CN105154563B - 一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，其是通过将端粒酶延长产物与辅助DNA结合释放出引发DNA，引发DNA能够引发链替代反应，形成发夹H1:H2复合物，在复合物的两个末端能够各自形成G‑四链体，N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)自身荧光信号很弱，嵌插G‑四链体后荧光信号显著增强，通过检测NMM荧光信号的变化，可灵敏的检测端粒酶活性，本发明充分利用链替代反应，无需酶辅助就能够实现信号放大，同时巧妙利用了G‑四链体的形成，构建了无需标记，就能灵敏的检测端粒酶活性的方法，为肿瘤疾病的诊断，治疗，以及关于疾病机理研究提供了新思路，在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。

Description

一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法
技术领域
本发明属于肿瘤活性检测技术领域，具体涉及一种基于链替代辅助三重放大技术实现简单、快速、低成本检测癌细胞中端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒是真核细胞染色体末端含有的“帽状”结构，它能防止染色体发生降解、端-端融合、重组和染色体丢失，从而保护染色体末端的稳定。在正常情况下，由于染色体存在的末端复制问题，细胞每分裂1次，端粒就丢失50～150个碱基对。随着细胞分裂次数的增加，端粒DNA末端缩短，当缩短到一定程度时，细胞进入危险期，最终导致细胞死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，主要由RNA模板(hTR)催化亚基(hTERT)和端粒酶相关蛋白(hTEP)组成。人类端粒酶能够以自身的RNA为模板，在染色体3’末端合成TTAGGG端粒重复序列，以保持染色体末端端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研究发现，在85％以上的癌症细胞中，端粒酶活性高度表达，而在正常体细胞中几乎没有表达。(Shay J.W.,WrightW.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions[J].Nat.Rev.Drug Discov.2006,5:577–584.)。
因此端粒酶已经被作为一种广谱性癌症标识物，在癌症的早期诊断，疾病预知以及癌症病理学研究方面有很重要的作用。(Piatyszek,M.；Kim,N.；Weinrich,S.；Hiyama,K.；Hiyama,E.Wright,W.；Shay,J.Detection of telomerase activity in human cellsand tumors by a telomeric repeat amplification protocol(TRAP)[J].Methods CellSci.1995,17:1-15.)。发展简便、快速、可靠，灵敏的端粒酶活性检测的方法在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。
在已报道的端粒酶活性检测的方法中经典的方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒重复序列扩增法(TRAP)。但是该方法需要先将端粒酶延长产物通过在引物和反向引物混合核苷酸以及热启动聚合酶存在时利用聚合酶链式反应通过一系列循环进行扩增，使目标物的浓度增大，然后再利用聚丙稀酰胺凝胶电泳和染色方法分析结果，操作过程繁琐复杂，条件摸索困难，费时费力，同时需要用到多种试剂，这些都很容易使实验结果中出现假性信号，导致实验结果不是很可靠。为了克服这些缺点，许多研究工作者试图发展无需PCR辅助，同时能够灵敏检测端粒酶活性的检测技术。已报道的无需PCR辅助的端粒酶活性检测的方法中，有基于纳米粒子和酶辅助的信号放大技术，但是纳米粒子合成复杂成本高，而酶需要复杂的操控技术，这都限制了这些技术的广泛应用。而其他一些技术例如表面等离子体共振(SPR)、等需要昂贵复杂的仪器，也限制了它们的广泛应用。为了克服这些缺点，不少研究者试图发展不同的检测途径，其中荧光光谱分析方法由于自身的高灵敏性检测，低成本，操作简单，简单的信号输出也被广泛应用于分析检测中。但是目前已经建立的方法中利用蛋白酶进行信号放大不仅操作复杂，而且使实验成本增加，同时对探针的预标记不仅操作复杂而且昂贵，这些都增加了工作的成本和复杂性。
此外，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)是一种荧光染料，对G-四链体有高度选择性，其本身的荧光信号很弱，嵌插G-四链体后能产生明显的荧光信号，而且与单链，双链或者三链的作用很弱。
基于此，本发明结合了链替代辅助三重放大技术与N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)的荧光特性，提供了一种非标记的简单灵敏的检测端粒酶活性的方法。
发明内容
为了克服现有技术中成本较高、操作复杂、步骤繁琐等缺陷，本发明提供了一种非标记的，无需酶辅助信号放大，也无需通过聚合酶链式反应就能够实现放大，灵敏度高的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法。
本发明实现上述目的所采用的技术方案是由以下步骤组成：
(1)将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，并与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系；
(2)将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2以及单链A-DNA和单链T-DNA分别用浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含5mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液稀释成浓度为20μmol/L的H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液；
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液；
(4)向浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含5mmol/L MgCl2和5mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液、H2溶液和步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0；
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含5mmol/L MgCl2和5mmol/LKCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入步骤(1)所配制的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液，使最终的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1；
