CN104263725A - 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)及其制备方法和在电化学检测端粒酶活性中的应用。本发明所述的STTS由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探针SC-DNA组成。本发明还公开了所述STTS电化学检测端粒酶活性的方法及其在检测细胞中端粒酶活性的应用。采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测的信号信噪比高于普通TSP检测2倍以上，灵敏度高，特异性强，应用范围广。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针及其制备方法和在电化学检测端粒酶活性中的应用。
背景技术
端粒是一段位于真核细胞内染色体末端的DNA重复片断，它可维持染色体的稳定性和完整性。端粒由端粒DNA和端粒相关蛋白组成，是位于真核细胞染色体末端的特殊结构。端粒酶是由RNA亚基(human telomerase RNA，hTR)和具有逆转录酶活性的端粒酶催化亚基(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)及端粒酶相关蛋白(telomere associated protein，TEP)三部分组成的蛋白质复合物。端粒酶是一种逆转录酶，它以自身的RNA为模板特异性地合成染色体3’末端端粒DNA重复序列，以延长端粒长度，填补复制过程中新合成链5’端留下的缺口，弥补了DNA聚合酶不能从头合成线性DNA-5’端留下的缺隙，从而使DNA的末端完整复制。端粒酶的功能主要在于维持端粒的长度和稳定性。除此之外，端粒酶在防止染色体相互融合、重组及一些连接酶、外切酶和其它DNA损伤因子方面起到重要作用。
端粒酶在细胞衰老过程中的作用主要有两个方面：一方面，由于大多数正常的人体细胞中都没有端粒酶活性，因此，端粒的长度将随着细胞的分裂逐渐缩短，使得细胞最终走向衰老；另一方面，当端粒酶被激活，可以阻止端粒进一步缩短，增加细胞的传代次数。端粒酶的表达会间接影响细胞的衰老，直接影响细胞走向衰老的是端粒长度的缩短。研究发现，85％～95％的肿瘤细胞中都可以检测到端粒酶活性，如乳腺癌，结肠癌，淋巴癌，肺癌，卵巢癌，急性白血病等等，都可以检测到端粒酶活性。于是，人们就将端粒酶作为一种判断肿瘤细胞的标识物。
端粒重复扩增法(TRAP)是目前测定端粒酶活性主要方法，该方法是由Kim等于1994年建立的。TRAP的反应原理是在同一反应体系中，分别由端粒酶和Taq DNA聚合酶介导两步反应：第一步为引物片段的延伸反应：TS引物的3’末端在端粒酶作用下，延伸数目不等的端粒重复序列TTAGGG；第二步为端粒重复序列的PCR扩增：以TS和CX为一对引物，通过PCR扩增端粒酶合成的端粒DNA，放大信号，使得检测灵敏度大大提高。TRAP方法使得所需标本大大减少至微少，敏感性提高103倍以上，可检出10个以下的细胞，适合于大量检测。该方法的建立使得成批、稳定、快速分析组织的端粒酶活性成为可能，极大地促进了端粒和端粒酶的研究。由于TRAP方法存在一些缺点，为了降低和避免该方法的不足，人们对其进行了改进：1)加内对照的TRAP法；2)端粒酶重复序列扩增-闪烁亲近法(TRAP-SPA)；3)TRAP-银染法；4)荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法；5)TRAP-ELISA法；6)杂交保护法(Hybridization protection assay，HPA)；7)转录介导的扩增/杂交保护法(Transcription-mediated amplification andhybridization protection assay，TMA/HPA)；8)实时定量荧光PCR法等。
尽管TRAP方法已应用于端粒酶活性检测，但其耗时长和抗细胞杂质干扰力差以及试剂仪器昂贵等缺点仍困扰研究人员。目前，检测端粒酶活性还有一些非PCR方法，例如比色法、荧光法、化学发光法、表面等离子体共振法、石英晶体微量天平法和电化学法等。其中，电化学传感器被认为是最有希望实现床边检测(point-of-care tests，POCTs)的器件，目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在(如基于电化学原理的家用血糖仪)(Nat.Protoc.，2007.2，2888-2895；Nature Chemistry，2011.3，697-703)。目前已报道的电化学传感器检测端粒酶方法是基于G-rich tetraplex DNA binder(Anal.Chem.，2005.77(22):7304-7309.)，bio-barcode(Biosens.Bioelectron.，2010，25(11):2543-2547)，alkaline phosphatase label(Biosens.Bioelectron.，2004，20(5):1011-1021)和guanine oxidation signals(Anal.Chem.，2007，79(22):8807-8811.)等方法。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制，需要进行电活性标记或操作步骤比较复杂，并且灵敏度都不高。因此，在通常的端粒酶检测实验中很难控制TS primer的方向和密度，端粒酶的活性也常因为表面拥挤效应而降低。
DNA三维纳米结构DNA tetrahedral-structured probe(TSP)，其具有与金电极相连的三个巯基基底顶点和一个悬垂的捕获探针顶点。研究发现，应用TSP结构的电化学传感器在检测可卡因(Anal.Chem.，2011，83(19):7418-7423.)和microRNA(Anal.Chem.，2014，86(5):2285-2288.)时能较好的解决表面拥挤效应等问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有端粒酶检测试验中灵敏度低、端粒酶活性因表面拥挤效应而降低的缺陷，提供一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针及其制备方法，大幅提高端粒酶检测的信噪比和灵敏度，并具有更广的细胞数检测范围。
本发明提供一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，包括DNA四面体基座、所述DNA四面体基座的顶点的DNA双链“塔尖”和端粒酶引物序列；其中，所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探针SC-DNA组成；所述DNA四面体基座由所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D组成；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3’端还依次含有结构域A和结构域B；所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链“塔尖”。
较佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补。
较佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ IDNo.6所示。
较佳地，所述端粒酶引物序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示。
较佳地，所述链探针SC-DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示。
本发明提供一种利用所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测端粒酶活性的检测方法，所述的方法包括以下的步骤：
(1)、通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体基座；所述的一步法合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D配制成探针溶液，在93～97℃加热8～12min后，冷却至2～5℃持续30min以上而得所述DNA四面体基座；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3’端还依次含有结构域A和结构域B；所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链“塔尖”；
(2)、在电化学装置的工作电极的表面添加步骤(1)所得的DNA四面体基座，使所述DNA四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一个顶点延伸出端粒酶引物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极；
(3)、将所述单链探针SC-DNA添加在步骤(2)所得的工作电极上，90～96℃加热8～12min，迅速降温到2～5℃，持续30min以上后，即获得表面修饰有所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针的工作电极；
(4)、将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加到步骤(3)所得的工作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延伸反应溶液包含带基团A修饰的dATP；
(5)、加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤(4)所述的基团A特异性结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤(4)所述的延伸产物上；
(6)、加入步骤(5)所述氧化还原酶催化的反应所需的底物，经所述氧化还原酶催化，产生电化学氧化还原信号，进行电化学检测分析。
本发明步骤(1)为：通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体基座；所述的一步法合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D配制成探针溶液，在93～97℃加热8～12min后，冷却至2～5℃持续30min以上而得所述DNA四面体基座；
其中，DNA四面体基座的一步法合成方法为本领域常规的方法，较佳地，所述一步法合成通过以下步骤实现：取所述1μM单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的溶液各1μL以及500mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)1L和45μL TM缓冲溶液B混合均匀，然后95℃加热10min，迅速降温到4℃，4℃持续30min以上，即得终浓度为1M的所述DNA四面体基座；所述TM缓冲溶液B包括20mM Tris，50mM MgCl2，调节至pH8.0。所述步骤(1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D用本领域常规的缓冲液配制；较佳地，所述步骤(1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D用含有0.1M～0.2M NaCl的缓冲液配制；更佳地，使用TE缓冲溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)配制。所述步骤(1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的摩尔浓度比为本领域常规的摩尔浓度比，较佳地，所述步骤(1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的摩尔浓度比为1:1:1:1；更佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的浓度都为1M。所述步骤(1)中一步法合成的加热和降温的条件为本领域常规的条件，较佳地，所述步骤(1)中一步法合成使用控温仪控制95℃加热10min，迅速降温到4℃，持续30min以上；更佳地，所述的一步法合成TSP探针使用PCR仪。
本发明步骤(2)为：在电化学装置的工作电极的表面添加步骤(1)所得的DNA四面体基座，使所述DNA四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一个顶点延伸出端粒酶引物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极；
其中：步骤(2)中所述的电化学装置为本领域常规的电化学装置，较佳地，电化学装置是金传感器芯片(SC1000-16X，GENE fluidics)的金电极。步骤(2)中所述的电化学装置与所述的DNA四面体结构探针的连接的方法和条件为本领域常规，较佳地，步骤(2)中所述的DNA四面体结构探针的三个顶点连接到所述电化学装置的工作电极表面，可以通过共价自组装连接；更佳地，使用所述DNA四面体探针的三个顶点的巯基和金通过金硫键连接。较佳地，步骤(2)中，将3μL的1μΜ含所述DNA四面体基座的溶液滴加到金电极表面15℃～35℃条件下反应过夜。
本发明步骤(4)为：将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加到步骤(3)所得的工作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延伸反应溶液包含带基团A修饰的dATP；
