CN113866234B - 基于双dna四面体结构检测fr的电化学生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器。所述生物传感器包括探针和修饰电极。所述探针包括带有叶酸的DNA四面体靶向探针和带有叶酸的DNA四面体信号放大探针。本发明构建了一种操作简单，灵敏度高的检测叶酸受体的生物传感器，该生物传感器基于DNA四面体设计，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和无污染等优点。

Description

基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器。
背景技术
目前恶性肿瘤已成为人类死亡的主要原因之一。在恶性肿瘤的早期阶段，癌症是最常见的恶性肿瘤，没有明显的非特异性症状[1,2]。尽管这些年来癌症研究取得了许多进展，但是目前我们依旧没有办法阻止癌症的发展。但是，癌症的早期诊断可以显着提高治愈率和存活率[3,4]。常见的癌症筛查方法包括基因检测、影像学检查、内窥镜检查、病理检查等。但是这些方法都不适用于癌症的早期诊断，而甲胎蛋白(AFP)、microRNA[5]等肿瘤标志物的发现与发展为癌症的早期诊断提供了新方向，并且肿瘤标记物检测是早期发现癌症的最有效和潜在方法，研究表明，肿瘤细胞表面通常会超表达多个受体，如叶酸受体[6]、表皮生长因子受体[7]、胰岛素受体[8]等。其中叶酸受体是一种跨膜单链糖蛋白，在正常组织中极少存在，然而在多种肿瘤细胞表面，如卵巢癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等，过度表达，通常比正常细胞高出20～200倍[3]，因此叶酸受体具有良好的肿瘤组织特异性，是一种较为理想的肿瘤标志物。叶酸是一种水溶性维生素B，在细胞环境中的叶酸可以特异性的识别叶酸受体。利用叶酸受体在肿瘤细胞和正常细胞上表达的差异性及叶酸受体与叶酸和叶酸类似物结合的高特异性、高亲和性，可以将叶酸用于肿瘤细胞的特异性检测。
传统的叶酸受体(FR)的检测方法包括放射免疫测定法(RIA)[9,10]和酶联免疫吸附测定法(ELISAs)[11]。这两种方法主要依赖于FR与相应抗体之间的相互作用，虽然都可以达到较高的灵敏度，但是这两种方法都有自身不可忽视的缺点。其中放射免疫测定法过程耗时长、操作复杂且含有一些反射物质，可能对人体健康造成危害，而酶联免疫吸附测定法不仅耗时长，而且还有酶的活性以及成本等问题需要考虑。目前，叶酸受体的检测主要依靠传统的放射免疫测定法，它利用叶酸受体与相应抗体之间的相互作用，虽然可以达到高灵敏度，但是过程耗时长且含有一些反射物质，可能对人体健康造成危害。
此外一些依赖于FR和FA之间特定相互作用的新方法已经被提出，比如通过结合荧光、电化学、比色和化学发光等[12]信号转导机制来提高检测的简便性和适应性。Zhan等[13]人提出了一种基于叶酸受体与DNA上修饰的叶酸相结合，保护DNA不被核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)剪切的电化学生物传感器。通过FR与FA的特异性结合，可以防止与FA终末结合的单链DNA被核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)降解，这种反应称为终端保护。Wμ等[14]人报道了一种透明双极微流控芯片电化学发光(ECL)系统，用于检测细胞膜上的叶酸受体(FR),获得了较高的灵敏度。Zhμ等[15]人提出了一种以纳米金为基础的基于小分子与DNA相互作用，致使溶液中金纳米粒子的颜色变化的标准比色传感检测法。该方法可以在均匀条件下进行操作，使用方便，但由于比色法固有的缺陷，其灵敏度不够高。
发明内容
叶酸受体(FR)在人类多种肿瘤细胞表面过表达，而在正常细胞中表达受到限制，因此被认为是一种肿瘤生物标志物。此外，叶酸(FA)对叶酸受体具有很高的亲和力，被认为是一种典型的细胞靶向剂。本发明构建了一种操作简单，灵敏度高的检测叶酸受体的生物传感器，该生物传感器基于DNA四面体设计，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和无污染等优点。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种生物传感器，其为基于双DNA四面体纳米结构的生物传感器，所述生物传感器包括探针和修饰电极。
