CN110505872A - 用于生育力和相关应用的端粒酶活性化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一系列化合物和包含它们的组合物用于治疗生育力相关的疾病、病症和/或病况、以及保持生育力和与其相关的病况中的方法和用途。在一些方面中，本文所述的化合物和/或组合物在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原生育力，所述受试者包括雄性和/或雌性受试者。这样的方法/用途作为体外受精方案的一部分，包括促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织的收率。

Description

用于生育力和相关应用的端粒酶活性化合物
相关申请的交叉引用
本发明要求享有2017年2月12日提交的以色列专利申请号250567、和2017年2月13日提交的美国临时申请号62/458,028、和2018年2月11日提交的以色列专利申请号257470的权益，其以参考的方式整体并入本文中。
技术领域
本发明涉及一系列化合物和包含它们的组合物用于治疗生育力相关的疾病、病症和/或病况、以及保持生育力和与其相关的病况中的用途。
背景技术
端粒酶是核糖核酸蛋白，其负责延长在真核生物的染色体末端重复的DNA结构(端粒)，由于“末端复制问题”，端粒在每次细胞分裂时缩短。端粒酶由两个主要亚基组成，催化亚基端粒酶逆转录酶(TERT)和可作为端粒延长的模板的RNA组分(TR)。端粒酶表达对于增殖细胞至关重要。决定细胞增殖能力的主要遗传机制之一是端粒酶对端粒的维持。
端粒酶活性已经在人生殖细胞、例如卵巢中检测到，并在具有再生能力的密集分裂的细胞和组织中表达。在TERT缺陷动物模型和TR缺陷雌性小鼠中，生育力的降低已显示出子宫萎缩，这表明颗粒细胞功能异常。在卵母细胞的发育过程中，卵泡发生伴随颗粒细胞的显著增殖。
大多数体细胞包含端粒酶的低表达或无专用表达，但是在精子发生过程中，端粒酶是有活性的，并且其催化亚基TERT也被表达。
除上述之外，关于端粒酶及其亚基在性腺发育中的作用，例如在卵母细胞和颗粒细胞中或在精子形成中的作用还知之甚少。关于端粒酶激活化合物和生育力的治疗或恢复的不同影响，也了解甚少。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原生育力的方法，其包括：使性腺或生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
在一些实施方案中，本发明提供了由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其用于在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原生育力。
根据这些方面并且在一些实施方案中，这种在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力的方法和/或用途在时机或数量或它们的组合方面，有益地调节促性腺激素表达或类固醇激素表达；或者在一些实施方案中，在时机或数量或它们的组合方面，改善卵泡成熟；或在一些实施方案中，改善精子数量、质量、活力或它们的组合；或其任意组合。
在其他实施方案中，本发明提供了一种在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原性腺细胞或组织的功能的方法，其包括：使性腺或生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
在其他实施方案中，本发明提供由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其用于在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原性腺细胞或组织的功能。
在一些实施方案中，本发明提供了一种作为体外受精方案的一部分的促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织收率的方法，其包括：使所述生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
在其他实施方案中，本发明提供由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其作为体外受精方案的一部分，用于促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织的收率。
在一个实施方案中，式I的结构由式IV的结构表示：
其中R1、R3、R4、R6、R7、R9和R10如上所述。
在另一个实施方案中，式I的结构由式VI的结构表示：
其中R1'、R3'、R4'、R6'、R7'、和R9'相同或不同地包含卤素、芳基、烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、单烷基氨基、二烷基氨基或芳基氨基；且
R10如上所述。
在另一个实施方案中，式I的结构由式VII的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式VIII的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式IX的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式X的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XI的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XII的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XIII的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XIV的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XV的结构表示：
在另一个实施方案中，式I的结构由式XVI的结构表示：
在另一个实施方案中，本发明利用包含如本文所述的化合物的药物组合物用于如本文所述的任何方法。
在一些实施方案中，本发明特别考虑包括使用以下化合物：
化合物68：
1,1,1-三(4-羟基-3,5-二溴-苯基)-乙烷
化合物70：
化合物79：
1,1,1-三(4-羟基-3,5-亚甲基乙氧基-苯基)-乙烷；
或者这些化合物的任何组合的方法或用途、以及采用这些化合物中任一者的方法/用途均应视为本发明的一个实施方案。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雌性受试者，以特异性地促进和/或增强排卵。在一些方面中，这样的用途可以尤其包括使用化合物79、化合物68和化合物70。根据该方面并且在一些实施方案中，这样的治疗可以增加最终可以原位受精的卵子的数量和/或质量。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雌性受试者，以特异性地提高适于取回用于体外受精或采集流程的卵子的质量和/或数量。在一些方面中，这样的用途尤其可以包括使用化合物79、化合物68和化合物70。
在一些方面中，就促进/增强排卵促进事件而言，化合物79特别且出乎意料地优于其他化合物。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雌性受试者，以在该受试者暴露于辐射后特异性保护或促进恢复的卵子质量和/或数量。
在一些方面中，本文所述的化合物在原位或体外促进或增强受精事件。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雄性受试者，以特异性地提高应用于原位或体外受精的精子的质量和/或数量。在一些方面中，本文所述的化合物可促进提高的精子获能、成熟度、数量、质量、活力或它们的组合。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雄性受试者，以特异性保护或促进该受试者暴露于辐射后或由于受试者的衰老或过早衰老而恢复的精子受精能力。
附图说明
在说明书的结论部分中特别指出并明确要求保护被当作本发明的主题。但是，通过在阅读附图的同时参照以下详细说明，可以最好地理解本发明的组织和操作方法、以及其目的、特征和优点。
图1：描点了用不同浓度的PMSG处理6小时的颗粒细胞。RNA提取物通过使用TERT的特异性引物且使用β-肌动蛋白作为参照基因的qRT-PCR，用于TERT相对mRNA水平的测量。结果表示平均值±SE(n＝3)。
图2：大鼠颗粒细胞中通过PMSG激活端粒酶表达。
图3：用两种实施方式的化合物(化合物79和化合物70)以50nM和200nM处理6小时的颗粒细胞。蛋白提取物用作使用TRAP测定进行端粒酶活性测量的来源。
图4：用两种实施方式的化合物(化合物79和化合物70)以50nM和200nM处理6小时的颗粒细胞。RNA提取物通过使用TERT特异性引物且使用β-肌动蛋白作为参照基因的qRT-PCR评估TERT相对mRNA水平测量。结果表示平均值±SE(n＝3)。通过t检验确定的统计显著性；*P值<0.05，**P值<0.01。
图5：用两种实施方式的化合物(化合物79和化合物70)以50nM处理6小时的颗粒细胞。RNA提取物通过使用StAr的特异性引物和使用β-肌动蛋白作为参照基因的qRT-PCR评估StAr相对mRNA水平测量。结果表示平均值±SE(n＝3)。通过t检验确定的统计学显著性；*P值<0.05。
图6：通过用放射免疫测定法(RIA)评估细胞培养基，用两种实施方式的化合物(化合物79和化合物70)以50nM在存在或不存在PMSG1IU/mL的条件下处理24小的颗粒细胞的孕酮水平。零值表示无法检测到的孕酮量。结果表示平均值±SE(n＝3)。通过t检验确定统计学显著性；*P值<0.05。
图7：用两种实施方式的化合物(化合物79和化合物70)以50nM在存在1IU/mL PMSG的条件下处理24小时的样品的颗粒细胞活力。通过XTT增殖测定法测量相对细胞活力。结果表示平均值±SE(n＝3)。
图8：通过利用使用EZquant软件的光密度分析法对不同年龄(10天、18天、1个月和3个月龄)的小鼠卵巢进行的TRAP测定来定量不同小鼠年龄的小鼠卵巢中的端粒酶活性，并计算为恒定阳性对照的％(平均值±标准误差；n＝12只小鼠)。
图9：源自处于不同发情期的3个月龄小鼠的卵巢中的TERT表达。由处于不同发情期的3个月龄小鼠的卵巢制备总RNA，并使用适当的引物进行qRT-PCR。数据为平均值±标准误差；n＝12。
