CN116732154A - 一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括以下组分：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液；所述混合液A中包括TRAP混合物、TS引物、dNTP；所述混合液B中包括TitaniumTaq缓冲液、FAM‑ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaqDNA聚合酶。本发明通过优化TRAP测定法的引物，并将TRAP测定法和测序仪联合使用，能可靠、稳定、快速地对端粒酶活性进行评价，并且能够实现对端粒酶活性的定量分析，从而使结果更加准确。

Description

一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。端粒酶活性与细胞生长状态和肿瘤的发生密切相关。研究发现，细胞的端粒酶活性越高，细胞增殖能力越强，肿瘤发生概率越大；反之，端粒酶活性越低，细胞的增殖能力和生长状态越差，肿瘤发生概率越小。目前干细胞疗法研究方兴未艾，显现出极强生命力，在干细胞应用于临床治疗之前，首先面临的问题是干细胞的成瘤问题。但目前，领域内对端粒酶活性评价方法的研究停滞不前，此时建立稳定、高效、快速而准确的端粒酶活性评价方法显得尤为重要。
1994年Kim建立了基于PCR的端粒重复序列扩增法(telomericrepeatamplificationprotocol,TRAP)。TRAP反应法测定端粒酶活性的原理是：首先合成一个18nt的TS做上游引物作为端粒酶延伸的底物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，端粒酶接着发生转位，合成一个ggttag，并在之后每转位一次合成一次ggttag序列，最终端粒酶活性越强则能合成的碱基序列越长，端粒酶活性越低则合成碱基序列越短。向端粒酶延伸的体系加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物，通过电泳方式，由条带的亮度和大小可评价端粒酶活性。目前对于端粒酶活性检测主要是依据TRAP测定法或其衍生的银染法和ELASA检测法等，但大多情况下容易出现假阳性结果，而且目前仍没有很好的对端粒酶活性进行定量和准确分析的方法。
ABI基因测序仪广泛用于STR检测、DNA测序分析使用，在基因测序方面有定量的优势，但目前市场上没有一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，ABI基因测序仪是干细胞行业必不可少的仪器，端粒酶活性检测也是干细胞质检的必检项，通过优化检测方法可使其适用于测序仪器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，本发明通过优化TRAP测定法的引物，并将TRAP测定法和测序仪联合使用，能可靠、稳定、快速地对端粒酶活性进行评价，并且能够实现对端粒酶活性的定量分析，从而使结果更加准确。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，包括以下组分：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液。
进一步地，所述混合液A中包括TRAP混合物、TS引物、dNTP。
进一步地，所述混合液B中包括TitaniumTaq缓冲液、FAM-FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaqDNA聚合酶。
进一步地，所述混合液A中的TS引物的序列如下所示：
TS(SEQ ID NO:1)：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。
进一步地，所述混合液B中的FAM-ACX引物的序列如下所示：
FAM-ACX(SEQ ID NO:2)：FAM-5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTT ACCCTAACC-3'。
进一步地，所述混合液A中TRAP混合物、TS引物、dNTP的体积比为1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5，所述TS引物的浓度为40～60ng/μL。
进一步地，所述混合液B中TitaniumTaq缓冲液、FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaqDNA聚合酶的体积比为2～3：0.5～1.5：1.5～2.5：0.1～1，所述FAM-ACX引物的浓度为40～60ng/μL。
进一步地，所述检测试剂盒中还包括阴性对照成纤维细胞(SFC)，空白对照CHAPS裂解液和阳性对照诱导多能性干细胞(iPSCs)。
本发明还提供了利用上述检测试剂盒检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将待检测细胞消化为单细胞状态后利用CHAPS裂解缓冲液裂解得到蛋白质提取物；
(2)向步骤(1)得到的蛋白质提取物中加入混合液A和无核酸酶水进行PCR反应，得到端粒酶扩增反应液；
(3)向步骤(2)得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B，进行PCR反应，得到检测物；
(4)在甲酰胺溶液中加入QD550分子量内标，分装到96孔板中，再向孔板中加入步骤(3)得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
