CN103333958B - 免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒 - Google Patents

免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新的端粒酶扩增方法——免洗涤的锚定延伸端粒亲和扩增（Washing-free，Anchored-extension and Telomeric-binding Amplification；WATA）。该方法利用一个锚定端粒酶引物进行端粒TTAGGGG序列（简称为G序列）延伸，以另一个带有通用PCR引物序列和6个单元的端粒CCCTAA序列（简称为C序列）的模板探针杂交结合在延伸的G序列上，通过酶切反应，除去未结合的模板探针，与G序列结合的模板探针进行PCR反应，扩增产物为一个固定长度的特异DNA片段。该方法将端粒酶活性检测过程简化为一管内完成的简单连续步骤，具有灵敏度高、特异性好等优点，适合推广到对各种来源的样品进行端粒酶活性检测。

Description

免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒
（一）技术领域
本发明涉及一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增（Washing-free,Anchored-extension and Telomeric-binding Amplification；WATA）端粒酶的方法及试剂盒。
（二）背景技术
端粒酶（telomerase）是一种特殊的逆转录酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白（RNP）复合物，包含3个主要成分：端粒酶RNA（TERC）模板，端粒酶催化亚单位（TERT）和端粒酶相关蛋白（TLP）。TERC是端粒酶进行延伸反应的模板，约有450个碱基，其中包含5'-CUAACCCUAAC-3'的模板序列，TERT是端粒酶的蛋白催化亚基，TLP是端粒酶的调节单位。端粒酶的主要功能是利用染色体末端端粒DNA的3'末端为引物，以自身RNA为模板合成延伸端粒-TTAGGG-重复序列（G序列），从而弥补细胞分裂过程中丢失的端粒DNA序列。在一些特定的组织细胞，如：生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、外周血淋巴细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织细胞中有低水平的活化端粒酶的表达，但在正常成熟的体细胞中则没有端粒酶活性，细胞因为端粒的逐渐缩短而导致衰老和死亡。极少数体细胞可能偶然通过激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展，即癌变，因此，端粒酶的重新激活是体细胞向肿瘤细胞转化，即癌变的关键步骤。目前发现，绝大多数的恶性肿瘤细胞都呈端粒酶阳性（>85%），而在癌旁组织和正常组织的端粒酶阳性率很低（<5%），因此，端粒酶是一个被广泛接受的特异性很高的肿瘤标志物。端粒酶的检测有望发展成为对癌症进行检测和分子诊断的有力手段。端粒酶检测的标本来源可以是培养细胞、手术摘除组织、针吸活检组织、胸水、腹水、膀胱或胰管冲洗液、棉拭子所取分泌物、痰液、尿液等。
现有端粒酶活性检测方法有三类:1.非PCR类的检测方法。这些方法采用同位素，荧光，化学发光等对端粒酶延伸反应产物进行直接分析测定。由于灵敏度有局限，目前已经基本被基于PCR扩增的检测方法所取代。2.传统的端粒酶活性PCR检测方法:端粒重复序列扩增方法（Telomeric Repeats Amplification Protocol，TRAP）及衍生方法，扩增产物是一系列长度不等的DNA片段；3.非TRAP类的PCR检测方法，包括提前中止端粒序列延伸-PCR（Premature Termination of telomericExtension-Pcr，PTEP）和锚定延伸端粒序列亲和扩增（Anchored-Extensionand Telomeric Complements Amplification，AETCA），扩增产物是一个固定长度的特异DNA片段；
传统的TRAP法需要进行繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色步骤。此后，虽然许多学者又进行了改进，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪器可以进行较精确的半定量测定，但这些改进只是在PCR后的检测手段上的，采用的TRAP-PCR核心反应是相同，因而无法改善TRAP法的如下固有缺陷：
（1）扩增效率低。因为TRAP法是直接以端粒酶的延伸反应的产物做PCR的模板，得到的PCR产物是从几十bp到几百bp的大小不等的一系列条带，扩增产物的不确定性导致扩增效率受到了很大限制，因而降低了灵敏度；
（2）特异性的问题。TRAP扩增产物的不确定性所衍生的问题是结果分析容易收到非特异PCR扩增的干扰；
（3）可重复性/稳定性不好。因为TRAP法是直接将细胞裂解液加入到PCR体系中的，而细胞裂解液往往含有很多抑制PCR反应的成分，所以很容易导致整个检测的失败；
（4）体系对灵敏度的限制。细胞裂解液可用来加入到检测反应体系中的体积，一般不能超过总体积的4%，这就限制了检测的灵敏度；
（5）适用性有局限，不适合用于检测端粒酶抑制的效果。因为PCR与端粒酶延伸反应是偶联在一起的，而端粒酶抑制剂对PCR有很强的抑制作用；
（6)难于结合实施荧光实时定量PCR。非特异PCR扩增的干扰导致，不适合用SYBR染料法，而探针区域与下游引物区域重叠，不适合用TaqMan探针法。
