品）等缺点使得它不适用于常规的临床诊断上。定量PCR（qPCR）和微芯片技术也是人们常用的miRNAs检测方法，但这些方法常常需要昂贵的仪器，复杂的操作，对miRNAs进行标记等，无法满足miRNAs床边检测（point-of-care tests,POCTs）的全部要求，例如不需要标记，不需要放大，在检测非常少的血清样品中miRNAs具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好的区分miRNAs家族中1~2碱基的错配，廉价且便携适用于小型临床或者家庭诊断等。

电化学传感器被认为是最有希望实现POCT的器件，目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在（如基于电化学原理的家用血糖仪）（Nat.Protoc.,2007.2，2888-2895；Nature Chemistry,2011.3，697-703）。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制。目前的电化学传感器检测miRNAs的灵敏度大多在pM-fM范围，无法在不进行PCR前处理情况下直接检测十分微量的miRNAs。

纳米结构表面的界面加工可以从热力学和动力学上大大改善分子间的识别能力，这一观点已经从理论和实验上都得到了证明（NatureNanotechnology,2009.4,844-848；Nature Biotechnology,2008.26,417-426）。随着DNA纳米技术的快速发展，人们已经可以高度可控地自下而上地组装精巧的DNA纳米结构。DNA纳米结构的界面工程在不需要借助工艺水平上的微加工技术就可以很方便的控制从溶液到空间立体结构的转变，并且能够增加表面探针与目标分子的接触机会。我们之前的研究也已经证明三维DNA纳米结构探针的三个顶点修饰巯基可以快速而又牢固地吸附到电极表面，形成有序、均相的DNA纳米结构自组装单分子层（SAM）用于生物传感研究（Adv.Mater.,2010，22，4754-4758）。

在此基础上，利用DNA三维纳米结构来进行DNA检测的方法也陆续出现，但是由于DNA和miRNA的结构和性质存在着巨大的差异，因此用于检测DNA的方法能否用于检测miRNA完全是无法预测的。例如专利申请（CN201010119941.9）公开了一种利用DNA三维纳米结构探针用于检测目标DNA的方法，其中，目标DNA、DNA三维纳米结构探针、DNA信号探针共同形成夹心结构，然后利用电化学检测进行定量分析。同样，由于miRNA序列非常短（22nt左右），与DNA探针进行杂交时的溶解温度（Tm）很低，因此不适用于形成夹心结构进行电化学检测。如果将待测的miRNA分成两段与DNA探针进行杂交，所涉及的Tm值会更低，常温下不稳定。因此，与形成夹心结构的检测方法相比，人们通常会选择与之截然不同的方法来对miRNA进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用DNA三维纳米结构探针的超灵敏的电化学miRNA的方法，解决了现有技术中的检测方法需要大量的目标miRNAs等缺点。

本发明提供一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，包括：（1）通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；（2）将所述的DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；（3）将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交；（4）加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。

通过上述简单的步骤，本发明提供了一种高灵敏度的检测miRNA的方法，该方法操作简单、不需要对目标miRNA进行标记和PCR扩增，具有成本低廉等优势。

在所述步骤（1）中，所述的DNA三维纳米结构探针是由四条单链DNA自组装形成的四面体探针，所述的四条单链DNA中的三条单链DNA的5'端修饰有巯基，另一条单链DNA在一端延伸出所述识别序列。通过调整三条修饰有巯基的单链DNA的碱基数目，本发明所提供的方法可以根据实际需要调整该DNA三维纳米结构探针从工作电极表面突伸出的高度。通过调整识别序列，本发明所提供的方法可以根据目标miRNA的碱基进行适应性调整，从而满足各种不同的检测要求。

在所述步骤（2）中，还包括将另一DNA三维纳米结构探针组装到所述电化学装置的工作电极表面，所述另一DNA三维纳米结构探针不具有所述识别序列。通过同时将具有识别序列的DNA三维纳米结构探针和不具有识别序列的DNA三维纳米结构探针同时组装到工作电极表面，可以调节工作电极表面的探针密度。由于该探针密度对于杂交效率的影响是十分关键的，通过该可选的步骤，可以找到最佳的组装密度以适合低浓度miRNA的杂交，从而提高灵敏度。