(6)将步骤(5)的荧光信号值I1与步骤(4)的基底荧光信号值I0进行比较，若I0＜I1，则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。
上述步骤(2)配制的H1溶液和H2溶液以及步骤(3)的AT-DNA溶液分别加热到80～95℃保持5～10min，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
上述步骤(4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量与步骤(1)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液的添加量相等。
上述步骤(4)中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积比为1:3.8～4.2。
上述待检液的添加量与步骤(4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。
本发明的基于三重放大技术非标检测端粒酶活性的方法，是基于链替代反应(SDR)建立了一种新型的无酶辅助、非标记的灵敏检测端粒酶活性的方法，其是利用发夹DNA探针H1和H2均在茎部隐藏有能够形成G-四链体的碱基序列，由引发DNA(T-DNA)和辅助DNA(A-DNA)形成的部分杂交双链DNA(AT-DNA)，当细胞裂解提取的端粒酶与混合核苷酸、端粒酶底物(TS)同时存在时，端粒酶能够延长端粒酶底物，形成一条较长的单链，该单链与许多A-DNA结合形成更稳定的结构，释放出大量的T-DNA完成第一步放大，释放的T-DNA与发夹探针H1作用，打开H1形成T-DNA：H1复合物，K+存在时，在H1的末端形成G-四链体，使N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)嵌插G-四链体产生明显的荧光信号，同时通过链替代反应，H1能够与H2形成更稳定的复合物H1:H2，释放出T-DNA，在K+存在时，H2的末端能够形成另一个G-四链体，使NMM的信号进一步增强实现第二步放大，同时被释放的T-DNA能够继续打开另一个H1完成新一轮的链替代反应，实现第三步放大，使该方法能够灵敏、快速地在均相溶液中检测出待检细胞中端粒酶的活性，从而能够准确判定出待检细胞是癌细胞还是正常细胞，可用于医学诊断癌细胞，为肿瘤疾病的诊断、治疗以及关于疾病机理研究提供了新思路，在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义，此外，本发明的方法充分利用链替代反应，无需酶辅助就能够实现信号放大，也不要复杂的荧光标记过程，响应速度快，操作简单，成本低，适于推广应用。
附图说明
图1是本发明的实验原理图。
图2为人急性淋巴细胞白血病T淋巴(CCRF-CEM)细胞端粒酶延长产物与H1、H2、AT-DNA、NMM作用的荧光光谱图。
图3为N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)与活性海拉细胞(HeLa)端粒酶延长产物与H1、H2、AT-DNA体系作用的荧光光谱图。
图4为N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)与失活海拉细胞(HeLa)端粒酶的延长产物与H1、H2、AT-DNA体系作用的荧光光谱图。
图5为N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)与无TS存在时海拉细胞(HeLa)端粒酶的延长产物与H1、H2、AT-DNA体系作用的荧光光谱图。
图6为N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)与不同个数的海拉细胞(HeLa)提取端粒酶延长产物与AT-DNA、H1、H2体系作用荧光光谱图。
图7为利用TRAP分析技术考察细胞提取物中端粒酶活性凝胶电泳图。
具体实施方式
现结合实施例和实验数据、附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施情形。
实施例1
以检测海拉(HeLa)细胞中的端粒酶为例，结合图1可知，本实施例的检测方法由以下步骤实现：
(1)按照常规方法将养好的海拉细胞裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物TS(序列为：AAT CCG TCG AGCAGA GTT)和500个海拉细胞所对应的端粒酶提取液，37℃孵育1小时，得到待检液体系。
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含有含5mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将发夹DNA探针H1(序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’)、发夹DNA探针H2(序列5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTT AGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’)和单链A-DNA(5’-AA CCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’)、单链(T-DNA 5’-GAGTTAGGG TTAGGGCGGGAATC)分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于1.5mL离心管中，水浴加热到90℃保持5分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到90℃保持5分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(4)向浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.75μL、H2溶液1μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终100μL的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液1μL，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0。
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含有5mmol/L MgCl2、5mmol/LKCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入20μL步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.75μL、H2溶液1μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.5μL，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟，向体系中再加入1μL浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1。