其中，步骤(4)中所述待检测端粒酶样本溶液的端粒酶来源于本领域常规的细胞，较佳地，来自于干细胞和/或癌细胞。所述待测端粒酶样本溶液的配制方法为本领域常规的配制方法，较佳地，为如下的步骤：收集并计数1.0×101～1.0×106个待测细胞，用胰蛋白酶消化4～6min，使其从培养基基底上脱落，再将待测细胞转移至离心管中，用PBS(10mM PB，0.3M NaCl，pH7.4)洗涤，1200～1800rpm，4℃离心2～4min，小心弃去上层清液，然后加入CHAPS裂解液(0.5％CHAPS，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，5mMβ-巯基乙醇，0.1mM PMSF，10％丙三醇)，在冰浴上孵育25～35min，其间用移液枪反复抽取，然后离心，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80℃冰箱中备用，每次实验根据实验要求，计数不同数量的细胞进行端粒酶提取获得相应浓度值的端粒酶提取液；更佳地，首先，计数并收集1.0×106个待测细胞，用胰蛋白酶消化5min，使其从基底上脱落，再将待测细胞转移至1.5mL的离心管中，用PBS(10mM PBS，0.3M NaCl，pH7.4)洗涤三次，用1500rpm，4℃离心3min，小心弃去上层清液，然后加入200μLCHAPS裂解液(0.5％CHAPS，10mMTris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，5mMβ-巯基乙醇，0.1mM PMSF，10％丙三醇)，在冰浴上孵育30min，其间用移液枪反复抽取三次，然后用12000rpm，4℃离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80℃冰箱中备用。步骤(4)中所述端粒酶延伸反应溶液为本领域常规的端粒酶延伸反应溶液；较佳地，所述端粒酶延伸反应溶液包括20mM Tris-HC1，pH8.3，1.5mM MgC12，1mM EGTA，63mM KCl，0.05％Tween20，0.2mM biotin-dATP，0.2mM dGTP，0.2mM dTTP。
步骤(4)中所述端粒酶延伸反应的延伸时间为本领域常规的时间，较佳地，为2～3小时；更佳地，为3小时。对于应用STTS电化学检测端粒酶活性，端粒酶延伸反应3小时是实验摸索得到的最佳的端粒酶延伸反应时间：一般来说，如端粒酶延伸反应时间太短则不能反应充分，如太长则浪费检测时间降低工作效率，因为反应后期扩增信号饱和，不再增长。步骤(4)中所述端粒酶延伸反应的温度为本领域常规的温度，较佳地，为28℃～35℃；更佳地，为30℃。步骤(4)中所述端粒酶延伸反应后为本领域常规的反应后处理，较佳地，电极用0.01M PBS冲洗，更佳地，电极冲洗后用惰性气体吹干；最佳地，所述惰性气体为氮气。步骤(4)中将所述的基团A为本领域常规的可以特异性结合的基团，较佳地，步骤(4)中所述的基团A为地高辛或生物素。步骤(4)待检测端粒酶样本溶液的端粒酶的来源为本领域常规，较佳地，是从正常细胞、干细胞和/或癌细胞中提取而得。
本发明步骤(5)为：加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤(4)所述的基团A特异性结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤(4)所述的延伸产物上；
其中：步骤(5)中所述的基团B为本领域常规的可以特异性结合的基团，较佳地，步骤(5)中所述的基团B为抗地高辛分子或抗生物素分子。步骤(5)中所述的氧化还原酶为本领域常规的氧化还原酶，较佳地，步骤(5)中所述氧化还原反应酶选自辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的一种或多种，但不限于此；更佳地，是抗生物素蛋白(avidin)修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)。
本发明步骤(6)为：加入步骤(5)所述基团B-氧化还原酶催化的反应所需的底物，经所述基团B-氧化还原酶催化，进行电化学检测分析；
其中：步骤(6)中所述加入反应所需的底物为本领域常规的底物，较佳地，为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、2，2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)、变色酸2R(CT2R)或双氧水的任一种，但不限于此。步骤(6)中所述基团B-氧化还原酶为本领域常规的氧化还原酶，较佳地，是抗生物素蛋白修饰的辣根过氧化物酶。步骤(6)中所述的电化学检测分析为本领域常规的电化学检测分析方法，较佳的是使用TMB作为底物进行检测。
采用所述的方法进行电化学检测后，根据测得的电流的值的大小，可以根据所述待测端粒酶阳性细胞的电流曲线图，拟合出曲线相应的阳性细胞数目与电流大小值之间的数学公式(公式电流I-细胞数目N)，一般而言，待测样品中端粒酶阳性细胞数目N越大，所含有的端粒酶的活性越大，相应的，测得的电流的值越大。因此对于电化学生物传感器而言，只要确定了电信号与细胞数之间的关系，就可以通过电信号来确定出待测样本中端粒酶活性的大小(Anal.Chem.2005.77(22):7304-7309；Biosens.Bioelectron.2010.25(11):2543-2547；Biosens.Bioelectron.2004.20(5):1011-1021.)。
较佳地，在所述步骤(1)～(6)的任意一步完成后，可以用洗液洗去反应体系中的游离物，所述的洗液为0.1M～0.2M NaCl的低盐浓度的洗液，更佳地，所述的洗液为0.01M PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4)；较佳的，所述洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10～20s。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：1.双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)，无需其他辅助分子(如巯基己醇等)维持DNA探针在界面上的形态、取向。抗蛋白质吸附表面，既可以抵抗非特异性吸附，又非常适合用于酶放大检测体系，提高了生物传感器的性能。2.采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测的信号信噪比高于普通TSP检测2倍以上。3.采用STTS方法，灵敏度高，计算得到的最低检出限低于10个Hela细胞的端粒酶活性。4.采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测动态范围广泛，可以横跨4个数量级(10～10000)可以满足不同要求的端粒酶活性检测。5.采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测实用性强，应用范围广，可以检测多种癌细胞和干细胞等端粒酶活性高的细胞，也可以检测正常的端粒酶活性低的细胞。
