CN101336298A - 用于检测端粒酶活性的测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体而言涉及诊断和预后测定的领域，例如用于端粒酶活性相关病症的诊断测定法。更具体地，本发明提供用于测量端粒酶活性的方法和适用于该方法的试剂和试剂盒，所述端粒酶活性是癌症、炎性病症和/或涉及胚胎发生的病症和/或需要干细胞增殖的病症的指标。允许高通量筛选的自动化和部分自动化测定也构成本发明的一部分。本发明还关注治疗方法，所述治疗方法使用通过本测定法鉴定的试剂，或者其中通过所述测定法监测治疗方案。

Description

用于检测端粒酶活性的测定法
技术领域
本发明总体而言涉及诊断和预后测定的领域，例如用于端粒酶活性相关病症的诊断测定法。更具体地，本发明提供用于测量端粒酶活性的方法和适用于该方法的试剂和试剂盒，所述端粒酶活性是癌症、炎性病症和/或涉及胚胎发生的病症和/或需要干细胞增殖的病症的指标。允许高通量筛选的自动化和部分自动化测定也构成本发明的一部分。本发明还关注治疗方法，所述治疗方法使用通过本测定法鉴定的试剂，或者其中通过所述测定法监测治疗方案。
背景技术
本说明书中提到的任何现有技术不被认为并且不应被认为是承认或以任何方式提示该现有技术形成任何国家中公知常识的一部分。
端粒是由串联的富含GT的重复组成的重复DNA序列，以位于染色体DNA 3′端的(TTAGGG)n来代表。由于每次细胞分裂中损失约50到200个端粒序列核苷酸，因此在正常的有丝分裂过程中发生端粒的逐渐损耗，最终导致细胞衰老。端粒通过端粒酶的作用保护染色体不被融合和降解，所述端粒酶是延伸端粒DNA的一种独特的逆转录酶(Shay等，Hum.Mole.Gen.70：667-685，2001)。端粒酶在种系和胚胎组织、炎性细胞、更新组织的增殖细胞以及癌细胞中丰度相对较高。相反，在正常的人类体细胞组织中难以检测到端粒酶活性。端粒酶活性与细胞复制之间的关联提示了端粒酶与癌症的相关性。已经在几乎所有的人肿瘤中发现了端粒酶活性，但是在邻近的正常细胞中则没有(Kim等，Science266：2011-2015，1994)。事实上，端粒酶在约85％的人癌症中被激活(Hiyama等，Cancer Lett.194：221-223，2003)。因此，已经提出端粒酶的上调或再表达(re-expression)可能是负责持续的肿瘤细胞生长的关键性事件。
鉴于端粒酶活性与细胞增殖疾病(包括癌症)的关系，端粒酶活性的检测是有诊断价值的。已经报导了用于定量端粒酶活性的若干种分析方法。最经常使用的测定法是端粒重复扩增方案(Telomeric RepeatAmplification Protocol，TRAP)，它是基于PCR的两阶段测定法。第一阶段中，端粒酶向合成引物的末端添加5′-TTAGGG-3′重复。第二阶段中，使用反向引物扩增延伸的寡核苷酸产物。通过放射自显影成像时，TRAP的阳性测试显示条带阶梯。然后可以定量条带体积(Hess等，Clin.Chem.48：18-24，2002)。TRAP是费时费力、依赖于PCR并对临床样品提取物的抑制敏感。另外，因为PCR扩增步骤中端粒酶产物的对数扩增，所以难以定量端粒酶活性。TRAP测定法对Taq-聚合酶抑制剂的敏感性常导致假阳性和假阴性结果的产生(Weizmann等，Chem.Bio.5：943-948，2004)。
已经开发了用ELISA检测体系代替TRAP测定法中电泳步骤的一种类似的端粒酶测定法。该体系也是PCR依赖性的，尽管ELISA检测方法似乎没有提供优于传统TRAP的明显优点。在消除与TRAP相关的技术问题的努力中，人们开发了用于定量人端粒酶(humenTelomerase，hTR)RNA和人端粒酶逆转录酶(humen telomeraseReverse Transcriptase，hTERT)mRNA的原位杂交测定法。然而，hTR和hTERT表达不一定等同于端粒酶活性(Hess等，2002，上文)。
另一种端粒酶测定法公开于PCT/IL01/00808(WO 02/20838)中。该测定法使用旋转的醌官能化磁珠在测定中产生H2O2。推测H2O2的内源生产克服了鲁米诺(luminol)在水性缓冲溶液中溶解度有限的问题。然而，旋转的磁珠降低了开发高通量筛选方案的能力，并可能影响灵敏度，所述灵敏度取决于所使用寡核苷酸引物的长度。
因此，需要用于检测临床样品中端粒酶活性的可靠、灵敏且成本有效的测定法，所述测定法对癌症、炎性病症和涉及胚胎发生的病症和/或在监测干细胞增殖潜力中具有诊断、预后和治疗价值。本发明的测定法适用于人、哺乳类脊椎动物、非哺乳类脊椎动物和植物。
发明内容
在说明书全文中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”应理解为表示包括所述要素或整数或者要素或整数的集合，但是不排除任何其它要素或整数或者要素或整数的集合。
核苷酸序列由序列识别号(SEQ ID NO)表示。SEQ ID NO在数字上对应于序列识别号<400>1[SEQ ID NO：1]、<400>2[SEQ ID NO：2]等。序列识别号的总结在表1中提供。序列表在权利要求书后提供。
本发明关注细胞中端粒酶活性的测定法，其提供了存在癌细胞以及炎性病症和涉及胚胎发生的病症的诊断和预后指示剂和/或用于监测干细胞增殖潜力的测定法。该测定法还可用于评估用于人的医学治疗方案以及用于筛选调控端粒酶活性或水平的试剂。非哺乳类脊椎动物和植物中的端粒酶活性也可以具有诊断价值或者作为研究工具。就脊椎动物而言，端粒酶活性水平与某些类型细胞(如癌细胞)的存在以及细胞生理学情况或增殖潜力随年龄和/或应答于治疗方案的改变相关。类似地，端粒酶活性的水平或改变提供了关于炎症(包括增殖以及涉及胚胎发生的病症)的信息。该测定法可以是自动化的或半自动化的，以允许高通量筛选。它基于上皮细胞的捕获和裂解来检测端粒酶活性。读出值是发光。与其它端粒酶测定法不同，它不是基于PCR的测定法。
因此，本发明通过将标记掺入端粒酶催化的延伸核苷酸序列中来测定端粒酶活性水平。
因此，本发明的一方面关注用于检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与阴性对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和产生端粒酶的推定细胞数。
就自动化而言，步骤(iii)尤其是鲁米诺、增强剂和/或H2O2的添加可以通过发光读数器自动添加。
本发明的另一方面提供了用于检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中，所述寡核苷酸引物包含序列(XnTTAGGYm)o，其中：
X是选自A、T、G和C的核苷酸；
Y是选自A、T、G和C的核苷酸；
n是0或1；
m是0或1；和
o为约1到约400；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与阴性对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和产生端粒酶的推定细胞数。
一般而言，在脊椎动物中，n为0，Y为G，o为约5到约30。在节肢动物中，n为0，m为0，o为约1到约30。在植物中，X为T，n为1，Y为G，m为1，o为约1到约30。
与阴性对照或已知的数据集相比，端粒酶活性的存在或端粒酶活性的水平指示着具有端粒酶活性的细胞数。这类细胞包括癌细胞、炎性或增殖性细胞或涉及胚胎发生的细胞，包括干细胞。“阴性对照”可显示端粒酶活性的基础水平。该测定法是灵敏的，允许在少至约1个细胞到多于106个细胞(例如从1个到106个细胞)中检测端粒酶活性。
因此，本发明提供了在来自受试者的样品中检测下述细胞的方法，所述细胞选自癌细胞、炎性或增殖性细胞和胚胎发生细胞(包括干细胞)，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与对照(例如不含癌细胞、炎性细胞或胚胎发生细胞的对照)相比或与已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平，由此提供了细胞数。
“受试者”可以是人或其它哺乳动物、非哺乳类脊椎动物或植物或包含端粒酶的其它实体。
如上所述，本发明的测定法可以是自动化的，或作为单个测定或一批测定使用。便利地，添加鲁米诺、增强剂和/或H2O2的步骤是自动化的。因此本发明提供包含进行测定所需的试剂以及使用说明的试剂盒。另外，该测定法可以在多种条件下使用多种标记来进行。另外，该测定法可以是辅助细胞鉴定或监测治疗方案的大量测定(即两个或更多测定)的一部分。
本发明使得能够通过测量信号的程度来定量检测细胞中的端粒酶活性。然而，本发明扩展到本测定法对端粒酶活性存在与否或相对水平提供定量检测的用途。术语如“测定”、“检测”、“诊断”、“预后”和“鉴定”可互换使用，表示定性、半定量和定量地检测细胞或细胞样品中的端粒酶活性。
在一些具体实施方案中，所述端粒酶测定法用于在受试者中检测癌细胞的存在或监测癌症的发展，包括在化学治疗剂存在下监测癌症。在这种情况下，“化学治疗剂”包括化学药剂以及免疫药剂或抗生素药剂。“癌症”在本发明中认为与肿瘤相同。
因此，本发明关注用于在来自受试者的样品中检测癌细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与对照(例如不含癌细胞)相比或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和推定癌细胞的存在或数量。
本发明还扩展至该测定法用于评价细胞毒剂(如抗癌化学治疗剂)的有效性的用途。它也可以用于对癌症患者如白血病患者进行风险分级。
在一个实施方案中，“获得细胞样品”包括收集和部分纯化细胞，或至少去除样品中非必需的组分。本发明的一方面提供了用于选择性纯化肿瘤细胞和将这些细胞从可能的干扰物质中取出的方法。肿瘤细胞的纯化通过将含有该细胞的体液与包被了肿瘤细胞特异抗体的磁珠一起孵育来实现。充分洗涤目的肿瘤细胞从而将其与其它细胞类型、体液基质(例如尿、血)和干扰物质分开。这减少了由测定法干扰引起的假阴性以及由非肿瘤细胞(如感染中可能存在的活化T淋巴细胞)引起的假阳性的可能性。因此，认为样品建立步骤可用于获得高临床灵敏度和特异性值。
因此，本发明的另一方面涉及用于评估细胞毒剂活性的方法，所述方法包括：
i)向癌细胞培养物中添加推定的细胞毒剂；
ii)将带有寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)的磁性颗粒与来自该癌细胞的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足够在NTP和生物素化的UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
iii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iv)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂以及外源的H2O2接触，以产生发光；和
v)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与对照(例如不含细胞毒剂)相比，存在该细胞毒剂时的发光强度水平提供了该试剂的细胞毒性水平。
本发明还关注使用通过本文定义方法所鉴定的细胞毒剂的治疗方法。该治疗方法还可涉及使用本测定法评估临床方案。该方案可以根据端粒酶水平随方案时间如何变化而进行改变。
TBT也可以用于评估衰老以及监测老年受试者中健康的衰退或程度。
所述寡核苷酸引物可以通过任何偶联化学(包括通过巯基、胺和醛偶联化学)而固定在珠子上。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)通过硫氢键固定在珠子上。例如，合适的接头以SEQ ID NO：5代表。
本发明的端粒酶测定法在本文中称作“TBT”或“端粒酶生物传感器技术”。
本发明的方法包括以下前提：端粒酶底物寡核苷酸引物的延伸不是通过PCR进行的。
在本说明书全文中使用的序列识别号的汇总在表1中提供。
表1
序列识别号汇总
  SEQUENCE ID NO： 描述
  1 人端粒酶识别核苷酸序列
  2 与磁珠表面连接的合成间隔区核苷酸序列
  3 组合在一起的与表面连接的间隔区序列及端粒酶识别序列
  4 由端粒酶添加至端粒酶识别序列的重复核苷酸序列
  5 端粒酶的靶序列，具有用于巯基偶联的5″半胱氨酸
  6 人端粒酶的短识别核苷酸序列
  7 人端粒酶的中等识别核苷酸序列
  8 人端粒酶的长识别核苷酸序列
在本说明书全文中使用的缩写的汇总在表2中提供。
表2
缩写
  缩写   描述
  CPG   果胶钙凝胶(Calcium Pectinate Gel)
  HRP   辣根过氧化物酶