图10：用指定化合物处理后的小鼠卵巢中的端粒酶活性。对小鼠皮下注射化合物79或68或DMSO。处理后12小时，从小鼠卵巢中制备蛋白提取物，并将1μg加入到TRAP特异性反应混合物中(A为代表性图片)。对源自不同年龄(B：10天，C：18天，D：1个月，E：3个月)的小鼠的卵巢蛋白提取物中的端粒酶活性(通过使用EZquant软件的TRAP测定DNA产物的光密度分析)进行定量。符号：PC阳性对照(癌细胞的蛋白质提取物)。阴性对照(NC)包含CHAPS缓冲液，而不是蛋白质提取物。IS＝内部标准。结果是平均值±标准误差；n＝48只小鼠)t检验：相对于DMSO，*p<0.05。
图11：本发明的化合物在处于所有发情期的小鼠卵巢中增加端粒酶表达(A)和活性(B)。处于不同发情期的雌性小鼠未经治疗，或用以6mg/kg单次注射(皮下)0.5％DMSO、化合物79或68进行治疗。在治疗后12小时处死小鼠并移除卵巢，A：制备总RNA，然后制备cDNA，并通过qRT-PCR用合适的引物进行分析。B：制备蛋白提取物，并使用TRAP测定分析1μg蛋白质的端粒酶活性。通过用EZquant软件光密度分析法对端粒酶DNA产物进行定量，并计算为恒定阳性对照的％。结果是平均值±SE，每组t检验n≥3只小鼠，相对于DMSO，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图12：(A)向处于不同发情期的雌性小鼠皮下注射DMSO、化合物79或68。12小时后，处死小鼠，移除卵巢并称重。结果是平均值±SE，每组n>6个卵巢。(B)在治疗后12小时，来自3个月龄的小鼠的卵巢的代表性图片。
图13：在用指定化合物治疗12小时之前和之后的处于发情前期和发情期的阴道涂片。阴道涂片采集自雌性小鼠，然后皮下注射DMSO、化合物79或68(A)。在治疗前为发情前期(A)、发情期(C)。治疗12小时后，再次采集阴道涂片，为发情前期(B)、发情期(D)。阴道涂片被结晶紫染色。
图14：处于不同发情期的小鼠卵巢的苏木精-曙红染色。如所示那样，对处于不同发情期的小鼠皮下注射DMSO或化合物68、70和79中的一者。12小时后，处死小鼠并移除卵巢，并用甲醛固定。用苏木精-曙红对组织染色，并通过光学显微镜以4倍进行观察。CL-黄体，GC-颗粒细胞，每组n≥3。
图15：用实施方式的化合物治疗后小鼠卵巢的PCNA染色：代表性图片。对处于发情期(A)或发情后期(B)的小鼠皮下注射DMSO或化合物79或68中的一者。12小时后，处死小鼠并移除卵巢，并用甲醛固定。使组织经受使用抗PCNA抗体的免疫荧光分析。符号：CL-黄体，GC-颗粒细胞。
图16：用实施方式的化合物治疗后12小时，雌性小鼠血浆中的孕酮浓度。用指定化合物或溶媒治疗处于不同发情期的小鼠。治疗后12小时处死小鼠，并采集血样，并按照所述方法测量孕酮的浓度(平均值±标准误差；n＝34只小鼠)。(A)P+12h，(B)E+12h，(C)M+12h，(D)D+12h，
图17：根据本发明的化合物增加了胚胎的数量。用单次皮下注射所示化合物6mg/kg或0.5％DMSO治疗ICR小鼠。注射后，立即将雌性小鼠放入雄性小鼠的笼子中，在14天后处死雌性小鼠并计数胚胎数。结果为平均值±SE，每组n≥3只小鼠。相对于DMSO，t检验，*p<0.05，**p<0.01。
图18：得自女性的颗粒细胞中的端粒酶活性经历IVF流程。通过使用EZquant的光密度法分析，对通过TRAP测定获得的端粒酶DNA产物(图18A为全细胞(WC)提取物的0.5μg蛋白，且图18B为DNA结合(DB)提取物的0.1μg蛋白)进行分析。端粒酶活性被计算为获得的永久阳性对照(胶质母细胞瘤细胞蛋白提取物)数据的％。结果是至少3次独立的TRAP测定的平均值±SD。
图19：端粒酶活性与雌激素水平相关。图19(A)(WC：p＝0.01，DB：p＝0.42)高时n＝9，低时n＝12，计算了高和低雌激素时端粒酶(在WC和DB提取物中)的平均酶活性。高雌激素水平确定为<1500ng/ml。
图20：不育的诊断与端粒酶活性之间的相关性，对于雌性不育n＝9，对于雄性不育n＝12。图20A是端粒酶平均活性(p＝0.159)。
图21：通过ELISA试剂盒(EIAab)分析WC蛋白提取物。图21A：端粒酶表达被计算为总蛋白表达的百分比，其与血液雌激素水平相关。图21B：个体女性的端粒酶表达。
图22：H&E染色显示睾丸组织、特别是精原细胞层中的形态方面的显著破坏。化合物68治疗保护精原细胞层免受X射线的伤害，并且睾丸组织的形态保持完整。对ICR小鼠(3个月龄)进行X射线照射(2.5Gy)，然后立即注射DMSO或用化合物68治疗。治疗后12小时移除睾丸并进行组织学检查，为代表性的图片(用H&E染色)。
图23：在X射线照射之前和之后，对睾丸中CREM表达的检查显示，与未治疗的小鼠相比，在X射线处理的睾丸中表达模式发生了显著改变。化合物68和化合物70处理复原了精子生成标记物的表达。对ICR小鼠(3个月龄)进行X射线照射(2.5Gy)，然后立即注射DMSO或化合物68(a)和化合物70(b)。处理后12小时移除睾丸，并用CREM标记物染色。
图24：与UT样品相比，γ-H2ΑX(绿色)标记物的IF分析显示照射后12小时DSB形成的显著增加。此外，仅用化合物70治疗不会引起DNA损伤。在受照射的小鼠中，化合物70治疗证明了在各种细胞类型(主要是精原细胞)中γ-Η2ΑX的表达水平降低，表明化合物70治疗可以保护睾丸组织免受X射线辐射诱导的DNA损伤。对ICR小鼠(3个月龄)进行X射线照射(2.5Gy)，然后立即注射化合物70。对于对照，对小鼠用化合物进行治疗而不进行照射。处理后12小时将睾丸移除，并用γ-H2ΑX抗体染色。
图25A、25B、25C和25D：在未经辐射然后进行了指定治疗的小鼠中，与DMSO相比，化合物68和化合物70治疗后12小时，来自附睾的精子细胞数量的测量分别显示显著的增加。来自经X射线处理和未处理的小鼠的精子计数显示了精子计数显著减少，而用指定化合物对经X射线照射的小鼠进行治疗使辐射后12小时的附睾中的精子数量显著增加了1.5-2.7倍(图25A和25B)。用化合物68治疗的经照射的小鼠在照射后9天和30天增加了精子计数(图25C和25D)。
图26A和26B：用实施方式的化合物进行的处理保护了精子免于辐射暴露后不良的头部形态。对3个月龄的小鼠进行X射线照射(2.5Gy)，并用6mg/kg化合物68或70进行单次皮下注射治疗。12小时后处死小鼠，从附睾中移除精子，并用曙红染色。对形态缺陷的精子(头部形态)的数量进行定量，并表示为占精子总数的百分比(每组N＝6只小鼠)。图26B提供了显示观察到的健康和有缺陷的精子头部形态的光学显微照片。
图27A和27B：即使在单次注射(6mg/Kg)后，实施方式的化合物70治疗也增加了老年小鼠(16个月龄)中的精子计数。每组n＝6只小鼠，t检验。
图28A、28B和28C：照射然后用化合物70或DMSO载体治疗后的卵巢组织组织病理学。
图29A、29B、29C和29D：实施方式的化合物影响垂体腺细胞中促性腺激素的表达。在用指定的具体化合物(50nM)治疗后，在6(图29A和29B)和12小时(图29C和29D)评估了源自小鼠垂体腺的细胞(LβT2)的LH和FSH的分泌。通过RT-PCR确定FSH和LH表达，并由5个不同实验定量，使用t检验单因素方差分析评估显著性。
图30A、30B、30C、30D、30E和30F。实施方式的化合物影响雌性生殖组织中体内促性腺激素的表达。端粒酶的子宫组织表达与促性腺激素表达相关，并且实施方式的化合物在整个周期中加速响应性/进程。示出经化合物534治疗和对照的雌性小鼠在发情前期(P)、发情期(E)和发情后期(M)的不同状态下，端粒酶对LH和FSH表达的评估
具体实施方式
在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明。在其他情况下，没有详细描述公知的方法、流程和组件，以免模糊本发明。
本发明在一些实施方案中，涉及新型三苯基化合物和包含其的组合物在治疗尤其是生育力相关或不育相关的疾病或病况中的用途，所述疾病或病况能够收到增强的端粒酶表达和/或端粒酶激活的影响。
在一些方面中，本发明使用了这样的化合物，其在受试者的性腺或生育力相关的细胞和组织中刺激和/或增加端粒酶的表达和/或活性，其中所述活性是降低的、缺失的、改变的或正常的。这样的病症尤其包括：a)生育力相关的损害，包括因癌症或癌症治疗而发生的组织更新障碍；b)黄体期缺陷；c)卵巢早衰(原发性卵巢功能不全或性腺功能亢进性腺功能减退)；和/或d)增加性腺或生育力相关的健康组织中端粒酶的表达和/或活性，从而促进或复原受试者的生育力。在一些方面中，受试者已经暴露于辐射。
在一些方面中，本文所述的化合物适合给予雌性受试者，以特异性促进和/或增强排卵。在一些方面中，这样的用途可包括使用本文所述的任何化合物。根据该方面并且在一些实施方案中，这样的治疗可以增加最终可以原位受精的卵子的数量和/或质量。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雌性受试者，以特异性地提高适于取回用于体外受精或采集流程的卵子的质量和/或数量。在一些方面中，这样的用途尤其可以包括使用本文所述的任何化合物。
在一些方面中，就促进/增强排卵促进事件而言，本文所述的某些化合物特别且出乎意料地优于其他化合物。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雌性受试者，以在该受试者暴露于辐射后特异性保护或促进恢复的卵子质量和/或数量。
在一些方面中，本文所述的化合物在原位或体外促进或增强受精事件。
在一些方面中，本文所述的化合物适合于给予雄性受试者，以特异性地增强用于原位或体外受精的精子的质量和/或数量。在一些方面中，本文所述的化合物可促进提高的精子获能、成熟度、数量、质量、活力或它们的组合。
本发明的化合物：
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式I的结构表示的三苯基化合物：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式II的结构表示的三苯基化合物：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1、R3、R4、R6、R7和R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合。
