CN101921829B - 一种dna三维纳米结构探针的电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法，该方法依次包括以下步骤：1)通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的探针包括延伸出的一段识别序列；2)将纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；3)将目标DNA和上述工作电极表面的探针进行杂交；4)加入氧化还原反应的酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。
Description
技术领域
本发明属于基因杂交检测领域，具体涉及到一种利用DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法。
背景技术
DNA电化学生物传感器以其快速、灵敏、低成本及易微型化等优点在临床医药、食品检验、环境监测以及反恐等各个领域有着巨大的潜在用途。决定DNA电化学生物传感器性能的一个重要的方面就是分子识别界面。DNA生物分子连接到界面上，由于其杂乱取向、自由能的降低以及与界面强的相互作用，将不可避免的降低其生物活性。为了最大程度提高生物传感器的性能，我们需要寻找到一种尽可能不妨碍生物分子活性连接到表面的方式。
较为理想的探针固定方法是通过末端修饰基团实现DNA在电极表面的共价自组装，因为末端连接可以使DNA骨架在空间构型上有很大的自由度，有利于碱基的暴露和双螺旋结构的形成。对于金电极，主要通过金-硫键实现固定，由于金原子与巯基之间的自组装过程非常快速、稳定，而且反应条件简单。通过末端巯基修饰和自组装把单链线性DNA直接固定在金电极表面已成为一种常用的方法，但这种方法存在一定的缺陷，因为单链DNA是一种柔性的分子，并且探针DNA的碱基与金之间有吸附位点，单链DNA平躺在金表面上，所以常常需要加入一些巯基小分子，如巯基己醇，实现共组装。这样小分子可以取代探针碱基与金之间的相互作用，使探针DNA一定程度的直立在电极表面上，这样可以有效的提高杂交效率。虽然这种方法一定程度上控制探针之间的距离，同时也保证了探针DNA在表面上有一定的自由度，但是在实际上，这种通过混合自组装层来控制探针DNA之间的距离的统计学方法并不能在纳米尺度上严格的控制探针之间的距离，因为具有相似基团的分子更加倾向于结合在一起，这样容易形成聚集效应，不利于DNA的生物活性。
DNA作为一种天然的生物纳米材料，除去其本身的生物学意义，还是一种卓越的纳米构建材料。自Seeman在20世纪90年代提出DNA构建三维 结构的设想以来，被定义为结构DNA的纳米技术已经取得的巨大的进展。不计其数的科学家们利用精巧的设计将DNA自组装成一维、二维甚至三维的千姿百态的纳米结构。这为在纳米尺度下精确控制纳米结构提供了一个非常有前景的途径。其中，Turberfield课题组(Goodman，R.P.et al.Science.310(5754)：1661-1665.)报道了用简单的四条DNA链自组装成一个具有四面体结构的DNA三维纳米结构的方法，并且这种方法非常简单，产率很高(95％以上)。
本发明在DNA纳米技术的基础上，将具有四面体形状的DNA纳米结构衍生化，分别在具有四面体形状的DNA纳米结构的三个顶点上连接上巯基，在剩下的一个顶点处延伸出来一段DNA识别序列，这样这种衍生化的具有四面体形状的DNA纳米结构，可以通过经典的Au-S化学作用将这种具有四面体形状的DNA三维纳米结构固定在金的衬底上，作为一种用于生物传感领域的新颖的DNA探针。该DNA探针主体有两个结构域，一个是四面体结构其中一个顶点延伸出来的一段DNA，它的作用是识别目标DNA分子。另一个是具有四面体形状的三维纳米结构，它的作用是作为该DNA纳米结构探针的底座，通过三个顶点衍生出来的巯基将这种结构的DNA探针固定在金衬底上，作为底座将DNA识别序列支撑起来，由于其底座的特殊结构(大小，构型)，可以使DNA识别序列高取向朝外的排列在固体表面，使得DNA识别序列有高的自由度，从而能更好的识别目标DNA。本发明将DNA纳米技术和DNA电化学生物传感技术相结合，发明了一种全新的DNA探针，它与传统的单链DNA探针相比，实现了表面DNA探针自组装的完全的均一，无需额外的小分子支撑，提高了表面识别DNA的自由度，从而提高了电化学生物传感器的性能。
发明内容