  hTERT   端粒酶逆转录酶
  hTR   人端粒酶
  TBT   端粒酶生物传感器技术
  TRAP   端粒重复扩增方案
附图说明
一些附图中含有彩色图表或实体。专利权人处有彩图备索，或彩图可得自适当的专利事务所。如果得自专利事务所的话，可能会发生费用。
图1是显示监测端粒酶靶序列与珠子缀合的方法图示。用于监测寡核苷酸(其适用于通过端粒酶活性延伸)与珠子(其可以通过磁体或其它手段进行收集)缀合的分光光度法。游离的寡核苷酸具有波长260nm左右的峰值吸收，而缀合的寡核苷酸具有343nm附近的峰值吸收。
图2是显示该端粒酶测定法对LIM1215细胞的灵敏度的图示。它显示，从裂解的LIM 1215人结肠癌细胞中释放的端粒酶活性可以通过荧光进行测量，所述荧光是由所掺入的结合了荧光素的核苷酸发射的。如通过使用100到1000个裂解细胞所确定的，线性的检测范围是很明显的。
图3是显示该端粒酶测定法对浅表膀胱癌样品之结果的图示。它显示了从1000个裂解的LIM 1215细胞和收集自下述患者的细胞中释放的端粒酶活性，所述患者患有经病理学确认的浅表膀胱癌。使用EpCAM珠子捕获膀胱癌细胞。使用以热预处理以灭活端粒酶活性(HI)的裂解物进行匹配的反应。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。还显示了链霉亲和素单独产生的低背景信号。
图4是显示该端粒酶测定法对侵袭性膀胱癌样品之结果的图示。它显示了从1000个裂解的LIM 1215细胞和收集自下述患者的细胞中释放的端粒酶活性，所述患者患有经病理学确认的侵袭性膀胱癌。使用EpCAM珠子捕获膀胱癌细胞。使用以热预处理以灭活端粒酶活性(HI)的裂解物进行匹配的反应。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。还显示了链霉亲和素单独产生的低背景信号。
图5是显示分离自粪便样品的细胞中端粒酶活性的图示。这些数据证明了使用EpCAM珠子从粪便样品中分离已知的和预先确定的结肠癌细胞以及随后释放端粒酶活性并使用发光进行测量的能力。
图6是显示本发明一个实施方案中该测定法对HEK293T细胞之灵敏度的图示。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。平均数据来自10个实验，所述实验使用手工测定形式在三种不同的裂解物制备物中在不同天进行。这表明，HEK293T细胞之细胞裂解物原液的端粒酶活性可以有再现性地进行测量。如通过使用20到1250个裂解细胞的等价物所确定的，线性的检测范围是很明显的。
图7是显示根据本发明的一个实施方案该测定法对低水平HEK293T细胞的灵敏度的图示。平均数据来自10个实验，所述实验使用手工测定形式用三种不同的裂解物制备物在不同天进行。这表明，HEK293T细胞之细胞裂解物原液的端粒酶活性可以有再现性地进行测量。线性的检测范围在1到500个裂解细胞的范围很明显。这些数据证实了其使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。这些数据证明TBT测定法在低细胞浓度下是灵敏的。
图8是显示本发明一个实施方案中的TBT测定法的检测下限统计学评价结果的图示。HEK293T之细胞裂解物原液的端粒酶活性使用TBT测定法用3种不同的裂解物制备物在不同天数的10个分开的场合进行测量。虚线表示测定20次的平均背景水平(0CE)以上的1倍(1×SD)和2倍(2×SD)标准差(SD)。在直方图上每个条柱内所示顶部数字是高于背景的确切SD倍数，“n”是用于产生该平均值的个体测定数。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。
图9是显示本发明一个实施方案中TBT测定法的测定内再现性(intra-assay reproducibility)的图示。测量了两种不同浓度的HEK293T肿瘤细胞的端粒酶活性。该TBT测定法中，每个不同浓度(100CE和1000CE)下六个分开测定之间的变异性水平分别为总信号的5.7％和4.9％。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。平均数据(平均值±标准差)来自每个浓度下六个重复样品。
图10是显示本发明一个实施方案的TBT测定法的测定间再现性(inter-assay reproducibility)的图示。在10个分开的场合测量了两种不同浓度的HEK293T肿瘤细胞的端粒酶活性。各个浓度(50CE和5000CE)下测定之间的变异性水平分别为总信号的6.4％和8.8％。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。平均数据(均值±标准误)来自在不同天对每个浓度进行的四个分开的测定。
图11是显示本发明一个实施方案中TBT测定法之酶特异性的图示。端粒酶活性在宽浓度范围的人白血病细胞系TF-1细胞和过表达hTERT(人端粒酶逆转录酶)的TF-1细胞中测定。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。该测定法的特异性通过在过表达hTERT的TF-1细胞中发现的更高端粒酶活性来证明。
图12是显示根据本发明一个实施方案中用于检测尿样中端粒酶活性的TBT测定法之灵敏度的图示。该TBT测试用于在分离自患者尿的细胞中、在0μl到2.5μl裂解物的细胞裂解物浓度中测量端粒酶活性。在来自先前显示阳性TBT结果的三名患者的尿细胞裂解物中测量端粒酶活性，所述三名患者中的两名具有高TBT结果(患者#3和#12)，一名患者具有低TBT结果(患者#31)。这些数据表明，少于1μl的细胞裂解物(代表每个患者样品中肿瘤上皮细胞总数的不到百分之一)就足够产生阳性信号。
图13是显示根据本发明一个实施方案用于检测尿样中端粒酶活性的TBT测定法之灵敏度和特异性的图示。该TBT测试用于在分离自膀胱癌患者(n＝29)和正常受试者(n＝12)尿的细胞中测量端粒酶活性。使用1.5(与无端粒酶对照相比的倍数改变)的“取舍(cut-off)”值时，该测定法具有96.6％的灵敏度和100％的特异性。使用1.2(虚线)的“取舍”阈值时，测定法的灵敏度为100％，假阳性有少量增加。
图14是显示根据本发明一个实施方案用于检测K562人白血病细胞中端粒酶活性的TBT测定法之灵敏度的图示。该TBT测试用于在宽细胞裂解物浓度范围(高至2500CE)中测量端粒酶活性。这些数据证实了使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素与鲁米诺反应而产生发光的端粒酶活性。在白血病细胞的端粒酶活性分析中，TBT测试显示高水平的灵敏度。
图15是显示根据本发明一个实施方案用于检测脐带血干细胞中端粒酶活性的TBT测定法之灵敏度的图示。分离来自三个患者的脐带血的CD34阳性细胞，并对1000个CD34阳性细胞进行该TBT测定法。在所有三个脐带血样品中都检测到了端粒酶活性。
图16是显示HEK293T细胞裂解物中TBT寡核苷酸长度效应的图示。
图17是显示接收器工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线的图示，其显示TBT测试在检测膀胱癌中的诊断能力。
发明详述
本发明提供了针对细胞或细胞样品中端粒酶的灵敏测定法。该测试称为“TBT”或“端粒酶生物传感器技术”。适用于进行该测定法的试剂也组成本发明的一部分。试剂可以是装有该测定法说明书的试剂盒的一部分，或者可以单独提供。端粒酶的检测可以是定量的、半定量的或定性的，它们均涵盖在术语“测定”、“检测”、“诊断”、“预后”和“鉴定”中。该测定法可以是自动化的或半自动化的，以允许快速的高通量筛选。对端粒酶活性的存在(包括端粒酶活性水平)的阐明可用于确定癌细胞或与炎症、增殖和/或胚胎发生相关的细胞的存在情况或相对水平。尽管本发明原则中心在于人，但是该测定法可以在所有的脊椎动物、植物和节肢动物中进行。
关于本发明所使用的方法和试剂，显而易见的是该测定法具有广泛的研究和诊断应用。该测定法是快速、准确的，并适用于单管反应、多重方案、自动化和原位检测。磁珠的使用使得能够以低成本常规临床使用，同时维持高灵敏度和临床可持续性。其它端粒酶测定法是昂贵的，无法适用于高通量筛选并且不能在临床实验室中常规使用。TBT的应用包括但不限于：
i)检测癌症活组织检查中的永生化细胞，用于鉴定可能的癌细胞；
ii)在基于细胞的筛选或无细胞筛选中鉴定能够激活、去阻抑、抑制或阻抑端粒酶的物质，包括永生化物质(例如癌基因)或可激活端粒酶并延长端粒和细胞复制寿命的化合物；
iii)在培养体系中或体内鉴定具有端粒酶活性的干细胞或早期祖细胞；
iv)检查分化和发育期间的端粒酶调节；
v)鉴定在纯化端粒酶时产生的端粒酶阳性级分；
vi)鉴定原生动物或真菌感染；和
vii)诊断特征在于无端粒酶活性的某些类型的不育(infertility)。
TBT是高通量、非常灵敏、不昂贵的，并可以在临床实验室中常规使用。
因此，本发明的一方面关注用于检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与阴性对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性的水平和推定产生端粒酶的细胞数。
在相关的实施方案中，本发明关注于用于检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光，其中所述增强子和H2O2在测量发光强度的机器中自动添加；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与阴性对照或已知数据集合相比的发光强度水平提供了端粒酶活性的水平和推定产生端粒酶的细胞数。
在一个实施方案中，“获得细胞样品”包括收集和部分纯化细胞，或至少去除样品中非必需的成分。本发明一方面提供了用于选择性纯化肿瘤细胞和将这些细胞从可能的干扰物质中取出的方法。肿瘤细胞的纯化通过将含有该细胞的体液与包被有肿瘤细胞特异性抗体的磁珠一起孵育来实现。充分洗涤目的肿瘤细胞从而与其它细胞类型、体液基质(例如尿、血)和干扰物质分离。这减少了由测定法干扰引起假阴性和由非肿瘤细胞(如可存在于感染中的活化T淋巴细胞)引起假阳性的可能性。因此认为样品建立步骤在获得高临床灵敏度和特异性值时是有用的。
例如，将尿与磁珠一起孵育，所述磁珠与选择性捕获上皮细胞的单克隆抗体Ber-EP4(CELLection[商标]Epithelial Enrich Dynabeads)偶联。将附着了肿瘤细胞的珠子洗涤数次并通过添加基于CHAPS的裂解缓冲液实现上皮细胞的裂解。该方法的优点在于其将肿瘤细胞与可能的干扰物质还有活化的淋巴细胞(可能含有升高的端粒酶活性)分离。
样品建立步骤将目的细胞从通常可干扰临床测定法的许多化学品中取出。从血中分离上皮细胞去除了来自血红蛋白、尿中的降解酶或治疗性化合物(例如用于化学疗法或其它治疗的化合物)干扰的任何可能性。
已经证明，活化淋巴细胞的存在对端粒酶活性的其它测定法是有问题的，因为这些细胞能够表达可检测水平的端粒酶活性。TBT测试中的样品建立步骤通过在附着了抗体的磁珠上的选择性捕获而将肿瘤上皮细胞与活化淋巴细胞分离。肿瘤细胞与活化淋巴细胞的分离导致更高的灵敏度和更低的假阳性概率。尽管有用，但这不应被认为是本发明的必要特征。
术语“受试者”包括脊椎动物(如人和非人哺乳动物、非哺乳类脊椎动物)、植物或包含端粒酶的其它实体。
如上所述，对于脊椎动物而言，所述细胞可以是癌细胞或与炎症、增殖或胚胎发生相关的细胞。因此，本发明的另一方面提供了用于在来自受试者的样品中检测下述细胞的方法，所述细胞选自癌细胞、炎性或增殖性细胞以及胚胎发生细胞(包括干细胞)，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与对照(例如不含有癌细胞、炎性细胞或胚胎发生细胞的对照)相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平，从而提供了细胞数。
在一个相关的实施方案中，本发明提供了用于在来自受试者的样品中检测下述细胞的方法，所述细胞选自癌细胞、炎性或增殖性细胞和胚胎发生细胞(包括干细胞)，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光，其中所述增强子和H2O2在测量发光强度的机器中自动添加；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与对照(例如不含有癌细胞、炎性细胞或胚胎发生细胞的对照)相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平，并从而提供了细胞数。