所述探针包括带有叶酸的DNA四面体靶向探针和带有叶酸的DNA四面体信号放大探针。
优选的，所述带有叶酸的DNA四面体靶向探针的制备方法包括：
S1：将A、S-B、S-C以及S-D四条DNA单链、TCEP以及10×PBS缓冲液混匀；
S2：在梯度PCR仪中90-100℃加热2-4min后，在20-40s内迅速降温至3-5℃并保持30s以上，得到四面体探针；
S3：将四面体探针与经EDC和NHS活化后的FA等体积混合均匀后，置于温度控制和混匀器中，37℃，300rpm反应1-3h，得到带有叶酸的DNA四面体靶向探针；
所述单链A、S-B、S-C以及S-D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3和SEQ ID NO：4。
优选的，所述置于温度控制和混匀器中，37℃，300rpm反应1-3h，的制备方法包括：
S1：将A、B-B、B-C以及B-D四条DNA单链、TCEP以及10×PBS缓冲液混匀；
S2：在梯度PCR仪中90-100℃加热2-4min后，在20-40s内迅速降温至3-5℃并保持30s以上，得到四面体探针；
S3：将四面体探针与经EDC和NHS活化后的FA等体积混合均匀后，置于温度控制和混匀器中，37℃，300rpm反应1-3h，得到带有叶酸的DNA四面体靶向探针；
所述单链A、B-B、B-C以及B-D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6和SEQ ID NO：7。
优选的，所述修饰电极的制备方法包括：
a.依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末的水溶液在抛光布上打磨金电极，再用去离子水、乙醇超声处理；
b.将金电极用去离子水冲洗，然后依次在0.5M、0.1MH2SO4/0.01M KCL溶液中进行电化学清洗；
c.将金电极置于H2SO4溶液中进行活化；
d.将活化后的电极用N2干燥，滴加带有叶酸的DNA四面体靶向探针，室温避光孵育过夜，得到S-FA修饰的工作电极。
更优选的，步骤a中用去离子水、乙醇超声处理3min。
更优选的，步骤c中将金电极置于0.05M的H2SO4溶液中进行活化。
本发明第二个方面公开了上述的生物传感器进行叶酸受体检测的方法，包括：
(1)在修饰了带有叶酸的DNA四面体靶向探针的电极上滴加叶酸受体溶液，37℃避光孵育1-3h；
(2)滴加带有叶酸的DNA四面体信号放大探针，37℃避光孵育1-3h；
(3)取1％BSA稀释的avidin-HRP滴加到电极表面，避光常温孵育10-20min；
(4)以TMB为底液对电极进行循环伏安和时间-电流扫描，通过电流的变化来表征FR浓度的变化。
优选的，每一步结束时用1×PBS缓冲液对电极进行冲洗，在下一步开始之前用N2对电极进行干燥。
本发明第三个方面公开了上述的生物传感器在叶酸受体检测中的应用。
本发明的设计思路为：
叶酸受体(FR)在人类多种肿瘤细胞表面过表达，而在正常细胞中表达受到限制，因此被认为是一种肿瘤生物标志物。此外，叶酸(FA)对叶酸受体具有很高的亲和力，被认为是一种典型的细胞靶向剂。在此，发明人开发了一种简单的基于双DNA四面体纳米结构的生物传感器，并用电化学的方法对FR进行检测。DNA四面体探针通过二硫键自组装在金电极上。本发明基于双DNA四面体的“三明治”式夹心法检测FR的电化学酶传感器示意图如图1所示。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明中成功构建了一种基于双DNA四面体纳米结构的生物传感器来检测FR。利用DNA四面体纳米结构的四个顶点作为生物活性位点，分别修饰上有关的生物基团以达到生物检测的目的。在结构探针S-FA的三个顶点上修饰-SH(巯基)，使得S-FA探针通过形成Aμ-S键稳定地装载到金电极，从而达到解决电极界面均质化问题，克服界面束缚效应，降低反应自由能的目的。在信号放大器B-FA的三个顶点上修饰了-biotin基团以与avidin-HRP通过生物素-亲和素效应相连接，从而达到进一步放大电信号的作用。
利用构建的电化学酶生物传感器来检测FR，其最低检测限为100ng/ml，并在100-400ng/ml的浓度范围内呈现出线性增加。
本发明公开的生物传感器基于DNA四面体设计，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和无污染等优点。