进一步地，步骤(2)中蛋白质提取物与混合液A的添加比例为2.5～3.5μg：3.5～4.5μL。
进一步地，步骤(2)中所述PCR反应的体系为20μL，所述PCR反应的过程为25～35℃反应30～60min。
进一步地，步骤(3)中端粒酶扩增反应液与混合液B的添加体积比为20：5～7。
进一步地，步骤(3)中PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min。
进一步地，步骤(4)中甲酰胺溶液与QD550分子量内标的比例为1mL：30～50μL，甲酰胺溶液和QD550分子量内标的混合液与检测物的体积比为8.5～9.5：0.5～1.5。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明依据TRAR测定法，对此法中引物和测定方法进行了改进，联合一代基因测序仪进行端粒酶活性检测。可进行微量的小分子片段检测，分析方法可靠，可定量检测特定细胞的端粒酶活性。本发明的试剂盒将端粒酶活性检测与测序仪器结合使用，改进了传统方法，与传统TRAR方法比较无需跑胶染色，对人体无毒害作用。能够快速的定量检测及微量检测，还可大通量检测，比传统方法检测更准确。并且还能针对每个条带都标记出bp值且可单独定量。
附图说明
图1为iPSCs蛋白样本倍比稀释后TRAP法检测端粒酶活性结果图；
图2-1为iPSCs蛋白样本未稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-2为iPSCs蛋白样本5倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-3为iPSCs蛋白样本10倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-4为iPSCs蛋白样本25倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-5为iPSCs蛋白样本50倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-6为iPSCs蛋白样本100倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-7为iPSCs蛋白样本200倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-8为iPSCs蛋白样本500倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-9为iPSCs蛋白样本1000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-10为iPSCs蛋白样本2000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-11为iPSCs蛋白样本5000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-12为iPSCs蛋白样本10000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-13为iPSCs蛋白样本20000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图2-14为iPSCs蛋白样本50000倍稀释时本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱；
图3为iPSCs蛋白样本倍比稀释后使用本发明试剂盒检测端粒酶活性定量结果；
图4为不同类型细胞TRAP法检测端粒酶活性结果图，其中，1-2：脐带间充质干细胞；3-4：脂肪间充质干细胞；5：神经干细胞；6：诱导性多能干细胞；7：成纤维细胞；8：灭活诱导性多能干细胞；9：CHAPS裂解液；
图5为本发明试剂盒检测不同类型细胞端粒酶活性图谱，其中，UC-MSC：脐带间充质干细胞；AD-MSC：脂肪间充质干细胞；NPC：神经干细胞；iPSC：诱导性多能干细胞；SFC：成纤维细胞；U-iPSC：灭活诱导性多能干细胞；N：CHAPS裂解液；
图6为本发明试剂盒检测不同类型细胞端粒酶活性定量结果图，其中，UC-MSC：脐带间充质干细胞；AD-MSC：脂肪间充质干细胞；NPC：神经干细胞；iPSC：诱导性多能干细胞；SFC：成纤维细胞；U-iPSC：灭活诱导性多能干细胞；N：CHAPS裂解液。
具体实施方式
本发明提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，包括以下组分：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液；所述混合液A中包括TRAP混合物、TS引物、dNTP；所述混合液B中包括TitaniumTaq缓冲液、FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaq DNA聚合酶。
在本发明中，所述TRAP混合物的具体组分如下：Tris-HCl200mM(PH8.3)，MgCl215mM，KCl630mM，Tween200.5％，EDTA10mM，加H2O定容至10mL。
在本发明中，所述混合液A中的TS引物的序列如下所示：
TS(SEQ ID NO:1)：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。
在本发明中，所述混合液B中的FAM-ACX引物的序列如下所示：