在一个实施方案中，Z为碳。在另一个实施方案中，R10是甲基。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-杂环烷基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-氨基烷基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-二烷基氨基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-N(CH3)2基团，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-N(Et)2基团，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-芳基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-杂芳基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-卤代烷基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-烷氧基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-乙氧基，其中n在1-6之间。在另一个实施方案中，R1、R3、R4、R6、R7和R9是-(CH2)n-环烷基，其中n在1-6之间。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式III的结构表示的三苯基化合物：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R'、R”和R”'独立地相同或不同，包括氢、烷基、卤代烷基、烷基氨基、苯基、苄基、烷酰基、乙酰基或苯甲酰基；
R1、R3、R4、R6、R7和R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式IV的结构表示的三苯基化合物：
其中R1、R3、R4、R6、R7、R9和R10如上定义；或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式V的结构表示的三苯基化合物：
其中
R'、R”、R”'独立地相同或不同，包括氢、烷基、卤代烷基、苯基、苄基、烷酰基、乙酰基或苯甲酰基；
R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'相同或不同，包括卤素、芳基、烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或芳基氨基；且R7如上所述；或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'为二烷基氨基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是二甲基氨基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是二乙基氨基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是N-哌啶基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是N-吡咯烷基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是N-哌嗪基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是N-哌嗪基-4-甲基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是N-吗啉基。在另一个实施方案中，R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'是乙氧基。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式VI的结构表示的三苯基化合物：
其中R1'、R3'、R4'、R6'、R7'和R9'相同或不同，包括卤素、芳基、烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或芳基氨基；且R10如上所述；或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式VII的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式VIII的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式IX的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式X的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任何组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式XI的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式XII的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用由式XIII的结构表示的三苯基化合物：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在另一个实施方案中，式I的结构由式XIV的结构表示：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在另一个实施方案中，式I的结构由式XV的结构表示：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在另一个实施方案中，式I的结构由式XVI的结构表示：
或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合，以及包含它们的组合物。
在一个实施方案中，术语“烷基”是指饱和脂族烃，其包括直链、支链和环状烷基。在一个实施方案中，烷基具有1-12个碳。在另一个实施方案中，烷基具有1-7个碳。在另一个实施方案中，烷基具有1-6个碳。在另一个实施方案中，烷基具有1-7个碳。在另一个实施方案中，烷基具有2-6个碳。在另一个实施方案中，烷基具有1-7个碳。在另一个实施方案中，烷基具有2-8个碳。在另一个实施方案中，烷基具有3-6个碳。在另一个实施方案中，烷基具有3-7个碳。在另一个实施方案中，烷基具有1-4个碳。在另一个实施方案中，支链烷基是被1-5个碳的烷基侧链取代的烷基。在另一个实施方案中，支链烷基是被1-5个碳的卤代烷基侧链取代的烷基。烷基可以未被取代；或被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
在一个实施方案中，“烯基”是指不饱和烃，其包括具有一个或多个双键的直链、支链和环状基团。烯基可具有一个双键，两个双键，三个双键等。在另一个实施方案中，烯基具有2-12个碳。在另一个实施方案中，烯基具有2-6个碳。在另一个实施方案中，烯基具有2-4个碳。在另一个实施方案中，烯基为乙烯基(CH＝CH2)。烯基的实例是乙烯基、丙烯基、丁烯基、环己烯基等。烯基可以未被取代；或被卤素、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
在一个实施方案中，“炔基”是指不饱和烃，其包括具有一个或多个三键的直链、支链和环状基团。炔基可具有一个三键，两个三键，三个双键。在另一个实施方案中，炔基具有2-12个碳原子；在另一个实施方案中，炔基具有2-6个碳原子；在另一个实施方案中，烯基具有2-4个碳原子；在另一个实施方案中，炔基是乙炔基(-CH≡CH2)。炔基的实例为乙炔基、丙炔基、丁炔基、环己炔基等。炔基可以未被取代；或被卤素、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
在另一个实施方案中，“烷氧基”是指与氧连接的如上所定义的烷基。烷氧基的实例是乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
在一个实施方案中，“卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子、例如被F、Cl、Br或I取代的如上定义的烷基。
在另一个实施方案中，“芳基”是指具有至少一个碳环芳族基团或杂环芳族基团的芳族基团，其可以未被取代；或被选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基或硫代或硫代烷基中的一个或多个基团取代。在另一个实施方案中，芳基在4-12元环之间。在另一个实施方案中，芳基在6-18元环之间。在另一个实施方案中，芳基在4-8元环之间。在另一个实施方案中，芳基是6元环。在另一个实施方案中，芳基是包含2-3个环的稠环体系。芳基环的非限制性实例是苯基、萘基、吡喃基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、咪唑基、异噁唑基等。
在另一个实施方案中，“杂芳基”是指具有至少一个杂环芳族基团的芳族基团，其其可以未被取代；或被选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氰基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基或硫代或硫代烷基中的一个或多个基团取代。在另一个实施方案中，杂芳基在4-12元环之间。在另一个实施方案中，杂芳基在6-18元环之间。在另一个实施方案中，杂芳基在4-8元环之间。在另一个实施方案中，杂芳基是6元环。在另一个实施方案中，杂芳基是包含2-3个环的稠环体系。杂芳基环的非限制性实例是吡咯基、噻吩基、噻唑基、苯并噻吩基、萘并噻吩基、嘌呤基、异噻唑基、呋喃基、呋咱基、异苯并呋喃基、吡喃基、色烯基、氧杂蒽基、吩噁噻基、吲哚基、异吲哚基、中氮茚基、异中氮茚基、苯并噻吩基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基等。
在一个实施方案中，“羟基”是指OH基团。在一些实施方案中，当本发明化合物的R1、R 2或R3为OR时，则R不是OH。
在一个实施方案中，术语“卤代”是指卤素、例如F，Cl，Br或I。
在另一个实施方案中，短语“苯酚”是指苯的醇(OH)衍生物。
在一个实施方案中，“氨基”是指通过单键连接至如上所述的氢原子、烷基、烯基或芳基或其组合的氮原子。氨基的非限制性实例是NH2、N(Me)2，N(Et)2，N(Ph)2等。