附图说明
图1为本发明基于双DNA四面体的“三明治”式夹心法检测FR的电化学酶传感器示意图；
图2为本发明实施例中全光谱扫描图((a)：FA和第1至第5次滤液的吸收光谱；(b)：S-FA、S-tetra和第5次滤液的吸收光谱)；
图3为本发明实施例中经各级修饰后的DNA四面体的活性聚丙烯酰氨凝胶电泳图(A：DNA单链；B：S-FA/FR；C：S-FA；D：S-tetra；E：第五次的滤液)。
图4为本发明实施例中各级修饰电极的循环伏安响应图(-0.3～0.7V，扫描速度为0.1V/s)：(a)裸金电极，(b)S-FA，(c)S-FA/FR，(d)S-FA/FR/B-FA，(e)S-FA/FR/B-FA/HRP。
图5为本发明实施例中各级修饰电极的电化学阻抗图谱法的尼奎斯特图(振幅为0.01V，扫描范围为100KHz-0.05Hz)：(a)裸金电极，(b)S-FA，(c)S-FA/FR，(d)S-FA/FR/B-FA，(e)S-FA/FR/B-FA/HRP。
图6为本发明实施例中基于双DNA四面体的电化学酶传感器检测不同浓度FR的电流值及其线性分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
一、试剂和仪器
FA(≥97.0％，国药集团化学试剂有限公司)，NHS(≥98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，EDC(≥99％，国药集团化学试剂有限公司)，BSA(﹥98％，上海碧云天生物技术有限公司)，FR、APS、TCEP、TMED、TBE、avidin-HRP和30％丙烯酰胺(生工生物工程(上海)股份有限公司)，GelRed(上海李记生物科技有限公司)，无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)，TMB(美国Neogen)，浓H2SO4、浓Hcl(国药集团化学试剂有限公司)，NaOH、KCL(上海泰坦科技股份有限公司)，K3[Fe(CN)6](上海麦克林生化科技有限公司)，K4[Fe(CN)6](上海泰坦化学有限公司)。
SMA4000紫外－可见全波长微量分光光度计(美林恒通技术有限责任公司)，电泳仪、凝胶成像仪、梯度PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)，CHI115铂丝对电极、CHI111Ag/AgCl参比电极、CHI1012mm直径金电极和CHI760E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。KQ-100DA型数控超声波清洗器(昆山市仪器公司)，Mill-Q纯水仪(≥18.2MΩ，美国Millipore)，温度控制和混匀器和Centrifμge 5424R离心机(德国Eppendorf公司)。
二、探针的合成及纯化
分别取50μM的A、S-B、S-C以及S-D四条DNA单链(表1)各2μl、30mM的TCEP5μl以及37μl的10×PBS缓冲液于PCR管中混匀，然后在梯度PCR仪中95℃加热3min后，在30s内迅速降温至4℃并保持30s以上，得到终浓度为2μM的四面体探针。再将四面体探针与经EDC和NHS活化后的FA等体积混合均匀后，置于温度控制和混匀器中，37℃、300rpm反应2h，得到终浓度为1μM的带有叶酸的DNA四面体靶向探针(S-FA)。为了除去多余的FA，将合成的S-FA溶液用超滤参数为3K的超滤管在4℃、相对离心力(rcf)13000的条件下离心30min，直到滤膜内的溶液为无色，此过程需要重复五次，每次加入200μl10×PBS缓冲液作为洗涤液。分别取纯化后的S-FA和1μM的FR溶液各5μl混合均匀，后放入温度控制和混匀器中，37℃、300rpm反应2h，得到S-FA/FR。带有FA的DNA四面体信号放大探针(B-FA)的组装步骤与S-FA探针的组装步骤和表征基本相同，只需将实验需要的四条DNA单链中的S-B、S-C和S-D分别替换为B-B、B-C和B-D，所述B-B、B-C和B-D的核苷酸序列也如表1所示。B-FA的纯化步骤为：为了除去多余的FA，将合成的B-FA溶液用超滤参数为3K的超滤管在4℃、相对离心力(rcf)13000的条件下离心30min，直到滤膜内的溶液为无色，此过程需要重复五次，每次加入200μl10×PBS缓冲液作为洗涤液。