如上所述，术语“癌症”、“肿瘤”和“癌性”在本说明书的通篇可以交换使用，表示任何癌性或恶性病症、癌前病症、骨髓瘤或任何淋巴瘤或恶性病症，或涉及赘生细胞的任何其它增殖性病症。术语“癌症”或“肿瘤”包括乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞瘤、肝癌/胆管癌(cholongio carcinoma)、神经内分泌肿瘤、垂体赘生物(pituitary neoplasm)、小圆细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、间质莱迪希细胞瘤(stromal leydig cell tumors)、塞尔托利细胞瘤(Sertolicell tumors)、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食管肿瘤、喉瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和维尔姆斯瘤(Wilm′s tumor)。
具体癌症的实例包括但不限于腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、adontoma、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性骨髓外化生(agnogenic myeloid metaplasia)、脱发、腺泡状软组织肉瘤(alveolarsoft-part sarcoma)、成釉细胞瘤、血管角质瘤、嗜酸细胞增多性血管淋巴样增生(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia)、血管瘤硬化(angioma sclerosing)、血管瘤病、胺前体摄取脱羧化细胞瘤(apudoma)、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调性毛细血管扩张(ataxia-telangiectasia)、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、鳃原瘤、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、童年期脑肿瘤、童年期癌症、童年期白血病、童年期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、癌(例如Walker、基底细胞癌、基底鳞状细胞(basosquamous)癌、Brown-Pearce、导管癌、埃利希肿瘤(Ehrlich tumor)、Krebs 2、默克尔细胞(Merkel cell)癌、粘蛋白癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、癌肉瘤、宫颈非典型增生、叶状囊性肉瘤(cystosarcoma phyllodies)、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(desmoplastic-small-round-cell-tumor)、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌症(endocrine cancers)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血症(fanconi anaemia)、纤维瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌肿瘤(gastrointestinal-carcinoid-tumor)、生殖泌尿癌、生殖细胞癌、妊娠性滋养层细胞病(gestational-trophoblastic-disease)、神经胶质瘤、妇科癌症(gynaecological cancers)、巨细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、血管球瘤(glomangioma)、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、血液恶性肿瘤(haematological malignancies)、毛细胞性白血病、头与颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头状瘤病毒、葡萄胎(hydatidiform mole)、高钙血症、咽下部癌症(hypopharynx cancer)、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞病症(histiocytic disorders)、恶性组织细胞增多病(histiocytosis malignant)、组织细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、软骨肉瘤(hondrosarcoma)、小型免疫增生(immunoproliferative small)、opoma、眼内黑素瘤(ontraocular melanoma)、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhan′s-cell-histiocytosis)、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、利-弗综合征(li-fraumeni syndrome)、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤(leigomyosarcoma)、白血病(例如b-细胞白血病、混合性细胞白血病、裸细胞白血病、t-细胞白血病、t-细胞慢性白血病、htlv-ii-相关白血病、淋巴管肉瘤、淋巴细胞急性白血病、淋巴细胞慢性白血病、肥大细胞白血病和髓细胞性白血病)、白血病性肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管细胞瘤(lymphangiocytoma)、淋巴管瘤(lymphagioma)、淋巴管肌瘤(lymphagiomyoma)、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、恶性肾棒状瘤(malignant-rhabdoid-tumor-of-kidney)、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓组织增生病、恶性类癌综合征、类癌心脏病、髓母细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、间叶瘤、中肾瘤、间皮瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征(Nijmegenbreakage syndrome)、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(nsclc)、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、赘生物(例如骨赘生物、乳腺赘生物、消化系统赘生物、结肠直肠赘生物、肝赘生物)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌(ostomy ovarian cancer)、胰腺癌、鼻旁癌(paranasal cancer)、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤(peripheral-neuroectodermal-tumors)、垂体癌、真性红细胞增多(polycythemia vera)、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、神经节细胞瘤、非嗜铬神经节细胞瘤(paraganglioma nonchromaffin)、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见的癌症及相关病症(rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤综合征(Rothmund-Thomson syndrome)、网状内皮组织增殖、横纹肌瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞泽里综合征(Sezarysyndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌(sclc)、小肠癌、软组织肉瘤、脊索瘤、鳞状细胞癌(皮肤)(squamous-cell-carcinoma-(skin))、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(例如尤因实验性肉瘤(Ewing′s experimental sarcomas)、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、塞尔托利细胞瘤、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、畸胎瘤、泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养层细胞瘤、尿道癌、泌尿系统癌、uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、阴门癌(vulva cancer)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s-macroglobulinemia)和维尔姆斯瘤。
TBT是用于对癌症患者进行风险分级(例如好转或癌症扩散的风险)的有用测定法。
炎性或增殖性病症包括与以下相关的细胞：痤疮、咽峡炎、关节炎、吸入性肺炎、疾病、脓胸、胃肠炎、炎症、肠型流感(intestinal flu)、nec(坏死性小肠结肠炎，necrotizing enterocolitis)、骨盆炎性疾病、咽炎、pid、胸膜炎、咽喉炎(raw throat)、发红(redness)、发红(rubor)、咽喉痛(sore throat)、胃型流感(stomach flu)和泌尿道感染、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经瘤、慢性炎性脱髓鞘性多神经病或慢性炎性多神经根神经瘤。
在一个优选的实施方案中，端粒酶活性用于定量、半定量或定性测定癌细胞的存在或水平。提及“癌症”时包括肿瘤和白血病以及癌和肉瘤。
因此，本发明的另一方面提供了在来自受试者的样品中检测癌细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与(例如不含癌细胞的)对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和推定的癌细胞数。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于在来自受试者的样品中检测癌细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光，其中所述增强子和H2O2在测量发光强度的机器中自动添加；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与(例如不含癌细胞的)对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和推定的癌细胞数。
细胞提取物可以通过任何数量的下述手段产生，所述手段包括超声处理、裂解和冻熔法。在一个实施方案中，细胞通过活组织检查收集或在血或组织样品中收集，并使用非离子型洗涤剂和/或两性离子型去污剂裂解。细胞碎片一般通过离心或过滤去除。然后收集上清液并在测定法中使用。合适去污剂的实例包括吐温20、Triton X-100、TritonX-114、Thesit、NP-40、正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽苷、辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-8)、癸酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-10)和异十三烷基聚(乙二醇醚)n，优选的两性离子型去污剂包括CHAPS(3-{(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基}-1-丙磺酸)、CHAPSO(3-{(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基}-2-羟基-1-丙磺酸)、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸和含有CHAPS的毛地黄皂苷。