附图说明
图1为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针的构建及其电化学检测端粒酶活性的流程图。
图2为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针、没有四面体结构的单链三维DNA纳米结构探针和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针检测端粒酶活性电流信号对比图。
图3为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测Hela细胞的端粒酶延伸反应中不同延伸时间的电流信号图。
图4为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测不同数量的Hela细胞的端粒酶活性的时间-电流(i-t)曲线图和检测数目的工作曲线。
图5为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测癌细胞、干细胞和正常细胞端粒酶活性的电流信号图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的室温指常规的操作间的温度，一般为15～30℃。
实施例1
1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)、没有四面体结构的单链DNA探针(ssP)和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针(TSP)的构建。
实验材料：
STTS：STTS-A(93bp，分子量28012.0，ssDNA)、TSP-B(55bp，分子量17018.0，5'端修饰巯基ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量16898.0，5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D(55bp，分子量16877.0，5'端修饰巯基ssDNA)和互补链Spire-Complementary DNA(SC-DNA，20bp，分子量6176.0，ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6和SEQ ID No.7所示。
ssP：即ss-primer(28bp，分子量8449.0，5'端修饰巯基ssDNA)，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
TSP：TSP-A(83bp，分子量25074.0，ssDNA)、TSP-B(55bp，分子量17018.0，5'端修饰巯基ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量16898.0，5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D(55bp，分子量16877.0，5'端修饰巯基ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。
如序列表中SEQ ID No.1～7所示的单链DNA均由life technology生物有限公司合成。
实验步骤：
取金电极芯片(SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡1min，然后用超纯水超声10s，然后用N2吹干，备用。
一个金电极芯片上有16个金电极，在三个完全相同的电极上分别进行下述STTS、ssP和TSP的构建。
STTS：取等量的四条单链DNA：STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D，用TM buffer(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，形成终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液。取终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50μL，95℃反应10min后，立即降温到4℃，持续30min以上，即得1μM的STTS溶液。将3μL STTS溶液加在金电极表面，室温孵育过夜，洗液(所述的洗液为0.01M PBS；0.01M PBS包括137mMNaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4调节至pH7.4；洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10～20秒)冲洗掉未结合的DNA，再加1μMSC-DNA37℃孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
ssP：取ssP，用TM buffer(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，形成终浓度均为1μM的ssP溶液。将1μM ssP溶液加在金电极表面，室温孵育过夜，将ssP固定到电极表面，洗液冲洗掉未结合的DNA，加2mM6-巯基己醇(MCH)室温封闭1小时，对金电极空白位点进行占位封闭。
TSP：取等量的TSP-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D四条单链DNA，用TM buffer(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，使其终浓度均为1μM，体积50μL。上述溶液95℃反应10min后，立即降温到4℃，持续30min以上，即得TSP溶液。取3μL TSP溶液滴加在金电极表面，室温孵育过夜，洗液冲洗掉未结合的DNA，将TSP固定到电极表面。
2电化学检测端粒酶活性
2.1端粒酶延伸反应
端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数1.0×106个Hela细胞，用胰蛋白酶消化5min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至1.5mL的离心管中，用PBS(10mM PBS，0.3M NaCl，pH7.4)洗涤三次，用1500rpm，4℃离心3min，小心弃去上层清液，然后加入200μL CHAPS裂解液(0.5％CHAPS，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，5mMβ-巯基乙醇，0.1mM PMSF，10％丙三醇)，在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反复抽取三次，然后用12000rpm，4℃离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80℃冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/μL。