表1实验所需的DNA探针序列
三、修饰电极的制备
依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末的水溶液在抛光布上打磨金电极，再用去离子水、乙醇超声处理3min。将金电极用去离子水冲洗，然后依次在0.5M、0.1MH2SO4/0.01M KCL溶液中进行电化学清洗，最后将金电极置于0.05M的H2SO4溶液中进行活化。将活化后的电极用N2干燥，滴加3μl 1μM的S-FA探针，室温避光孵育过夜，得到S-FA修饰的工作电极。
四、FR的检测
在修饰了S-FA的电极上滴加3μl不同浓度的FR溶液，37℃避光孵育2h。然后滴加3μl纯化后的基于DNA四面体的信号探针B-FA，37℃避光孵育2h。最后，取3μl用1％BSA稀释的avidin-HRP滴加到电极表面，盖上电极帽，避光常温孵育15min。以TMB为底液对电极进行循环伏安和时间-电流扫描，通过电流的变化来表征FR浓度的变化。实验过程中每一步结束时应用1×PBS缓冲液对电极进行冲洗，在下一步开始之前用N2对电极进行干燥。
实施例2
为了研究实验探针的合成情况，我们通过紫外可见分光光度计以10×PBS缓冲液为空白对照分别对DNA四面体(S-tetra)、S-FA以及纯化S-FA时产生的各级滤液进行了全光谱(UV-Vis)扫描。其检测结果如图2所示，在光谱扫描结果中，FA有两个吸收峰，分别是230nm-290nm和350nm，经稀释后的FA的吸收峰分别在260nm和350nm处，因此260nm和350nm两处的吸收峰为FA的特征吸收峰。而四面体结构的最高吸收峰在260nm处，260nm处的吸收峰为DNA四面体的特征峰，这与DNA的吸收波长相符合。在各级滤液中的FA的光谱信号依次降低，到第五次超滤产生的滤液中的叶酸吸收峰峰值已经远低于S-FA的吸收峰峰值(a)，这说明超滤管中的滤出液为FA溶液，超滤到第五次时，溶液中已经几乎没有FA分子。而相同浓度的纯化后的S-FA与四面体DNA的吸收峰相比，S-FA同时具备S-tetra和FA的特征吸收峰(b)，说明实验条件下FA与四面体纳米结构已成功连接，也说明我们成功的制备了本实验中设计的基于DNA四面体结构的S-FA探针。
实施例3
为了进一步表征S-FA和S-FA/FR的连接情况，我们用8％活性聚丙烯酰氨凝胶电泳对经各级修饰后的DNA四面体进行了表征。电泳缓冲液为1×TBE。用80V电泳，电泳时间约为2小时。电泳后的凝胶用GelRed染色20min。然后在凝胶成像仪中拍照成像。电泳图如图3所示，从左到右依次为DNA单链(A)、S-FA/FR(B)、S-FA(C)、S-tetra(D)以及第五次的滤液(E)。从图3中可以看出，DNA四面体的电泳条带要明显高于DNA单链的电泳条带，这说明DNA四面体纳米结构已成功形成。而S-FA的条带略高于DNA四面体的条带，并且S-FA-FR的条带高于S-FA。这是由于S-FA是在DNA四面体纳米结构的基础上修饰了一个FA分子，而FA的相对分子量远小于DNA四面体的相对分子量，FA分子对DNA四面体的相对分子量几乎没有任何影响，因此S-FA在聚丙烯酰氨凝胶中的迁移率只是稍微略低于DNA四面体，电泳条带几乎没有差距。而S-FA/FR是在S-FA的基础上修饰了FR，由于FR的相对分子量较大，因此在聚丙烯酰氨凝胶中S-FA/FR的迁移率要低于S-FA的迁移率。这说明FR已经通过FA成功地修饰在了DNA四面体结构上。而滤液的电泳图上没有任何条带，说明我们在对制备的探针S-FA进行超滤时，的确只有游离的、多余的FA被过滤出，说明了我们对探针进行超滤的策略是有效的。
实施例4
为了进一步表征S-FA和S-FA/FR的连接情况，我们用8％活性聚丙烯酰氨凝胶电泳对经各级修饰后的DNA四面体进行了表征。电泳缓冲液为1×TBE。用80V电泳，电泳时间约为2小时。电泳后的凝胶用GelRed染色20min。然后在凝胶成像仪中拍照成像。电泳图如图3所示，从左到右依次为DNA单链(A)、S-FA/FR(B)、S-FA(C)、S-tetra(D)以及第五次的滤液(E)。从图中可以看出，DNA四面体的电泳条带要明显高于DNA单链的电泳条带，这说明DNA四面体纳米结构已成功形成。而S-FA的条带略高于DNA四面体的条带，并且S-FA-FR的条带高于S-FA。这是由于S-FA是在DNA四面体纳米结构的基础上修饰了一个FA分子，而FA的相对分子量远小于DNA四面体的相对分子量，FA分子对DNA四面体的相对分子量几乎没有任何影响，因此S-FA在聚丙烯酰氨凝胶中的迁移率只是稍微略低于DNA四面体，电泳条带几乎没有差距。而S-FA/FR是在S-FA的基础上修饰了FR，由于FR的相对分子量较大，因此在聚丙烯酰氨凝胶中S-FA/FR的迁移率要低于S-FA的迁移率。这说明FR已经通过FA成功地修饰在了DNA四面体结构上。而滤液的电泳图上没有任何条带，说明我们在对制备的探针S-FA进行超滤时，的确只有游离的、多余的FA被过滤出，说明了我们对探针进行超滤的策略是有效的。
