CN102876792A

CN102876792A - 一种端粒酶的aetca检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102876792A
Application number: CN2012103704337A
Authority: CN
Inventors: 陈燃; 伍迪; 金晓铮
Original assignee: ZHEJIANG JFK BIOLOGICAL TECHNOLOGY Inc
Current assignee: ZHEJIANG JFK BIOLOGICAL TECHNOLOGY Inc
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: CN102876792B

Abstract

本发明提供了一种端粒酶的锚定延伸端粒序列互补扩增（Anchored-Extension and Telomeric Complements Amplification，AETCA）检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括：（1）内部固定有端粒酶引物ATS（SEQ ID No.1）的锚定PCR管；（2）探针BT（SEQ ID No.2）；（3）PCR引物（SEQ ID No.3/4）；（4）裂解缓冲液；（5）延伸杂交缓冲液；（6）PCR缓冲液；（7）洗涤液。本发明以一段与端粒重复序列互补的探针序列（探针BT）为模板，该探针以多拷贝的形式结合在端粒酶合成的端粒重复序列上，这样虽然端粒重复序列的长度不固定，探针BT的扩增仍能保持高效的固定长度，从而克服了TRAP法的缺陷。本方法操作简便易行，可提高端粒酶活性检测的敏感度和特异性，适合对各种来源的包括来源于痰液等临床标本的细胞或组织进行检测。

Description

一种端粒酶的AETCA检测试剂盒及检测方法

（一）技术领域

本发明涉及一种端粒酶的锚定延伸端粒序列互补扩增（Anchored-Extension and Telomeric Complements Amplification，AETCA）检测试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

端粒酶（telomerase）是一种特殊的逆转录酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白（RNP）复合物，包含3个主要成分：端粒酶RNA（hTR）模板，端粒酶催化亚单位（hTERT）和端粒酶相关蛋白（hTLP）。hTR是端粒酶进行延伸反应的模板，约有450个碱基，其中包含5'-CUAACCCUAAC-3'的模板序列， hTERT是端粒酶逆转录酶的蛋白催化亚基， hTLP是端粒酶的调节单位。端粒酶的主要功能是利用染色体末端（端粒）的3'末端为引物，以自身RNA为模板合成端粒-TTAGGG-重复序列添加到染色体末端，从而维持端粒原有长度，使端粒的稳定和保护染色体的功能得以延续，细胞因逃逸渐进性衰老而达到“永生化”。在一些特定的组织细胞，如：生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、外周血淋巴细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织细胞中有低水平的活化端粒酶的表达，但在正常成熟的体细胞中则没有端粒酶活性，细胞因为端粒的逐渐缩短而导致衰老和死亡。极少数体细胞可能偶然通过激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展，即癌变，因此，端粒酶的重新激活是体细胞向肿瘤细胞转化，即癌变的关键步骤。对大量的临床标本的检测表明，绝大多数的肿瘤细胞都呈端粒酶阳性（>85%），而在癌旁组织和正常组织的端粒酶阳性率很低（<5%），因此，端粒酶是一个被广泛接受的特异性很高的肿瘤标志物.端粒酶的检测则可能发展成为对癌症进行检测和分子诊断的有力手段.端粒酶检测的标本来源可以是培养细胞，手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物，痰液，尿液等。早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液：40～100mg冷冻（-70℃）组织或10⁴～10⁶沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mmol/L hepes-KOH（pH7.5）， 1.5mmol/L MgCl2， 10mmol/L KCI， 1mmol/LDTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mmol/Ltris-HCI（pH7.5）， 1mmol/L MgC12，1mmol/L EGTA， 0.1mmol/L PMSF， 5mmol/L β-巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm，25min， 16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。对某些标本可以用0.5％Tween-20代替0.5％CHAPS。

现有端粒酶活性检测方法有三类: 1.传统的端粒酶活性PCR检测方法: 端粒重复序列扩增方法（Telomeric Repeats AmplificationProtocol， TRAP）及衍生方法； 2. 非TRAP类的PCR检测方法: （premature termination of telomeric extension-PCR，PTEP）； 3. 非PCR类的检测方法.