PTEP法由陈燃等人于2003年报道，同年获得中国发明专利授权（ZL00127583.6）。该方法的原理是:PCR引物的有效性是其3’端与模板的互补结合，而链中间的部分错配不阻碍对PCR反应的引导。该方法引入一段专门构建的159bp DNA，端粒酶引物TS除了3’末端的2个碱基外，与该159bp DNA的两端完全互补；通过不加入dTTP，将端粒酶延伸反应限定终止在一个单元之内，得到提前终止的延伸产物TS+AGGG，之后，向体系中加入dTTP和Taq酶，TS+AGGG做为起始引物引导对该159bpDNA进行扩增在2个PCR循环之后，由于TS的完全互补序列被合成到新的产物中，TS被用作PCR引物对新的产物进行扩增。扩增产物为159bp DNA的特异片段，适合于各种常规分析方法。该方法对TRAP法的主要改进是将TRAP法的大小不等的不确定的扩增产物改变为一个特异的扩增片段，但因为也是端粒酶延伸反应与PCR的偶联，未能在排除细胞裂解液对PCR的抑制方面有所改进，因此，可重复性/稳定性等方面不够好。另外，需要在反应中间，逐管补充试剂（dTTP和Taq酶），也比较繁琐。
AETCA法由陈燃等人于2012年发明。该方法利用一个锚定端粒酶引物进行端粒G序列延伸，以另一个带有通用PCR引物序列和6个单元的端粒C互补序列的模板探针杂交结合在锚定的端粒G序列上，通过反复洗涤，除去未结合的模板探针，与锚定的端粒G序列结合的模板探针则在随后的PCR反应被扩增，产物为一个固定长度的特异DNA片段。该方法采用的反复洗涤步骤可以除去PCR抑制物质，并且模板探针以多拷贝的形式结合在锚定的端粒G序列上，富集了PCR的模板，提高了方法的整体灵敏度，但反复洗涤步骤比较比较繁琐，模板探针与目标G序列结合的温度控制要求较高，且受环境温度变化的影响，若室温过低，则容易导致非特异的结合，造成假阳性，这些给结果造成了不稳定不一致的因素。本发明对AETCA法进行了重大的革新改进：通过引入一个抑制探针介导的酶切反应除去未结合G序列的模板探针，免去了洗涤步骤。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种操作简单快速、高性能的端粒酶扩增方法及检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：
一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增端粒酶的方法，所述方法是将待测样品的细胞裂解上清液加入固定有端粒酶引物的PCR反应管中，冰上放置使端粒酶与引物结合，吸干上清后，加入由模板探针、抑制探针、缓冲液和dNTP组成的端粒酶反应体系，在30～37℃保温进行端粒G序列延伸反应，随即在55～65℃保温进行杂交反应，之后吸干，加入含有限制性内切酶和PCR引物的PCR反应液，先以37℃保温10分钟，随即进行PCR反应，PCR反应产物用于荧光定量或琼脂糖凝胶电泳分析；
所述端粒酶引物序列如下：
5’-TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；其下划线部分为与端粒酶TERC的模板区域互补结合的序列，其5’端固定在PCR管壁、磁珠或其他和吸附结合合算的固体介质上；端粒酶引物S的固定可以采用本领域常规方法进行，用于端粒酶引物S的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质。
所述模板探针序列如下（其两端为PCR引物位点，中间为n个单元的端粒重复序列(TTAGGG)n（G序列）的互补序列（C序列），在C序列与PCR引物位点之间加入有限制性内切酶的酶切位点）：
5’-CCGTCACCCTGGATGC GGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；阴影部分是6个单元的G序列(TTAGGG)6的互补的C序列，下划线标出的序列是BamHI的识别位点，方框内为与抑制序列结合的区域，两端序列分别为PCR通用引物对：5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’和5’-AAGAGCC G C G A GCG A TCCTT-3’的PCR识别位点。
所述抑制探针序列如下：
5’-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3’；下划线标出的是BamHI识别位点；
所述PCR引物序列如下：
上游引物：5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，
下游引物：5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’。
具体的，所述方法如下：
（1）合成端粒酶引物，将其固定到PCR反应管中，得到锚定PCR管；
优选的，所述的固定有端粒酶引物的锚定PCR管的制作方法如下：TBST缓冲液50ul，含有5pmol生物素化的端粒酶引物，装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ul TBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，密封后放置于-20℃备用。
（2）分别合成模板探针和抑制探针；
（3）将模板探针和抑制探针复性结合形成双链DNA，记作dsTU；
具体方法可如下：模板探针和抑制探针分别溶解在TE缓冲液中，取等摩尔的模板探针和抑制探针混合在一起，60℃10min，37℃10min，冷却到室温，得到dsTU。由于dsTU带有完整的BamHI位点，所以能被BamHI切割。
以上步骤都可以在进行端粒酶活性检测之前批量准备好，冻存于-20℃备用。
（4）取待测样本，加入裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置10min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂（如吐温20、NP-40、CHAPS等）、用于细胞或组织裂解得到保留端粒酶活性的缓冲液；
待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；
