CN104774857B - 一种dna三维纳米结构人工酶前体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA三维纳米结构人工酶前体及其制备与应用。本发明采用DNA四面体作为核酸酶的骨架，为其提供一个稳定的化学环境；利用DNA四面体纳米结构的可控性，将核酸酶分别连接在DNA四面体骨架的不同位置，构建形成不同构型的DNA四面体纳米结构人工酶前体。与传统核酸酶相比，本发明设计的不同构型的DNA四面体纳米结构人工酶前体形成酶后的结构更稳定，灵敏度更高，催化活性是传统核酶的6~14倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA三维纳米结构人工酶前体及其制备与应用。
背景技术
人工酶在生物医学和化学工业等领域研究中拥有巨大的应用潜力，同时它也是科学家研究蛋白质催化原理的重要工具。天然酶是生物长期进化的结果，而人工酶则是科学家通过模拟生物进化的过程，按照蛋白质的形成规律，从而达到改造蛋白质的目的而构建的。人工酶的构建不仅使我们能够充分地利用自然界存在的基因和蛋白质，而且还能在分子水平上对蛋白质进行设计和改造，在短期内完成自然界几百万年进化才能完成的过程，进而创造出自然界不存在的蛋白质。传统的人工酶是通过基因工程的手段构建的，该方法不仅繁琐、耗时而且进化效果与预期相差甚远，经常需要重新设计并进行改造，从而导致需要经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的目标。科学家们常用的构建人工酶的方法是将一个天然酶的催化活性中心迁移到另一个生物分子或人工分子骨架上，从而形成新的人工酶。
某些核酸和酶蛋白一样，也具有催化作用，我们称之为核酸酶。G-四链体(G-quadruplex)是一段富G碱基的DNA序列。它可以与辅酶血红素(hemin)结合，形成具有过氧化物酶催化活性的复合物(简称为G4-DNAzyme)。该酶已被广泛用于生物分子、金属离子以及基因的检测中。虽然核酶并不具有蛋白质一样的高度多样化的功能基团且催化能力较弱，但由于核酸比蛋白质性质稳定、结构简单、容易贮存而且制备简单，因此人们一直致力于研究并改进这些核酸酶，期望提高其底物特异性和催化活性，从而使其能够应用于工业生产中。根据调查研究，推测这些核酸酶的催化活性较低，是由于没有精妙的生物分子骨架为其提供足够的化学环境，从而降低其稳定性以及催化能力。因此，可以为核酸酶构建一个精密坚固的骨架以提高这些核酸酶的催化活性。
DNA纳米技术的出现为达到上述目的提供了新的解决方法。它使得我们不仅可以构建具有动态结构的DNA纳米结构，而且可以控制其形态以及性质。同时这些构建的DNA纳米结构不仅能够跨越三维空间的界限，而且生物相容性好，因此它们已经成为蛋白质、DNA、RNA、纳米颗粒以及药物等生物分子的优良载体。其中，四面体DNA则是现有的纳米结构中最成熟和稳定的DNA纳米结构。它最早是由英国牛津大学的Tuberfield小组在2004年设计并构建的。该DNA四面体是由4条DNA单链组成，每条DNA单链长度均为55个碱基，每条棱为17个碱基杂交形成的双链，所构成的直径为7nm左右的正四面体三维结构。利用碱基互补的特性，只需要经过一个简单的退火过程，即可在十分钟内完成自组装过程。由于DNA四面体设计简单、制备容易、结构及性质稳定并且形状可控，因此它被认为是蛋白、纳米颗粒、适配体以及microRNA的优良载体。2005年，Goodman等又进一步优化和改进，使得四面体的组装效率可以高达95％，并且具有良好的机械刚性。2006年Tuberfield利用DNA双链结构的稳定性和周期性的特点，成功地将细胞色素c修饰在DNA四面体的空腔内，可以调控细胞色素c与外界生物分子的作用，具有潜在的生物医学应用。2010年樊春海课题组将DNA四面体进行修饰，使其三个顶点带上巯基，与金电极相互作用连接到电极上，发展了一种基于DNA四面体纳米结构的分子传感平台。2010年Willner等将G-四链体DNA酶(G4-DNAzyme)组装在金电极，揭示了它的生物电催化能力和催化还原H2O2的活性，被用来开发电化学传感器追踪葡萄糖氧化酶的活性以及检测DNA或低分子量底物(AMP)。这种方法的优势是无需对DNA酶-底物进行荧光标记；DNA酶组装在金电极上形成单层结构，减少了传感矩阵的容量，还可以再生传感表面；普通的光学传感平台缺少一个放大元件，DNA酶电催化的特性可以放大传感事件。电化学检测方法具有操作简单、快速、灵敏、准确、仪器简便、易于微型化、集成化、能耗低、适用于即时检测、床边检测等独特的优势，因而在临床检测、科学研究中具有非常大的潜力。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种DNA四面体纳米结构人工酶前体，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体相对于传统核酶，具有稳定性好，催化活性高，灵敏度高的优点。
本发明的另一目的在于提供所述DNA四面体纳米结构人工酶前体的制备方法及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面，提供了一种DNA四面体纳米结构人工酶前体，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体包括一个DNA四面体骨架和连接在所述DNA四面体骨架上的一段核酸酶核苷酸，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体由分别记为S1、S2、S3、S4的四条单链DNA自组装形成且具有一个四面体底座，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S1的5’端延伸出来一段核酸酶核苷酸。