FAM-ACX(SEQ ID NO:2)：FAM-5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTT ACCCTAACC-3'。
在本发明中，所述混合液A中TRAP混合物、TS引物、dNTP的体积比为1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5，优选为1.8～2.3：0.7～1.4：0.7～1.3，进一步优选为1.9～2.1：0.8～1.2：0.8～1.1；所述TS引物的浓度为40～60ng/μL，优选为45～55ng/μL，进一步优选为48～52ng/μL。
在本发明中，所述混合液B中TitaniumTaq缓冲液、FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaqDNA聚合酶的体积比为2～3：0.5～1.5：1.5～2.5：0.1～1，优选为2.2～2.8：0.7～1.3：1.8～2.2：0.3～0.8，进一步优选为2.4～2.6：0.8～1.2：1.9～2.1：0.4～0.6；所述FAM-ACX引物的浓度为40～60ng/μL，优选为45～55ng/μL，进一步优选为48～52ng/μL。
在本发明中，所述检测试剂盒中还包括阴性对照成纤维细胞(SFC)，空白对照CHAPS裂解液和阳性对照诱导多能性干细胞(iPSCsC)。
本发明还提供了利用上述检测试剂盒检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将待检测细胞消化为单细胞状态后利用CHAPS裂解缓冲液裂解得到蛋白质提取物；
(2)向步骤(1)得到的蛋白质提取物中加入混合液A和无核酸酶水进行PCR反应，得到端粒酶扩增反应液；
(3)向步骤(2)得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B，进行PCR反应，得到检测物；
(4)在甲酰胺溶液中加入QD550分子量内标，分装到96孔板中，再向孔板中加入步骤(3)得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
在本发明中，首先将待检测细胞消化为单细胞状态后利用CHAPS裂解缓冲液裂解得到蛋白质提取物，具体步骤优选为：将待检测细胞以0.01～0.1％Trypsin-EDTA溶液消化为单细胞状态，用4℃预冷的PBS洗涤沉淀细胞3～5次，除去上清液后，每管加入80～120μLCHAPS裂解缓冲液(1×)，在冰上孵育25～35min后，以10000～15000g的转速在4℃离心机中离心25～35min，上清即为蛋白质提取物。
在本发明中，向步骤(1)得到的蛋白质提取物中加入混合液A和无核酸酶水进行PCR反应，得到端粒酶扩增反应液。
在本发明中，所述蛋白质提取物与混合液A的添加比例为2.5～3.5μg：3.5～4.5μL，优选为2.7～3.3μg：3.8～4.2μL，进一步优选为2.8～3.2μg：3.9～4.1μL。
在本发明中，向蛋白质提取物与混合液A中添加无核酸酶水使PCR反应的体系为20μL。
在本发明中，所述PCR反应的过程为25～35℃反应30～60min，反应温度优选为28～32℃，进一步优选为29～31℃；反应时间优选为40～50min，进一步优选为42～48min。
在本发明中，向步骤(2)得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B，进行PCR反应，得到检测物。
在本发明中，所述端粒酶扩增反应液与混合液B的添加体积比为20：5～7，优选为20：5.5～6.5，进一步优选为20：5.7～6.3。
在本发明中，所述PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min。
在本发明中，在甲酰胺溶液中加入QD550分子量内标，分装到96孔板中，再向孔板中加入步骤(3)得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
在本发明中，所述甲酰胺溶液与QD550分子量内标的比例为1mL：30～50μL，优选为1mL：35～45μL，进一步优选为1mL：38～42μL。
在本发明中，所述甲酰胺溶液和QD550分子量内标的混合液与检测物的体积比为8.5～9.5：0.5～1.5，优选为8.7～9.3：0.8～1.2，进一步优选为8.9～9.1：0.9～1.1。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，由以下组分组成：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液。其中，混合液A为TRAP混合物(10×)2μL，TS引物(0.1μg，50ng/μL)1μL，dNTP(10mM)1μL。混合液B为TitaniumTaq缓冲液(10×)2.5μL，FAM-ACX引物(0.1μg，50ng/μL)1μL，无核酸酶水2μL，TitaniumTaq DNA聚合酶(50×)0.5μL。
所述混合液A中TS引物的序列为5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；所述混合液B中FAM-ACX引物的序列为5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3'。
利用上述检测试剂盒检测端粒酶活性的方法为：