将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液(20mM Tris-HC1，pH8.3，1.5mMMgC12，1mM EGTA，63mM KCl，0.05％吐温20，0.2mM biotin-dATP，0.2mMdGTP，0.2mM dTTP)混合，4μL端粒酶提取液加入6μL延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS、ssP和TSP的电极上，30℃延伸反应2小时。
反应后用0.01M PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)冲洗电极并用N2吹干，滴加3μL0.5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，室温反应45min。制备好的电极最后用0.01M PBS冲洗，备用于电化学测试。
2.2电化学检测
实验材料：
avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用100mM PBS稀释成0.5U/mL avidin-HRP。3，3'，5，5'-四甲基联苯胺水溶液(TMB)购于Neogen公司，已配有双氧水的K-blue高活性底物购自Neogen。
所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用RNase-free水配制。RNase-free水用0.1％DEPC处理MilliQ水(18MΩ·cm，Millipore)得到。
实验步骤：
将步骤2.1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50μL TMB(已含有双氧水)底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidics，Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测量的电位为-200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
STTS的构建过程和电化学检测端粒酶活性的过程可以参见图1。
实验结果：
图2显示了双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)、没有四面体结构的单链DNA探针(ssP)和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针(TSP)检测端粒酶活性的电流信号对比图。从图2可以看出，当使用ssP时，能够观察到只用单链ssP检测5000个Hela细胞的端粒酶活性信噪比很低，这说明了尽管具有TS primer序列(因为ssP的单链中含有TS primer)，但单链DNA的探针与金电极表面距离太近，并且表面密度可控性差，不易与端粒酶的结合并进行延伸反应；用具有单层四面体结构的TSP检测5000Hela细胞的端粒酶活性信噪比变大，说明四面体结构有助于端粒酶的结合和延伸反应；用STTS检测时，仅3000个Hela细胞信噪比就大约为TSP检测5000个Hela细胞信噪比的两倍多：STTS检测3000个Hela细胞的信噪比为15.89，而TSP检测5000个Hela细胞的信噪比仅为7.37。说明刚性的塔尖结构增加了TS primer与金电极之间的距离(估算增加距离为6.8nm)，有助于端粒酶的结合和延伸反应，且由于四面体的厚度增加可以降低表面效应而又不牺牲电化学反应活性，对开发高灵敏度端粒酶活性检测传感器十分有利。
加入含有端粒酶活性的细胞提取液时，端粒酶会同TS primer结合并延伸，由于我们用生物素修饰的dATP代替了正常的dATP，所以延伸产物中掺入了生物素修饰的dATP，它可以与avidin-HRP特异性的结合,使得avidin–HRP连接到电极表面。TMB就像电子穿梭机一样进出HRP酶的氧化还原活性中心，同时被H2O2在电极表面大量催化还原，使得催化电流迅速增加形成一个明显增大的电催化峰。稳态时间电流法可以更加直接的表征HRP酶催化的电化学过程。当初始电位保持在-200mV(相对于Au参比电极)时，可以观察到电流随时间变化曲线关系很快电流就会达到平衡状态，在60s左右已经达到稳态电流。对应典型的HRP酶电催化过程的出现，还原峰电流明显增加，形成了一对非对称的氧化还原峰。这一现象说明了端粒酶与双链塔尖四面体DNA纳米结构探针结合并进行端粒酶延伸反应的产物已经结合到电极表面。
实施例2
1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)的构建
实验材料：
STTS-A(93bp，分子量28012.0，ssDNA)、TSP-B(55bp，分子量17018.0，5'端修饰巯基ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量16898.0，5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D(55bp，分子量16877.0，5'端修饰巯基ssDNA)和互补链Spire-Complementary DNA(SC-DNA，20bp，分子量6176.0，ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7所示。
如序列表中SEQ ID No.1、4～7所示的单链DNA均由life technology生物有限公司合成。
实验步骤：
取金电极芯片(SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡1min，然后用超纯水超声10s，然后用N2吹干，备用。一个金电极芯片上有16个金电极，在任一电极上进行所述STTS的构建。
取等量的四条单链DNA：STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D，用TM buffer(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，形成终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液。取终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50μL，97℃反应8min后，立即降温到2℃，持续30min以上，即得1μM的STTS溶液。将3μL STTS溶液加在金电极表面，室温(15℃)孵育过夜，洗液(所述的洗液为0.01M PBS；0.01M PBS包括137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4调节至pH7.4；洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10～20秒)冲洗掉未结合的DNA，再加1μM SC-DNA37℃孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