为了分析对电极表面每一步修饰后的情况进行分析，在含有浓度为5mM的[Fe(CN)6]3/4-和0.1mol/LKCl的电解质溶液中，我们采用了电化学的循环伏安法(CV)和电化学阻抗图谱法(EIS)对酶生物传感器的制备过程进行了表征，以证明我们的基于DNA四面体纳米结构酶的电化学传感器已经成功组装(图4和图5)。图4显示了在DNA四面体结构探针修饰、与目标检测物的连接、四面体信号探针修饰以及HRP标记前后，金电极表面上的活性离子对[Fe(CN)6]3-/4-的循环伏安行为。对于裸金电极(a)，有一对氧化还原峰在0.3V(阳极，Epa)和0.37V(阴极，Epc)，其峰电位差ΔEp为0.07V，这是由于[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原反应。通过巯基(-SH)在金电极表面修饰了DNA四面体结构探针S-FA后(b)，电极的氧化还原峰电流值显著降低，并且ΔEp显著增加，这说明巯基基团与金电极表面的结合阻碍了金表面与电解池中溶液的界面电子传递，也说明四面体结构的探针被成功固定在金电极表面。然而在金电极表面上进一步修饰上待检测的FR后，形成S-FA/FR结构(c)，与只修饰了DNA四面体探针的金电极相比，CV曲线几乎没有变化，这可能是由于DNA四面体纳米结构的内部孔隙空间使得电极表面可以被小分子/离子(例如[Fe(CN)6]3-/4-)接触到。这一结果与报道的DNA四面体具有机械刚性和结构稳定性相一致，这使得位于DNA四面体顶部的探针“直立”，排列有序，方向一致，可以减少表面效应、增强生物分子识别，并允许酶扩增增加检测信号。而在进一步修饰上DNA四面体信号放大探针B-FA后，形成S-FA/FR/B-FA结构(d)，与之前相比，氧化还原峰电流值进一步降低，这说明DNA四面体信号探针已成功的被修饰到电极上。将制备好的电极再与avidin-HRP孵化15min后形成S-FA/FR/B-FA/HRP(e)，与(d)相比，CV曲线几乎没有变化，这也与之前的结论相印证
这些结论都得到了EIS分析的证实，图4为各级电极修饰后的尼奎斯特图。阻抗谱由高频的半圆形部分和低频的线性部分组成，半圆是电子转移受限的过程，而线性部分是扩散受限的过程。半圆直径的变化反映了界面电子转移电阻的变化。裸金电极的阻抗谱(a)表现出一种几乎没有半圆区域且近乎直线的特点，这表明界面电荷转移电阻很小。当带有巯基的DNA四面体结构探针S-FA固定到电极表面后(b)，在高频区出现了一个半圆区域，表明界面电子转移电阻增大。其原因是带负电荷的四面体DNA结构有效地排斥了溶液中的带负电荷的氧化还原离子[Fe(CN)6]3/4-，增强了电荷转移电阻。之后在修饰上待检测蛋白FR后，形成S-FA/FR结构(c)，尼奎斯特图几乎没有变化，这与循环伏安法获得的结果是一致的。其次，在进一步修饰上DNA四面体信号放大探针B-FA后，形成S-FA/FR/B-FA结构(d)，半圆部分直径增大，以及之后与avidin-HRP孵化15min形成的S-FA/FR/B-FA/HRP结构(e)的半圆直径变化，均与之前的CV曲线变化情况一致，进一步证明了每一步的电极都已成功修饰。
实施例5
利用构建的电化学酶生物传感器对FR进行了不同浓度的检测，其结果如图6所示，电流强度随FR的浓度增加而增加并在100-400ng/ml的浓度范围内呈现出线性增加，其线性方程为Y＝0.0728X+62(R2＝0.99)，S/N≥3。
因此我们成功构建了一种基于双DNA四面体纳米结构的生物传感器来检测FR。利用DNA四面体纳米结构的四个顶点作为生物活性位点，分别修饰上有关的生物基团以达到生物检测的目的。在结构探针S-FA的三个顶点上修饰-SH，使得S-FA探针通过形成Au-S键稳定地装载到金电极，从而达到解决电极界面均质化问题，克服界面束缚效应，降低反应自由能的目的。在信号放大器B-FA的三个顶点上修饰了-biotin基团以与avidin-HRP通过生物素-亲和素效应相连接，从而达到进一步放大电信号的作用。利用构建的电化学酶生物传感器来检测FR，其最低检测限为100ng/ml，并在100-400ng/ml的浓度范围内呈现出线性增加。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