本发明要解决的技术问题包括：结合结构DNA纳米技术和电化学检测迅速、灵敏、操作简便的特点，构建一种新型DNA探针自组装界面，提供一种基于DNA三维纳米结构的探针对目标DNA序列进行检测，特别是在区分单核苷酸多态性(SNP)中的应用。本发明由于其底座的特殊结构(大小，构型)，可以使DNA识别序列高取向朝外的排列在固体表面，使得DNA识别序列有高的自由度，实现了表面DNA探针自组装的完全的均一，无需额外的小分子支撑，提高了表面识别DNA的自由度。目前传统的DNA探针是通过混合 自组装形成分子识别层，这种通过混合自组装形成的分子识别层通常是通过统计学的方法来控制DNA探针在表面上的分布，由于含有相似功能化基团的分子倾向于聚集在一起而导致聚集效应，在一些情况下会严重影响DNA识别能力。实现高活性，高特异性的电化学的DNA检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法，所述结构探针典型的示例为四面体DNA纳米结构探针：将四条单链DNA自组装形成具有四面体底座的DNA探针，将其通过金-硫键固定在电极表面，形成具有高活性、高特异性的DNA分子识别界面。
其原理为：用三条5′端修饰了巯基的单链DNA和一条在一端延伸出来一段识别序列的单链DNA自组装形成一个具有四面体底座的DNA探针。四面体的其中三个顶点含有巯基基团，用于固定在电极表面，在剩下的一个顶点上延伸一段DNA识别序列。所述的目标DNA与所述的识别序列互补，通过信号探针末端的基团或带有标记分子的目标DNA(此时不需要信号探针)与带修饰的氧化还原酶结合产生电化学信号进行电化学检测。
优选地，所述目标DNA序列与所述的识别序列以及DNA信号探针完全互补形成夹心结构，通过信号探针末端的基团与带修饰的氧化还原酶结合产生电化学信号进行电化学检测。
为实现上述目的，本发明的具体技术方案为：一种DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法，包括以下步骤：
1)通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的探针包括延伸出的一段识别序列；
2)将DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；
3)将目标DNA与所述工作电极表面的所述探针杂交；
4)加入氧化还原酶和相应的底物，进行电化学检测。
优选的，本发明步骤1)所述的DNA三维纳米结构探针是四面体DNA纳米结构探针。所述探针可以保证顶端的识别DNA序列不易和电极表面相互作用，另外作为底座的四面体纳米结构，由于其自身的结构特点，可以控制顶端上延伸出来的识别序列ssDNA与周围的ssDNA的空间距离，充分降低了邻近的DNA之间的相互作用，如图1所示。
优选的，本发明步骤1)使用的缓冲溶液为20mM Tris，50mM MgCl2， pH8.0。
优选的，本发明步骤1)自组装形成DNA纳米结构探针形成条件为95℃5min，而后立即将其放置冰水中。
优选的，本发明步骤1)构建的DNA四面体边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。优选的，本发明步骤1)中所述的DNA四面体边长是由17对碱基互补配对形成，长度大概在5.8nm。
优选的，本发明步骤2)所述的四面体DNA纳米结构探针与电化学装置的工作电极表面的组装是使用巯基和金之间的金硫键，四面体DNA纳米探针结构中的三个顶点上各连接了一个巯基，可以直接与裸金的工作电极进行自组装，该组装的步骤是将形成的四面体DNA纳米探针滴在裸金的工作电极上。自组装形成的四面体DNA纳米结构探针表面可以很好的抵制蛋白质在表面上的吸附。
优选的，本发明步骤2)中使用的四面体DNA纳米结构探针的浓度为0.01μM-10μM，更优选的是1μM。
优选的，本发明步骤3)中的杂交是目标DNA与四面体DNA纳米结构探针上的识别序列互补杂交，目标DNA上连接有生物素分子。
优选的，本发明步骤3)中的杂交是目标DNA与四面体DNA纳米结构探针上的识别序列及DNA信号探针形成夹心的杂交结构。DNA信号探针上连接有生物素分子，通过生物素和亲和素的作用连接上酶分子，这样通过DNA碱基互补产生信号。
优选的，本发明步骤4)中所述的氧化还原酶可以包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等氧化还原酶，但不限于此。优选的，本发明步骤4)中所述的能催化氧化还原的酶是辣根过氧化物酶，其修饰有亲和素分子；所述的目标DNA分子末端修饰有生物素分子，通过生物素分子和亲和素分子的结合连接辣根过氧化物酶和四面体DNA纳米探针。本发明步骤4)中所述的相应的底物是四甲基联苯胺(TMB)和双氧水。
综上所述，本发明检测方法，原理如下：
首先将四条单链DNA通过自组装的方法形成四面体DNA纳米探针。
然后将四面体DNA纳米探针固定在裸金的工作电极上，加入检测样品(目标DNA)之后，杂交条件下，只有目标DNA才能和四面体DNA纳米探针互补配对结合，加入过氧化物酶，四面体DNA纳米探针就可以通过修饰目 标DNA或DNA信号探针上的标记分子，特异性地和辣根过氧化物酶结合。