优选地，所述核酸酶核苷酸为自由的G四链体的核苷酸，其序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GGGTAGGGCGGGTTGGG。
优选地，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG。
优选地，所述S2的5'端修饰了巯基。得到的S2的整体结构为：
SH-C6-CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG。SH是指巯基，C6是指6个CH2。
优选地，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC。
优选地，所述S3的5'端修饰了巯基。得到的S3的整体结构为：
SH-C6-CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC。SH是指巯基，C6是指6个CH2。
优选地，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG。
优选地，所述S4的5'端修饰了巯基。得到的S4的整体结构为：
SH-C6-CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG。SH是指巯基，C6是指6个CH2。
优选地，5’端延伸出来一段核酶核苷酸序列的单链DNA S1的核苷酸序列如SEQ IDNO.5～9所示。
优选地，S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGCCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCA。
此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链体位于DNA四面体骨架底座的内部。
优选地，S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGG。
此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链体位于DNA四面体骨架底座的外部。
优选地，S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTA。
此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链体位于DNA四面体骨架侧面的外部。
优选地，S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACAT。
此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链体位于DNA四面体骨架侧面的内部。
优选地，S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA。
此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链体位于DNA四面体骨架的顶点。
本发明第二方面，提供了制备前述DNA四面体纳米结构人工酶前体的方法，包括如下步骤：分别取等量四条单链DNA S1、S2、S3和S4，混合自组装，即可形成DNA四面体纳米结构人工酶前体。
优选地，溶解时采用TMK buffer(20mM tris，50mM MgCl2，50mM KCl，pH8.0)。
优选地，所述自组装的条件为：95摄氏度5min，而后立即降温到4摄氏度，保持30s以上。
本发明第三方面，公开了前述DNA四面体纳米结构人工酶前体在制备核酸酶中的用途。
本发明的第四方面，公开了一种人工核酸酶，由前述DNA四面体纳米结构人工酶前体与辅酶血红素(hemin)结合后获得。
本发明的第五方面，公开了前述人工酶前体或人工核酸酶在制备检测试剂中的用途。
本发明的第六方面公开了一种电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极表面固定前述DNA四面体纳米结构人工酶前体所得。
优选地，所述基底电极选自金电极。
优选地，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体通过巯基固定在基底电极表面。
当S2、S3和S4的5’端修饰有巯基时，S1与S2、S3、S4自主装所形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体通过巯基与金电极表面结合。
优选地，所述参比电极选自选自饱和甘汞电极或银/氯化银。更优选银/氯化银。
优选地，所述对电极选自铂电极。
本发明的一个优选实施例中，为了提高G4-DNAzyme的催化活性，将DNA四面体作为G4-DNAzyme的骨架，为G4-DNAzyme提供一个稳定的化学环境，而构建一种新型人工酶前体(Tetrazyme前体)，所述人工酶前体由三条5'端修饰了巯基的单链DNA和一条5'端延伸出来一段G四链体的DNA序列的单链DNA自组装形成，组装成功的Tetrazyme前体的DNA四面体骨架每条边有21个碱基，顶点处是一个碱基A，其中位于底面的三个顶点处去掉碱基A，修饰巯基，以便通过金-硫键实现Tetrazyme前体在金电极上的固定。传统的G4-DNAzyme结构简单，催化活性低，稳定性较差，而Tetrazyme前体由于具有DNA四面体结构而具有良好的稳定性和刚性结构，能够避免单链探针之间的互相缠绕，不需要用巯基己醇等小分子封闭电极就能很好的“站立”在电极表面。