(6)将步骤(5)的荧光信号值I1与步骤(4)的基底荧光信号值I0进行比较，若I0＜I1，则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。本实施例的I0＜I1，该海拉细胞(HeLa)中的端粒酶有活性。
本实施例的端粒重复序列扩增缓冲中包含有20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，pH＝8.3，1.5mmol/L MgC12，1mmol/L EGTA，63mmol/L KCl，0.05％Tween 20，0.2mmol/L dNTPs，0.1mg mL-1BSA。(Wang J.S.，Wu L.,Ren J.S.,and Qu X.G.[J].引物功能化的金纳米粒子可视化检测端粒酶活性Visualizing Human Telomerase Activitywith Primer-Modified Au Nanoparticles.Small.2012,8(2):259-264)。
上述步骤(2)与步骤(4)、步骤(5)所用的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中仅仅是KCl含量不同，但是其制备均属于常规技术，本领域技术人员均可知晓。
实施例2
以检测人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中端粒酶为例，本实施例的检测方法由以下步骤实现：
(1)按照常规方法将养好的人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物TS和500个人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)对应的活性端粒酶提取液，30℃孵育2小时，得到待检液体系。
(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(含5mmol/LMgCl2)将发夹DNA探针H1(序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’)、发夹DNA探针H2(序列5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTT AGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’)和单链A-DNA(5’-AA CCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’)、单链(T-DNA 5’-GAGTTAGGG TTAGGGCGGGAATC)分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于1.5mL离心管中，水浴加热到90℃保持5分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(3)将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到80℃保持10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
(4)向76μL的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.72μL、H2溶液0.96μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.48μL，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30℃孵育60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液0.96μL，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0，结果如图2中的a线。
(5)向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.72μL、H2溶液0.96μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.48μL，使最终的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30℃孵育60分钟，向体系中再加入0.96μL浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1，结果如图2中的b线。
(6)与实施例1相同，从图2结果可以看出，在没有延长产物存在时，NMM的信号值较低(如图2中a线)，在有人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)对应的端粒酶延长产物时，NMM的荧光信号值明显升高(如图2中a线)，说明人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞中含有活性端粒酶，是肿瘤细胞。
实施例3
上述实施例1或2的步骤(1)是按照常规方法将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，向20μL的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中加入0.4μL浓度为10μmol/L的端粒酶底物TS和500个待检细胞所对应的端粒酶提取液，37℃孵育0.5小时，得到待检液体系。步骤(2)中制得的H1溶液和H2溶液分别置于1.5mL离心管中，水浴加热到95℃保持5分钟，自然冷却至室温，于0℃保存，备用。步骤(3)是将步骤(2)配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液，将其置于1.5mL离心管中，水浴加热到95℃保持5分钟，自然冷却至室温，于0℃以下保存，备用。步骤(4)是向84μL浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)H1溶液0.78μL、H2溶液1.04μL和步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.52μL，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液1.04μL，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0。步骤(5)是向与步骤(4)等量的浓度为50mmol/L、pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(其中含有5mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl)中加入20μL步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液0.78μL、H2溶液1.04μL以及步骤(3)制得的AT-DNA溶液0.52μL，使最终的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，37℃孵育30分钟，向体系中再加入1.04μL浓度为100μmol/L的N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1。
其他的操作对应与实施例1或2相同。