待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1～5ml痰液+5～10ml前处理液，37℃振荡10min，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，取沉淀+200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；前处理液组成为：PBS+0.1%（w/vol）DTT。
待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下：24孔板细胞培养，吸去培养液，加入200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；
待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下：取约0.1cm3大小的组织块放入1.5ml离心管中，加入200ul裂解液，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；
优选的，所述裂解液组成如下：1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA-Na，1%（vol/vol）NP-40（NP-40是很温和的表面活性剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱），0.25mmol/L脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10%（vol/vol）甘油，5mmol/L2-巯基乙醇，0.1mmol/LAEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。
（5）取裂解上清液至锚定PCR管中，轻轻振荡后，冰上放置30min（目的是使得裂解上清液中的端粒酶分子与固定的端粒酶引物结合吸附在反应管中。），吸干，加入由缓冲液（端粒酶反应缓冲液）、dNTP和dsTU配制的端粒酶反应液，30～37℃30～60min（目的是进行端粒G序列的延伸反应），55～65℃15～30min（目的是解链dsTU，同时恢复单链的模板探针T复性结合到延伸的端粒G序列上。），吸干管内液体（吸干的步骤可以除去抑制干扰酶切及PCR反应的物质），加入由缓冲液（RE/PCR反应缓冲液）、dNTP、Taq酶、PCR引物、SYBR green I或TaqMan探针及BamHI所配制的RE/PCR反应液，在PCR仪上进行如下程序：37℃酶切5～15min（残留痕量的dsTU被切割，与端粒G序列结合的模板探针T，因BamHI位点的完整性被破坏了，因此不会被酶切。整合的酶切反应不仅能防止未与端粒延伸序列杂交结合的模板探针B对PCR反应的干扰，也能防止痕量的PCR产物气溶胶扩散造成的交叉污染，从而保证了PCR反应的特异性和成功率），92～95℃预变性2～5min，然后35个循环的92～95℃3～30sec，55～65℃20～60sec；扩增产物用于荧光定量分析；所述缓冲液为常规用于PCR反应的缓冲液；
实际检测时，需以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（4）～（5）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值，且差的绝对值大于等于1，判断为阳性。
优选的，步骤（5）中所述端粒酶反应液（端粒酶反应缓冲液+0.06mmol/L dNTP+1nmol/L dsTU）组成如下：0.06mmol/L dNTP，1nmol/LdsTU，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.1mg/mlBSA，0.05%（vol/vol）Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0Tris-HCl。
优选的，步骤（5）中所述RE/PCR反应液（RE/PCR缓冲液+dNTP+Taq酶+PCR引物+SYBR green I（或TaqMan探针）+BamHI）组成如下：0.2mmol/L dNTP，1U/50ul Taq酶，PCR引物0.2umol/L，0.4×SYBR GreenI，2U/50ul BamHI，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.05%（vol/vol）Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
本发明还涉及一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶活性的试剂盒，主要包括固定有端粒酶引物的锚定PCR管，模板探针、抑制探针、PCR引物，端粒酶反应缓冲液、RE/PCR反应缓冲液，以及Taq酶和BamHI酶；上述为试剂盒主要试剂，还有dNTP、SYBR Green I或TaqMan探针等，本领域普通技术人员可根据需要进行选择；
所述端粒酶引物序列如下：
5’-TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；
所述模板探针序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGATCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；
所述抑制探针序列如下：
5’-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3’；
所述PCR引物序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，
5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’；
所述端粒酶反应缓冲液组成如下：1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.1mg/ml BSA，0.05%Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0Tris-HCl。