在一个优选的实施方案中，用CHAPS缓冲液[0.5％(体积/体积)CHAPS、10mM Tris、1mM MgCl2、1mM EGTA和10％(体积/体积)甘油与每10ml 1片蛋白酶抑制剂(Compete Mini，Roche)]裂解细胞。
细胞收集可以通过任何手段实现，且样品中待测定的细胞数可变化。一般每次可测定从约1个细胞到约106或更多的细胞。因此，本发明能够测定从1到1010个细胞，包括5到106个细胞、10到105个细胞等等。尤其有用的细胞数包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个细胞或5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106和107个细胞。测定法的灵敏度可见于图2。在该方法一个尤其便利的方面中，细胞样品不在测定之前稀释，而是取出若干体积的细胞以提供从约1个细胞到106个细胞或更多。
因此，从1到1000个细胞的灵敏度是尤其优选的，例如测量样品中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个细胞。
任何类型的磁性颗粒均可用于本发明测定法的实践中。颗粒一般由Fe3O4、Fe、Co、Ni、其合金以及其它铁磁性材料制成。尽管不希望将本发明限制在任何珠子类型，但是可使用Dynal(商标-DynalInvitrogen Corporation，9099 North Deerbrook Trail，Brown Deer，WI，USA 53223)或Bioclone(San Diego，CA 92126，USA)珠子或CPG果胶酸钙凝胶磁珠(CPG Inc，Lincoln Pk，NJ 07035，USA)。也可以使用LodeStar，基于聚合物的珠子(Polymer Labs，UK和USA)。
端粒酶底物(即寡核苷酸引物)包含以下序列：
(XnTTAGGYm)o
其中：
X选自A、T、G和C；
Y选自A、T、G和C；
n是0或1；
m是0或1；和
o是从约1到约400。
一般而言，在脊椎动物中，n为0，Y为G且o是从约5到约30。在节肢动物中，n为0，m为0，且o从约1到30。在植物中，X为T，n为1，Y为G，m为1且o为从1到约30。
在一个具体的实施方案中，磁珠包含固定在其表面上的人端粒酶靶核苷酸序列[SEQ ID NO：1]。人端粒靶序列为掺入了重复序列(TTAGGG)[SEQ ID NO：4]的5′-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3′[SEQ ID NO：1]。
端粒酶靶序列[SEQ ID NO：1]便利地在其5′端与包含5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′[SEQ IDNO：2]的表面连接间隔区(或锚着)序列[SEQ ID NO：2]融合。
组合的端粒酶识别序列[SEQ ID NO：1]和表面连接间隔区序列[SEQ ID NO：2]被称作间隔区-端粒酶识别序列[SEQ ID NO：3]：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3′[SEQ ID NO：3]。
端粒酶识别序列便利地通过硫氢键固定。例如，合适的接头示于SEQ ID NO：5：
5′SH(SCH2)6-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG[SEQ ID NO：5]。
尽管最优选固定在磁珠上的是人端粒酶识别序列，但是本发明扩展至作为人端粒酶底物的任何非人端粒酶识别序列。非人端粒酶序列的实例包括来自非人灵长类、家畜动物和实验室测试动物(如来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪或猴)的序列。
TBT也可以使用其它固体支持物，包括微型图案化表面(micropatterned surface)、玻璃表面和支持物、石英晶体微量天平支持物(quartz crystal microbalance support)、微阵列、多孔氧化铝支持物、硅石表面支持物、纳米颗粒、图案化聚合物刷(patterned polymerbrush)、聚乙二醇刷、膜。TBT也可以在其它体系上进行，例如纳米颗粒放大的表面等离振子共振(SPR)和BIAcore体系。
本发明在使用生物素标记DNA的方面具体进行了示例。dUTP上的生物素部分掺入端粒酶延伸的序列中。生物素作为下述试剂的特异结合位点，所述试剂在H2O2存在下作为生物催化标记，例如链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)、亲和素-HRP或neutravidin-HRP。
然而，也可以使用其它标记，只要添加外源试剂来使标记显影或用于得到可检测信号即可。因此，可以将例如荧光的、发磷光的、化学发光的或放射性标记掺入所提供的延伸端粒酶识别序列中，为了使得到的信号最大化，添加外源增强剂和/或信号促进剂。备选标记包括但不限于生物素-dUTP、藻红蛋白-dUTP、荧光素-dUTP和[α-32P]-dUTP，包括其所有可能的同分异构体。所述dNTP包括dATP和dGTP。也可以使用基于酶的测定法和化学检测测定法。
因此，该方面关注检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，所述条件足以在dNTP(包括标记的dNTP)存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，因此将该标记掺入延伸的引物中；
ii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并将洗涤过的珠子与信号促进剂接触，以使该标记产生的信号最大化；和
iii)对得到的混合物应用检测手段，以读出信号强度，
其中与对照(例如不包含含有端粒酶的细胞的对照)或已知数据集相比的信号强度水平提供了端粒酶活性水平和推定显示端粒酶的细胞数。
步骤(ii)或其部分便利地自动或半自动进行，例如在读出发光强度的机器中进行。
尽管对照一般是不含有特定细胞提取物的样品，但是它同样可以是不含有端粒酶活性或标记dNTP或测定法操作所需其它成分的样品。对照也可以是细胞数相关的数值的已知数据集。
重要的是注意下述方面：获得细胞并将其提取物与带有寡核苷酸引物(其为端粒酶的底物)的磁性颗粒接触并在dNTP存在下孵育颗粒，使得能够在珠子无任何转动的情况下发生端粒酶介导的引物延伸。认为珠子的转动不是加速反应动力学所必需的，或者不会加速反应的动力学。因此，TBT测定法的灵敏度不依赖于阳极电解液或参与该测定法的其它物质的转运速率。
本发明的测定法也可用于研究目的的在细胞中检测端粒酶、测定细胞的健康状态，或评估化合物抑制或增强端粒酶活性的能力。这可应用于所有的脊椎动物、非脊椎动物和植物。对于脊椎动物以及在癌症或炎性病症的情况下，可以通过从受试者(如人)取出组织以筛查癌细胞或炎性细胞的存在来诊断病症。另外，存在特定长度的端粒可能是干细胞(例如造血干细胞)增殖所必需的。这对于输血(例如白血病患者中的输血)是很重要的。可以在血样中筛查具有特定端粒酶活性的干细胞，所述活性指示了干细胞增殖和分化为粒细胞和造血谱系其它细胞的能力。例如，本方法可用于监测通过细胞因子(例如G-CSF、GM-CSF或其它药物)动员干细胞的成功情况。因此，本方法可用于增强和/或代替用于在外周血或骨髓中监测干细胞的其它方法。
或者，可以在治疗已知癌症或炎性病症期间采取组织样品，从而评价治疗计划或治疗方案的成功或进展或其它情况。然后可以根据需要调整这样的方案。
因此，本发明的另一方面提供了用于监测进行治疗的受试者的治疗方案(例如用于癌症或炎症)的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将所述磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与阴性或阳性对照相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平，其中端粒酶活性的提高或端粒酶活性的稳定指示治疗方案不对该受试者产生有害影响。
同样，上述任何步骤尤其是步骤(iii)也可以自动进行。
本测定法也可以用于筛选降低端粒酶活性的化学治疗剂。提及“化学治疗剂”时包括化合物、免疫化合物、天然产物或sRNAi复合物或者所引入病毒载体的产物。
因此，本发明的另一方面关注评估细胞毒剂活性的方法，所述方法包括：
i)向癌细胞培养物中添加推测的细胞毒剂；
ii)将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自该癌细胞的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化的UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
iii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iv)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强子以及外源的H2O2接触，以产生发光；和
v)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与(例如不含细胞毒剂的)对照相比，存在该细胞毒剂时的发光强度水平提供了该试剂的细胞毒性水平。
本发明还提供了通过本方法鉴定的化学治疗剂以及包含所述化学治疗剂的药物组合物。
一般而言，所测试的受试者是人。然而，本发明扩展至任何动物受试者，尤其是哺乳动物受试者，包括灵长类(例如大猩猩、狨猴、猩猩、猴)、家畜动物(例如绵羊、牛、猪、马、山羊)、实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、犬)和野生动物。本发明还关注非哺乳类脊椎动物和植物。
在本发明的方法中，通过信号(例如电信号、颜色信号或光发射)信息确定所掺入标记的存在情况。感受构件是能够感受信号、通常跟踪化学或电信号的构件。当信号是光发射时，检测器是光检测器。
当信号是电信号时，其产生自电子在电极与电子传递链之间的传递，其中所述标记是该电子传递链的成员。
适用于本发明方法的电极由导电材料和半导体材料制成或由其包裹，例如金、铂、钯、银、碳、铜和铟、氧化锡。
本文提到“发光”时包括化学发光、生物发光、结晶发光、电致发光、阴极射线发光、光致发光、磷光、荧光、声致发光、热致发光或摩擦发光。
本发明的测定法也可应用于同时或依次检测多于一种标记(例如在多重测定法期间所发生的)。在一个实例中，可对不同的患者样品或在不同时间或不同治疗后来自相同患者的样品使用多种标记。在这样的情况下，磁性颗粒带有多于一种标记(在相同的磁性颗粒上或在不同的磁性颗粒上)。为了进行同时检测，测定条件是允许同时形成对于每个标记而言可以区分的反应信号的条件。因此，一种标记的存在产生一种类型的反应信号(例如光发射)，而另一种标记的存在产生另一种类型的反应信号(例如光谱不同的光发射)。或者，可以依次实现对多于一种标记的检测，使得进行一个测定后，将磁性颗粒收集、洗涤并提供于不同的测定条件，用于另一种标记的检测。在该情况下，反应信号可以是相同的，只要在每个测定中反应信号将仅与单个信号标记的存在相关联地获得即可。
在本发明的诊断方法中，进行所述测定法来确定是否存在升高的端粒酶水平。短语“升高的水平”表示与该个体中的正常体细胞相比或与未患疾病的其它个体中的正常体细胞相比，特定细胞中端粒酶活性的绝对水平升高。一般地，在来自正常的出生后人身体组织的细胞中，任何可检测的端粒酶活性水平都认为是升高的。尽管端粒酶活性存在于种系细胞(germline cell)中，并且在干细胞和某些造血干细胞中能够检测到低水平的端粒酶活性，但是这类细胞对本发明方法的实践者而言不存在问题，除非这些细胞是被移植的血或组织的一部分。在这种情况下(例如在输血期间)，具有端粒酶活性的干细胞是确保分化和增殖能力所需要的。种系细胞可以容易地与人身体组织样品区分和/或分离，并且存在于干细胞和某些造血细胞中的端粒酶活性的水平很低，使得存在于体组织样品中的少量这类细胞不会在端粒酶活性测定法中产生假阳性信号。在体细胞中检测到端粒酶活性指示存在永生化细胞(例如某些类型的癌细胞或炎性细胞)，并且甚至在细胞将被归类为非癌性或非炎性病理学时也可用于做出该决定。因此，本发明的方法允许在细胞成为可见的癌性之前以提高的置信度检测癌性病症。