上述实施例中所制得的H1、H2、AT-DNA溶液还可以在4℃以下、-80℃以上的任意温度保存，不仅限于上述实施例的温度条件。在步骤(1)中还可以加入肝癌细胞，肺癌细胞，乳腺癌细胞等作为待检细胞按照实施例1的方法进行端粒酶活性的测定。
为了验证本发明的有益效果，申请人进行了大量的对比实验验证，具体可参见下述的实验：
1、荧光强度对照
按照实施例1的方法制得H1溶液、H2溶液以及AT-DNA溶液，将实施例1的荧光信号变化与对比例1、2进行对比，其中，
对比例1：向步骤(1)的待检液体系中加入失活海拉细胞(HeLa)端粒酶；
对比例2：向步骤(1)的待检液体系中没有添加端粒酶底物；
将其分别按照实施例1的方法进行检测，结果分别如图3、4、5所示。
由图3、4、5的对比结果可以看出，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)本身的荧光信号较弱，在加入失活的端粒酶或者没有端粒酶底物存在时，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的荧光信号都基本没有变化，而本发明实施例1在加入活性端粒酶和端粒酶底物时，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)的信号明显增加，说明在活性端粒酶存在时，端粒酶底物被延长，与AT-DNA中的A-DNA结合后释放出的T-DNA能够引发链替代反应，在K+存在时形成G-四链体，NMM嵌插G-四链体产生明显的荧光信号。
2、灵敏度验证
按照实施例1的方法将不同个数海拉细胞(Hela)对应的端粒酶延长产物，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)荧光信号强度进行对比，结果如图6所示。
从图6的结果可以看出，随着逐渐增加海拉(HeLa)细胞数目对应的端粒酶，N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)信号逐渐增加，并且在加入1个海拉(HeLa)细胞对应的端粒酶延长产物时，NMM的信号都有明显的信号变化，说明本发明的方法可以灵敏的检测癌细胞海拉细胞中端粒酶的活性，即利用此方法可以简单快速灵敏准确出肿瘤细胞中端粒酶的活性。
3、可靠性验证
将传统的基于聚合酶链式反应(PCR)技术进行端粒重复序列扩增(TRAP)(WangJ.S.，Wu L.,Ren J.S.,and Qu X.G.[J].Visualizing Human Telomerase Activity withPrimer-Modified Au Nanoparticles.Small.2012,8(2):259-264)方法对上述实施例1所用海拉细胞中所提取的端粒酶活性进行验证，并与失活的端粒酶以及裂解液进行对照，实验结果如图7所示。
由图7可以看到失活的端粒酶和裂解液都没有明显的条带，只有加入活性端粒酶的泳道中才有明显的梯度条带，并且随着细胞个数的增加，梯度条带颜色越来越来深，说明所提取的端粒酶具有活性，进一步验证了实验结果的可靠性。

Claims (5)

1.一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于由以下步骤组成：
（1）将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，并与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系，其中所述端粒酶底物序列为：AAT CCG TCG AGC AGA GTT；
（2）将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2以及单链A-DNA和单链T-DNA分别用浓度为50mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液稀释成浓度为20μmol/L的H1溶液、H2溶液、A-DNA溶液以及T-DNA溶液，其中所述发夹DNA探针H1序列为5’-GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC-3’，发夹DNA探针H2序列为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA-3’，单链A-DNA序列为5’-AACCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC-3’，单链T-DNA序列为5’-GAGTTAGGGTTAGGGCGGGAATC；
（3）将步骤（2）配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液；
（4）向浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）H1溶液、H2溶液和步骤（3）制得的AT-DNA溶液，使最终混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150 nmol/L、200nmol/L、50 nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0；
（5）向与步骤（4）等量的浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中加入步骤（1）所配制的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）的H1溶液、H2溶液以及步骤（3）制得的AT-DNA溶液，使最终的混合体系中H1、H2、AT-DNA的浓度分别为150 nmol/L、200 nmol/L、50 nmol/L，37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1；
（6）将步骤（5）的荧光信号值I1与步骤（4）的基底荧光信号值I0进行比较，若I0＜I1，则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。
2.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（2）配制的H1溶液和H2溶液以及步骤（3）的AT-DNA溶液分别加热到80～95℃保持5～10min，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用。
3.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（4）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量与步骤（1）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液的添加量相等。
4.根据权利要求3所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述步骤（4）中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积比为1:3.8～4.2。
5.根据权利要求1所述的基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于：所述待检液的添加量与步骤（4）的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。
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