在一个实施方案中，“环烷基”基团是指包含碳和氢原子的非芳族单环或多环。环烷基可以在环中具有一个或多个碳-碳双键，只要该环不因其存在而变成芳族即可。环烷基的实例包括但不限于(C3-C7)环烷基、例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基、以及饱和的环状和双环萜烯；和(C3-C7)环烯基、例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和环庚烯基、以及不饱和的环状和双环萜烯。优选地，环烷基为环结构的单环或双环，除碳原子之外还包含硫、氧、氮或其任意组合作为环的一部分。在另一个实施方案中，环烷基是3-12元环。在另一个实施方案中，环烷基是6元环。在另一个实施方案中，环烷基是5-7元环。在另一个实施方案中，环烷基是4-8元环。在另一个实施方案中，环烷基可以未被取代；或被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、氰基、硝基、CO2H、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
在一个实施方案中，“杂环烷基”基团是指非芳香的单环或多环，其包含碳并且除碳之外还包含硫、磷、氧或氮作为环的一部分。杂环烷基可在环中具有一个或多个双键，只要该环不因其存在而变成芳族即可。杂环烷基的实例包括但不限于哌啶、哌嗪、吡喃、吗啉。优选地，杂环烷基为环结构的单环或双环，该环结构除了碳原子之外还包含硫、氧、氮或其任意组合作为环的一部分。在另一个实施方案中，杂环烷基是3-12元环。在另一个实施方案中，杂环烷基是6元环。在另一个实施方案中，杂环烷基是5-7元环。在另一个实施方案中，杂环烷基是4-8元环。在另一个实施方案中，杂环烷基可以未被取代；或被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、氰基、硝基、CO2H、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。在另一个实施方案中，杂环烷基是环状脲、咪唑啉基、咪唑烷基、吡咯啉基、吡咯烷基、噁唑啉基、异噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、异噁唑烷酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪、吗啉基。
在一个实施方案中，术语“烷基烷氧基”、“烷基卤代烷基”、“烷基芳基”、“烷基环烷基”、“烷基杂环烷基”、“烷基杂芳基”和“烷基氨基”分别是指与如上所述的烷氧基、卤代烷基、卤代烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基或氨基连接的烷基。烷氧基、卤代烷基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基或氨基如上文所定义。实例包括但不限于CH2-OEt、CH2-N-哌啶、CH2-N-哌嗪、CH2-N(Me)2等。
在另一个实施方案中，式I-IV的稠合杂环烷基与主芳环形成苯基吡咯烷酮基团。在另一个实施方案中，式I-IV的稠合芳基与主芳环形成萘基。在另一个实施方案中，式I-IV的稠合杂芳基与主芳环形成喹啉或异喹啉基团。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的化合物和/或其类似物、衍生物、异构体、代谢物、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、前药、多晶型物、杂质、或晶体或它们的组合的用途。
在一个实施方案中，术语“异构体”包括但不限于光学异构体和类似物、结构异构体和类似物、构象异构体和类似物等。
在一个实施方案中，术语“异构体”是指涵盖三苯基化合物的光学异构体。应当理解，本发明涵盖任何外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式、或它们的混合物，其形式具有可用于治疗本文所述的端粒酶表达和/或活性病况的特性。在一个实施方案中，三苯基化合物是纯的(R)-异构体。在另一个实施方案中，三苯基化合物是纯的(S)-异构体。在另一个实施方案中，三苯基化合物是(R)和(S)异构体的混合物。在另一个实施方案中，三苯基化合物是包含等量的(R)和(S)异构体的外消旋混合物。如何制备光学活性形式是公知的(例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，通过光学活性的起始原料进行合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相进行色谱分离)。
本发明包括本发明化合物的“药学上可接受的盐”，在一个实施方案中，其可以被制造以形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的加成盐。本发明化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。在一个实施方案中，无机酸的实例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。在一个实施方案中，有机酸可选自脂族、脂环族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸，其实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨基苯甲酸、草酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氨磺酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、海藻酸、半乳糖醛酸。在一个实施方案中，本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐、或由N,N'-二苄基乙二胺、胆碱、氯普鲁卡因、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。所有这些盐可以通过常规方法由相应的化合物制备。
在其他实施方案中，可以通过用无机碱、例如氢氧化钠处理，从而由酚类化合物制备药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，酚类化合物的酯可以用脂族和芳族羧酸制备，例如乙酸和苯甲酸酯。
本发明还包括本文所述化合物的氨基取代基的N-氧化物的用途。
本发明提供了本文所述化合物的衍生物的用途。在一个实施方案中，“衍生物”包括但不限于醚衍生物、酸衍生物、酰胺衍生物、酯衍生物等。在另一个实施方案中，本发明进一步包括如本文所述的化合物的水合物的用途。在一个实施方案中，“水合物”包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等。
在其他实施方案中，本发明提供了本文所述化合物的代谢物的用途。在一个实施方案中，“代谢物”是指通过代谢或代谢过程而从另一种物质产生的任何物质。
在其他实施方案中，本发明提供了本文所述化合物的药物产品的用途。在其他实施方案中，术语“药物产品”是指例如本文所述的适合于药物用途的组合物(药物组合物)。
在一些实施方案中，本发明提供了化合物和/或包含本发明化合物的组合物的方法和用途，用于在有需要的受试者中促进、改善、恢复或复原其生育力，其包括使性腺或生育力相关的细胞或组织与化合物接触。在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原性腺细胞或组织的功能的方法，其包括使性腺或生育力相关的细胞或组织与本文所述的化合物和/或包含其的组合物接触。在包含该化合物的组合物中，本发明提供了该化合物和/或包含本发明化合物的组合物用于作为体外受精方案的一部分的促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织收率的方法和用途。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明化合物和/或治疗雌性不育相关病况的组合物，所述病况包括黄体期缺陷或卵巢早衰(原发性卵巢功能不全或促性腺功能低下性腺功能减退)；和/或颗粒细胞端粒酶活性降低；和/或治疗雄性不育相关的病况，所述病况包括精子生产受损或精子输送受损；和/或作为体外受精(IVF)技术的辅助；和/或提高精子质量和/或卵子质量。例如并且在一些实施方案中，本发明的化合物在离体培养中延长了胚泡生存力，这反过来又提高了植入效率。在一些实施方案中，用本文所述的化合物治疗群体使得其对其他IVF技术更易感，或在一些实施方案中，允许评价组合疗法或新化合物。
在一些实施方案中，本发明提供了本文所述的任何化合物、或其组合、或包含本发明的化合物或化合物的组合的任何组合物合，其在于在暴露于辐射的受试者中复原、增强、挽救或促进的生育力的任何方面。
在一个实施方案中，本发明提供了使用本文所述的本发明化合物或包含其的组合物的治疗方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本发明的化合物治疗指定的疾病、病症或病况的方法，并且包括使用包含其的组合物。
应当理解，本文考虑将本文所述的任何化合物的任何组合和/或包含本文所述的这样的化合物组合的组合物用于本文所述的任何方法或测定等中。
在一个实施方案中，术语“治疗”包括预防性以及症状缓解性治疗。术语“减少”、“压抑”和“抑制”具有其通常理解的含义，即在另一个实施方案中减少或减轻、或在另一个实施方案中延迟、或在另一个实施方案中降低疾病、病症或病况的发生率、严重性或发病机理。在实施方案中，术语治疗是指与疾病、病症或病况相关的延迟进展、延长缓解、降低发病率、或改善症候。在一个实施方案中，术语“治疗”、“减少”、“压抑”或“抑制”是指与指定的疾病、病症或病况相关的发病率、死亡率或其组合的降低。在一个实施方案中，术语“进展”是指范围或严重性的增加、进行、生长或恶化。在另一个实施方案中，术语“复发”是指缓解后疾病的复发。在一个实施方案中，本发明的治疗方法降低了疾病的严重性，或在另一个实施方案中，降低了与疾病相关的症状，或在另一个实施方案中，降低了疾病期间表达的生物标志物的数量。
在一个实施方案中，术语“治疗”及其包括的方面是指向患有指定的疾病、病症或病况的受试者给予，或者在一些实施方案中，向易患指定的疾病、病症或病况的受试者给予。术语“易患”被认为尤其是指与指定的疾病的发生率、严重性等的趋势或统计增加相关的遗传特征或家族关系。在一些实施方案中，术语“易患”被认为尤其是指与指定的疾病的风险增加相关的生活方式。在一些实施方案中，术语“易患”被认为尤其是指例如在癌症中存在与指定的的疾病相关的生物标志物，术语“易患”癌症可以包括存在指定的的癌症的癌前前兆。
在另一个实施方案中，术语“给予”是指使受试者与本发明的化合物接触。给予可以在体外(即在试管中)或在体内(即在活生物体、例如人类的细胞或组织中)完成。在一个实施方案中，本发明包括将本发明的化合物给予受试者。