在所述步骤（2）中，所述的电化学装置的工作电极是金电极，通过巯基和金之间的金硫键将所述DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面。该金硫键可以将探针牢牢地固定于工作电极表面，无需其他辅助分子维持探针在界面上的形态，取向。

DNA信号探针、所述DNA三维纳米结构探针与所述目标miRNA形成夹心结构。虽然通常来说识别序列无法与miRNA形成夹心结构用于电化学检测，但是本发明通过将识别序列负载在DNA三维纳米结构探针上，最终结合DNA信号探针与miRNA形成了夹心结构用于电化学检测，克服了现有技术中在检测miRNA时的偏见，这也就从一个侧面体现出本发明所涉及的DNA三维纳米结构探针的在稳定性上的优势。

在所述步骤（3）中，所述DNA信号探针的序列和所述DNA三维纳米结构探针的所述识别序列彼此相邻地与所述目标miRNA的整个序列互补。即DNA信号探针的序列和DNA三维纳米结构探针的识别序列无间隔地相连，两者之间不具有缺口地与miRNA互补，从而利用DNA与RNA之间的氢键作用以及DNA之间的碱基堆积作用增强了miRNA杂交的稳定性。与在先申请CN201010119941.9中的DNA信号探针与识别序列之间具有缺口相比，这也是本发明的又一突破。

在所述步骤（3）中，所述目标miRNA的浓度为10aM-10nM，优选为10fM-10nM。利用单链DNA探针作为对照的实验表明，具有识别序列的单链DNA（不具有DNA三维纳米结构）的探针在浓度低于10pM时就很难与背景电流区分，在浓度高于10pM而低于10nM的时候信号偏差较大。换句话说，不具有DNA三维纳米结构的探针无法用于检测10pM以下的miRNA，用于检测10pM-10nM的miRNA时误差很大。而本发明的方法通过参数的调节，例如氧化还原酶的替换，却能够检测低至10aM的miRNA，而且检测都相当精确，这一点从各个附图中的平滑曲线可以看出。

在所述步骤（3）中，所述目标miRNA的序列选自：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22。当所述miRNA的序列选自SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:18时，本发明的方法能够很好地区分let-7家族miRNA中的单碱基错配，具有良好的特异性。当所述miRNA的序列选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:22时，本发明的方法能够特异性地识别成熟的miRNA，不受前体miRNA的干扰，具有良好的特异性。

在所述步骤（4）中，所述的氧化还原酶为亲和素修饰的辣根过氧化物酶或多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶。其中，与亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）相比，本发明的方法中使用多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80）能够大大提高检测的灵敏度。

在所述步骤（4）中，所述的底物是TMB和双氧水。步骤简单，检测方法成本低廉。

总之，本发明所提供的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法是一种高灵敏度的检测miRNA的方法，可以检测低至10aM的miRNAs，从而解决了现有技术中需要大量的测试样品（miRNA）的难点。另外，该检测方法特异选择性强，能够很好区分同族的miRNAs的碱基错配。与利用单链DNA探针相比，本发明的方法稳定性更高。附图说明

图1为本发明方法的技术原理图。其中，1表示目标miRNA，2表示DNA信号探针，3表示亲和素修饰的辣根过氧化物酶，4表示多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶，5表示四面体探针，6表示工作电极表面。

图2为实施例1中目标miRNA浓度与电流信号对应关系图。A图为根据本发明的四面体探针检测miR-21的结果，待测miR-21浓度依次分别为10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM。B图为对照的单链DNA探针检测miR-21的结果，待测miR-21浓度依次分别为100fM、1pM、10pM、100pM、1nM。

图3为实施例2中miRNA浓度与电流信号对应关系图。待测miR-21浓度依次分别为10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM。

其中：

aM：10^-18mole／L；

fM：10^-15mole／L；

pM：10^-12mole／L；

nM：10^-9mole／L。

图4为实施例3中电流信号与没有识别序列的四面体探针调控组装密度的关系图，其中空白（blank）是指不含目标miRNAs的电流信号。

图5为实施例4中的四面体探针检测miRNAs的特异性图。A图是对let-7家族所有miRNAs的区分图，所有miRNAs浓度为1pM。B图是对成熟的miR-31与前体miR-31的区分图，浓度都为10pM。