本发明的诊断测试也可以与其它诊断测试组合进行。在一些情况下，这类组合测试能够提供关于疾病发展的有用信息，尽管用于测试端粒酶活性的本方法在这点上提供了很多有用的信息。使用本发明的方法时，例如用于检测患者样品中癌细胞的存在时，端粒酶活性的存在情况可以用于确定患者处于疾病发展过程中的何种阶段、特定的肿瘤是否可能侵袭相邻组织或转移至远处的位点，以及癌症的出现是否可能复发。可与本发明方法组合而提供额外信息的测试包括针对以下的诊断测试：雌激素受体、孕酮受体、DNA倍性、S期细胞级分、结节状态、Her-2/neu基因产物、p53、p16、p21，ras；EGF受体、A33(结肠特异性抗原)[Catimel等，J.Biol.Chem 271(41)：25664-25670，1996]、NY-ESO-1(睾丸癌抗原)[Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(5)：1914-1918，1997]或其它癌基因。
如上所述，本发明的TBT还可用于对干细胞如胚胎干细胞进行测定。具体地，TBT可用于在下述疾病中评价干细胞的治疗牵连，所述疾病如帕金森病、心脏病、糖尿病、关节炎、血液病、骨质疏松症、器官移植和脊髓损伤。TBT可用于监测干细胞或干细胞衍生组织的移植以及监测干细胞的寿命或分化状态。
本发明还提供了用于实施本发明诊断方法的试剂盒。这类试剂盒可从容易获得的材料和试剂制备，并能够用于多种实施方案中。例如，这类试剂盒可包含任何一种或多种以下的材料：反应管、缓冲液、洗涤剂、寡核苷酸端粒酶底物、对照试剂、过氧化氢和说明书。一种特别优选的本发明试剂盒包含反应管，所述反应管中放置了端粒酶底物和dNTP以及生物素化dNTP。可以根据本发明制备多种试剂盒和成分，取决于试剂盒的计划使用者和该使用者的具体需要。
本发明还包括测定法在产生诊断计划以监测受试者中的癌症的用途，所述测定法包括：
i)获得来自受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化的UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触(任选地自动化接触)，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度。
本发明还通过以下的非限制性实施例进一步进行描述。
实施例1
端粒酶发光测定法
本实施例描述了用于高灵敏度和选择性的生物传感器测定法的实验方案，该实验方案使用发光作为读出数据，用于定量测量膀胱癌患者的尿或结肠癌患者的粪便中的脱落肿瘤细胞中的端粒酶。简言之，该测定法使用超顺磁性珠子，所述珠子使用巯基偶联官能化到核苷酸引物上，所述核苷酸引物含有端粒酶识别序列。将这些珠子(Biobeads)与含有端粒酶的肿瘤细胞提取物在核苷酸混合物(其包含生物素化的dUTP)存在下一起孵育。端粒酶诱导的引物延伸进行下去，掺入生物素-标记。大量的生物素分子被掺入，导致信号放大。添加以高亲和力(10-15M)结合所掺入生物素的抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)。然后充分洗涤Biobeads，这使得大量生物样品中其他可能的干扰物质最小化(可以使用磁体有效地捕获磁性颗粒)，转移至BMG Luminometer中的96孔板中。(任选地自动化)添加过氧化氢、鲁米诺和化学增强剂，并检测发光信号。
该方案便利地使用了Kingfisher磁性颗粒处理器辅助测定的自动化。还使用了BMG发光计(BMG，Lattech，Germany)。化学发光读数器也可以被修饰以允许自动化，例如添加增强剂、鲁米诺和/或H2O2。它可以设定为多板模式。
磁性颗粒的使用被设计成便于实现自动化。颗粒自身可以使用磁体收集和操作：例如Kingfisher磁性颗粒处理器(Thermo Corporation，USA)用覆盖了一次性末端的电磁棒混合和移动磁性颗粒，所述一次性末端防止交叉污染。Kingfisher软件允许针对特定的应用定制方案。在最初的步骤中，收集珠子，添加缓冲液、反应混合物和样品，并混合。需要人工干预将平板转移至Labnet摇动培养箱中以升高温度(37℃，30分钟)，从而驱动端粒酶延伸反应。Kingfisher 96(其内建了温度控制)的使用排除了这种需要。孵育后将平板转移回Kingfisher中进行链霉亲和素HRP的最后添加，然后是剧烈的洗涤步骤，所述洗涤步骤对维持该测定法中观察到的恒定低背景是关键性的。最后，将带有延伸寡核苷酸的磁珠转移进Nunc 96孔LumiNunc平板上：这些平板具有最小的自身发光。然后将平板手动转移至BMG Fluorostar光度计(BMGLabtech，Germany)：这种基于全自动微板的多检测读数器(其装配有在测量点递送试剂的注射器)可以设置程序以用于添加鲁米诺(PierceSuperSignal ELIS A Femto Substrate)和过氧化物。相同的装置可以用于荧光检测。工作站(Kingfisher和BMG)之间的转移可以使用机器人转移(例如Zymark Twister，Beckman Sagian)来进一步实现自动化。同样，可以用其它技术代替Kingfisher(例如Beckman Biomek，BrukerDaltronics ClinProt Robot)或BMG Fluorostar(例如Molecular DevicesLMax II)。
Kingfisher磁珠处理器的实验方案
向平板A1(和B1，如果使用两个平板的话)中添加以下各项：
·A行-100μl延伸缓冲液
·B行-特定体积的反应混合物(一旦添加了端粒酶，则总体积为50μl)
·B行-添加端粒酶提取物
·A行-最后向每孔中100μl的延伸缓冲液中添加10μl与oligo偶联的dynal珠子(30mg/ml的珠子贮液)-确保充分混合。
将平板放进Kingfisher设备并盖上盖玻片(comb coverslip)以保护磁体。
选择程序-“端粒酶测定”
按两次“开始”。
当Kingfisher暂停时-其会指示“在37℃孵育”
·取出平板，用Nescofilm(注册商标)覆盖A&B行以确保平板密封良好。
·将平板放进Labnet摇动培养箱(设定：温度＝37℃；时间＝30分钟；RPM＝12)中。
孵育30分钟后，去除Nescofilm(注册商标)并如下填充其余行：
·C行-100μl 1％(重量/体积)SDS/10mM HEPES
·D行-100μl 1％(重量/体积)SDS/10mM HEPES
·E行-100μl工作缓冲液/吐温
·F行-100μl工作缓冲液/吐温
·G行-100μl工作缓冲液/吐温
·H行-100μl工作缓冲液/吐温
将平板放回Kingfisher中并按下“开始”(方法会继续)。
建立平板A2(和B2，如果使用2个平板的话)
向平板A2(B2)中添加以下：
·A行-100μl工作缓冲液/Tween
·B行-500μl工作缓冲液/吐温中的0.5μg/ml Strept HRP(KPL)
·C行-100μl工作缓冲液
·D行-100μl工作缓冲液
·E行-100μl工作缓冲液
·F行-100μl工作缓冲液
·G行-100μl工作缓冲液
·H行-50μl工作缓冲液
当Kingfisher暂停并指示“更换平板”时
·交换平板
按下“开始”，方法会继续。
Prime BMG FluoroStar光度计，泵A中有鲁米诺，泵B中有过氧化物-设定平板模板(APL测定法-孔模式)和体积(各50μl)。
发光计捕获(gain)设定为2000。
在方法结束时，机器会持续蜂鸣，按下结束。
从Kingfisher取出平板，将H行转移进NUNC白色96孔板上并置于BMG FluoroStar光度计中进行读数。
缓冲液
延伸缓冲液
20mM Tris-HCl
1.5mM MgCl2
63mM KCl
1mM EGTA
1mM EDTA
150mM NaCl
0.05％吐温20
SDS缓冲液
0.1％(重量/重量)SDS
10mm HEPES
工作缓冲液
0.1M Tris，pH7.4
0.1M KC1
(0.05％(体积/体积)吐温20)
反应混合物
1×延伸缓冲液
0.25％(重量/体积)BSA
12.5μM B-dUTP
18.75μM dAdG
端粒酶(或含有端粒酶活性的提取物)
MilliQ H2O
·取出待测定样品的两份等分式样(通常为1-5μl)。
·将一份等分式样在95℃加热20分钟以热灭活样品，然后置于冰上。
·将试剂等分进96孔Kingfisher平板中并置于Kingfisher颗粒处理器(见其他文件中的方案)中。
·将与特异性寡核苷酸序列偶联的Bynal磁珠(寡聚物-珠子)在100μl延伸缓冲液(1×)中洗涤2分钟。
·将珠子转移进50μL反应混合物(延伸缓冲液、12.5μM生物素-dUTP、0.25％(重量/体积)BSA、18.75μM dAdG)和样品中。
·手工将平板转移至加热/摇动设备。
·将寡聚物-珠子与反应混合物在37℃孵育30分钟，使得该寡聚物能够被样品中的酶延伸。
·将平板手工转移回Kingfisher设备。
·用100μl1％(重量/体积)SDS/1m HEPES在室温下将寡聚物-珠子洗涤2分钟，洗涤两次
·用100μl延伸缓冲液(1×)在室温下将寡聚物-珠子洗涤2分钟，洗涤5次。
·将寡聚物-珠子与50μl 1μg/ml链霉亲和素-HRP在室温下孵育30分钟。
·用100μl工作缓冲液(1M Tris-HCl、1M KCl、pH 7.4)在室温下将寡聚物-珠子洗涤2分钟，洗涤5次。
·将寡聚物-珠子重悬于终体积50μl的操作缓冲液中，并将样品转移进白色发光平板中。
·将白色发光平板置于光度计中读出发光结果(设备自动添加50μl鲁米诺和50μl过氧化物)。
实施例2
靶序列与珠子的巯基偶联
使用异双功能交联剂Sulfo-LC-SPDP(Pierce)将带有用于巯基偶联的5”半胱氨酸的端粒酶靶序列(5′SH(CH2)6-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG[SEQ IDNO：5])与磁珠缀合。使用50mM三烷基膦(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)将该寡聚物在室温下还原2小时。在Superpose 12HPLC柱(Amersham)上通过尺寸排除层析将被还原的寡聚物从TCEP中纯化。然后将被还原的寡聚物与Sulfo-LC-SPDP修饰的磁珠在4℃孵育过夜。通过343nm处吸光度读数的提高来监测缀合(见图1)。
实施例3
端粒酶生物传感器测试(TBT)
如下进行端粒酶测定法：
使用与珠子表面结合的寡核苷酸[SEQ ID NO：2]和固定在Dynal(Dynal Invitrogen Corporation，9099 North Deerbrook Trail，BrownDeer，WI，USA 53223)上的组合序列[SEQ ID NO：3]来合成端粒酶靶序列[SEQ ID NO：1]。固定通过与SEQ ID NO：35’末端的半胱氨酸残基的结合来实现。
获得含有推测癌细胞的细胞并用CHAPS缓冲液[0.5％(体积/体积)CHAPS、10mM Tris、1mM MgCl2、1mM EGTA和10％(体积/体积)甘油以及每10ml 1片蛋白酶抑制剂(Compete Mini，Roche)]裂解。然后将裂解细胞提取物添加至带有dNTP和生物素化dUTP的磁珠上。然后添加链霉亲和素-HRP。孵育后使用不转动的磁体收集珠子并洗涤。然后将珠子转移至96孔平板。与过氧化氢一起添加鲁米诺和增强剂。然后读出发光。
实施例4
测定法的灵敏度
计数LIM1215癌细胞(Whitehead等，J Natl Cancer Inst74(4)：749-765，1985)并取出含100到1000个细胞的等分式样，并针对端粒酶进行测定。结果显示于图2中。该图显示灵敏度为少至一个细胞。含106个或更多细胞的样品也良好地检测到了端粒酶活性。
实施例5
样品制备
下文提供了癌症列表和取样技术。该列表仅是能够被检测的癌症类型的示例。
其中一些的样品建立包括在Item 11中。针对每种癌症标出了可使用TBT的临床样品类型的实例。
膀胱癌：尿中的沉降细胞、膀胱洗出液；
生殖泌尿道癌；肾盂洗出液、膀胱洗出液；
肾癌：肾盂洗出液、膀胱洗出液；
结肠癌：脱落的粪便上皮细胞、内窥镜活检标本；
白血病：骨髓和外周血；
黑素瘤：外周血、细针吸取物(fine needle aspirates)；
皮肤癌：活检、外周血、细针吸取物；
肺癌：支气管肺泡灌洗液、支气管刷检和洗出液、痰、刮片和涂片、细针吸取物、活检和组织切片；
前列腺癌：细针吸取物、尿中的沉降细胞；
头颈癌：刮片和涂片
淋巴结：细针吸取物；
胰腺：细针吸取物；
唾液腺：细针吸取物；
乳腺：细针吸取物、乳头溢液
肝：细针吸取物；
甲状腺：细针吸取物；
脑癌：脑脊液；和
宫颈癌、阴道癌和卵巢癌：涂片、腹膜洗出液。
实施例6
浅表膀胱癌样品
测定了包含细胞的5μl样品。