传统的TRAP法需要进行繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色步骤。此后，虽然许多学者又进行了改进，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪可以进行较精确的半定量测定，但这些改进只是在PCR后的检测手段上的，采用的TRAP-PCR核心反应是相同，因而无法改善TRAP法的如下固有缺陷:

（1）扩增效率低。因为TRAP法是直接以端粒酶的延伸反应的产物做PCR的模板，得到的PCR产物是从几十bp到几百bp的大小不等的一系列条带，扩增产物的不确定性导致扩增效率受到了很大限制，因而降低了灵敏度；

（2）特异性的问题。TRAP扩增产物的不确定性所衍生的问题是结果分析容易收到非特异PCR扩增的干扰；

（3）可重复性/稳定性不好。因为TRAP法是直接将细胞裂解液加入到PCR体系中的，而细胞裂解液往往含有很多抑制PCR反应的成分，所以很容易导致整个检测的失败；

（4）体系对灵敏度的限制。细胞裂解液可用来加入到检测反应体系中的体积，一般不能超过总体积的4%，这就限制了检测的灵敏度；

（5）适用性有局限，不适合用于检测端粒酶抑制的效果。因为PCR与端粒酶延伸反应是偶联在一起的，而端粒酶抑制剂对PCR有很强的抑制作用；

（6) 难于结合实施荧光实时定量PCR。非特异PCR扩增的干扰导致，不适合用SYBR染料法，而探针区域与下游引物区域重叠，不适合用TaqMan探针法。

PTEP法由陈燃等人于2003年报道，同年获得中国发明专利授权（ZL00127583.6）。该方法的原理是: PCR引物的有效性是其3’端与模板的互补结合，而链中间的部分错配不阻碍对PCR反应的引导。该方法引入一段专门构建的159bp DNA，端粒酶引物TS除了3’末端的２个碱基外，与该159bp DNA的两端完全互补；通过不加入dTTP，将端粒酶延伸反应限定终止在一个单元之内，得到提前终止的延伸产物TS+AGGG，之后，向体系中加入dTTP和Taq酶，TS+AGGG做为起始引物引导对该159bp DNA进行扩增　在2个PCR循环之后，由于TS的完全互补序列被合成到新的产物中，TS被用作PCR引物对新的产物进行扩增。扩增产物为159bp DNA的特异片段，适合于各种常规分析方法。该方法对TRAP法的主要改进是将TRAP法的大小不等的不确定的扩增产物改变为一个特异的扩增片段，但因为也是端粒酶延伸反应与PCR的偶联，未能在排除细胞裂解液对PCR的抑制方面有所改进，因此，可重复性/稳定性等方面不够好。另外，需要在反应中间，逐管补充试剂（dTTP和Taq酶），也比较繁琐。

非PCR类的检测方法采用同位素，荧光，化学发光等对端粒酶延伸反应产物进行直接分析测定.这些方法由于敏感度有局限，目前均未能得到广泛应用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种操作简单快速、特异性好的端粒酶活性检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种端粒酶的锚定延伸端粒序列互补扩增检测试剂盒，主要包括：

（1）内部固定有端粒酶引物ATS的锚定PCR管；所述端粒酶引物ATS序列为：5’- TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；端粒酶引物ATS可引导端粒酶合成端粒重复序列的寡核苷酸，其5’端锚定在PCR管壁、磁珠或其他和吸附结合合算的固体介质上；端粒酶引物ATS的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于端粒酶引物ATS的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；

（2）探针BT，其核苷酸序列为：5'-CAGGAGCAGCATTCCATCACGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’；其结构为两端是特异的PCR引物序列，中间为与多个（3个或以上）单元的端粒重复序列的互补序列；下划线为6个单元的互补序列，两端为PCR引物序列；

（3）PCR引物：

TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG

TAB2:CCTTCTCTGGACCTGCGACG；

（4）裂解缓冲液；所述裂解缓冲液为本领域常规含有温和表面活性剂（如NP-40、Triton X100等）、用于细胞裂解的缓冲液；

（5）延伸杂交缓冲液；所述延伸杂交缓冲液为本领域常规用于延伸杂交的缓冲液；

（6）PCR缓冲液；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液；

（7）洗涤液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂的缓冲液。

优选的，所述裂解缓冲液组成如下：1mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA-Na，1% （vol/vol）NP-40（NP-40是很温和的表面活性剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱），0.25mmol/L 脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10%（vol/vol）甘油，5mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。

优选的，所述延伸杂交缓冲液组成如下：1.5mmol/L MgCl₂，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.06mmol/L dNTP，0.1mg/ml BSA，0.05%（vol/vol） Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0 Tris-HCl。