其中，*代表P<0.05，说明两者之间有显著性差异，可以区分目标miRNA与非特异性miRNA。

具体实施方式

下面用实施例进一步说明本发明的工作流程和功效，但本发明并不受其限制。

实施例1

试剂包括：

组装形成具有DNA三维纳米结构的四面体探针的四条单链DNA，Tetra-A（75bp,分子量23071.0,ssDNA)、Tetra-B （55bp，分子量17018.0，5’端修饰巯基ssDNA）、Tetra-C(55bp,分子量16898.0,5’端修饰巯基ssDNA)、Tetra-D(55bp,分子量16877.0,5’端修饰巯基ssDNA)，均购自大连Takara生物有限公司。该四条单链DNA含有三个结构域，每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补（17对碱基互补），每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈，在每个顶点处含有两个碱基（非互补，柔性）起弯折作用，单链DNA 3’端和5’端汇聚在四面体的四个顶点，Tetra-A在5’末端延伸出一段DNA序列作为识别序列，Tetra-B/C／D分别在5’末端修饰巯基，分别在四面体的顶点上衍生出来。

Tetra-A（SEQ ID NO:1）：

5’-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CACGAG AAG AGC CGC CAT AGT A AAAAAAAAAA TCAACATCAG-3’

Tetra-B（SEQ ID NO:2）:

5'-HS-C6-TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGTAAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3’

Tetra-C（SEQ ID NO:3）:

5'-HS-C6-TCA ACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGGGAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3’

Tetra-D（SEQ ID NO:4）:

5'-HS-C6-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGTCGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3’

其中，

Tetra-A链上10bp的识别序列：5’-TCAACATCAG-3’目标miRNA：

hsa-miR-21（SEQ ID NO:5）:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’（ssRNA）

DNA信号探针（SEQ ID NO:6）：5’-TCTGATAAGCTA-Biotin-3’（12bp，分子量4214.4，3’端标记生物素分子的ssDNA）

作为对照的单链DNA 探针（SEQ ID NO:7）：5’-SH-C6-TAAATAAATATCAACATCAG-3’（20bp，分子量6298.0，5’端修饰巯基的ssDNA），该单链DNA探针同样具有识别序列：5’-TCAACATCAG-3’

目标miRNA分别与四面体探针的识别序列及DNA信号探针互补，形成夹心结构。

亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP），购自Roche公司，参考产品说明书使用前用100mM PBS稀释成0.5U／mL avidin-HRP。

3,3’,5,5’-四甲基联苯胺水溶液(TMB)购于Neogen公司，K-blue低活性底物（已配有双氧水）。

焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)购买于Sigma公司。

巯基修饰的OEG(HS-(CH₂)₁₁-EG₂-OH,OEG)购于Prochimia(Poland)。

所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用RNase-free水配制。RNase-free水用0.1%DEPC处理MilliQ水（18MΩ·cm,Millipore）得到。

本发明的检测步骤如下：

1、具有DNA三维纳米结构的四面体探针的自组装

取等量的Tetra-A、B、C、D四条单链DNA，用TM buffer（20mM Tris,50mM MgCl₂,pH8.0）稀释，使其终浓度为1uM，体积50μL。上述溶液95°C反应10min后，立即降温到4°C，持续10min以上。

2、清洗打磨电极并组装

取直径为2mm的金电极，先用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉依次打磨，然后用乙醇和超纯水各超声2min，在0.5M硫酸中测定其循环伏安曲线，最后用超纯水冲洗然后用氮气吹干，备用。

在电极上分别滴加3μL四面体探针组装液，室温下组装过夜。

另外，将一段巯基修饰的单链DNA探针用做对照实验。该单链DNA探针的组装溶液为20mM Tris，50mM MgCl₂，pH 8.0。取3μL 0.2μM的单链探针滴加到金电极表面室温反应3hr，然后用2mM的OEG封闭过夜，防止DNA倒伏在电极表面，使DNA分子单层有序的排列在电极表面。