LIM1215结肠癌细胞系(Whitehead等，1985上文)是阳性对照。注意降低是热灭活(HI)后的信号。样品加工期间使用Ep-CAM珠子将癌细胞与活化淋巴细胞分离。结果显示于图3中。
实施例7
侵袭性膀胱癌样品
测定了1μl含细胞的样品。结果显示于图4中。
实施例8
端粒酶测定法与TRAP法的比较
使用如实施例3中所述的端粒酶测定法与TRAP测定法(Hess等，2002，见上文)进行比较。结果显示于表3中。端粒酶测定法明显比TRAP测定法更灵敏。也参见实施例18。
表3
使用TBT测定法测定的临床样品
  癌症类型   端粒酶测定法   TRAP结果
  浅表的   阳性   阴性
  浅表的   阳性   阴性
  浅表的(CIS)   阳性   NT
  侵袭性的   阳性   阴性
  侵袭性的   阳性   NT
  正常的   阴性   NT
  正常的   阴性   NT
NT＝未测试
实施例9
从粪便样品中分离结肠细胞
·测定粪便样品的重量。
·将样品在50mL/g含有添加剂的PUCK′s分散缓冲液(见Puck′s缓冲液配方)中剧烈振荡。
·将浆体滤过100μm膜并收集流出液。
·将收集的液体滤过60μm的膜并收集流出液。
·将流出液以1000g在4℃下离心10分钟。
·将细胞沉淀重悬于含抗体的2.5mL PUCK′s分散缓冲液中。
·在7.5ml Percoll的不连续梯度上分层，并以20000×g在4℃下离心20分钟(固定角转子)。
·收集细胞级分并用含1％(体积/体积)FCS和0.6％(重量/体积)柠檬酸钠的PBS补足10ml。
·以1000g在4℃下离心10分钟。
·重悬于含1％(体积/体积)FCS和0.6％(重量/体积)柠檬酸钠的PBS(2ml)中。
·将40μl(1×107)Dynal EpCAM珠子等分进2个管中并在PBS/0.1％(重量/体积)BSA中洗涤两次。
·将2ml样品等分进含40μl EpCAM珠子的2个管(每管1mL)中并在4℃旋转孵育30分钟。
·将管置于磁体中并去除S/N(保留用于细胞离心涂片器(cytospin))。
·重悬于PBS/0.1％(重量/体积)BSA(200μl)中-将两管合并为一管并放进磁体中以去除400μl上清液。
·将200μl PBS/0.1％(重量/体积)BSA洗涤重复两次。
·添加200μl CHAPS裂解缓冲液。
·通过经过细针来裂解细胞。
·将裂解物在冰上孵育30分钟。
·以10,000g在4℃下离心20分钟。
·等分S/N并在LN2中迅速冷冻。
·迅速冷冻剩余的细胞沉淀。
测定结果显示于图5中。
实施例10
TBT的灵敏度
在宽裂解物浓度范围(从10-1250个细胞等价物(CE))中对HEK293T(Graham等，J Gen Virol 36：59-74，1977)肿瘤细胞裂解物进行端粒酶测定。TBT结果(发光信号)与裂解物浓度之间的相关性高达1250CE时仍是线性的，之后TBT信号成为平台。在膀胱癌患者的尿中所预计的细胞浓度下，TBT应答关系是线性的。结果显示于图6和图7中。
TBT测定在非常低的细胞浓度下有效。检测下限的统计学评价揭示，可以用TBT测定法检测的最小细胞数为少至20CE。结果显示于图8中。TBT测试可以检测来自极少量表达端粒酶的细胞的阳性信号。因此，它具有检测尿中极少量脱落肿瘤细胞的能力。
实施例11
测定内再现性
通过测量两种不同浓度(100CE和1000CE)HEK293T肿瘤细胞的端粒酶活性来评价TBT测试的测定内再现性。TBT测定法中每个浓度下六个重复样品之间的变异性水平约为5％。结果显示于图9中。
实施例12
测定间再现性
通过测量两种不同浓度(50CE和5000CE)HEK293T肿瘤细胞的端粒酶活性来评价TBT测试的测定间再现性。测定在不同天的四个独立的情况下进行。每个浓度下的测定间变异性水平范围为6-9％。结果显示于图10中。
实施例13
测定的特异性
通过测量过表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)的肿瘤细胞的端粒酶活性来测定TBT测试的特异性。在含有逆转录病毒载体的TF-1人红白血病细胞系(Kitamura等，Blood 73(2)：375-380，1989)中测量端粒酶活性，所述逆转录载体表达人端粒酶逆转录酶[hTERT](Li等，Leukemia20：1270-1278，2006)。结果显示于图11中。
实施例14
测量尿样中的端粒酶活性
使用TBT测试在细胞裂解物浓度范围从0μl到2.5μl裂解物的细胞中测量端粒酶活性，所述细胞从膀胱癌患者的尿中分离。在来自三名先前显示阳性TBT结果的患者的尿细胞裂解物中测量端粒酶活性，其中两名具有高TBT结果(患者#3，TBT比值6.70和患者#12，TBT比值6.38)，一名具有低TBT结果(患者#31，TBT比值1.59)。结果显示于图12中。
实施例15
膀胱癌监测
使用TBT测试测量细胞中的端粒酶活性，所述细胞从膀胱癌患者和正常受试者的尿中分离。阳性TBT测试信号定义为强度比背景信号高出＞1.5倍的信号。结果显示于图13和表4中。
表4
临床数据-汇总
TBT数据
上文给出的平均数据代表平均TBT结果。除了与“取舍”值的关系外，似乎TBT结果的程度和膀胱癌的阶段与严重性之间几乎没有相关性。
实施例16
白血病
使用TBT测试在人白血病细胞系K562(Lozzio和Lozzio，Blood45：321-334，1975)中测量端粒酶活性。TBT测试对于白血病细胞中端粒酶活性的检测是灵敏的，与现有用于测量白血病细胞中端粒酶的方法相比是定量的并且相对易于进行。结果显示于图14中。
实施例17
脐带血干细胞
使用TBT测试在脐带血干细胞中测量端粒酶活性。在使用1000CE的三个脐带血样品中，TBT测定法均对于脐带血干细胞中端粒酶活性检测是灵敏的。结果显示于图15中。
实施例18
比较测定法
将本发明的测定法特征和标准TRAP测定法进行了比较。比较特征的概述在表5中提供。比较突出了TBT与TRAP测定法相比改进的效率。
表5
与标准TRAP比较
  测定法特征   TBT   原因 TRAP   原因
  时间范围   ＜21/2小时   使用试管和平板、简单的吸取步骤和磁珠 1天   使用PCR热循环、凝胶电泳和复杂的图像分析
  操作通量   高   当完全自动化时，每21/2小时能够进行96个孔(或更多) 低   受凝胶电泳和复杂分析的限制
  常规使用   高   使用标准的实验室设备。高度适用于在典型的病理学实验室机器人系统上自动化。 不可能   对凝胶上电泳PCR产物的需要和复杂的图像分析阻止了常规的临床效用
  自动化   高   基于磁珠的方法适用于在常规病理学实验室中容易获得的液体操作机器人 不可能   非标准的测定方法(凝胶、图像分析)阻止了自动化
  灵敏度-研究用途   高(＜10个细   在少于10个HEK293T或LIM1215细胞时检测 高(可变的)   难以获得用于PCR的最适条件
  胞)   到阳性信号
  灵敏度-临床样品   高(93-97％)   从接近取舍点的临床样品中检测到阳性信号   低 在我们手中灵敏度非常低，可能是由于PCR污染的问题
  干扰   低   样品建立纯化了目的细胞并将它们从干扰物质中取出   高 PCR反应容易被临床样品中的干扰物质“毒害”；例如血成分(血红蛋白)。
  稳定性   高   磁珠非常稳定。端粒酶反应很稳定。化学发光在临床实验室中广泛使用。   低 典型的PCR问题如交叉污染和Taq聚合酶被内源物质干扰。PCR在延伸产物的数量和比值中引入误差。
  定量   定量的   荧光测量可以按每个细胞数(等价裂解物)进行测量   最多为半定量 产物的对数递增使得必需在凝胶上对DNA进行复杂的图像分析。
  假结果   如果有的话也很少   常见 由于PCR抑制剂、过度灵敏或PCR污染，假阴性和假阳性结果均是常见的
  操作简便性   良好   容易的移液操作，可以被完全自动化。   无。耗时并需要熟练的操作人员 需要凝胶电泳。难以分析。一些TRAP测定使用放射性用于检测。
  成本   低   设备简单，试剂相对   高 昂贵的试剂盒
  便宜。
实施例19
监测与端粒酶疗法关联的端粒酶活性
TBT在选择和监测患者中是有益的，所述患者进行了靶向端粒酶活性和端粒酶复合物成分的疗法。这类应用包括针对端粒酶成分的疫苗，它们可用于癌症或自身免疫病或过度增殖病症的治疗中。
类似地，TBT可以用于监测作为治疗一部分的端粒酶活性，例如组织再生、置换、修复和恢复(例如皮肤或其它器官)中的干细胞活化。其它情况包括骨髓、成人脑神经原性区(neurogenic zone)中的干细胞活性激活，以及HIV患者中T淋巴细胞的再激活。其它情况包括例如由化学疗法或放射疗法所导致的损伤后胃肠道和呼吸道的恢复。
类似地，TBT可用于在实验室条件、动物模型和患者中药物开发的情况中监测端粒酶抑制剂的效力。
类似地，TBT可用于在使用胚胎干细胞衍生细胞重建的组织中和需要实现短期或长期组织替换的组织中监测干细胞和祖细胞活性的维持。
实施例20
端粒酶重复序列的重复
附着于磁珠的端粒酶特异性寡核苷酸模板的设计对于最大化TBT测定法的灵敏度而言是关键性的。用于端粒酶RNA组件和端粒末端之间碱基配对的最小识别DNA序列为9个碱基TAGGGTTAG，然而，该序列的多次重复更准确地描述了染色体端粒末端的性质和用于实现准确碱基配对识别的酶的扫描性质。端粒酶模板包括1.5-3个六聚体重复的模板。
测试了三种形式的寡核苷酸。含有部分(0.5)重复的短形式、含2.5个重复的稍长形式和具有3.5个重复的更长形式。更长形式相对于背景信号(无端粒酶提取物)提供了更好的绝对信号。该提高的动态范围很可能转变为提高的测定灵敏度。结果显示于图16中。
所测试的寡核苷酸如下：
短：5’SH-(CH2)6-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT (SEQID NO：6)
中：5’SH-(CH2)6-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：7)
长：5’SH-(CH2)6-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGG GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：8)。
寡核苷酸的长度对于贮存期稳定性也是重要的。反应珠子在结合/螯合游离金属离子的EDTA和EGTA存在下储存。金属离子是降解核酸的酶的必要辅因子，因此它们的去除保护寡核苷酸免于降解。
实施例21
自动化
TBT测定法高度适用于自动化，因为其使用标准的磁珠技术。基于磁珠的液体操作机器人系统在常规病理学实验室中普遍用于多种应用。TBT测定法可容易地适应多种这类系统并且不依赖于机器。
TBT测定法的自动化使其与其它技术如TRAP和PCT/IL01/00808(WO 02/20838)中描述的测定法相比具有独特的优点。后者使用旋转的电磁体并且不易于实现自动化。它不适用于常规病理学实验室用途。TRAP的原始形式需要在电泳凝胶上对PCR产物进行电泳并随后通过成像进行分析，因此它不适用于高通量自动化。
实施例22
捕获细胞的珠子
任何细胞特异性抗体、受体或模拟体物(mimetics)都可以用于纯化目的细胞用于端粒酶活性测量。这包括例如：
抗-EGF受体(对肿瘤细胞而言)；
抗-CD34(干细胞)；
抗-CD45(通用白细胞抗原)；
抗-CD19(泛B细胞抗原)CD4和CD8(淋巴细胞)；
抗-BerEP4(泛上皮细胞表面抗原)；和
抗-A33(结肠上皮细胞抗原)
也可以通过其它方法纯化或分离细胞，如用于分离外周血单个核细胞(PBMC)的连续或不连续的聚蔗糖梯度。
实施例23
样品制备方法和建立
TBT测试可用于检测与许多不同癌症相关的恶性细胞。可以使用TBT测试分析的典型临床样品包括但不限于以下：
用于检测支气管树、肺癌、头颈癌中赘生物的支气管肺泡灌洗液、支气管刷检和洗出液、痰、刮片、涂片。
用于在肺、淋巴结、胰腺、唾液腺、乳腺、肝、甲状腺和前列腺的癌症中检测恶性细胞的细针吸取物、活检和组织切片。
用于检测前列腺癌、膀胱癌、泌尿生殖道癌和肾癌的尿中沉降细胞、肾盂洗出液、膀胱洗出液。
用于检测黑素瘤和造血系统癌症的血。
用于检测恶性赘生物的体腔液(胸膜液、腹膜液、心包液、腹膜洗出液、肠洗出液)。
用于在CSF中检测恶性细胞的脑脊液。
用于检测胃肠道癌的内窥镜活检标本。用于在结肠癌和其它胃肠道癌症中检测恶性细胞的粪便标本。
乳头溢液：用于检测乳腺癌和引起乳头溢液的癌症。
用于检测宫颈癌、阴道癌和卵巢癌的PAP TestTM/PAP涂片(宫颈/阴道筛查)。也可以用于检测某些感染性及炎性病症。
用于疱疹病毒感染(单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒)后次发的水泡病的皮肤(Tzanck涂片)。
在膀胱癌的情况下，通过使用与磁珠结合的上皮细胞特异性抗体从尿中进行选择性捕获来分离肿瘤上皮细胞。
实施例24
尿加工操作-样品建立