本发明的第七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前述人工酶前体或人工核酸酶。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用DNA四面体作为核酸酶的骨架，为其提供一个稳定的化学环境；利用DNA四面体纳米结构的可控性，将核酸酶分别连接在DNA四面体骨架的不同位置，构建形成不同构型的DNA四面体纳米结构人工酶前体。
(2)与传统核酸酶相比，本发明设计的不同构型的DNA四面体纳米结构人工酶前体形成酶后的结构更稳定，灵敏度更高，催化活性是传统核酶的6～14倍。
附图说明
图1：为本发明的原理图。
图2A：(a)是Hemin对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(b)G4-DNAzyme对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(c)Tetrazyme-Bottom-out对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(d)是Tetrazyme-Bottom-in对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线，显示了Hemin、G4-DNAzyme、Tetrazyme-Bottom-out和Tetrazyme-Bottom-in还原H2O2所产生阴极电流的情况，扫描速率为100mV/s。
图2B：从上到下分别是Hemin；G4-DNAzyme；Tetrazyme-Bottom-out；Tetrazyme-Bottom-in对6mM的H2O2的响应的电流时间曲线，其中扫描电势为100mV，扫描时间为100s。
如图3A：是Tetrazyme-Bottom-out对一系列不同浓度H2O2的响应的循环伏安曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1.5mM,3mM,6mM。
图3B：是Tetrazyme-Bottom-out对一系列不同浓度H2O2的响应的电流时间曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1mM,2mM,4mM,6mM；可以看出Tetrazyme-Bottom-out随着H2O2浓度的增大，产生的阴极电流增大。
图3C：是Tetrazyme-Bottom-in对一系列不同浓度H2O2的响应的循环伏安曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1.5mM,3mM,6mM。
图3D：是Tetrazyme-Bottom-in对一系列不同浓度H2O2的响应的电流时间曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1mM,2mM,4mM,6mM；可以看出Tetrazyme-out随着H2O2浓度的增大，产生的阴极电流增大；循环伏安曲线：扫描速率：100mV/s；电流时间曲线：扫描电压为-0.4V，扫描时间为100s。
图4：(a)是Tetrazyme-Bottom-in对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(b)是Tetrazyme-Bottom-out对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(c)是G4-DNAzyme对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(d)是Hemin对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；H2O2的浓度从左往右依次是0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0mM。
图5：不同构型的Tetrazymes对6mM H2O2的响应电流值的信号比较，从左往右依次是Tetrazyme-Top-out；Tetrazyme-Side-out；Tetrazyme-Bottom-out；Tetrazyme-Side-in；Tetrazyme-Bottom-in。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
1.材料与试剂
本发明实施例中用到的DNA由上海生工公司合成。hemin，TCEP购自Sigma公司，其他所有试剂购自国药集团。本发明中所用的缓冲溶液包括：TMK缓冲溶液(20mM trisbuffer,50mM MgCl2和50mMKCl，pH 8.0)；PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl和2.7mM KCl,pH7.4)；hemin用DMSO溶解后于-20℃冰箱保存备用；30mM TECP水溶液。所有溶液用Milli-Q水(18.2MΩcm电阻)配制。
2.设计思路