优选的，所述PCR缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% （vol/vol）DMSO，0.05%（vol/vol）Tween20，0.4×SYBR Green I（浓度0.4×的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为1×SYBR Green I 中的0.4倍，通常市购Mircoprobe原液浓度为10000×，使用时按体积比将其稀释至PCR缓冲液中终浓度为0.4×即可），0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl 。

优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液，其终浓度组成为：150 mmol/LNaCl，0.05% Tween 20，溶剂为10 mmol/L、pH 7.5Tris-HCl。

该试剂盒的原理如下：（1）预先制备好可引导端粒酶合成端粒重复序列的寡核苷酸的端粒酶引物ATS；端粒酶引物ATS被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上；（2）与端粒重复序列互补的模板探针——探针BT；探针BT两端带有PCR引物序列，使用时是添加在延伸杂交缓冲液中的；当细胞被裂解后，细胞中的端粒酶可在端粒酶引物末端添加6bp的端粒重复序列，探针BT则通过部分杂交与端粒重复序列结合，这样探针BT也就被选择性地吸附在上述固体介质上；（3）在延伸杂交反应之后，经过反复清洗，只有末端延伸有端粒重复序列的端粒酶引物ATS及与该重复序列杂交结合的探针BT留在反应管中；（4）由于探针BT两端带有PCR引物序列，这样加入PCR反应液后，以探针BT为模板，可直接进行PCR反应。具体参见图1。

本发明还涉及利用所述试剂盒检测端粒酶活性的方法，所述方法包括：

（1）取待测样本，加入裂解缓冲液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；

待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；

待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1~5 ml痰液 +5~10 ml 痰融液，37℃振荡 10min，4℃、5000 rpm 离心10min，弃上清，取沉淀+ 200 ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成: PBS+0.1%（w/vol）DTT。

待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下：24孔板细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；

待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下：取约0.1mm³大小的组织块放入1.5 ml 离心管中，+ 200ul裂解缓冲液，用吸头捣碎组织，室温振荡10min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；

（2）取10uL裂解上清液加入锚定PCR管中，静置1小时后吸干，加入20uL含1nmol/L探针BT的延伸杂交缓冲液（由探针B加入延伸杂交缓冲液制得），再加入5uL裂解上清液，置于PCR仪上，33℃30min，95℃ 3min，60℃ 3min，进行延伸杂交反应；

（3）延伸杂交反应结束后，吸干反应液，以洗涤液洗涤5~9次，吸干，加入15uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液（PCR反应液中引物对浓度为0.2umol/L），进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；

（4）以空白裂解缓冲液作为阴性对照，按照步骤（1）~（4）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解缓冲液Ct值判断为阳性。

所述PCR扩增条件如下： 94℃预变性3min；然后94℃ 3s、64℃20s，35个循环。

本发明主要优点如下:

一、通过2项设计提高了敏感度：

1.一管两步反应法。端粒酶延伸反应对裂解液的适应范围比Taq酶大的特点。将端粒酶延伸反应与PCR分成2步进行，由于端粒酶引物和延伸产物是锚定在固体介质上的，可以在两步反应之间，通过洗涤去除PCR抑制物，加入到反应体系中的细胞裂解液可以由4%提高到33%，因此，敏感度提高了8倍；

2.探针模板，两个优化的PCR专用引物，一个特异产物，大大降低了非特异PCR反应的可能性，提高了扩增效率。并且，一个较长的端粒重复序列产物，可以结合多个用作PCR模板的探针。进一步提高了敏感度，以一个300bp（50个单元）来估算，可以结合8个探针（6个单元），又提高8倍。

结合1，2两点，总体敏感度可以比TRAP法提高60倍以上。

二、简化了操作。整个过程顺畅简单，虽然是两步反应，但第二步PCR的反应体系，对于不同的样品一是完全一致的，所以就是一个简单分装的过程; 产物检测完全做到了可以与常规的PCR一样简便，如琼脂糖电泳观测; 也可以结合应用各种荧光实时定量PCR，如常用的SYBR染料法，TaqMan探针法等。