Claims (7)

1.一种生物传感器，其特征在于，其为基于双DNA四面体纳米结构的生物传感器，所述生物传感器包括探针和修饰电极；
所述探针包括带有叶酸的DNA四面体靶向探针和带有叶酸的DNA四面体信号放大探针，所述带有叶酸的DNA四面体靶向探针的制备方法包括：
S1：将A、S-B、S-C以及S-D四条DNA单链、TCEP以及10×PBS缓冲液混匀；
S2：在梯度PCR仪中90-100°C加热2-4min后，在20-40s内迅速降温至3-5°C并保持30s以上，得到四面体探针；
S3：将四面体探针与经EDC和NHS活化后的叶酸等体积混合均匀后，置于温度控制和混匀器中，37°C，300rpm反应1-3h，得到带有叶酸的DNA四面体靶向探针；
所述单链A、S-B、S-C以及S-D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4；
所述带有叶酸的DNA四面体信号放大探针的制备方法包括：
S1：将A、B-B、B-C以及B-D四条DNA单链、TCEP以及10×PBS缓冲液混匀；
S2：在梯度PCR仪中90-100°C加热2-4min后，在20-40s内迅速降温至3-5°C并保持30s以上，得到四面体探针；
S3：将四面体探针与经EDC和NHS活化后的叶酸等体积混合均匀后，置于温度控制和混匀器中，37°C，300rpm反应1-3h，得到带有叶酸的DNA四面体信号放大探针；
所述单链A、B-B、B-C以及B-D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7，所述SEQ ID NO：5为Biotin-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；所述SEQ ID NO：6为Biotin-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；所述SEQ ID NO：7为Biotin-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述修饰电极的制备方法包括：
a.依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末的水溶液在抛光布上打磨金电极，再用去离子水、乙醇超声处理；
b.将金电极用去离子水冲洗，然后依次在0.5M、0.1M H2SO4 /0.01M KCl溶液中进行电化学清洗；
c.将金电极置于H2SO4溶液中进行活化；
d.将活化后的电极用N2干燥，滴加带有叶酸的DNA四面体靶向探针，室温避光孵育过夜，得到带有叶酸的DNA四面体靶向探针修饰的工作电极。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，步骤a中用去离子水、乙醇超声处理3min。
4.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，步骤c中将金电极置于0.05M的H2SO4溶液中进行活化。
5.利用权利要求1-4任一项所述的生物传感器进行叶酸受体非诊断检测的方法，其特征在于，包括：
（1）在修饰了带有叶酸的DNA四面体靶向探针的电极上滴加叶酸受体溶液，37°C避光孵育1-3h；
（2）滴加带有叶酸的DNA四面体信号放大探针，37°C避光孵育1-3h；
（3）取1%BSA稀释的avidin-HRP滴加到电极表面，避光常温孵育10-20min；
（4）以TMB为底液对电极进行循环伏安和时间-电流扫描，通过电流的变化来表征叶酸受体浓度的变化。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每一步结束时用1×PBS缓冲液对电极进行冲洗，在下一步开始之前用N2对电极进行干燥。
7.根据权利要求1-4任一项所述的生物传感器在叶酸受体非诊断检测中的应用。
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