(1)待检测细胞以0.05％Trypsin-EDTA溶液消化为单细胞状态，用4℃预冷的PBS洗涤沉淀细胞3～5次，除去上清液后，每管加入100μLCHAPS裂解缓冲液(1×)，在冰上孵育30min，以13000g转速在4℃离心机中离心30min，将上清转入RNase-free的1.5mLEP管。用天根BCA试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司)对端粒酶进行定量检测后在-80℃下将蛋白质提取物以10μL的等分试样储存。
(2)取上述得到的蛋白质提取物3μg，加入混合液A4μL后用无核酸酶水补足至20μL置于PCR管中，然后将PCR管置于30℃的预热水浴中45min，得到端粒酶扩增反应液。
(3)向上述得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B6μL，进行PCR反应，所述PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min，得到检测物；
(4)在1mL甲酰胺溶液中加入40μL的QD550分子量内标，混匀后分装到96孔板中，9μL/孔，再向孔板中加入1μL上述得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
实施例2
本实施例提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，由以下组分组成：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液。其中，混合液A为TRAP混合物(10×)1.8μL，TS引物(0.1μg，50ng/μL)0.8μL，dNTP(10mM)1.2μL。混合液B为TitaniumTaq缓冲液(10×)2.6μL，FAM-ACX引物(0.1μg，50ng/μL)0.8μL，无核酸酶水2.2μL，TitaniumTaqDNA聚合酶(50×)0.6μL。
所述混合液A中TS引物的序列为5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；所述混合液B中FAM-ACX引物的序列为5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3'。
利用上述检测试剂盒检测端粒酶活性的方法为：
(1)待检测细胞以0.06％Trypsin-EDTA溶液消化为单细胞状态，用4℃预冷的PBS洗涤沉淀细胞3～5次，除去上清液后，每管加入100μLCHAPS裂解缓冲液(1×)，在冰上孵育35min，以14000g转速在4℃离心机中离心25min，将上清转入RNase-free的1.5mLEP管。用天根BCA试剂盒对端粒酶进行定量检测后在-80℃下将蛋白质提取物以10μL的等分试样储存。
(2)取上述得到的蛋白质提取物3.2μg，加入混合液A3.8μL后用无核酸酶水补足至20μL置于PCR管中，然后将PCR管置于28℃的预热水浴中50min，得到端粒酶扩增反应液。
(3)向上述得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B6μL，进行PCR反应，所述PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min，得到检测物；
(4)在1mL甲酰胺溶液中加入35μL的QD550分子量内标，混匀后分装到96孔板中，9.2μL/孔，再向孔板中加入0.8μL上述得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
实施例3
本实施例提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，由以下组分组成：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液。其中，混合液A为TRAP混合物(10×)2.2μL，TS引物(0.1μg，50ng/μL)1.2μL，dNTP(10mM)0.5μL。混合液B为TitaniumTaq缓冲液(10×)2.4μL，FAM-ACX引物(0.1μg，50ng/μL)1.2μL，无核酸酶水0.9μL，TitaniumTaqDNA聚合酶(50×)0.3μL。
所述混合液A中TS引物的序列为5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；所述混合液B中FAM-ACX引物的序列为5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3'。
利用上述检测试剂盒检测端粒酶活性的方法为：
(1)待检测细胞以0.04％Trypsin-EDTA溶液消化为单细胞状态，用4℃预冷的PBS洗涤沉淀细胞3～5次，除去上清液后，每管加入100μLCHAPS裂解缓冲液(1×)，在冰上孵育30min，以12000g转速在4℃离心机中离心35min，将上清转入RNase-free的1.5mLEP管。用天根BCA试剂盒对端粒酶进行定量检测后在-80℃下将蛋白质提取物以10μL的等分试样储存。
(2)取上述得到的蛋白质提取物2.8μg，加入混合液A4.1μL后用无核酸酶水补足至20μL置于PCR管中，然后将PCR管置于32℃的预热水浴中40min，得到端粒酶扩增反应液。
(3)向上述得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B6μL，进行PCR反应，所述PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min，得到检测物；
(4)在1mL甲酰胺溶液中加入45μL的QD550分子量内标，混匀后分装到96孔板中，8.9μL/孔，再向孔板中加入1.1μL上述得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