详细的比较见下表：

本发明不是以端粒重复序列为PCR模板，而是以一段与端粒重复序列互补的探针序列（探针BT）为模板，该探针以多拷贝的形式结合在端粒酶合成的端粒重复序列上，这样虽然端粒重复序列的长度不固定，探针BT的扩增仍能保持高效的固定长度，从而克服了TRAP法的缺陷。本方法操作简便易行，可提高端粒酶活性检测的敏感度和特异性，适合对各种来源的包括来源于痰液等临床标本的细胞或组织进行检测。

（四）附图说明

图1为本发明原理示意图；BT: 互补结合模板；C: 固定介质；P1/P2: PCR引物对；ATS: 锚定的端粒酶引物；TR: 端粒酶延伸合成的端粒重复序列；IIII: 互补杂交结合；

图2为对肺癌患者及正常人对照的痰液样品进行检测的结果。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：洗涤去除非固定的探针BT

50ul延伸杂交缓冲液，其中添加有1nmol/L的探针BT，加到0.2ml的PCR薄壁管中，25℃保温10min， 55~70℃保温5~15min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1，3，5，7，9 或12次，加入50ul PCR反应液，进行PCR程序（94℃ 3min 预变性，然后40个循环的94℃ 3s，66℃ 30s，二步法），以SYBR green I荧光定量分析，结果见下表。结果显示洗涤次数达到及超过5次，探针BT不再有强于空白对照的扩增信号（Ct值与空白相当），表明洗涤步骤可以彻底洗掉不结合的探针DNA。

PCR反应液组成：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% DMSO，0.05% Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，0.2umol/L引物对，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。

端粒酶引物ATS：5’- TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；

探针BT：5'-CAGGAGCAGCATTCCATCACGCCCTAACCCTAACCC TAACCCTAACCCTAACCCTAACGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’；

PCR引物：TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG 和TAB2:CCTT CTCTGGACCTGCGACG；

空白对照的Ct值（来源于引物二聚体）在27.28~28.62之间. 当洗涤次数达到及超过5次，探针BT的Ct值为27.94~28.50，与空白对照的值相当，说明不再有特异扩增。

实施例2：磁珠法制作锚定管

TBST缓冲液20ul，含有 10ug Dynabeads? M-280链霉亲和素磁珠和 2pmol生物素化的端粒酶引物ATS（生物素由引物合成时修饰到5’端），装入0.2ml的PCR薄壁管中，室温1hr，以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加50ul TBST 缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共6次，最后吸干；加50ul TE缓冲液，然后以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，加入20ul细胞裂解液上清（A549细胞用24孔板（10~10000个/孔）进行细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液），室温放置1hr，吸干，加入20ul延伸杂交缓冲液，为了进一步增强反应，再加入5ul细胞裂解液上清，33℃保温30min， 66℃保温5min，再以磁铁将磁珠吸附在管壁内，吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤6次，加入20ul PCR反应液（同实施例1），进行PCR程序（95℃2min 预变性，然后40个循环的95℃ 3s， 64℃ 30s，二步法），SYBR荧光定量分析，结果见下表。用这种方法，对10-10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值）。

实施例3：直接PCR管内偶联法制作锚定管

TBST缓冲液50ul，含有5pmol生物素化的端粒酶引物ATS，装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST 缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例2），室温放置1hr，吸干，加入40ul延伸杂交缓冲液（含0.1nmol/L探针BT），再加入10ul细胞裂解液上清， 30℃保温30min， 64℃保温10min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤7次，加入50ul PCR反应液（同实施例1），进行PCR程序（93℃ 3min 预变性，然后40个循环的93℃ 3s， 62℃ 30s，二步法）， SYBR荧光定量分析，结果见下表。用这种方法，对10-10000个A549细胞进行检测，可以得到阳性结果（细胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值）.

实施例4：微球法制作锚定管

1ml的50mmol/L MES pH6.1 缓冲液中含有: 1%羧基化的橡胶微球（Latex beads，carboxylate-modified polystyrene， SigmaCLB9），0.1mmol/L 氨基修饰的端粒酶引物ATS（氨基化修饰于引物合成时进行）和0.15mmol/L 新鲜配制的EDAC（偶联剂），室温反应1hr，然后离心3min（15000 rpm），用1ml的TBST缓冲液洗涤3次，微球重新悬浮在1ml TE中. 取1ul微球，加入50ul细胞裂解液上清（同实施例2），室温放置1hr，离心吸干，+40ul延伸杂交缓冲液（含1nmol/L探针BT），+10ul细胞裂解液上清，35℃保温20min，62℃保温15min，再离心3min （15000 rpm），用100ul的TBST缓冲液洗涤8次，加入20ul PCR反应液（同实施例1），进行PCR程序（92℃ 3min 预变性，然后40个循环的92℃ 3s， 60℃ 30s，二步法）， SYBR荧光定量分析，结果见下表。对10-10000个A549细胞进行检测，得到阳性结果.