所有的步骤均在冰上进行，以防止细胞与Dynal珠子的非特异附着。
1.收集尿(至少50ml)并保持在冰上。将尿转移至50ml管中。如果多于50ml，则将尿在50ml管中分为等体积的2份，每份如下处理。
2.将样品以750g在4℃离心5分钟。将上清液倒入含HazTab的烧杯中。
3.将沉淀物重悬于10ml PBS(pH 7.4)中，其中补充了0.1％(重量/体积)BSA和蛋白酶抑制剂片(下文称作洗涤缓冲液)。
4.将样品以750g在4℃离心5分钟。将上清液倒入含HazTab的烧杯中。
5.重复洗涤步骤(步骤4-5)。
6.在步骤5中，用100μl洗涤缓冲液将Epithelial EnrichCellection Dynal珠子洗涤一次(使用Dynal磁阱)。
7.离心后，将沉淀物重悬于1ml洗涤缓冲液中并转移至1.5ml微量离心管中。
8.将洗涤过的珠子添加进来自步骤5的洗涤过的尿细胞中。对于直径小于1mm的沉淀物而言，使用25μl珠子。对于1-2mm之间的沉淀物而言，使用30μl珠子。对于任何大于2mm的而言，使用40μl珠子。
9.在4℃下通过摇动(60r.p.m.)将珠子与尿细胞温和混合30分钟。
10.将样品离心(Capsule Tomy HF120)30秒，以确保微量离心管盖子上不残留任何珠子或缓冲液。
11.将管置于Dynal磁阱(Dynal MPC-S)中，并使用Gilson P1000移液器将上清液小心地转移至新的1.5ml微量离心管中：在HereausBiofuge中在4℃下将上清液以13,000r.p.m.离心5分钟。去除上清液并裂解沉淀物(其含有未与Epithelial Enrich Cellection Dynal珠子结合的细胞)中的细胞。该级分可能含有活化的淋巴细胞，并应当作为冷冻的细胞沉淀物(-70℃)独立储存，必要时用于后续的分析。
12.通过重悬于1ml洗涤缓冲液中洗涤来自步骤11的珠子，然后如上所述使用Dynal磁阱去除上清液。丢弃上清液。
13.向与上皮癌细胞结合的Dynal珠子中添CHAPS裂解缓冲液(100μl)。
14.通过使用Gilson P200移液器吸打至少10分钟来裂解细胞。
15.将裂解物在冰上孵育30分钟。
16.将裂解物在Hereaus Biofuge中在4℃下以13,000r.p.m.离心5分钟。
17.通过将管子置于磁阱中来去除珠子。
18.将上清液(～30μl)等分进3个管中，弃去沉淀物。
19.将裂解物在干冰上迅速冷冻5分钟并转移至-70℃冰箱。
实施例25
来自于结肠癌患者粪便样品的脱落结肠细胞的样品建立
在知情同意下从临床证实患有结肠癌的患者收集粪便样品。样品在家中收集并立刻运输至实验室(少于2小时)，在实验室中将等分式样(2g)分散在含抗生素(500U/L青霉素、500mg/L硫酸链霉素、1.25mg/L两性霉素B和50mg/L庆大霉素)的Puck′s盐水中。依次通过100μm和60μm的膜(尼龙/网膜滤器，Millipore，Australia)过滤粪便浆体以去除大碎片，之后于4℃下400g离心10分钟。用含1％(体积/体积)FCS和0.6％(重量/体积)柠檬酸钠的PBS洗涤沉淀物两次，然后使用40μl Epithelial Enrich CELLection(商标)Dynabeads回收。将细胞与Dynabeads在4℃孵育30分钟，然后使用Dynal磁性颗粒处理器去除上清液。用含0.1％(重量/体积)BSA的PBS将与附着在磁珠上的细胞洗涤三次，然后用200μl CHAPS裂解缓冲液裂解。将得到的上清液在液氮中迅速冷冻并储存于-70℃。
实施例26
脐带干细胞的样品建立：(谱系阴性细胞的富集)
在含抗凝血柠檬酸缓冲液的无菌瓶中收集人脐带血(umbilicalcord blood，UCB)，并在收集后18小时内加工。为了去除红细胞，用Dulbecco′s磷酸缓冲盐水将UCB 1∶2稀释，并在室温下使用1％(重量/体积)Hespan(DuPont Pharma，Wilmington，DE)凝集红细胞。用0.17mM NH4Cl、10mM Tris-Cl pH 7.2、0.25mM EDTA裂解剩余的红细胞。使用StemSep试剂盒(Stem Cell Technologies，Vancouver，BritishColumbia，Canada)根据试剂盒说明书通过去除表达血型糖蛋白A、CD3、CD2、CD56、CD24、CD19、CD66b、CD14和CD 16的细胞来分离谱系阴性(Lin-)细胞。得到的Lin-级分中CD34+细胞的百分比范围为63％到82％。
实施例27
对白血病细胞的样品建立
用于诊断和分析白血病患者的细胞从骨髓或外周血中分离。将取自正常供体髂嵴(iliac crest)的10ml人骨髓抽取物用磷酸缓冲盐水1∶1稀释，并在室温下900g离心10分钟。将洗涤过的细胞在PBS中重悬至10ml的终体积并在等体积的1.073g/ml Percoll溶液中分层。在900g离心30分钟后，从梯度界面回收单个核细胞(MNC)并用PBS洗涤。将Percoll分级的MNC或未分级的骨髓细胞重悬于PBS中用于分析。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从外周血的血沉棕黄层分离MNC，并在PBS中洗涤。
实施例28
接收器工作特性曲线
图17显示了“接收器工作特性”曲线(ROC曲线)，其显示TBT测试在检测膀胱癌时的灵敏度。
ROC曲线描述在不同诊断阈值下评价TBT测试的性能时，临床研究中观察到的灵敏度和特异性模式。TBT测试的总体诊断性能由ROC线的位置来判断。差的测试具有接近上升对角线的线条，而完美测试的线条迅速上升并经过接近左上角的位置，这时灵敏度和特异性均为1。TBT测试的ROC线与完美诊断测试的线条十分接近。
本领域技术人员应当明白，本文所述的发明是容易有除具体描述的之外的变更和修饰的。应当理解，本发明包括所有这样的变更和修饰。本发明还包括该说明书中个体或整体提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或更多所述步骤或特征的任何及所有组合。
文献目录
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Claims (34)

1.用于检测来自受试者的显示端粒酶活性的细胞的方法，所述方法包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将所述磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与不含有待检测细胞的对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和细胞数。
2.权利要求1的方法，其中寡核苷酸引物包含序列(XnTTAGGYm)o，其中：
X是选自A、T、G和C的核苷酸；
Y是选自A、T、G和C的核苷酸；
n是0或1；
m是0或1；和
o是从约1到约400。
3.权利要求2的方法，其中寡核苷酸引物包含SEQ ID NO：1中公开的核苷酸序列。
4.权利要求2的方法，其中寡核苷酸引物包含SEQ ID NO：3中公开的核苷酸序列。
5.权利要求1或2或3或4的方法，其中所述受试者为人。
6.权利要求1或2或3或4的方法，其中所述受试者为非人或脊椎动物。
7.权利要求1或2或3或4的方法，其中所述受试者为植物。
8.权利要求5或6的方法，其中所述来自受试者的细胞包含癌细胞。
9.权利要求5或6的方法，其中所述来自受试者的细胞包含炎性细胞。
10.权利要求5或6的方法，其中所述来自受试者的细胞包含干细胞。
11.权利要求1的方法，其中寡核苷酸引物通过硫氢键被固定在磁性颗粒上。
12.权利要求1的方法，其中鲁米诺、增强剂和/或H2O2的添加是自动化的或半自动化的。
13.权利要求1的方法，其中癌症是任何癌性或恶性病症、癌前病症、骨髓瘤，或任何淋巴瘤或恶性病症，或涉及赘生性细胞的任何其它增殖病症。
14.权利要求13的方法，其中癌症包括乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞瘤、肝癌/胆管癌、神经内分泌肿瘤、垂体赘生物、小圆细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、间质莱迪希细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食管肿瘤、喉瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和维尔姆斯瘤。
15.权利要求13的方法，其中癌症为腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、adontoma、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性骨髓外化生、脱发、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞瘤、血管角质瘤、嗜酸细胞增多性血管淋巴样增生、血管瘤硬化、血管瘤病、胺前体摄取脱羧化细胞瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调性毛细血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、鳃原瘤、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、童年期脑肿瘤、童年期癌症、童年期白血病、童年期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、癌(例如Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、埃利希肿瘤、Krebs 2、默克尔细胞癌、粘蛋白癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、癌肉瘤、宫颈非典型增生、叶状囊性肉瘤、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌症、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血症、纤维瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌肿瘤、生殖泌尿癌、生殖细胞癌、妊娠性滋养层细胞病、神经胶质瘤、妇科癌症、巨细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、血管球瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、血液恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头与颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头状瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、咽下部癌症、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞病症、恶性组织细胞增多病、组织细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、软骨肉瘤、小型免疫增生、opoma、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、利-弗综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤、白血病(例如b-细胞白血病、混合性细胞白血病、裸细胞白血病、t-细胞白血病、t-细胞慢性白血病、htlv-ii-相关白血病、淋巴管肉瘤、淋巴细胞急性白血病、淋巴细胞慢性白血病、肥大细胞白血病和髓细胞性白血病)、白血病性肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管细胞瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、恶性肾棒状瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓组织增生病、恶性类癌综合征、类癌心脏病、髓母细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、间叶瘤、中肾瘤、间皮瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、赘生物(例如骨赘生物、乳腺赘生物、消化系统赘生物、结肠直肠赘生物、肝赘生物)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、神经节细胞瘤、非嗜铬神经节细胞瘤、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见的癌症及相关病症、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤综合征、网状内皮组织增殖、横纹肌瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞泽里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊索瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(例如尤因实验性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、塞尔托利细胞瘤、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、畸胎瘤、泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养层细胞瘤、尿道癌、泌尿系统癌、uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