所述RE/PCR反应缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
所述试剂盒中还可包括细胞裂解液，组成如下：1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA-Na，1%NP-40，0.25mmol/L脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10%（vol/vol）甘油，5mmol/L2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。
TRAP法是对端粒延伸产物进行扩增，而本发明保留了AETCA方法的优点，即不以端粒延伸序列为PCR模板，而是以与端粒序列互补结合的模板探针为PCR模板，该模板探针能够以多拷贝的形式结合在端粒酶合成的较长的端粒延伸序列上，这样虽然端粒延伸序列的长度不固定，模板探针的扩增仍能保持高效的固定长度，从而克服了TRAP法的扩增长度不固定的低效缺陷。本方法不用进行AETCA法的反复洗涤步骤，因此简化了操作，增强了一致性，并且方法上先通过低温吸附把端粒酶分子结合到锚定的端粒酶引物上，通过吸干换液去除PCR抑制物，提高了PCR扩增效率。
与TRAP法相比，本发明的方法提高了用于PCR的模板量，因此提高了检测的灵敏度。模板的提高量的估算如下：
以通常端粒延伸产物以6bp的单元递增分布在从36bp（6个单元）～354bp（59个单元）之间来估算，端粒延伸产物可以结合的模板探针量为：
a.36bp～66bp:共6个6bp递增的端粒延伸产物，分别可以结合1个模板探针；
72bp～102bp:共6个6bp递增的端粒延伸产物，分别可以结合2个模板探针；
……
324bp～354bp：共6个6bp递增的端粒延伸产物，分别可以结合9个模板探针；
b.总的被结合的模板探针量为：
(1+2+3+4+5+6+7+8+9)×6=270，
因此，推算出本方法的灵敏度可以是TRAP法的270倍。
由于只有在存在6个单元以上的单链TTAGGG端粒DNA序列的情况下，模板区域的BamHI位点的完整性被破坏，而PCR扩增产物中BamHI位点是保持完整的，若痕量的扩增产物污染到WATA体系，这些扩增产物将被体系中的BamHI切割，因此，本发明方法的另一个重要优点是能在一定程度上限制扩增产物造成的假阳性交叉污染。
本发明的有益效果主要体现在：本发明方法操作简便易行，可提高端粒酶活性检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的包括来源于痰液等临床标本的细胞或组织进行检测。
（四）附图说明
图1为本发明方法流程示意图；
步骤S0，固定端粒酶引物（TS）；
步骤S1，裂解细胞，得到裂解上清液，其中含有端粒酶分子；
步骤S2，冰上放置，使得端粒酶分子吸附结合到TS上；
步骤S3，吸干后，加入端粒酶反应体系，先进行端粒延伸反应，再进行杂交反应，模板探针与端粒延伸产物结合；
步骤S4，吸干后，加入RE/PCR体系，PCR反应程序前增加37°C保温以切割多余的模板探针，与端粒延伸产物结合的模板探针，因为酶切位点处呈单链状态不能被切割而保持完整；
步骤S5,继续进行PCR程序，模板探针被扩增，结果显示端粒酶活性；
TS，端粒酶引物；TPB，模板探针；CSC，抑制探针；RS，酶切位点。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：整合有BamHI的WATA体系，可以除去痕量的dsTU对PCR的干扰
（1）合成各引物和探针序列：
端粒酶引物S序列如下：5’-TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；
模板探针T序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGATCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；
抑制探针U序列如下：5‘-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3‘；
PCR引物序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，
5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’。
（2）固定有端粒酶引物S的锚定PCR管制作：
TBST缓冲液50ul，含有5pmol生物素化的端粒酶引物S，装入链霉亲和素包被的0.2ml PCR薄壁管中，室温1hr，吸干管内液体，加100ulTBST缓冲液，打匀，吸干，如此反复洗涤共3次，最后吸干；加100ul TE缓冲液，然后，吸干管内液体，密封后放置于-20°C备用。
（3）裂解液及反应液组成：
裂解液T组成：1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA-Na，1%（vol/vol）NP-40，0.25mmol/L脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10%（vol/vol）甘油，5mmol/L2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。
端粒酶反应液（反应液T）组成如下：0.06mmol/L dNTP，1nmol/LdsTU，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.1mg/mlBSA，0.05%Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0Tris-HCl。
RE/PCR反应液组成如下：0.2mmol/L dNTP，1U/50ul Taq酶，PCR引物0.2umol/L，0.4×SYBR Green I，2U/50ul BamHI，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