最后，滴加TMB和双氧水底物，辣根过氧化物酶可以催化TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号，使用现有的电化学检测或分析仪进行电化学检测或分析。
本发明将结构DNA纳米技术和电化学生物传感器相结合，实现了对目标DNA的定量检测。
相对于现有的技术，本发明具有如下优点：
1.自支撑DNA探针，无需其他辅助分子维持DNA探针在界面上的形态，取向。
2.抗蛋白质吸附表面，抵制非特异性吸附，提高了生物传感器的性能。
3.纳米尺度上精确的控制探针与探针之间的距离，充分保证了探针的识别活性，避免了探针之间的相互作用。
4.高选择性，单碱基错配分辨可以达到1％以下。
附图说明
图1是四面体DNA纳米探针形成的原理图，其中，四面体的三个顶点BCD通过Tetra B/C/D三条单链DNA5’端修饰巯基分别衍生出三个巯基，在四面体剩下的一个顶点A处延伸出一段DNA序列，作为识别序列。
图2是根据本发明的方法的技术原理图。
图3是根据本发明的实施例1中的目标DNA浓度与电化学电流信号对应关系图。图中的待测DNA依次分别为10％的人血清稀释的人工合成的浓度为1pM、10pM、100pM、1nM、5nM目标DNA。
图4是根据本发明的实施例3中目标DNA浓度为1nM时的四面体探针修饰的电极检测对应的电流图，其中空白是不含目标DNA的电流信号。
图5是根据本发明的实施例4中目标DNA浓度为1nM时的四面体探针修饰的电极检测对应的电流图，其中空白是不含目标DNA的电流信号。
图6是单链DNA探针修饰和根据本发明的实施例5中的四面体DNA纳米结构探针修饰的电极区分SNP时分别对应的电化学电流信号图。图中待测DNA为10nM的T1、T2、T3、T4。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明的工作流程和功效，但本发明并不受其限制。
实施例1：
试剂包括：
4条用于组装形成四面体DNA纳米结构探针的单链DNA，Tetra-A(80bp，分子量24539.0，ssDNA)、Tetra-B(55bp，分子量17018.0，5’端修饰巯基ssDNA)、Tetra-C(55bp，分子量16898.0，5’端修饰巯基ssDNA)、Tetra-D(55bp，分子量16877.0，5’端修饰巯基ssDNA)，均购自大连Takara生物有限公司。
构成四面体结构探针的四条DNA含有三个结构域，每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补(17对碱基互补)，每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈，在每个顶点处含有两个碱基(非互补，柔性)起弯折作用，单链DNA 3’端和5’端汇聚在四面体的四个顶点，TetraA在5’末端延伸出一段DNA序列作为识别序列，TetraB/C/D分别在5’末端修饰巯基，分别在四面体的顶点上衍生出来，具体如图1所示。
Tetra-A：
5’-GTATC CAGTG GCTCATTTTTTTTTT ACA TTC CTA AGT CTG
AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT
A-3’
Tetra-B：
5′-HS-C6-TATCAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT
AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3
Tetra-C：
5′-HS-C6-TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG
GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3′
Tetra-D：
5′-HS-C6-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT
CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3
其中，
Tetra-A链上15bp的识别序列：
5’-GTATC CAGTG GCTCA-3’
目标DNA：
5’-TGA GCC ACT GGA TAC TTTTT CAA GAG CAT TAC TAG CATGC-3’(40bp，分子量12263，ssDNA)：
DNA信号探针(20bp，分子量6119，5’端标记生物素分子的ssDNA)
5’-Biotin-GCATGCTAGTAATGCTCTTG-3’
亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)，购自Roche公司，参考产品说明书使用前用100mM PBS稀释成0.5U/mL avidin-HRP.