实施例5：端粒酶引物ATS的优化

三种5’-生物素化的端粒酶引物ATS， ATS1:AAAAAATCCGTCGAGCAGAGTT，

ATS2: AAAATCCGTCGAGCAGAGTTAG，

ATS3: TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG

TBST缓冲液50ul，分别含有5pmol 5’-生物素化的端粒酶引物ATS（1/2/3），装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST 缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，加入50ulA549细胞裂解液上清（A549细胞用24孔板（1000个/孔）进行细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液）， 25℃保温20min，吸干， +40ul延伸杂交缓冲液（含0.1nmol/L探针BT）， 10ul A549细胞（100个细胞）裂解液上清， 33℃保温30min， 85℃保温5min， 66℃保温5min，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤7次，加入50ul PCR反应液（SYBR荧光定量），进行PCR程序（92℃3min 预变性，然后35个循环的92℃ 3s， 66℃ 30s，二步法）， SYBR荧光定量分析，结果见下表。结果显示ATS3得到最小的Ct值，说明其灵敏度最好。

实施例6：以AETCA端粒酶检测试剂盒检测A549的端粒酶活性

AETCA试剂盒7种成分:1.预制的锚定了端粒酶引物ATS3的PCR管；2.裂解缓冲液；3.延伸杂交缓冲液；4.TBST洗涤液；5.PCR缓冲液（SYBR荧光定量）；6.探针BT（在延伸杂交缓冲液中添加浓度为0.1nmol/L）；7.PCR引物（在PCR缓冲液中添加浓度为0.2umol/L）。

端粒酶引物ATS：5’- TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；

PCR引物：TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG 和TAB2:CCTTCTCTGGACCTGCGACG；

裂解缓冲液组成如下：1mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA-Na，1% NP-40，0.25mmol/L 脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10% 甘油，5mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。

延伸杂交缓冲液组成如下：1.5mmol/L MgCl₂，63 mmol/LKCl，1mmol/L EGTA-Na，0.06mmol/L dNTP，0.1mg/ml BSA，0.05% Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0 Tris-HCl。

PCR缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% DMSO，0.05% Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl 。

检测方法如下：

（1）A549细胞用24孔板（10-10000个/孔）进行细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；

（2）取10uL裂解上清液加入锚定PCR管中，加入20uL含1nmol/L探针BT的延伸杂交缓冲液，置于PCR仪上，33℃30min，95℃ 3min，60℃3min，进行延伸杂交反应；

（3）延伸杂交反应结束后，吸干反应液，以洗涤液洗涤6次，吸干，加入15uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液（PCR反应液中引物对浓度为0.2umol/L），进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析。

以该试剂盒对10-10000个A549细胞进行检测，均能得到阳性结果。

实施例7：以AETCA端粒酶检测试剂盒检测人表皮鳞状细胞癌细胞株A431的端粒酶活性

AETCA试剂盒7种成分同实施例6。

以该试剂盒按照实施例6方法对10-10000个A431细胞进行检测，均能得到阳性结果：

实施例8 ：以AETCA端粒酶检测试剂盒检测人胚肾细胞株293T的端粒酶活性

AETCA试剂盒7种成分同实施例6。

以该试剂盒按照实施例6方法对10-10000个293T细胞进行检测，均能得到阳性结果：

实施例9：以AETCA端粒酶检测试剂盒检测人宫颈癌细胞株Hela的端粒酶活性

AETCA试剂盒7种成分同实施例6。

以该试剂盒按照实施例6方法对10-10000个Hela细胞进行检测，均能得到阳性结果：

实施例10：以AETCA端粒酶检测试剂盒检测人痰液标本的端粒酶活性

AETCA试剂盒7种成分同实施例6。

裂解上清液获得方法如下：1~5 ml痰液 + 5~10 ml 痰融液，37℃振荡 10min，4℃、5000 rpm 离心10min，弃上清，取沉淀+ 200 ul裂解缓冲液，反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成: PBS+0.1%DTT。