为了提高G4-DNAzyme的催化活性，本发明采用DNA四面体作为G4-DNAzyme的骨架为G4-DNAzyme提供一个稳定的化学环境，从而构建形成一种新型人工酶(Tetrazyme)。本发明利用DNA四面体纳米结构的可控性，将G4-DNAzyme分别连接在DNA四面体纳米结构骨架的不同位置，并利用电化学检测方法研究所述DNA四面体纳米结构所提供的化学环境对G4-DNAzyme的活性的影响，从而制备得到具有很强活性和稳定性的Tetrazyme。
进一步的，本发明中Tetrazyme前体由三条5'端修饰了巯基的单链DNA(分别记为S2、S3和S4)和一条在3'端延伸出来一段自由的G四链体核苷酸序列的单链DNA(记为S1)自组装形成。组装成功的Tetrazyme前体含有一个DNA四面体骨架，所述DNA四面体骨架底座的三个顶点处有巯基修饰。通过设计含有不同核苷酸序列的S1，即可使得自由的G四链体位于DNA四面体骨架的不同位置，再与辅酶hemin结合，亦即得到不同构型的Tetrazyme。
如图1所示，为本发明的原理图，利用DNA四面体纳米结构的可控性，将G四链体连接在DNA四面体骨架的不同位置：(a)G四链体位于DNA四面体骨架底座的内部；(b)G四链体位于DNA四面体骨架底座的外部；(c)G四链体位于DNA四面体骨架的顶点；(d)G四链体位于DNA四面体骨架侧面的外部；(e)G四链体位于DNA四面体骨架侧面的内部。
Tetrazyme前体上所连接的自由的G四链体在hemin存在时，能够形成hemin/G4-DNAzyme的二级结构，即为本发明所构建人工酶Tetrazyme，具有电催化还原H2O2的能力。
构成四面体纳米结构人工酶前体的四条DNA含有四个结构域，每个结构域分别和其它三条单链DNA的相对应结构域互补(20个碱基互补)，每条单链DNA分别围绕四面体结构的一个面一圈，在每个顶点处含有一个碱基(非互补，柔性)起弯折作用，单链DNA3’端和5’端汇聚在四面体的四个顶点。S1在5’端延伸出一段G四链体DNA，S2、S3、S4分别在5’末端修饰巯基，分别在四面体骨架底座的顶点上衍生出来。
具体的，几条用于组装形成Tetrazyme前体的单链DNA：
(1)S2：是一条5'端修饰了巯基的单链DNA，总分子量19101.33；含有62个碱基，核苷酸序列为：
CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQ IDNO.2)；
S2的整体结构为：
SH-C6-CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG；SH是指巯基，C6是指6个CH2。
(2)S3：是一条5'端修饰了巯基的单链DNA，总分子量19200.42；含有62个碱基，核苷酸序列为：
CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ IDNO.3)；
S3的整体结构为：
SH-C6-CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC；SH是指巯基，C6是指6个CH2。
(3)S4：是一条5'端修饰了巯基的单链DNA，总分子量19077.24；含有62个碱基，核苷酸序列为：
CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ IDNO.4)；
S4的整体结构为：
SH-C6-CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG；SH是指巯基，C6是指6个CH2。
(4)S1-inside：是5’端延伸出一段G四链体的单链DNA，总分子量24807.99；含有80个碱基，核苷酸序列为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGCCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCA(SEQ ID NO.5)；
S1-inside与S2、S3和S4自组装形成的Tetrazyme记为Tetrazyme-Bottom-in，其G四链体位于DNA四面体骨架底座的内部；
(5)S1-outside：是5’端延伸出一段G四链体的单链DNA，总分子量24807.99；含有80个碱基，核苷酸序列为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGG(SEQ ID NO.6)；
S1-outside与S2、S3和S4自组装形成的Tetrazyme记为Tetrazyme-Bottom-out，其G四链体位于DNA四面体骨架底座的外部。
(6)A1-outside：是5’端延伸出一段G四链体的单链DNA，总分子量24807.99；含有80个碱基，核苷酸序列为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTA(SEQ ID NO.7)；
A1-outside与S2、S3和S4自组装形成的Tetrazyme记为Tetrazyme-Side-out，其G四链体位于DNA四面体骨架侧面的外部；
(7)A1-inside：是5’端延伸出一段G四链体的单链DNA，总分子量24807.99；含有50个碱基，核苷酸序列为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACAT(SEQ ID NO.8)；