TMB底物(TMB substrate)，购自NEOGEN公司，其中含有TMB和双氧水。
目标DNA分别和四面体DNA纳米探针识别序列及DNA信号探针互补，可以形成夹心结构。
本发明的检测步骤如下：
第一步，自组装四面体DNA纳米探针。
取等量的Tetra-A、B、C、D四条单链DNA，用TM buffer(20mM Tris，50mMMgCl2，pH8.0)稀释，使其终浓度为1uM，体积50μL。95℃5min后，立即转移到冰水中孵育5min。
第二步：清洗打磨电极并组装。
取直径为2mm的金电极，先用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉依次打磨，然后用乙醇和水各超声2min，在0.5M硫酸中测定其伏安曲线，最后用超纯水冲洗然后用氮气吹干，备用。
在电极上分别滴加3μL四面体DNA纳米探针组装液，室温下组装2小时。
第三步，进行杂交反应。
将目标DNA和DNA信号探针(末端修饰了生物素的DNA)混合，用1M NaCl 10mM PBS溶液稀释目标DNA成不同浓度(1pM，10pM，100pM，1nM，5nM)，信号探针浓度为1μM，37℃预杂交0.5小时，然后将预杂交后的反应液滴在电极表面杂交1小时，最后用0.1M NaCl 10mM PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干。
第四步，检测。
在每根电极表面滴加3μL 0.5U/mL avidin-HRP，只有在目标DNA存在的条件下，DNA信号探针才可以连接到四面体DNA纳米探针上，捕获avidin-HRP。最后用超纯水冲洗、用氮气吹干之后，检测。取1mL TMB底物 到电解池中，将电极浸没到TMB底物中检测采用三电极系统，金电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。使用CHI电化学分析仪(CHI660)检测。扫描循环伏安图和时间电流曲线，其中循环伏安法，起始电压0V，最高电压+0.7V，最低电压0V，扫速0.1V/s。时间电流曲线，电压+0.15V，时间100s。
结果如图3所示，电化学信号随着目标DNA的浓度发生变化。利用此曲线，根据本发明的四面体DNA纳米探针可实现对目标DNA的定量分析。
实施例2
试剂包括：
DNA同实例1
亲和素修饰的葡萄糖氧化酶(GOx-A)，购自Vector Laboratories(SanDiego，CA)
实验步骤同实施例1，将亲和素修饰的辣根过氧化物酶替换成亲和素修饰的葡萄糖氧化酶，底物TMB替换成葡萄糖和苯醌。电压为0.35V(参比为银/氯化银电极)，其余参数不变，其结果与实施例1相同。
实施例3
试剂包括：
4条用于组装形成四面体DNA纳米结构探针的单链DNA，S1(88bp，分子量27014.0，ssDNA)、S2(83bp，分子量25642.6，5’端修饰巯基ssDNA)、S3(83bp，分子量25678.6，5’端修饰巯基ssDNA)、S4(83bp，分子量25535.5，5’端修饰巯基ssDNA)，均购自大连Takara生物有限公司S1：
5’-GTATCCAGTGGCTCATTTTTTTTTTACGAACATTCCTAAGTCT
GAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTG
AG-3’
S2：
5’-HS-ATTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGAGGAAATG
AAGTCCAATACCGACGATTACAGGCCTTTGCGCCTTGCTACAC
G-3’
S3：
5’-HS-ACGTGTAGCAAGGCGCAAAGGCCTGTAATCGACTCTAC
GGGAAGAGCATGCCCATCCGGCTCACTACTATGGCGGGTGAT
AAA-3’
S4：
5’-HS-ACTCAACTGCCTGGTGATACGAGAGCCGGATGGGCATG
CTCTTCCCGTAGAGACGGTATTGGACTTCATTTCCTCCTCGCA
TG-3’
其中，
S1链上15bp的识别序列、目标DNA和DNA信号探针与实施例1同。组装形成的四面体DNA纳米结构探针的六条边其中三条是由30对碱基互补配对形成，另外三条是由20对碱基互补配对形成。