2电化学检测端粒酶活性
2.1端粒酶延伸反应
端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数1.0×106个Hela细胞，用胰蛋白酶消化4min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至1.5mL的离心管中，用PBS(10mM PBS，0.3M NaCl，pH7.4)洗涤三次，用1200rpm，4℃离心4min，小心弃去上层清液，然后加入200μL CHAPS裂解液(0.5％CHAPS，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，5mMβ-巯基乙醇，0.1mM PMSF，10％丙三醇)，在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反复抽取三次，然后用12000rpm，4℃离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80℃冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/μL。
将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液(20mM Tris-HC1，pH8.3，1.5mMMgC12，1mM EGTA，63mM KCl，0.05％吐温20，0.2mM biotin-dATP，0.2mMdGTP，0.2mM dTTP)混合，4μL端粒酶提取液加入6μL延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS的电极上，35℃延伸反应2小时。
反应后用0.01M PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)冲洗电极并用N2吹干，滴加3μL0.5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，室温反应45min。制备好的电极最后用0.01M PBS冲洗，备用于电化学测试。
2.2电化学检测
实验材料：
avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用100mM PBS稀释成0.5U/mL avidin-HRP。3，3'，5，5'-四甲基联苯胺水溶液(TMB)购于Neogen公司，已配有双氧水的K-blue高活性底物购自Neogen。
所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用RNase-free水配制。RNase-free水用0.1％DEPC处理MilliQ水(18MΩ·cm，Millipore)得到。
实验步骤：
将步骤2.1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50μL TMB(已含有双氧水)底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidics，Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测量的电位为-200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
实验结果：
将步骤2.1所得的备用于电化学测试的电极，浸没在50μL已含有双氧水的TMB底物中电化学检测端粒酶活性，观察到明显增加的还原峰电流。
实施例3
1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)的构建
实验材料：
STTS-A(93bp，分子量28012.0，ssDNA)、TSP-B(55bp，分子量17018.0，5'端修饰巯基ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量16898.0，5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D(55bp，分子量16877.0，5'端修饰巯基ssDNA)和互补链Spire-Complementary DNA(SC-DNA，20bp，分子量6176.0，ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7所示。
如序列表中SEQ ID No.1、4～7所示的单链DNA均由life technology生物有限公司合成。
实验步骤：
取金电极芯片(SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡1min，然后用超纯水超声10s，然后用N2吹干，备用。一个金电极芯片上有16个金电极，在任一电极上进行所述STTS的构建。
取等量的四条单链DNA：STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D，用TM buffer(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，形成终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液。取终浓度均为1μM的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50μL，93℃反应12min后，立即降温到5℃，持续30min以上，即得1μM的STTS溶液。将3μL STTS溶液加在金电极表面，室温(35℃)孵育过夜，洗液(所述的洗液为0.01M PBS；0.01M PBS包括137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4调节至pH7.4；洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10～20秒)冲洗掉未结合的DNA，再加1μM SC-DNA37℃孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
2电化学检测端粒酶活性
2.1端粒酶延伸反应