不含BamHI的常规PCR反应液组成：0.2mmol/L dNTP，1U/50ul Taq酶，PCR引物0.2umol/L，0.4×SYBR Green I，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，0.05%Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
人肺癌细胞株A549细胞（购自美国ATCC）于24孔板中进行细胞培养，10000个细胞/孔，共8孔细胞。过夜培养后，吸去培养液，加入200ul/孔裂解液T，反复吸打，分别转移到8个1.5ml离心管中，冰上放置10min，4℃、15000rpm离心10min后，取上清得到裂解上清液。
分别取50ul裂解上清液加到6个0.2ml的固定有端粒酶引物的反应管中，其中4个再分别加入1nmol/L dsTU，另外4个加入相当于dsTU体积的ddH2O对照，30℃保温30min，再60℃保温30min，吸干，4管（2个含dsTU，2个ddH2O对照，下同）加入不含BamHI的常规PCR反应液，另3管加入含BamHI的RE/PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，按37℃10min，94℃3min，再40个循环的94℃5sec63℃30sec，SYBR greenI荧光定量分析。结果如下：
可见，2种体系ddH2O对照的Ct值（来源于引物二聚体）>29。常规PCR，dsTU管Ct值<21，远远小于对照的，说明含1nmol/L dsTU的裂解上清液的反应管在吸干后，残留的痕量dsTU有明显扩增。RE/PCRdsTU管Ct值>29，与对照相当，说明RE/PCR体系可以有效地切割控制残留的痕量dsTU造成的扩增本底。
实施例2：整合有BamHI的WATA体系，可以除去痕量PCR产物污染的干扰
引物、探针序列、反应管、裂解液T、反应液T、常规PCR反应液、RE/PCR反应液如同实施例1。
A549细胞及裂解上清液的制备同实施例1。分别取50ul裂解上清液加到8个0.2ml的固定有端粒酶引物的反应管中，其中4个再分别加入稀释度为10-7的扩增产物，另外4个加入相同体积的ddH2O对照，30℃保温30min，再60℃保温30min，吸干，4管（2个含扩增产物，2个ddH2O对照，下同）加入不含BamHI的常规PCR体系，另3管加入含BamHI的RE/PCR体系，在荧光定量PCR仪上，按37℃10min，94℃3min，再40个循环的94℃5sec63℃30sec，SYBR green I荧光定量分析。结果如下：
可见，2种体系ddH2O对照的Ct值（来源于引物二聚体）>29。常规PCR，扩增产物管Ct值<16，远远小于对照的，说明稀释度为10-7的扩增产物能够给常规PCR体系造成严重假阳性污染，而RE/PCR扩增产物管Ct值>29，与对照相当，说明RE/PCR体系可以有效地切割控制痕量的扩增产物污染造成的假阳性。
实施例3WATA法检测人肺癌A549细胞的端粒酶活性
引物、探针序列、反应管、裂解液T、反应液T、RE/PCR反应液如同实施例1。
检测方法如下：
1）A549细胞用24孔板（约10-10000个/孔）进行细胞培养，吸去培养液，加入200ul/孔的裂解液T，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液。
2）取50uL裂解上清液加入锚定PCR管中，冰上放置30min，吸干，加入50uL含1nmol/L dsTU的反应液T，30℃30min，60℃30min。
3）吸干，加入50uL RE/PCR反应体系（PCR缓冲液、0.2umol/L PCR引物、0.2mmol/L dNTP、1U Taq酶、2UBamHI），在PCR仪上先37°C10min，94℃3min，然后进行40个循环94℃5sec63℃30sec，SYBR green I荧光定量分析。
4）以裂解液和热灭活（80°C10min）的1000个细胞裂解上清液做为阴性对照，取代裂解上清液，进行上述2）～-3）步的操作。
5）以Ct值≤28，判断为阳性，Ct值>28，判断为阴性结果如下：
样品 Ct 结果判断
裂解液 29.55 阴性
10个细胞 27.76 阳性
100个细胞 24.19 阳性
1000个细胞 20.83 阳性
10000个细胞 17.21 阳性
热灭活 29.38 阴性
可见，WATA法对10-10000个A549细胞都能检出端粒酶活性。
实施例4：批量制备的固定反应管的稳定性
引物、探针序列、反应管、裂解液T、反应液T、RE/PCR反应液如同实施例1。
1)取24个反应管，分成6组，4个/组，密封后，分别在37°C放置1,2,3,4,5,6天，记作组1，组2，组3，组4，组5，组6。
2)按实施例1的方法准备好A549细胞裂解上清液,共2×1ml，其中1ml置于冰上备用，做为阳性对照；另外1ml进行热灭活处理（80°C10min），做为阴性对照。
3)按实施例3的步骤2）、步骤3）进行操作，每组反应管分别做2个阳性对照，2个阴性对照。
4)以Ct值≤28，判断为阳性，Ct值>28，判断为阴性。
结果如下：
组 Ct阳性对照1 Ct阳性对照2 Ct阴性对照1 Ct阴性对照2
1 17.28 17.43 29.14 29.23
2 17.52 17.39 29.26 29.38
3 17.33 17.45 29.41 29.29
4 17.75 17.54 29.32 29.46
5 24.79 21.93 29.66 29.31
6 27.50 28.25 29.81 29.65
可见，批量制备的固定反应管在37°C放置1～4天，对端粒酶活性检测结果基本无影响，但在37°C放置5天及以上，对检测结果有严重影响。
实施例5：以WATA法检测人表皮鳞状细胞癌细胞株A431细胞的端粒酶活性
引物、探针序列、反应管、裂解液T、反应液T、RE/PCR反应液如同实施例1。
检测方法如下：
A431细胞用24孔板（约10-10000个/孔）进行细胞培养，吸去培养液，加入200ul/孔的裂解液T，反复吸打，转移到1.5ml离心管中，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液。以下操作同实施例3，以Ct值≤28，判断为阳性，Ct值>28，判断为阴性。