在一个实施方案中，本发明的方法利用本发明所描述的化合物与端粒酶接触或结合，所述端粒酶为对于增加端粒酶活性和/或表达从而介导所描述的效应的有效量。在一些实施方案中，该方法可包括鉴定需要增加端粒酶活性和/或表达的细胞或组织的初步步骤。所述细胞可以在培养物中，即在体外或离体；或在受试者或患者体内。在一个实施方案中，细胞或组织中端粒酶表达和/或活性的增加包括例如提高所接触细胞的复制能力和/或寿命。
在一些实施方案中，对于本文所述的任何方法/试剂盒或应用，本发明具体考虑分别使用化合物68、70和79：
在一些方面中，可以在暴露于辐射之后对这样的细胞进行具体地保护、增强、刺激等。
药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供了使用方法，所述方法包括给予包含所述化合物的组合物。如本文所用，“药物组合物”是指“治疗有效量”的活性成分、即本发明的化合物；以及药学上可接受的载体或稀释剂。如本文所用，“治疗有效量”是指对于给定的病况和给予方案提供治疗效果的量。
在一些实施方案中，本发明提供了可以包含本文所述的任何形式或实施方案的至少一种本发明化合物的组合物。在一些实施方案中，术语“一个”应理解为涵盖指定的材料的单个或多个。在一些实施方案中，术语“一”或“一个”是指至少一个。
在一些实施方案中，本发明的任何组合物将由本文所述的任何形式或实施方案的本发明的化合物组成。在一些实施方案中，本发明的组合物将基本上由本文所述的任何形式或实施方案的本发明的化合物组成。
在一些实施方案中，术语“包含”是指包括指定的活性药剂，例如本发明的化合物、以及其他活性药剂；以及如在制药工业中已知的药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等。在一些实施方案中，本发明的任何组合物将包含本文所述的任何形式或实施方案的式I-XVI的化合物。在一些实施方案中，本发明的任何组合物将由本文所述的任何形式或实施方案的式I-XVI的化合物组成。在一些实施方案中，本发明的组合物将基本上由本文所述的任何形式或实施方案的本发明的化合物组成。在一些实施方案中，术语“包括”是指包括指定的活性药剂，例如本发明的化合物；以及包含其他活性药剂；以及药学上已知的药学上可接受的载体、溶媒、软化剂、稳定剂等。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”是指仅活性成分为指定的活性成分的组合物，然而可以包括用于将制剂进行稳定、保存等的其他化合物，但不直接涉及在指定活性物质的疗效。一些实施方案中，术语“基本上由……组成”是指其唯一的活性成分具有可比的作用模式、或者可比分子靶标是指定的活性成分的组合物，但也可以并入其他活性成分，这些次要活性成分可以作用于不同的靶标或具有姑息作用。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”是指促进活性成分释放的组分。在一些实施方案中，术语“由……组成”是指包含如本文所述的化合物作为唯一活性成分；和药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的本发明化合物或其前药、类似物、异构体、代谢物、衍生物、药学上可接受的盐、药物产品、多晶型物、晶体、杂质、N-氧化物、酯、水合物或其任意组合；和合适的载体或稀释剂。
可以将活性成分配制成中和的药学上可接受的盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐，其与无机酸例如盐酸或磷酸、或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等而形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙、或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将包含本发明化合物的药物组合物给予受试者，例如口服、肠胃外、血管内、癌旁、经粘膜、经皮、肌内、鼻内、静脉内、皮内、皮下、舌下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内、通过吸入、直肠、肿瘤内或通过其中重组病毒/组合物可以递送至组织的任何方式(例如，针或导管)。或者，局部给予可以期望应用于粘膜细胞、皮肤或眼部给予。另一给予方法是通过吸入或气雾制剂。
在一个实施方案中，本发明的组合物被配制用于口服递送，其中所述活性化合物可以与赋形剂结合并以可服用的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、干胶片等形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以包含以下物质：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和，可以加入甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃矫味剂。当单位剂型是胶囊剂时，除上述类型的材料之外，其还可包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在，或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用虫胶、糖或两者包衣。酏剂的糖浆可包含活性化合物、蔗糖作为甜味剂、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为防腐剂、染料和矫味剂，例如樱桃或橙子矫味剂。另外，可以将活性化合物并入持续释放、脉冲释放、受控释放或推迟释放的配制剂和制剂中。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的载体材料。
在一个实施方案中，用于此类组合物中的载体是生物相容的，并且在另一个实施方案中，是可生物降解的。在其他实施方案中，所述制剂可以提供相对恒定水平的一种活性成分的释放。然而，在其他实施方案中，可能期望在给予后立即具有更快的释放速率。在其他实施方案中，活性化合物的释放可以是事件触发的。触发活性化合物释放的事件在一个实施方案中可以相同，或在另一个实施方案中不同。触发活性成分释放的事件可以是在一个实施方案中暴露于湿气，在另一个实施方案中暴露于较低的pH，或在另一个实施方案中是温度阈值。使用已知技术，这样的组合物的制剂完全在本领域普通技术人员的水平内。在这方面有用的说明性载体包括聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其他说明性的推迟释放载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水核(例如，交联的多糖或寡糖)和任选的包含两亲化合物(例如磷脂)的外层。在一个实施方案中，在持续释放制剂中包含的活性化合物的量取决于给予位点、释放的速率和预期的持续时间、以及被压抑或抑制的待治疗病症的性质。
在一个实施方案中，期望胃肠外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文公开的组合物。这样的途径对于本领域技术人员是众所周知的，其中一些方法例如在美国专利号5,543,158、美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363中进一步描述，其全部内容通过参考而完全并入。在某些实施方案中，可以在水中适当地与表面活性药剂、例如羟丙基纤维素混合，制备游离碱或药学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物、和油中制备。其必须在生产和储存条件下稳定，并且必须加以保存以防止微生物、如细菌和真菌污染。
在另一个实施方案中，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在其他实施方案中，期望可注射组合物的延长吸收。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂、例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
在某些实施方案中，肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体等。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以以各种剂量给予受试者，在一个实施方案中，所述受试者是人类受试者。在一个实施方案中，本发明的化合物以每天0.1-200mg的剂量给予。在一个实施方案中，本发明的化合物以0.1-10mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.1-25mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.1-50mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.3-15mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.3-30mg的剂量给予，或在另一个实施方案中，0.5-25mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.5-50mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.75-15mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以0.75-60mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以1-5mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以1-20mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以3-15mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以1-30mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以30-50mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以30-75mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以100-2000mg的剂量给予。在一些实施方案中，本领域技术人员将认识到，本发明的化合物可以根据时间、疾病/症候/病况严重程度、或年龄或其他因素而以不同剂量给予。