16.权利要求9的方法，其中炎症细胞涉及痤疮、咽峡炎、关节炎、吸入性肺炎、疾病、脓胸、胃肠炎、炎症、肠型流感、坏死性小肠结肠炎、骨盆炎性疾病、咽炎、pid、胸膜炎、咽喉炎、发红(redness)、发红(rubor)、咽喉痛、胃型流感和泌尿道感染、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经瘤、慢性炎性脱髓鞘性多神经病或慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经瘤。
17.权利要求1到16中任一项的方法，其中所述细胞在检测端粒酶活性水平之前进行选择性纯化或富集。
18.权利要求17的方法，其中如下纯化或富集细胞：通过将细胞在装载了细胞特异性抗体的磁珠中孵育，随后洗涤去除可能干扰的物质。
19.用于评价细胞毒剂活性的方法，所述方法包括：
i)向癌细胞培养物中添加推测的细胞毒剂；
ii)将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自该癌细胞的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
iii)将磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iv)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强子以及外源的H2O2接触，以产生发光；和
v)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与例如不含细胞毒剂的对照相比，存在细胞毒剂时的发光强度水平提供了该试剂的细胞毒性水平。
20.测定法在产生诊断方案以检测受试者的癌症中的用途，所述测定法包括：
i)获得来自受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度。
21.权利要求19的方法或权利要求20的用途，其中所述寡核苷酸引物通过巯基键合固定在磁性颗粒上。
22.权利要求19的方法或权利要求20的用途，其中鲁米诺、增强子和/或H2O2的添加是自动化的或半自动化的。
23.权利要求19的方法或权利要求20的用途，其中所述细胞在检测端粒酶活性水平之前进行选择性纯化或富集。
24.权利要求23的方法或用途，其中如下纯化或富集细胞：通过将细胞在装载了细胞特异性抗体的磁珠中孵育，随后洗涤去除可能干扰的物质。
25.用于检测癌症或用于评估抗癌剂细胞毒性可能性的试剂盒，所述试剂盒以区室的形式包含：第一区室，其包含带有寡核苷酸引物的磁性颗粒，所述寡核苷酸引物是端粒酶的底物；包含试剂的第二区室，所述试剂包括过氧化氢；和包含dNTP和/或生物素化dNTP的第三区室，所述试剂盒还包含使用说明，所述使用包括：
i)获得来自所述受试者的细胞样品，将带有寡核苷酸引物的磁性颗粒与来自所述细胞样品的细胞提取物接触，所述寡核苷酸引物为端粒酶的底物，并将磁性颗粒与细胞提取物一起在下述条件下孵育一段时间，所述条件足以在NTP和生物素化UTP存在下发生端粒酶介导的寡核苷酸引物延伸，由此将生物素掺入延伸的引物中；
ii)将磁性颗粒与链霉亲和素-辣根过氧化物酶接触；
iii)使用不旋转的磁体收集珠子，洗涤珠子并在外源添加的H2O2存在下将洗涤过的珠子与鲁米诺和增强剂接触，以产生发光；和
iv)对得到的混合物应用检测手段，以读出发光强度，
其中与不含有待检测细胞的对照或已知数据集相比的发光强度水平提供了端粒酶活性水平和细胞数。
26.权利要求25的试剂盒，其中寡核苷酸引物包含序列(XnTTAGGYm)o，其中：
X是选自A、T、G和C的核苷酸；
Y是选自A、T、G和C的核苷酸；
n是0或1；
m是0或1；和
o是从约1到约400。
27.权利要求26的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物包含SEQ IDNO：1中所示核苷酸序列。
28.权利要求26的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物包含SEQ IDNO：3中所示核苷酸序列。
29.权利要求25或26的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物通过巯基键合固定在磁性颗粒上。
30.权利要求25的试剂盒，其中鲁米诺、增强子和/或H2O2的添加是自动化的或半自动化的。
31.权利要求25的试剂盒，其中癌症是任何癌性或恶性病症、癌前病症、骨髓瘤，或任何淋巴瘤或恶性病症，或涉及赘生性细胞的任何其它增殖病症。
32.权利要求31的试剂盒，其中癌症包括乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞瘤、肝癌/胆管癌、神经内分泌肿瘤、垂体赘生物、小圆细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、间质莱迪希细胞瘤、塞尔托利细胞瘤、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食管肿瘤、喉瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和维尔姆斯瘤。
33.权利要求31的试剂盒，其中癌症为腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、adontoma、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性骨髓外化生、脱发、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞瘤、血管角质瘤、嗜酸细胞增多性血管淋巴样增生、血管瘤硬化、血管瘤病、胺前体摄取脱羧化细胞瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调性毛细血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、鳃原瘤、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、童年期脑肿瘤、童年期癌症、童年期白血病、童年期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、癌(例如Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、埃利希肿瘤、Krebs 2、默克尔细胞癌、粘蛋白癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管原癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、癌肉瘤、宫颈非典型增生、叶状囊性肉瘤、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌症、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血症、纤维瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌肿瘤、生殖泌尿癌、生殖细胞癌、妊娠性滋养层细胞病、神经胶质瘤、妇科癌症、巨细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、血管球瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、血液恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头与颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头状瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、咽下部癌症、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞病症、恶性组织细胞增多病、组织细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、软骨肉瘤、小型免疫增生、opoma、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、利-弗综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤、白血病(例如b-细胞白血病、混合性细胞白血病、裸细胞白血病、t-细胞白血病、t-细胞慢性白血病、htlv-ii-相关白血病、淋巴管肉瘤、淋巴细胞急性白血病、淋巴细胞慢性白血病、肥大细胞白血病和髓细胞性白血病)、白血病性肉瘤、莱迪希细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管细胞瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、恶性肾棒状瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓组织增生病、恶性类癌综合征、类癌心脏病、髓母细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、间叶瘤、中肾瘤、间皮瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、赘生物(例如骨赘生物、乳腺赘生物、消化系统赘生物、结肠直肠赘生物、肝赘生物)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、神经节细胞瘤、非嗜铬神经节细胞瘤、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见的癌症及相关病症、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤综合征、网状内皮组织增殖、横纹肌瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞泽里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊索瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(例如尤因实验性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、塞尔托利细胞瘤、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、畸胎瘤、泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养层细胞瘤、尿道癌、泌尿系统癌、uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
34.权利要求25的试剂盒，其还包含这样的磁性颗粒，所述磁性颗粒上固定了针对癌细胞或白血病细胞或炎性细胞或干细胞的抗体。
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