检测步骤同实施例1，其结果如图4。通过调整DNA纳米探针四面体底座的边长可以改变识别序列离固体表面和识别序列相互之间的距离。可以通过这种方法来调整表面探针的组装密度，从实施例1和实施例3可以看出，在目标DNA同样浓度的情况下，实施例3中的电流信号要略小于实施例1中的电流信号，这说明DNA四面体纳米结构探针的底座结构对构成的电化学传感器有一定的影响。由此可知，本发明的四面体DNA纳米探针的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。应该理解，实施例1和3中的具体的碱基数目在此只作为示例而非限制。
实例4
将实例1中自组装的四面体DNA纳米探针中使用的Tetra-A替换成Tetra-MA(86bp，分子量26391，ssDNA)：
5’-TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC TTTTTTTTTT ACA TTC CTAAGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CATAGT A-3’
其中Tetra-MA链上21bp的识别序列：
TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC
目标DNA：
5’-GGG TAT CAT ACG GGA TCCCCA-biotin-3’(21bp，分子量6431，3’ 端修饰生物素分子ssDNA)
由于目标DNA的单链DNA末端修饰了生物素分子，可以通过与识别序列互补，直接同亲和素修饰的过氧化物酶作用，所以无需DNA信号探针。
检测的其他步骤同实例1，结果如图5所示，blank是不含目标DNA的电流信号，左侧的柱状图显示目标DNA为1nM时的电流信号。由此可知，本发明的四面体DNA纳米探针的识别序列可以根据目标DNA序列进行设计。应该理解，实施例1和4中的识别序列在此只作为示例而非限制。
实例5
试剂包括：
单链探针DNA FP(3’巯基修饰，20bp，分子量6066)：
FP：5’-GTATC CAGTG GCTCATTTTT-SH-3’
四条待检测的DNA：一条与DNA纳米探针的识别序列完全互补的目标DNA(T1，15bp，分子量4878.2，3’端标记生物素分子)；三条中间分别有一个碱基错配DNA(T2，15bp，分子量4869；T3，15bp，分子量4893；T4，15bp，分子量4932，3’端标记生物素分子的单链)，均购自大连Takara生物有限公司。
T1：5’-TGA GCC ATT GGA TAC-biotin-3’
T2：5’-TGA GCC CTT GGA TAC-biotin-3’
T3：5’-TGA GCC TAT GGA TAC-biotin-3’
T4：5’-TGA GCC GGT GGA TAC-biotin-3’
试验前组装两种探针(单链探针和四面体DNA纳米结构探针)修饰的金电极。
1.四面体DNA纳米结构探针修饰电极过程同实例1。
2.单链探针修饰电极过程如下：
1)配制单链探针组装液，其中单链探针组装液用2mol/L NaCl，3mMTCEP，10mM TE缓冲液配制成1μM)。取3.2μL组装液滴在电极表面，组装过夜。
2)配制100mM的巯基己醇。
3)将步骤1中修饰了单链探针的电极浸入100μL步骤2中的巯基己醇中，室温放置1小时后用超纯水冲洗然后用氮气吹干。
其检测步骤同实施例1。由于目标DNA的单链DNA末端修饰了生物素分子，可以直接同亲和素修饰的过氧化物酶作用，所以无需DNA信号探针。
分别利用两种探针修饰电极检测T1、T2、T3、T4四条单链DNA，杂交温度为48℃，其它所有条件相同，结果如图6所示，单链探针修饰的电极对中间一个碱基错配的分辨率(错配的信号：完全互补的信号)均大于1％，而四面体DNA探针修饰的电极对单碱基错配的分辨率均小于1％，这归结于四面体DNA探针的本身的特殊性。
因此根据本发明的三维纳米结构探针具有良好的SNP的分辨能力。
实例6
试剂包括：
Tetra-E：5’-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTACAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A TTTTTTTTTTTTCCCACCAACGCTG-3’(80bp，分子量为24456.9，ssDNA)
P1：5’-GCGAAAACTGTGGAATTGAT-3’(20bp，分子量为6205.1，ssDNA)
P2：5’-TGATGCTCCATCACTTCCTG-3’(20bp，分子量为6018.9，ssDNA)
Rep-P：5’-ATCAATTCCACAGTTTTCGC-biotin-3’(20bp，分子量为6027，3’末端修饰生物素分子单链DNA)
本发明检测步骤如下：
第一步：大肠杆菌DNA的提取
1.挑取保存于LB平板的大肠杆菌(E.coli DH5α)单菌落，置于新鲜的LB培养基，37℃，200rpm摇床，过夜培养。