本发明的化合物可以各种剂量给予。在一个实施方案中，本发明的化合物以1mg的剂量给予。在另一个实施方案中，本发明的化合物以5mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以3mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以10mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以15mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以或20mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以25mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以30mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以35mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以40mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以45mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以50mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以55mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以60mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以65mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以70mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以75mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以80mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以85mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以90mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以95mg的剂量给予，或在另一个实施方案中以100mg的剂量给予。
虽然本发明的化合物可以作为唯一的活性药物给予，但是如本领域技术人员将理解的，它们也可以与一种或多种其他化合物联合使用和/或与其他药物联合使用，用于治疗和/或预防疾病、病症和/或病况。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以与一种或多种这样的试剂依次给予以提供持续的治疗和预防作用。在另一个实施方案中，化合物可以通过不同途径、在不同时间或其组合给予。
另外，本发明的化合物可以单独或组合地与其他方式组合使用，用于预防或治疗病况、疾病或病症。在一些实施方案中，这样的其他治疗方式如将适合于待治疗的病况，可包括但不限于手术、放射线、激素补充、饮食调节、伤口清创术等。这些可以依次进行(例如，在手术或放疗后用本发明的化合物治疗)或组合进行(例如，附加于饮食方案)。
额外的活性药剂通常可以以PHYSICIANS'DESK REFERENCE(PDR)第53版(1999)中指出的治疗量使用，或者以本领域普通技术人员已知的治疗上有用的量使用。本发明的化合物和其他治疗活性药剂可以推荐的最大临床剂量或更低的剂量给予。可以改变本发明组合物中活性化合物的剂量水平以获得期望的治疗应答，这取决于给予途径、疾病的严重程度和患者的应答。组合可以作为单独的组合物或作为包含两种药物的单一剂型给予。当以组合形式给予时，治疗剂可以被配制为同时或不同时提供的单独组合物，或者治疗剂可以以单一组合物形式提供。
药物组合物可以单独包含本发明的化合物，或者可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、乳剂、凝胶剂、霜剂或栓剂(包括直肠和尿道栓剂)。药学上可接受的载体包括胶、淀粉、糖、纤维素材料及其混合物。包含本发明化合物的药物配制剂可以通过例如皮下植入小丸来给予对象。在另一个实施方案中，小丸在一段时间内提供了本发明化合物的受控释放。配制剂还可以通过静脉内、动脉内、或肌肉内注射液体制剂、口服液体或固体制剂、或局部应用来给予。给予也可以通过使用直肠栓剂或尿道栓剂来完成。药物组合物也可以是肠胃外制剂；在一个实施方案中，所述制剂包含脂质体，其包含本发明化合物的复合物。
本发明的药物组合物可以通过已知的溶解、混合、造粒或压片的方法制备。对于口服给予，将本发明的化合物或其生理学上可耐受的衍生物、例如盐、酯、N-氧化物等、与为此目的惯用的添加剂，例如溶媒、稳定剂或惰性稀释剂混合，然后通过常规方法将其转化成合适给予的形式，例如片剂、包衣片剂、硬明胶胶囊或软明胶胶囊剂、水性、酒精性或油性溶液剂。合适的惰性溶媒的例子是常规的片剂基质，例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，结合粘合剂、如阿拉伯胶，玉米淀粉、明胶；或结合崩解剂、如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；或结合润滑剂、如硬脂酸或硬脂酸镁的混合物。合适的油性溶媒或溶剂的实例是植物油或动物油，如向日葵油或鱼肝油。配制剂可以以干颗粒和湿颗粒的形式实现。对于肠胃外给予(皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)，将本发明的化合物或其生理学上可耐受的衍生物、例如盐、酯、N-氧化物等、与根据需要的为此目的常规和合适的物质、例如增溶剂或其他助剂转化为溶液剂、混悬剂或乳剂。实例是：添加或不添加表面活性药剂和其他药学上可接受的佐剂的无菌液体，例如水和油。示例性的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，特别是对于可注射溶液而言，水、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液、以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体。
含有活性成分的药物组合物的制备在本领域中是众所周知的。典型地，将这样的组合物制备为递送至鼻咽的多肽的气雾剂，或制备为注射剂(液体溶液剂或混悬剂)，但是，也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。该制剂也可以被乳化。活性治疗成分通常与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，根据需要，该组合物可以包含少量的助剂物质，例如润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂，其提高了活性成分的有效性。
为了使用例如霜剂、凝胶剂、滴剂等向身体表面局部给予，制备本发明的化合物或其生理上耐受的衍生物、例如盐、酯、N-氧化物等，并且在存在或不存在药物载体的情况下，在生理上可接受的稀释剂中以溶液剂、混悬剂或乳剂形式使用。
在另一个实施方案中，可以在囊泡中、特别是在脂质体中递送活性化合物(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；一般参见同上)。
在一个实施方案中，本发明提供了组合配制剂。在一个实施方案中，术语“组合配制剂”特别地定义为“组件试剂盒”，在其意义上如上定义的组合搭档可以独立地给予或通过使用具有独立量的组合搭档的不同固定组合，即同时、同步、分别或依次给予。在一些实施方案中，然后可以例如同时或按时间交错地给予组件试剂盒的部分，即对于组件试剂盒的任何部分在不同的时间点并且以相等或不同的时间间隔给予。在一些实施方案中，可以在组合配制剂中给予组合搭档的总量的比例。在一个实施方案中，组合配制剂可以不同，例如以应对待治疗的患者亚群的需求、或单一患者的需求，其中不同的需求可能是由于特定的疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重而造成的，其可以容易地由本领域技术人员确定。
应当理解，本领域技术人员将理解本发明涉及适当时用于任何疾病、病症或病况的如本文所述的组合物和联合疗法。上文已经描述了代表本发明实施方案的这样的组合物和联合疗法的用于特定疾病、病症和病况的特定应用，以及通过单独或作为联合疗法的一部分给予本文所述的化合物，并且使用本发明的组合物而在受试者中治疗这样的疾病、病症和病况的方法代表了本发明的另外的实施方案。
病症或疾病的治疗
在一些实施方案中，本发明提供化合物和包含其的药物组合物，用于在受试者中治疗特别涉及性腺细胞或组织、或生育力相关的细胞或组织的病况和/或疾病。
在一些方面中，通过使用与端粒酶相互作用并刺激和/或增加受试者的组织和细胞中的端粒酶表达和/或活性的化合物，在一些方面中通过经典的途径，且在一些实施方案中通过非经典的途径，从而实现这样的病况/疾病等的治疗。
在一些实施方案中，这样的活性由于例如受试者中的疾病、病症或病况而降低或不存在，或在一些实施方案中被破坏，和/或由于在受试者中治疗疾病、或病症、或病况而提高。
在一些方面中，受本发明的化合物、组合物和方法帮助的受试者可能患有或易患癌或癌前状态。在一些方面中，受本发明的化合物、组合物和方法帮助的受试者可能暴露于放射线或其他毒性疗法。
在一些实施方案中，受本发明的化合物、组合物和方法帮助的受试者可能遭受或易患、或已遭受或经历过a)黄体期缺陷；b)卵巢早衰(原发性卵巢功能不全或性腺功能亢进性腺功能减退)；c)精子生产受损；d)精子输送受损；同时将所述受试者维持在良好的健康状况和/或其他临床治疗和/或诊断领域，包括本文所述的术语“治疗”所涵盖的任何实施方案。
在一些实施方案中，受本发明的化合物、组合物和方法帮助的受试者可能需要或受益于改善的生育力或改善的原位或通过体外方案的生育潜力，或者用于促进原位或体外过程的生育力的制备方法。
例如并且在一些实施方案中，受试者是雄性，并且本发明的化合物、组合物和方法使从受试者中采集的精子或精子样品扩增，用于治疗受试者的生育力受损或降低。在一些方面中，受试者正在接受GIF、AIF或IVF方案。在其他实施方案中，本发明的化合物、组合物和方法导致受试者中精子的数量/质量提高，而无需任何其他的生育力治疗或操作。在一些实施方案中，受试者可能已经暴露于辐射。