3、杂交反应

将不同浓度（10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM）的目标miRNA（has-miR-21）与生物素修饰的信号探针DNA（500nM）在含有1M NaCl和20mM MgCl₂的10mM PB缓冲溶液(pH 7.4)中混合。混合均匀之后80°C变性5分钟，室温冷却20分钟后，取100μL混合液加入2mL RNase-free的小管中（Axygen）。最后将修饰了四面体探针或单链DNA探针的电极浸入小管中与目标miNRA和信号探针进行孵育杂交。经过10°C杂交5hr后，取出电极用0.01M PBS缓冲溶液冲洗电极并用N₂吹干，再与3μL的avidin-HRP（0.5U／mL）在4°C冰箱孵育15分钟。制备好的电极最后用0.01M PBS进行彻底冲洗用于电化学测试。

4、电化学检测

取1mL TMB底物到电解池中，将电极浸没到TMB底物中。电化学检测采用传统的三电极体系，以Ag／AgCl(3M KCl)为参比电极，铂丝电极为对电极，金电极为工作电极。使用CH Instruments公司的CHI630B型电化学工作站进行电化学检测，采用循环伏安法(CV)和稳态时间电流曲线法（amperometric i-t）进行电化学表征。循环伏安法起始电压为0V，最高电压为+0.7V，最低电压为0V，扫速为0.1V/s。时间电流曲线法测量的电位为100mV，检测时间为100s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。电化学检测使用辣根过氧化物酶（HRP）的催化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺水溶液（K-Blue低活性底物TMB，已含有双氧水）。

结果如图2A所示，电化学信号随着目标miRNA的浓度变化而发生变化。利用此曲线，我们可以实现对目标miRNA的定量分析，可以检测低至10fM的miRNA。单链DNA探针作为对照,结果如图2B所示，信号值偏差较大，并且当浓度目标miRNA的浓度低于10pM时就很难与背景电流区分开来。

其具体机理如图1所示，连接于工作电极表面6上的四面体探针5与目标miNRA1和信号探针2进行杂交，在与亲和素修饰的辣根过氧化物酶3或多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶4结合以后进行电化学检测，所涉及的反应方程式如下：

实施例2

用多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80）代替亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP），其他试剂和DNA同实例1。poly-HRP80和poly-HRP80稀释液都购于Fitzgerald Industries International公司。poly-HRP80是一种超分子酶复合物包含400（80*5）个HRP分子，而avidin-HRP只含有大约20个HRP分子。

实验步骤同实施例1，将亲和素修饰的辣根过氧化物酶替换成多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80），其余参数不变。

结果如图3所示，使用多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80）可以大大提高检测的灵敏度。从曲线中我们可以看出，根据本发明的利用四面体探针的方法能够检测低至10aM的miRNA。

实施例3

将实例1中自组装的四面体探针中使用的Tetra-A替换成Tetra-NA（55bp，分子量16959.0，ssDNA），其他合成四面体探针的DNA序列与实施例1相同，合成方法也相同，从而组装形成一种没有识别序列的四面体DNA。序列如下：

Tetra-NA（SEQ ID NO:8）：5’-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TACAGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A-3’（不含识别序列）

按照实施例1中的方法合成第一四面体探针和不带识别序列的第二四面体探针。第一、第二四面体探针的浓度都为1μM，按照不同比例进行混合，然后取3μL两种四面体探针混合液共组装到电极表面，室温过夜。如此通过不带识别序列的第二四面体探针对第一四面体探针在电极表面的密度进行调控。

检测的其他步骤同实施例1，将亲和素修饰的辣根过氧化物酶替换成多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80），其余参数不变。结果如图4所示，当我们按不同比例稀释两种四面体探针时，空白（blank）值不随稀释比例的改变也变化，说明根据本发明所形成的共组装表面很稳定，而当加入10aM目标miRNA时，信号值随着稀释比例的增加先增大后减小，说明本发明可以通过第二四面体探针来调控第一四面体探针在电极表面的组装密度，从而找到一个最佳的组装密度，能够适合低浓度的miRNAs杂交，进一步提高灵敏度。应当注意，稀释的表面对较高浓度的miRNAs的杂交效率提高影响不大，稀释后反而信号会降低。