A1-inside与S2、S3和S4自组装形成的Tetrazyme记为Tetrazyme-Side-in，其G四链体位于DNA四面体骨架侧面的内部；
(8)V1-outside：是5’端延伸出一段G四链体的单链DNA，总分子量24807.99；含有80个碱基，核苷酸序列为：
GGGTAGGGCGGGTTGGGATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.9)；
V1-outside与S2、S3和S4自组装形成Tetrazyme记为Tetrazyme-Top-out，其G四链体位于DNA四面体骨架的顶点；
3、Tetrazyme前体的制备
把各条链稀释到终浓度50uM保存备用。分别取等量的四条单链DNA S1(分别为
S1-inside、S1-outside、A1-outside、A1-inside、V1-outside)、S2、S3和S4，用TMKbuffer(20mM tris，50mM MgCl2，50mM KCl，pH8.0)稀释，使其终浓度为均为1uM，体积100uL。95摄氏度5min后，立即降温到4摄氏度，保持30s以上，即可自组装形成各种不同构型的Tetrazyme前体。
实施例2
将实施例制备的各种不同构型的Tetrazyme前体固定到工作电极上，与辅酶hemin孵育，形成稳定的人工酶Tetrazyme，通过电化学检测方法，验证其活性。其中，以Hemin和未连接DNA四面体骨架的G4-DNAzyme作为对照。所述未连接DNA四面体骨架的G4-DNAzyme为已与Hemin孵育的3’端修饰了巯基的自由的G四链体(Free G-quadruplex)，含有17个碱基，核苷酸序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGG(SEQ ID NO.1)
Free G-quadruplex的整体结构为：GGGTAGGGCGGGTTGGG-C6-SH；SH是指巯基，C6是指6个CH2。
1、清洗工作电极并固定不同构型的Tetrazyme前体、Free G-quadruplex：
取直径为2mm的金电极，先用0.3um和0.5um的氧化铝粉依次打磨，然后用乙醇和水各超声3min，在0.5M的硫酸中测定其伏安曲线，最后用超纯水冲洗然后用氮气吹干备用。在电极上滴加3uL实施例1中制备的Tetrazyme前体、Free G-quadruplex、Q水，室温下固定过夜。此处需要说明的是在做Hemin和Free G-quadruplex对照实验时加了MCH封闭电极(1mM，30min)的其他位点，而做Tetrazyme前体固定的时候无需加MCH封闭电极。
2、加hemin孵育，形成稳定的有催化活性的Tetrazyme和G4-DNAzyme
取出固定好Tetrazyme前体、Free G-quadruplex和Q水的工作电极，用1X PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，37mM NaCl and 2.7mM KCl,pH7.4)冲洗金电极，氮气吹干。将金电极孵育在含有浓度为1uM的hemin的TMK buffer(20mM Tris-HCl，50mM MgCl2，50mMKCL，PH 8.0)中37℃，30min。
3、检测
电解池中的检测溶液为TMK buffer(20mM Tris-HCl，50mM MgCl2，50mM KCL，PH8.0)其中含有一系列不同浓度的H2O2(0mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM，4.5mM，5mM，5.5mM，6mM)。将电极浸没的所述检测溶液中检测，采用三电极系统，金电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极。使用CHI电化学分析仪检测。扫描循环伏安图和时间电流曲线。其中循环伏安法的起始电压-0.6V，最高电压0.2V，最低电压-0.6V，扫描速度0.1v/s。时间电流曲线，电压为-0.4V，时间100秒。
检测结果如图2～5所示：
如图2A：(a)是Hemin对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(b)G4-DNAzyme对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(c)Tetrazyme-Bottom-out对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线；(d)是Tetrazyme-Bottom-in对6mM的H2O2的响应的循环伏安曲线，显示了Hemin、G4-DNAzyme、Tetrazyme-Bottom-out和Tetrazyme-Bottom-in还原H2O2所产生阴极电流的情况，扫描速率为100mV/s。
如图2B：从上到下分别是Hemin；G4-DNAzyme；Tetrazyme-Bottom-out；Tetrazyme-Bottom-in对6mM的H2O2的响应的电流时间曲线，其中扫描电压为-0.4V，扫描时间为100s。
从图2A和2B的结果可以看出，在还原H2O2时，Tetrazyme-Bottom-in和Tetrazyme-Bottom-out相对于传统的G4-DNAzyme产生的阴极电流更大，其中Tetrazyme-Bottom-in产生的阴极电流最大。
如图3A：是Tetrazyme-Bottom-out对一系列不同浓度H2O2的响应的循环伏安曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1.5mM,3mM,6mM。