2.运用“细菌基因组DNA提取试剂盒”(TIANGEN BIOTECH(BeiJing)Co.，LTD.)提取大肠杆菌的基因组DNA。
第二步：PCR扩增
以P1，P2为引物(浓度10μM)，大肠杆菌基因组DNA为模板(ng级)，总体积25μL，95℃变性2分钟，设置变性95℃30s，复性61℃30s，延伸72℃30s，30个循环。
第三步：检测
实验步骤同实例1，将合成DNA四面体纳米结构探针中的Tetra-A替换成Tetra-E。
将PCR产物95℃变性2分钟，迅速置入冰盒保存。检测过程中，将变性后的PCR产物和信号探针(biotin修饰)混合在一起，滴在电极上杂交1小时。后检测步骤同实例1。
结果表明，本发明的探针不仅用于检测SNP等单链DNA，还可用于检测双链DNA。
本发明上述实施例中所用的各种DNA序列都是人工合成的，均购自大连Takara生物有限公司。其它未特殊说明的条件按照常规条件或按照药品或以其制造厂商所建议的条件。
序列表
<110>中国科学院上海应用物理研究所
<120>一种DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法
<130>P1-101028N
<140>2010101199419
<141>2010-03-09
<160>21
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>未知
<220>
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Claims (11)
1.一种DNA三维纳米结构探针的电化学检测方法，其特征在于，包括：
通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的探针包括延伸出的一段识别序列，其中，所述的DNA三维纳米结构探针是四面体DNA纳米结构探针，由四条单链DNA自组装形成，所述的四条单链DNA中三条单链DNA的5′端修饰有巯基，另一条单链DNA在一端延伸出所述识别序列；
将所述纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面，其中，将所述纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面是将所述的纳米结构探针滴在所述工作电极上，所述的电化学装置的工作电极是金电极，通过巯基和金之间的金硫键将所述纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面，所述组装到电化学装置的工作电极表面的DNA三维纳米结构探针的浓度为0.01μM-10μM；
将目标DNA与所述工作电极表面的所述探针杂交；
加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA三维纳米结构探针的边长通过DNA碱基配对数调整其长度。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的DNA三维纳米结构探针的边长由17对碱基互补配对形成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组装到电化学装置的工作电极表面的DNA三维纳米结构探针的浓度为1μM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的识别序列与所述的目标DNA序列相配对。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标DNA的3’端标记生物素分子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标DNA与所述识别序列及DNA信号探针完全互补形成夹心结构。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的DNA信号探针的5’端标记生物素分子。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氧化还原酶包括辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氧化还原酶是修饰有亲和素分子的辣根过氧化物酶。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底物是TMB和双氧水。
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