实施例4

将实例1中自组装的四面体探针中使用的Tetra-A替换成Tetra-let-7d（75bp，分子量23095.0，ssDNA），用于对let-7家族所有miRNAs进行检测。序列如下：

Tetra-let-7d（SEQ ID NO:9）：5’-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TACAGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A AAAAAAAAAAAACTATGCAA-3’

其中5’-AACTATGCAA-3’为Tetra-let-7d上的识别序列，与let-7d互补。

信号探针（SEQ ID NO:10）：5’-CCTACTACCTCT-BIOTIN-3’（12bp，分子量4086.4，ssDNA）

目标miRNAs：

hsa-let-7a（SEQ ID NO:11）：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’

hsa-let-7b（SEQ ID NO:12）：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’

hsa-let-7c（SEQ ID NO:13）：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’

hsa-let-7d（SEQ ID NO:14）：5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’

hsa-let-7e（SEQ ID NO:15）：5’-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3’

hsa-let-7f（SEQ ID NO:16）：5’-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3’

hsa-let-7g（SEQ ID NO:17）：5’-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3’

hsa-let-7i（SEQ ID NO:18）：5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’

hsa-mirR-21（SEQ ID NO:5）：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’

将实例1中自组装的四面体探针中使用的Tetra-A替换成Tetra-miR-31（75bp，分子量23107.0，ssDNA），用于对miR-31及其前体miR31的区分。序列如下：

Tetra-miR-31（SEQ ID NO:19）：CATCTTGCCT AAAAAAAAAA ACA TTCCTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGCCAT AGT A

信号探针（SEQ ID NO:20）：5’-BIOTIN-AGCTATGCCAG-3’(11bp,分子量3420.1,ssDNA)

目标miRNAs：

hsa-miR-31（SEQ ID NO:21）：5’-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3’

前体miR31（SEQ ID NO:22）：5’-GGC AAG AUG CUG GCA UAG CUGUUG AAC UGG GAA CCU GCU AUG CCA ACA UAU UGC CAU-3’(57nt,ssRNA)

检测的其他步骤同实施例1，将亲和素修饰的辣根过氧化物酶替换成多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（poly-HRP80），其余参数不变。结果如图5所示，A图显示了对let-7家族所有miRNA检测的结果，证明本发明可以很好的区分同族miNRAs中的单碱基错配，具有良好的特异性。B图显示了对成熟miR-31和前体mi-31的检测结果，证明本发明可以特异性的识别成熟的miRNA，不受前体miRNA的干扰。

Claims

1.一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，该检测方法不用于疾病的诊断，其特征在于，包括：（1）通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；（2）将所述的DNA三维纳米结构探针和另一DNA三维纳米结构探针共组装到电化学装置的工作电极表面，所述另一DNA三维纳米结构探针不具有所述识别序列；（3）将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交，DNA信号探针、所述DNA三维纳米结构探针与所述目标miRNA形成夹心结构，所述DNA信号探针的序列和所述DNA三维纳米结构探针的所述识别序列彼此相邻地与所述目标miRNA的整个序列互补；（4）加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测；其中，在所述步骤（1）中，所述的DNA三维纳米结构探针是由四条单链DNA自组装形成的四面体探针，所述的四条单链DNA中的三条单链DNA的5'端修饰有巯基，另一条单链DNA在一端延伸出所述识别序列；在所述步骤（2）中，所述的电化学装置的工作电极是金电极，通过巯基和金之间的金硫键将所述DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面。

2.如权利要求1所述的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述目标miRNA的浓度为10aM-10nM。

3.如权利要求2所述的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述目标miRNA的浓度为10fM-10nM。

4.如权利要求1所述的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述目标miRNA的序列选自：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22。

5.如权利要求1所述的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，所述的氧化还原酶为亲和素修饰的辣根过氧化物酶或多聚的亲和素修饰的辣根过氧化物酶。

6.如权利要求1所述的基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，所述的底物是TMB和双氧水。