结果如下：
样品 Ct 结果判断
裂解液 29.82 阴性
10个细胞 27.66 阳性
100个细胞 24.91 阳性
1000个细胞 21.26 阳性
10000个细胞 17.68 阳性
热灭活 29.53 阴性
可见，WATA法对10-10000个A431细胞都能检出端粒酶活性。
实施例6：WATA检测试剂盒
8人份的试剂盒，组成如下：
前处理液浓缩液组成：50×PBS+50g/L DTT，稀释50倍后即为1×PBS+1g/L DTT；1×PBS组成如下：NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO41.8mM，溶剂为蒸馏水；
引物序列、裂解液T、反应液T、RE/PCR反应液组成同实施例1。
操作步骤：
1）将试剂盒从冻存环境中取出，室温下融解，暂存于4℃。
2）用83ml ddH2O把前处理液浓缩液稀释50倍成前处理液，暂存于4℃。
3）收集样品，样品可以是培养细胞、组织，也可以是痰液、全血（加抗凝剂）、尿样等。
样品量建议：培养细胞量约10～106个之间，组织大小约0.1cm3，痰液约2ml，全血约0.5ml，尿样约10ml。
样品预处理方法：悬浮培养的细胞，离心收集后，重悬于10ml前处理液；组织块浸泡在10ml前处理液中，剪碎；痰液加10ml前处理液，37℃振荡约10min至痰液完全溶解；全血直接加10ml前处理液；尿样离心后，沉淀重悬于10ml前处理液；以上均再离心弃上清，沉淀进入下一步操作。
4）上述沉淀加200ul/样品的裂解液T，反复吸打后转移至1.5ml离心管，冰上放置20min，4℃、15000rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液。
5）取50uL裂解上清液加入锚定PCR管中，冰上放置30min，吸干，加入50uL含1nmol/L dsTU的反应液T，30℃30min，60℃30min。
6）吸干，加入50uL RE/PCR反应体系（PCR缓冲液、0.2umol/L PCR引物、0.2mmol/L dNTP、1U Taq酶、2U BamHI），在PCR仪上先37℃10min，94℃3min，然后进行35个循环94℃5sec63℃30sec，SYBRgreen I荧光定量分析。
7）对照设置：以阴性对照和阳性对照，取代裂解上清液，进行上述5）～-6）步的操作。
8）以Ct值≤28，判断为阳性，Ct值>28，判断为阴性。
实施例6：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测人胚肾细胞株293T细胞的端粒酶活性
293T细胞（细胞购自美国ATCC）用24孔板（约1-106个/孔）进行细胞培养。试剂盒及操作步骤见实施例5。1000个细胞裂解上清液的热灭活处理同实施例3。
结果如下：
样品/对照 Ct 结果判断
1个细胞 29.10 阴性
10个细胞 27.03 阳性
100个细胞 23.46 阳性
103个细胞 20.18 阳性
104个细胞 16.79 阳性
105个细胞 14.35 阳性
106个细胞 14.82 阳性
阴性对照 29.67 阴性
阳性对照 20.44 阳性
可见，WATA试剂盒对10-106个293T细胞都能检出端粒酶活性，但当样品细胞数达到或超过105个之后，Ct值不再明显减少，说明扩增限制因素已由端粒G序列延伸转变到模板探针，即全部的模板探针都已被结合吸附，因此，虽然更高的端粒酶活性导致的更多的端粒G序列延伸，但不能继续导致PCR模板量的增加。
实施例7：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测人宫颈癌细胞株Hela细胞的端粒酶活性
Hela细胞（细胞购自美国ATCC）用24孔板（约10-105个/孔）进行细胞培养。试剂盒及操作步骤见实施例5。1000个细胞裂解上清液的热灭活处理同实施例3。
结果如下：
样品/对照 Ct 结果判断
10个细胞 26.88 阳性
100个细胞 23.37 阳性
103个细胞 20.09 阳性
104个细胞 16.55 阳性
105个细胞 14.44 阳性
阴性对照 29.59 阴性
阳性对照 20.32 阳性
热灭活 29.66 阴性
可见，WATA试剂盒对10-106个Hela细胞都能检出端粒酶活性，且在这个范围内，细胞数越多，则Ct值越低，暗示WATA端粒酶活性检测具有用于定量检测的价值。
实施例8：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的端粒酶活性
MCF-7细胞（细胞购自美国ATCC）用24孔板（约10～105个/孔）进行细胞培养。试剂盒及操作步骤见实施例5。1000个细胞裂解上清液的热灭活处理同实施例3。
结果如下：
样品/对照 Ct 结果判断
10个细胞 27.92 阳性
100个细胞 24.43 阳性
103个细胞 21.27 阳性
104个细胞 17.88 阳性
105个细胞 15.29 阳性
阴性对照 29.33 阴性
阳性对照 20.47 阳性
热灭活 29.73 阴性
可见，WATA试剂盒对10-106个MCF-7细胞都能检出端粒酶活性，且在这个范围内，细胞数越多，则Ct值越低，暗示WATA端粒酶活性检测具有用于定量检测的价值。
实施例9：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测肺癌患者痰液标本的端粒酶活性
肺癌患者20例为组织穿刺活检确诊处在I期，尚未进行手术。痰液均为清晨新鲜痰液。
试剂盒及操作步骤见实施例5。
20例肺癌患者中检测阳性结果为16例，阴性4例；2例正常人（吸烟有痰、近期体检健康）对照的检测结果均为阴性：
样品/对照 Ct 结果判断
阴性对照 29.68 阴性