端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数1.0×106个Hela细胞，用胰蛋白酶消化6min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至1.5mL的离心管中，用PBS(10mM PBS，0.3M NaCl，pH7.4)洗涤三次，用1800rpm，4℃离心2min，小心弃去上层清液，然后加入200μL CHAPS裂解液(0.5％CHAPS，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，5mMβ-巯基乙醇，0.1mM PMSF，10％丙三醇)，在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反复抽取三次，然后用12000rpm，4℃离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80℃冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/μL。
将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液(20mM Tris-HC1，pH8.3，1.5mMMgC12，1mM EGTA，63mM KCl，0.05％吐温20，0.2mM biotin-dATP，0.2mMdGTP，0.2mM dTTP)混合，4μL端粒酶提取液加入6μL延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS的电极上，28℃延伸反应3小时。
反应后用0.01M PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)冲洗电极并用N2吹干，滴加3μL0.5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，室温反应45min。制备好的电极最后用0.01M PBS冲洗，备用于电化学测试。
2.2电化学检测
实验材料：
avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用100mM PBS稀释成0.5U/mL avidin-HRP。3，3'，5，5'-四甲基联苯胺水溶液(TMB)购于Neogen公司，已配有双氧水的K-blue高活性底物购自Neogen。
所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用RNase-free水配制。RNase-free水用0.1％DEPC处理MilliQ水(18MΩ·cm，Millipore)得到。
实验步骤：
将步骤2.1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50μL TMB(已含有双氧水)底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidics，Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测量的电位为-200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
实验结果：
将步骤2.1所得的备用于电化学测试的电极，浸没在50μL已含有双氧水的TMB底物中电化学检测端粒酶活性，观察到明显增加的还原峰电流。
实施例4STTS检测Hela细胞端粒酶不同延伸时间的电流信号
STTS的构建以及使用STTS的电化学检测端粒酶活性的方法与实施例1中的实验材料以及实验步骤相同。
6000个Hela细胞(Hela细胞购自ATCC细胞库)的端粒酶延伸时间分别为0min、15min、30min、1hour、2hour、3hour、4hour。
图3为STTS在不同端粒酶延伸时间的电流信号图。结果如图3所示，电化学信号随着延伸时间的增加指数递增，在3hour后信号增长达到平台期，因此，选取3hour作为STTS检测Hela细胞端粒酶活性的最佳延伸时间。
实施例5 STTS检测不同数量Hela细胞端粒酶活性与电流的关系
STTS的构建以及使用STTS的电化学检测端粒酶活性的方法与实施例1中的实验材料以及实验步骤相同。
图4A显示检测50000个Hela细胞有端粒酶活性和端粒酶失活的时间-电流(i-t)曲线图。
从图中可以看出，端粒酶有活性时，电流信号(～1600nA)明显大于端粒酶失活的信号(～86nA)。图4B显示不同Hela细胞数目的时间-电流(i-t)曲线图。从图中可以看出，随着细胞数从少到多依次递增(0，45，90，188，375，750，1500，3000，6000，10000，20000)，电流信号也单向递增。图4C显示0-50000个Hela细胞端粒酶活性检测的工作曲线，其中插入的柱形图显示空白、45个和188个Hela细胞的电流信号图。根据图4C中的曲线拟合公式如下：
其中I表示电流nA，N表示细胞个数。
从图中可以看出，45个Hela细胞的信号(即约90nA)很容易与背景信号(约21nA)区分。将空白的电流信号20nA代入公式中计算得出N<10，所以，细胞数量的检测范围跨度为4个数量级：10个～10000个。
实施例6STTS检测癌细胞和正常细胞的端粒酶活性
STTS的构建以及使用STTS的电化学检测端粒酶活性的方法与实施例1中的实验材料以及实验步骤相同。
图5显示STTS对癌细胞和正常细胞端粒酶活性的分析图。结果如表1和图5所示，发现检测同样数目(6000个细胞)的乳腺癌细胞MCF7(购自ATCC细胞库)、褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12(购自ATCC细胞库)和人宫颈癌细胞Hela(购自ATCC细胞库)的端粒酶活性要明显高于小鼠成纤维细胞NIH/3T3(购自ATCC细胞库)的端粒酶活性。故而，本发明分析法有助于快速灵敏检测多种细胞的端粒酶活性。
表1STTS检测不同细胞的端粒酶活性相对值
| 细胞名称 | I(-nA) | 端粒酶活性相对值 |
| MCF-7 | 745.3±80.6 | 176.8％ |
| PC-12 | 737.0±24.2 | 174.8％ |
| ES-E14TG2a | 439.0±48.5 | 104.1％ |
| HeLa | 421.6±40.4 | 100.0％ |
| NIH/3T3 | 181.8±27.5 | 43.1％ |
| HeLa加热失活 | 86.1±7.5 | 20.4％ |
Claims (10)
1.一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，包括DNA四面体基座、所述DNA四面体基座的顶点的DNA双链“塔尖”和端粒酶引物序列；其中，所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探针SC-DNA组成；所述DNA四面体基座由所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D组成；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3’端还依次含有结构域A和结构域B；所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链“塔尖”。