例如并且在一些实施方案中，受试者是雌性，并且本发明的化合物、组合物和方法使从受试者中采集/取的回成熟的卵泡或卵子扩增，用于治疗受试者的生育力受损或降低。在一些方面中，受试者正在接受GIF、AIF或IVF方案。在其他实施方案中，本发明的化合物、组合物和方法导致受试者中成熟卵泡/卵子的数量/质量提高，而无需任何其他的生育力治疗或操作。在一些实施方案中，受试者可能已经暴露于辐射。
在一些实施方案中，受本发明的化合物、组合物和方法帮助的受试者可能需要或受益于暴露性腺或生育力相关的细胞或组织，其从患有癌性或癌前病况、患有对类固醇生成产生负面影响的内分泌失调、患有不育症或易患不育症、或患有导致性腺细胞或组织早衰的遗传性病症或其他病症的受试者分离或在其体内。
在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物激活端粒酶，并且本文所述的方法因此是有用的。
如本文进一步描述的实施例3证明，即使使用单剂量的实施方式的化合物，在所评估的所有发情期，本发明的化合物在卵巢中均增加了端粒酶表达和活性。
类似地，本发明的实施方式的化合物在发情周期的每个阶段有助于/促进了卵巢尺寸和重量的增加，并加速了发情周期(图12)。
实施方式的化合物促进和增强了排卵(图13)。
实施方式的化合物也诱导孕酮的分泌。本发明的化合物增加了胚胎的数量。
因此，具体体现的化合物明显改善并促进了雌性的生育力，并且极大地有助于提高生育力治疗策略，并且在一些方面中，还考虑到下一个实施例中提供的数据，特别适合支持IVF治疗。
实施例4证明了实施方式的化合物还特别有用于保护雄性腺细胞/组织免受X射线诱导的形态学损害(图22)。
还证实了实施方式的化合物在X射线辐射后的不同时间对精子计数的有益影响(图25)。尽管来自经X射线处理的受试者的精子数量显著减少，但暴露于X射线辐射但给予了具体化合物的受试者显示出附睾中精子数量显著增加(图25)。
因此，本发明实施方式的化合物尤其可用于在暴露于辐射的受试者中促进受精，并因此在一些方面中，显著复原组织形态，增加CREM表达并减少DSB形成。进一步，在辐射后的不同时间点用选择的化合物、如化合物68进行治疗增加了附睾中的精子计数，表明其有望作为复原受照射对象的雄性生育力能力的疗法。
辐射后在性腺组织中的这种保护作用也被证明对雌性受试者有效(图26)。
化合物增加细胞中端粒酶表达和/或活性的能力可以使用本领域已知的TRAP(端粒重复扩增方案)测定来确定(例如，Kim等人，美国专利号5,629,154；Harley等人，美国专利号5,891,639)。典型地将活性与在这样的细胞的对照测定中类似测量的活性相比较(例如，端粒酶活性比在溶剂对照中观察到的高50％)。适用于该测定的细胞系可包含正常人成纤维细胞(Now)或正常人角质形成细胞(NHK)。
在一些实施方案中，端粒长度可以用作端粒酶表达和/或活性的有用指示剂。在一个实施方案中，端粒酶表达和/或激活在治疗癌症、过早衰老综合征或节段性早衰、遗传异常和年龄相关的疾病中是重要的。端粒长度在特定疾病进展中具有不同的表达模式，并且是其激活的函数，因此在一些实施方案中，就不同疾病的预后而言，测量这种长度作为治疗的函数具有价值。
在一个实施方案中，端粒长度可以通过Southern印迹、杂交保护测定、荧光原位杂交、流式细胞术、原位引发、定量聚合酶链反应和单端粒长度分析来测量，这些都是本领域已知的技术(Kah-Wai Lin and Ju Yan,J.Cell.Mol.Med.,2005,Vol 9,No.4,977-989)。
提供以下实施例以更充分地说明本发明的优选实施方案。但是，它们绝不应解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
实施例1
化合物的合成
本发明的化合物如PCT国际申请号WO 2008/149,345；WO 2008/149353；WO 2008/149,346中记载那样合成，通过参考将其整体并入本文中。
特别地，使用以下化合物：
化合物79：
1,1,1-三(4-羟基-3,5-亚甲基乙氧基-苯基)-乙烷
化合物68：
1,1,1-三(4-羟基-3,5-二溴-苯基)-乙烷；和
化合物70：
用于制备化合物70的合成方法可包括以下方法：
1,1,1-三(4-甲氧基苯基)-乙烷：向1.53g、5mM的1,1,1-三(4-羟苯基)-乙烷在20ml乙醇和10ml水中的溶液，经过1小时并同时分批加入在10ml水中的1g、25mM的NaOH和5.1gr、40mM的硫酸二甲酯(1:8摩尔比)。然后将溶液回流1小时，并在室温下搅拌70小时。过滤白色沉淀物，用水洗涤并干燥，得到1.74g。用50ml乙醇重结晶两次，得到1.15gr白色晶体，收率66％，熔点-160℃。CH2Cl2中，TLC Rf＝0.85。
NMR CDCl3δ6.99,6.79(12H,ABq,JAB＝8.8Hz),3.78(9H,s,OCH3),2.11(3H,s,CH3)。
向来自A的0.49gr、1.4mM的l,l,l-三(4-甲氧基苯基)乙烷在22ml的1,2-二氯乙烷中的溶液，分批加入1.65gr、10.2mM，(7.3:1的比例)的溴在5ml的1,2-二氯乙烷中的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜，并加热3小时至70℃，并进行后处理(硫代硫酸钠)，得到1.0gr粗产物。TLC显示没有SM，但NMR是混合物(m为6.90ppm，且4个甲氧基)。再次用1gr溴将固体溴化，回流18小时。用热乙醇进行后处理和研磨，得到0.27g白色固体，收率23％，熔点-160°。CH2Cl2中，TLC Rf＝0.95。
NMR CDCl3δ7.16(6H,s,ArH),3.92,3.91(6:4ratio)(9H,2s,OCH3),2.04,2.03(4:6ratio)(3H,s,CH3)。
实施例2
本发明实施方式的化合物对大鼠颗粒细胞中类固醇生成的作用
材料和方法
用怀孕的母马血清促性腺激素(PMSG)、或指定的化合物、或两者处理表达FSH受体的永生化大鼠颗粒细胞6小时。从这些细胞制备的蛋白质提取物用于使用端粒重复扩增方案(TRAP)测定的端粒酶活性测量。
简而言之，将蛋白提取物与用作端粒酶(TS)模板的寡核苷酸一起在30℃下温育45分钟，然后用反向引物(ACX)和内部对照进行PCR。PCR产物在4.5％琼脂糖凝胶上分离。RNA提取物用于使用端粒酶逆转录酶(TERT)、类固醇急性调节蛋白(StAr)和β-肌动蛋白作为参照基因的特异性引物的cDNA合成和定量实时PCR。为了测量细胞分泌的孕酮水平，在100nM地塞米松存在下，在存在或不存在1IU/mL PMSG和DMSO、化合物79 50nM或化合物70 50nM的情况下培养颗粒细胞。24小时后，通过放射免疫测定法(RIA)确定细胞培养基中的孕酮水平。对于细胞增殖测量，将1×105个细胞接种在具有1IU/mL PMSG和DMSO、化合物79 50nM或化合物70 50nM的96孔板中。24小时后，通过XTT增殖测定法测量细胞活力。
蛋白质提取物的制备
将卵巢匀浆并在4℃下以1200RPM离心10分钟，然后将其在冰上悬浮在CHAPS缓冲液(10mM Tris-HCl pH-7.0，1mM MgCl2，1mM EDTA pH-0.5，0.1mM PMSF，0.5％的3-[(3-胆固醇酰胺丙基)二甲基氨基-丙磺酸[CHAPS]和10％的甘油)中30分钟，并且在4℃下以13500RPM再次离心30分钟，收集上清液。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-RadLaboratories，德国)确定总蛋白质浓度。
端粒酶重复扩增方案(TRAP)测定
通过对TRAP测定法[Grin,Y.,T.Admoni,and E.Priel,Telomerase activity inthe various regions of mouse brain:non-radioactive telomerase repeatamplification protocol(TRAP)assay.J Vis Exp,2014(91):p.e51865]的轻微修改来评估小鼠卵巢中的端粒酶活性。该测定包括三个主要阶段：端粒酶反应、PCR反应和高分辨率琼脂糖微凝胶电泳分析。将蛋白质提取物(0.5μg/μl)与1μl的10X TRAP测定反应混合物：(20mM Tris-HCl pH 8.2、63mM KCl，1.5mM MgCl2、1mM EDTA，0.1mg/mL BSA和0.05％Tween20)、和0.1μg端粒酶底物(TS)引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，0.l/μl)、2.5mM dNTP's和UPW在30℃水浴中温育45分钟，至最终体积10μl。然后，通过使用含有0.1g ACX引物(5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'，0.2μg/μ1)、1.25μl Titanium Taq聚合酶缓冲液x10和0.25μl Titanium Taq聚合酶x50的反应混合物的PCR，扩增端粒酶反应产物。内标引物用作对照：0.5x10-15μgIS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3'，1x10-15μL)和0.025μg ISR引物(5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3'，0.05μL)。如先前所述[Grin,Y.,T.Admoni,and E.Priel,Telomerase activity in the various regions of mousebrain:non-radioactive telomerase repeat amplification protocol(TRAP)assay.JVis Exp,2014(91):p.e51865]，将34个PCR周期用于检测产物。将这些产物在4.5％的高分辨率琼脂糖微凝胶上分离，并用Gel-Red溶液(X10000储备溶液用0.01M NaCl稀释至X3工作溶液)检测20分钟。使用紫外透射照明器数码相机系统，在302nm波长下对凝胶进行成膜。所有测定均包括CHAPS缓冲液作为阴性对照、以及阳性对照——来自胶质母细胞瘤细胞的蛋白质提取物。
端粒酶活性的定量
通过使用EZQuant软件(EZQuant Ltd.，Rehovot，以色列)的光密度分析法对TRAP测定产物进行定量，并对IS(内标)标准化。在每个实验中，我们还使用阳性对照(来自癌细胞的蛋白质提取物)作为不同实验之间比较的恒定参比。在每个实验中，对IS标准化的数据被计算为从阳性对照值的％。
总RNA和cDNA制备物的分离