阳性对照 20.84 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-201 16.33 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-202 19.58 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-203 26.54 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-204 18.29 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-205 30.43 阴性
肺癌患者JFK-ZJL-206 31.76 阴性
肺癌患者JFK-ZJL-207 24.99 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-208 27.86 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-209 19.19 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-210 16.93 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-211 17.40 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-212 26.62 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-213 21.52 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-214 28.74 阴性
肺癌患者JFK-ZJL-215 18.47 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-216 20.78 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-217 29.85 阴性
肺癌患者JFK-ZJL-218 27.22 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-219 26.59 阳性
肺癌患者JFK-ZJL-220 20.55 阳性
正常人JFK-ZJN-001 28.96 阴性
正常人JFK-ZJN-002 29.75 阴性
可见WATA法能够从多数肺癌患者的新鲜痰液中检测出端粒酶活性。
实施例10：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测宫颈癌手术切除组织
宫颈癌患者10例的手术切除组织冻存于-80℃。取约30mg冻存宫颈组织，用无菌眼科剪剪碎，加10ml前处理液，离心，弃上清，加200ul裂解液T，冰浴30min，以下操作按实施例5的操作步骤进行。试剂盒同实施例5。
10例宫颈癌患者组织的WATA端粒酶活性检测结果均为阳性：
样品/对照 Ct 结果判断
阴性对照 29.77 阴性
阳性对照 20.53 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-001 20.47 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-002 15.62 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-003 22.78 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-004 19.91 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-005 21.35 阴性
宫颈癌患者JFK-ZJC-006 24.88 阴性
宫颈癌患者JFK-ZJC-007 17.18 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-008 20.26 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-009 18.71 阳性
宫颈癌患者JFK-ZJC-010 17.55 阳性
可见WATA法能够从宫颈癌患者的手术分离的冻存癌组织中检测出端粒酶活性。
实施例11：以WATA端粒酶活性检测试剂盒检测ALT+肺癌细胞株（K-LU-1细胞）
ALT（端粒延伸替代机制）是端粒酶阴性的癌细胞延伸和维持端粒DNA长度的机制。SK-LU-1（细胞购自美国ATCC）是一种已知的ALT+细胞用24孔板（约10-105个/孔）进行细胞培养。试剂盒及操作步骤见实施例5。1000个SK-LU-1细胞裂解上清液的热灭活处理同实施例3。
结果如下：
样品/对照 Ct 结果判断
10个细胞 29.71 阴性
100个细胞 28.98 阴性
103个细胞 29.18 阴性
104个细胞 29.73 阴性
105个细胞 29.24 阴性
阴性对照 29.68 阴性
阳性对照 20.11 阳性
热灭活 29.93 阴性
可见，10-105个SK-LU-1细胞的WATA检测都呈阴性结果，再次验证了WATA端粒酶活性检测的特异性。
实施例12：以TaqMan探针替代SYBR Green I染料，WATA端粒酶活性检测效果
引物、探针序列、反应管、裂解液T、反应液T、RE/PCR体系同实施例1，RE/PCR体系中以0.5umol/L TaqMan探针（序列为：5‘-FAM-TAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-TAMRA-3’）取代SYBRgreen I。细胞为A549细胞。检测方法同实施例3，以FAM荧光定量分析取代SYBR green I分析，以Ct值≤30，判断为阳性，Ct值>30或无Ct，判断为阴性；
结果如下：
样品 Ct 结果判断
裂解液 无Ct 阴性
10个细胞 29.82 阳性
100个细胞 25.37 阳性
1000个细胞 22.15 阳性
10000个细胞 18.61 阳性
热灭活 33.54 阴性
可见，使用TaqMan的WATA法对10-10000个A549细胞都能检出端粒酶活性。