实验例1
本实验例采用不同浓度的诱导多能性干细胞(iPSCsC)蛋白样本对端粒酶活性进行检测，未稀释蛋白样本量3μg，倍比稀释后按照实施例1的过程和方法进行端粒酶活性检测，同时采用TRAP法检测端粒酶活性作为对照，结果见图1～图3，图1为iPSCs蛋白样本倍比稀释后TRAP法检测端粒酶活性结果图，图2-1至图2-14为iPSCs蛋白样本倍比稀释后本发明试剂盒端粒酶活性检测图谱，图3为iPSCs蛋白样本倍比稀释后使用本发明试剂盒检测端粒酶活性定量结果图。由上图可知，两种方法的结果一致，证明本发明试剂盒可行，通过峰面积的大小可以对不同浓度的iPSCs样本进行定量检测。
实验例2
本实验例采用不同干细胞样本对端粒酶活性进行检测，检测细胞包括脐带间充质干细胞(UC-MSC)、脂肪间充质干细胞(AD-MSC)、神经干细胞(NPC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、成纤维细胞(SFC)，以上细胞均购买自国家干细胞转化资源库，同时使用灭活诱导性多能干细胞和CHAPS裂解液作对照，按照实施例1的方法进行端粒酶活性检测，结果见图4～图6，图4为不同类型细胞TRAP法检测端粒酶活性结果图，图5为采用本发明试剂盒检测不同类型细胞端粒酶活性图谱，图6为采用本发明试剂盒检测不同类型细胞端粒酶活性定量结果。由上图可知，采用本发明试剂盒及检测方法可以针对不同细胞制作图谱和定量分析，与传统方法比较，减少了背景误差，可以给不同干细胞端粒酶活性检测作参考。
由以上实施例和实验例可知，本发明提供了一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒及其检测方法，本发明通过优化TRAP测定法的引物，并将TRAP测定法和测序仪联合使用，能可靠、稳定、快速地对端粒酶活性进行评价，并且能够实现对端粒酶活性的定量分析，从而使结果显得更加准确。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种适用于基因测序仪的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：CHAPS裂解缓冲液、混合液A、混合液B、QD550分子量内标、甲酰胺溶液；
所述混合液A中包括TRAP混合物、TS引物、dNTP；
所述混合液B中包括Titanium Taq缓冲液、FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaqDNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述混合液A中的TS引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述混合液B中的FAM-ACX引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述混合液A中TRAP混合物、TS引物、dNTP的体积比为1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5；
所述TS引物的浓度为40～60ng/μL。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述混合液B中Titanium Taq缓冲液、FAM-ACX引物、无核酸酶水、TitaniumTaq DNA聚合酶的体积比为2～3：0.5～1.5：1.5～2.5：0.1～1；
所述FAM-ACX引物的浓度为40～60ng/μL。
5.利用权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检测细胞消化为单细胞状态后利用CHAPS裂解缓冲液裂解得到蛋白质提取物；
(2)向步骤(1)得到的蛋白质提取物中加入混合液A和无核酸酶水进行PCR反应，得到端粒酶扩增反应液；
(3)向步骤(2)得到的端粒酶扩增反应液中加入混合液B，进行PCR反应，得到检测物；
(4)在甲酰胺溶液中加入QD550分子量内标，分装到96孔板中，再向孔板中加入步骤(3)得到的检测物进行基因测序仪检测，根据检测图谱判断端粒酶活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中蛋白质提取物与混合液A的添加比例为2.5～3.5μg：3.5～4.5μL。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR反应的体系为20μL，所述PCR反应的过程为25～35℃反应30～60min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中端粒酶扩增反应液与混合液B的添加体积比为20：5～7。
9.根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应的扩增程序为：90℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，变性、退火、延伸进行30个循环后；72℃最终延伸2min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中甲酰胺溶液与QD550分子量内标的比例为1mL：30～50μL，甲酰胺溶液和QD550分子量内标的混合液与检测物的体积比为8.5～9.5：0.5～1.5。
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