以该试剂盒按照实施例6方法对痰液样品进行检测，20例肺癌患者中检测阳性结果为18例，阴性2例； 3例正常人对照的检测结果均为阴性：

实施例11：PCR引物序列的改变，不影响AETCA端粒酶检测试剂盒的检测效果

AETCA试剂盒7种成分除PCR引物外其他同实施例6。

在PCR反应液中测试了3对PCR引物:

NTP1: CCGGAGGAAAGCGTGGACACC 和NTP2: CGCCGAAACCTCA A CC GTCG；

TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG 和TAB2:CCTTCTCTGG ACCTGCGACG；

PEG1:CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC 和PEG2:CTTGCTCACCA TGGTGGCGAC。

对应的探针BT序列分别为：

CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGACGGTTGAGGTTTCGGCG（对应NTP1、2）

CAGGAGCAGCATTCCATCACGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGTCGCAGGTCCAGAGAAGG （对应TAB1、2）

CGTCAGATCCGCTAGCGCTACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGTCGCCACCATGGTGAGCAAG（对应PEG1、2）

分别对1000个A549细胞进行检测，均得到阳性结果：

实施例12：以TaqMan探针替代SYBR Green I染料，不影响AETCA端粒酶检测试剂盒的检测效果.

AETCA试剂盒6种成分:1~4、6~7不变，第5种成分，即PCR缓冲液，不加入SYBR Green I，而是加入0.2 umol/L TaqMan探针: FAM-TAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-TAMRA。

以该试剂盒对10-10000个A549细胞进行检测，均能得到阳性结果：

实施例13：琼脂糖电泳结合EB染色也可以用于AETCA端粒酶检测试剂盒的检测

AETCA试剂盒6种成分:1~4、6~7不变，第5种成分，即PCR缓冲液，不加入SYBR Green I（即无荧光定量）。

对肺癌患者及正常人对照的痰液样品进行检测，结果分析采用琼脂糖电泳结合EB染色，紫外分析仪上观测拍照，结果参见附图2。结果可见: 3例正常人对照（N4，N5，N6）只有分子量较小的引物二聚体条带（左面白色箭头所指的位置），无分子量较大的特异扩增条带（右面白色箭头所指的位置），结果均为阴性； 21例肺癌患者中检测阳性结果为12例（21， 23， 25， 28， 29， 32， 33， 35，36， 38， 39， 41），阴性9例（22， 24， 26， 27，30， 31， 34， 37， 40）。

Claims

1.一种端粒酶的锚定延伸端粒序列互补扩增检测试剂盒，主要包括：

（1）内部固定有端粒酶引物ATS的锚定PCR管；所述端粒酶引物ATS序列为：5’- TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；

（2）探针BT，其核苷酸序列为：5'-CAGGAGCAGCATTCCATCACGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’；

（3）PCR引物：

TAB1:CAGGAGCAGCATTCCATCACG

TAB2:CCTTCTCTGGACCTGCGACG；

（4）裂解缓冲液；

（5）延伸杂交缓冲液；

（6）PCR缓冲液；

（7）洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述裂解缓冲液组成如下：1mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA-Na，1% NP-40，0.25mmol/L 脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10% 甘油，5mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述延伸杂交缓冲液组成如下：1.5mmol/L MgCl₂，63 mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.06mmol/L dNTP，0.1mg/ml BSA，0.05% Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0 Tris-HCl。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% DMSO，0.05% Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl 。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。

6.利用如权利要求1所述试剂盒检测端粒酶活性的方法，所述方法包括：

（2）取10uL裂解上清液加入锚定PCR管中，静置1小时后吸干，加入20uL含0.1nmol/L探针BT的延伸杂交缓冲液，再加入5uL裂解上清液，置于PCR仪上，33℃30min，95℃ 3min，60℃ 3min，进行延伸杂交反应；

（3）延伸杂交反应结束后，吸干反应液，以洗涤液洗涤5~9次，吸干，加入15uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；

（4）以空白裂解缓冲液作为阴性对照，按照步骤（1）~（4）方法进行处理和分析，以空白裂解缓冲液Ct值减去样本Ct值的差值大于或等于1，判断样品为阳性。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下： 94℃预变性3min；然后94℃ 3s、64℃20s，35个循环。