Claims (6)

1.一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增端粒酶的方法，所述方法是将待测样品的细胞裂解上清液加入固定有端粒酶引物的PCR反应管中，冰上放置使端粒酶与引物结合，吸干上清后，加入由模板探针、抑制探针、缓冲液和dNTP组成的端粒酶反应体系，在30～37℃保温进行端粒G序列延伸反应，随即在55～65℃保温进行杂交反应，之后吸干，加入含有限制性内切酶和PCR引物的PCR反应液，先以37℃保温10分钟，随即进行PCR反应，获得PCR反应产物；
所述端粒酶引物序列如下：
5’-TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；
所述模板探针序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGATCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；
所述抑制探针序列如下：
5’-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3’；
所述PCR引物序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，
5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)合成端粒酶引物，将其固定到PCR反应管中，得到锚定PCR管；
(2)分别合成模板探针和抑制探针；
(3)将模板探针和抑制探针复性结合形成双链DNA，记作dsTU；
(4)取待测样本，加入裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置10min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；
(5)取裂解上清液至锚定PCR管中，轻轻振荡后，冰上放置30min，吸干，加入由缓冲液、dNTP和dsTU配制的端粒酶反应液，30～37℃30～60min，55～65℃15～30min，吸干管内液体，加入由缓冲液、dNTP、Taq酶、PCR引物、SYBR green I或TaqMan探针及BamHI酶所配制的RE/PCR反应液，在PCR仪上进行如下程序：37℃酶切5～15min，92～95℃预变性2～5min，然后35个循环的92～95℃3～30sec，55～65℃20～60sec；获得PCR扩增产物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述端粒酶反应液组成如下：0.06mmol/L dNTP，1nmol/L dsTU，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.1mg/ml BSA，0.05％Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0Tris-HCl。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述RE/PCR反应液组成如下：0.2mmol/L dNTP，1U/50ul Taq酶，PCR引物0.2umol/L，0.4×SYBR Green I，2U/50ul BamHI，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.05％Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
5.一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶活性的试剂盒，包括固定有端粒酶引物的锚定PCR管，模板探针、抑制探针、PCR引物，端粒酶反应缓冲液、RE/PCR反应缓冲液，以及Taq酶和BamHI酶；
其特征在于：
所述端粒酶引物序列如下：
5’-TCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAG-3’；
所述模板探针序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGATCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；
所述抑制探针序列如下：
5’-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3’；
所述PCR引物序列如下：
5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，
5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’；
所述端粒酶反应缓冲液组成如下：1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，1mmol/L EGTA-Na，0.1mg/ml BSA，0.05％Tween20，溶剂为20mmol/L、pH8.0Tris-HCl；
所述RE/PCR反应缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.05％Tween20，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括细胞裂解液，组成如下：1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA-Na，1％NP-40，0.25mmol/L脱氧胆酸钠，150mmol/L NaCl，10％甘油，5mmol/L2-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF，溶剂为10mmol/L、pH7.5Tris-HCl。
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