2.如权利要求1所述的双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，其特征在于，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6所示；所述端粒酶引物序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示；所述链探针SC-DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示。
3.一种利用所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测端粒酶活性的检测方法，所述的方法包括以下的步骤：
(1)、通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体基座；所述的一步法合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D配制成探针溶液，在93～97℃加热8～12min后，冷却至2～5℃持续30min以上而得所述DNA四面体基座；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3’端还依次含有结构域A和结构域B；所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链“塔尖”；
(2)、在电化学装置的工作电极的表面添加步骤(1)所得的DNA四面体基座，使所述DNA四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一个顶点延伸出端粒酶引物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极；
(3)、将所述单链探针SC-DNA添加在步骤(2)所得的工作电极上，90～96℃加热8～12min，迅速降温到2～5℃，持续30min以上后，即获得表面修饰有所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针的工作电极；
(4)、将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加到步骤(3)所得的工作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延伸反应溶液包含带基团A修饰的dATP；
(5)、加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤(4)所述的基团A特异性结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤(4)所述的延伸产物上；
(6)、加入步骤(5)所述氧化还原酶催化的反应所需的底物，经所述氧化还原酶催化，产生电化学氧化还原信号，进行电化学检测分析。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D用TE缓冲溶液配制；或步骤(1)中所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的摩尔浓度比为1:1:1:1；或步骤(1)中所述一步法合成控制95℃加热10min，迅速降温到4℃，持续30 min以上；较佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的浓度都为1μM；较佳地，步骤(1)中所述一步法合成为：取所述1μM单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的溶液各1μL以及500mM的TCEP1L和45μL TM缓冲溶液混合均匀，然后95℃加热10min，迅速降温到4℃，持续30min以上得到终浓度为1M的所述DNA四面体基座。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的工作电极为金电极；或步骤(2)所述的连接是将1μΜ含所述DNA四面体基座的溶液滴加到金电极表面15℃～35℃条件下反应过夜。
6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述端粒酶延伸反应溶液包括20mM Tris-HC1，pH8.3，1.5mM MgC12，1mM EGTA，63mM KCl，0.05％Tween20，0.2mM基团A-dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdTTP；或步骤(4)中所述端粒酶延伸反应的延伸时间为2～3小时，较佳地，为3小时；或步骤(4)中所述端粒酶延伸反应的温度为28℃～35℃，较佳地，为30℃；或步骤(4)中所述端粒酶延伸反应后，电极用0.01M PBS冲洗；较佳的，电极冲洗后用惰性气体吹干；更佳地，所述惰性气体为氮气；较佳地，所述步骤(4)中所述端粒酶延伸反应的温度为30℃；步骤(4)中所述的基团A为地高辛或生物素。
7.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述的基团B为抗地高辛分子或抗生物素分子；或步骤(5)中所述氧化还原反应酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的一种或两种；较佳地，是抗生物素蛋白修饰的辣根过氧化物酶。
8.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(6)中所述加入反应所需的底物选自3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、2，2-连氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸、变色酸2R或双氧水的任一种。
9.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)到步骤(6)的任一步骤完成后，用洗液洗去反应体系中的游离物；或所述的洗液为0.1M～0.2M NaCl；较佳地，所述的洗液为0.01M PBS，所述0.01M PBS包括137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和2mM KH2PO4调节至pH7.4；或所述洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10～20秒。
10.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)待检测端粒酶样本溶液的端粒酶是从正常细胞、干细胞和/或癌细胞中提取而得。
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