如图3B：是Tetrazyme-Bottom-out对一系列不同浓度H2O2的响应的电流时间曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1mM,2mM,4mM,6mM；可以看出Tetrazyme-Bottom-out随着H2O2浓度的增大，产生的阴极电流增大。
如图3C：是Tetrazyme-Bottom-in对一系列不同浓度H2O2的响应的循环伏安曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1.5mM,3mM,6mM。
如图3D：是Tetrazyme-Bottom-in对一系列不同浓度H2O2的响应的电流时间曲线，H2O2的浓度从上往下依次是0mM,1mM,2mM,4mM,6mM；可以看出Tetrazyme-out随着H2O2浓度的增大，产生的阴极电流增大；(循环伏安曲线：扫描速率：100mV/s；电流时间曲线：扫描电压为-0.4V，扫描时间为100s)。
图4：(a)是Tetrazyme-Bottom-in对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(b)是Tetrazyme-Bottom-out对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(c)是G4-DNAzyme对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；(d)是Hemin对不同浓度H2O2响应电流值绘制的模拟分析曲线；H2O2的浓度从左往右依次是0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0mM。发现电流值对不同浓度H2O2的响应曲线符合剂量响应曲线，都是随H2O2浓度增大，阴极电流值增大。
图5：不同构型的Tetrazymes对6mM H2O2的响应电流值的信号比较，从左往右依次是Tetrazyme-Top-out；Tetrazyme-Side-out；Tetrazyme-Bottom-out；Tetrazyme-Side-in；Tetrazyme-Bottom-in。由此可见不同构型的Tetrazymes的对同一浓度的H2O2的催化还原能力不同。其中Tetrazyme-Bottom-in催化还原H2O2的能力最强，Tetrazyme-Top-out催化还原H2O2的能力最弱。
上述实验结果说明：本发明采用DNA四面体作为骨架构建的不同构型的人工酶前体所形成的酶，相对于传统的未连接DNA四面体骨架的G4-DNAzyme催化活性更高，稳定性更高，灵敏度更高，具有很好的应用前景。尤其是通过图2A、2B和图4均可以看出，Tetrazyme-Bottom-in催化还原H2O2的能力最强，它的催化活性是传统自由的G四链体的14倍；就连催化还原H2O2的能力最弱的Tetrazyme-Top-out的催化活性也是传统的自由的G四链体的6倍。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种DNA四面体纳米结构人工酶前体，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体包括一个DNA四面体骨架和连接在所述DNA四面体骨架上的一段核酸酶核苷酸，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体由分别记为S1、S2、S3、S4的四条单链DNA自组装形成且具有一个四面体底座，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S1的5’端延伸出来一段核酸酶核苷酸；所述核酸酶核苷酸为自由的G四链体的核苷酸，所述核酸酶核苷酸的编码序列如SEQ ID NO.1所示；所述四条单链DNA中的S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；S4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S1的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5～9所示的序列之任一。
2.一种制备如权利要求1所述DNA四面体纳米结构人工酶前体的方法，包括如下步骤：分别取等量四条单链DNA S1、S2、S3和S4，混合自组装，即形成DNA四面体纳米结构人工酶前体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述自组装的条件为：95摄氏度5min，而后立即降温到4摄氏度，保持30s以上。
4.如权利要求1所述DNA四面体纳米结构人工酶前体在制备核酸酶中的用途。
5.一种人工核酸酶，由权利要求1所述DNA四面体纳米结构人工酶前体与辅酶血红素结合后获得。
6.如权利要求1所述人工酶前体或权利要求5所述人工核酸酶在制备检测试剂中的用途。
7.一种电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极表面固定权利要求1所述DNA四面体纳米结构人工酶前体所得。
8.一种试剂盒，包括权利要求1所述人工酶前体或权利要求5所述人工核酸酶。
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