移除小鼠卵巢并在三试剂RNA提取缓冲液(Sigma-Aldrich，Rehovot，Israel)中匀浆，并根据制造商的方案分离RNA。使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo FisherScientific Inc.，Pittsburgh PA，USA)确定RNA浓度。根据制造商的说明，使用“还原辅助第一链cDNA合成试剂盒”(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)将RNA(1000ng)转录为cDNA。
实时PCR
RT-PCR被用于测量mTERT的基因表达，其被标准化为管家基因β-肌动蛋白的表达。将cDNA(25ng)添加到反应混合物中，所述混合物包括：引物(FW和RV)、SYBR-Green和UPW的混合物。用于mTERT的PCR扩增的引物是：FW 5'-GAAAGTAGAGGATTGCCACTGGC-3'和RV 5'-CGTATGTGTCCATCAGCCAGAAC-3'。β-肌动蛋白的引物是：FW 5'-GATGTATGAAGGCTTTGGTC-3'和RV 5'-TGTGCACTTTTATTGGTGTG-3'。通过ΔΔCt法测量产物，其中mTERT基因被计算为相对于β-肌动蛋白。
小鼠血清中的孕酮水平
从处死的小鼠中采集血样，并离心(3800rpm，10分钟)后，将血清送至临床内分泌实验室(Soroka University Medical Center，Beer-Sheva，以色列)，用于确定孕酮水平。
结果：
促性腺激素刺激诱导TERT表达和端粒酶活性。图1以图形方式描点了相对TERT表达(％)随PMSG浓度增加的函数。图2显示了由用10IU/mL PMSG处理6小时的颗粒细胞的TRAP测定得出的蛋白质水平。
所述化合物增加TERT表达和端粒酶活性(参见图3和4)。当通过TRAP来测定蛋白质表达和通过以剂量依赖方式qRT-PCR支持增加表达来测定和TERT相对mRNA水平时，分别以50nM和200nM用两种本发明化合物(化合物79和70)处理的颗粒细胞6个小时。令人惊讶地，与化合物79相比，化合物70进一步增加了颗粒细胞中的端粒酶活性和表达(图3)。
通过实施方式的化合物增加的TERT表达诱导了类固醇生成急性调节蛋白(StAr)的表达。图5显示了以50nM用化合物79和70处理6小时的颗粒细胞，表明StAr的表达增加。
通过实施方式的化合物增加的TERT表达增加了促性腺激素刺激后颗粒细胞特异性产生的孕酮水平，而未检测到对细胞生长的显著影响。
图6显示了通过放射免疫测定法(RIA)确定的在存在或不存在PMSG 1IU/mL的条件下以50nM用化合物79或化合物70处理24小时的颗粒细胞中的孕酮水平。图7显示了通过XTT增殖测定法测量的在存在1IU/mL PMSG的条件下以50nM的化合物79和70、50nM处理24小时后的颗粒细胞活力。
综上所述，本文首次证明了颗粒细胞中的促性腺激素(FSH)刺激增加了端粒酶的表达，进而促进了FSH控制的颗粒细胞增殖的途径。
颗粒细胞中(通过给予的化合物)增加端粒酶影响了FSH刺激途径中涉及的基因的表达和细胞分泌的孕酮水平，支持了端粒酶参与颗粒细胞中的类固醇生成、以及由此积极影响雌性的生育力能力。
实施例3
本发明的实施方式的化合物对体内排卵的作用
材料和方法
至少3个月龄的雌性ICR小鼠通过皮下给予本发明的实施方式的化合物(化合物79和化合物68)(6mg/Kg)或单独的DMSO(0.5％)。给予后在基线和12小时时进行阴道涂片以确定发情周期阶段，然后处死小鼠。
卵巢被称重；一个用于采集蛋白质提取物，用于通过TRAP测定测量端粒酶活性，另一个用于使用苏木精-伊红染色的卵巢及其卵泡的组织学检查。
组织学分析
移除小鼠卵巢，并用4％多聚甲醛固定过夜，以增加的乙醇对二甲苯浓度脱水，并包埋在石蜡中。旋转切片机用于生成5μm的切片，其被装载在Superfrost plus载玻片上。将切片干燥并在37℃下加热过夜，并保存在干燥的地方。将石蜡包埋的切片在二甲苯中脱蜡，并在乙醇浓度降低的情况下重新水化。然后，将切片用苏木精-曙红染色或进行免疫化学和免疫荧光测定[Liani-Leibson,K.,I.Har-Vardi,and E.Priel,Inhibition oftopoisomerase I by anti-cancer drug altered the endometrial cyclicity andreceptivity.Curr Mol Med,2014.14(1):p.141-50]。
免疫荧光
所有切片最初均用抗原回收溶液处理；将切片在pH＝6的10mM柠檬酸钠溶液中加热5分钟。通过将切片与3％BSA温育来阻断非特异性结合。使用在PBS+3％BSA中以1：200稀释的单克隆小鼠抗PCNA、克隆PC 10sc-56(Santa cruz Dallas，Texas USA)作为一抗。将切片与一抗在4℃下温育过夜。第二天，将切片用PBS洗涤，并且PBS包含0.1％TWEEN 20(Sigma)。在室温下施加二抗抗小鼠抗体(cy3)(Jackson PA，USA)2小时。将切片用PBS洗涤，并且PBS包含0.1％TWEEN 20，并施加DAPI(Sigma)10分钟。最后，将切片洗涤，并用基于水的载体介质覆盖。使用Pannoramic midi(3D Histech)设备检查了PCNA标记。
雄性和雌性小鼠之间的配对
用6mg/kg的化合物79、化合物68和化合物70或0.5％的DMSO的单次皮下注射，治疗雌性ICR小鼠。注射后立即将雌性小鼠放入雄性小鼠的笼子中，14天后，处死雌性小鼠并对子宫中的胚胎数进行计数。
其他方法如上文实施例2中所述。
结果
在雌性小鼠的卵巢中，端粒酶活性在18日龄时达到峰值。通过修改的TRAP测定[Grin,Y.,T.Admoni,and E.Priel,Telomeraseactivity in the various regions ofmouse brain:non-radioactive telomerase repeat amplification protocol(TRAP)assay.J Vis Exp,2014(91):p.e51865]，确定了由处于不同年龄的小鼠获得的源自卵巢的蛋白提取物中的端粒酶活性：10天、18天、1个月和3个月(n＝12，每组3只)，并如前所述，通过使用EZquant软件的光密度分析进行定量[Eitan,E.,et al.,Novel telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateralsclerosis.EMBO Mol Med,2012.4(4):p.313-29；Tichon,A.,et al.,Oxidative stressprotection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derivedfrom healthy and diseased individuals.Curr Mol Med,2013.13(6):p.1010-22；Tichon,A.,et al.,Telomerase activity and expression in adult humanmesenchymal stem cells derived from amyotrophic lateral sclerosisindividuals.Cytotherapy,2009.11(7):p.837-48]。图8所示的结果表明，卵巢中的端粒酶活性随年龄下降，并且在18日龄时观察到该活性的峰值。为了检查端粒酶表达水平是否受小鼠卵巢中发情周期阶段的影响，在处死前，我们使用普通的阴道涂片法，确定了雌性小鼠(3个月龄)的发情周期阶段。从卵巢中提取总RNA，制备了cDNA，并使用适当的mTERT引物进行了实时PCR。图9中的结果表明，贯穿发情周期，小鼠卵巢中TERT的表达没有明显改变。
在处于不同年龄的小鼠中，给予实施方式的化合物增加了端粒酶活性。将不同年龄的小鼠分组(10天、18天、1个月和3个月)，并用化合物79、化合物68、作为溶媒对照的DMSO进行治疗，以及未治疗(n＝48，每组3只小鼠)。将化合物79和化合物68(6mg/Kg)或DMSO(0.5％)皮下注射到小鼠中，并在12小时后处死小鼠，移除卵巢，并通过TRAP测定将蛋白提取物用于测量端粒酶活性。在所有检查的年龄，单剂量的化合物68显著增加端粒酶活性(最多1.5倍)(图10A-E)，而化合物79仅在3个月龄的小鼠卵巢中显著提高端粒酶活性(图10E)。
本发明的化合物在所有发情期均增加小鼠卵巢中端粒酶的表达和活性。为了确定化合物导致的端粒酶表达和活性的增加是否取决于发情期，我们如上所述在各个发情期用单剂量的指定化合物治疗小鼠。治疗后12小时处死小鼠，移除卵巢：一个用于采集蛋白质提取物，用于通过TRAP测定测量端粒酶活性，另一个用于RNA提取物，用于使用qRT-PCR测量TERT mRNA表达水平。在处于发情前期、发情期和间情期的小鼠卵巢中，化合物显著增加了端粒酶的表达(最高1.5倍)(图11A)和端粒酶的活性(11B)。当在发情后期给予化合物时，它们增加了端粒酶的表达和活性，但不显著。
端粒酶的激活在发情周期的每个阶段增加了卵巢的大小和重量，并加速了发情周期。在进行各种分析之前，对来自上述实验的小鼠的卵巢进行称重。在所有发情周期阶段，与未治疗和DMSO相比，使用指定化合物治疗后，我们观察到小鼠卵巢的尺寸和重量增加(最多40％)(图12)。为了检查在发情周期中化合物导致的卵巢中端粒酶增加的生物学效应，对小鼠(3-5月龄)在发情周期的各个阶段，未进行治疗，或用化合物(单剂量化合物79、化合物68)或溶媒(0.5％DMSO)进行治疗，并且在治疗后12小时，通过阴道涂片中细胞的成分确定发情周期的阶段。图13中显示的结果表明，在发情前期(P)或发情期(E)中，注射单剂量化合物的小鼠被发现在治疗12小时后处于发情后期。而如预期的那样，未处理或用溶媒处理的对照小鼠在12小时后处于发情期。当在间情期或发情后期注射化合物时，治疗后12小时的发情周期阶段没有观察到变化。
实施方式的化合物促进和增强排卵，如治疗前和治疗后12小时在发情前期和发情期的阴道涂片的变化所证明的(图13)。如图(A)所示，通过皮下注射DMSO、化合物79和化合物68后，从雌性小鼠中采集阴道涂片。在治疗前为发情前期(A)、发情期(C)。治疗12小时后，再次采集阴道涂片，为发情后期(B)、发情期(D)。阴道涂片通过结晶紫染色。
对用所述化合物治疗的3个月龄的小鼠的卵巢进行的组织学分析扩展了这些发现。根据它们的发情周期阶段(P、E、M、D)将小鼠分组。在发情周期的每个阶段，对小鼠不进行治疗，或用单剂量(6mg/Kg)的化合物70、79、化合物68或DMSO 0.5％进行治疗。治疗后12小时，处死小鼠，移除卵巢用于使用苏木精-曙红染色的组织学检查。如图14所示，治疗后12小时，用化合物70、79或化合物68治疗的处于发情前期(P)和发情期(E)的小鼠引起了比对照组(UT，DMSO)多的黄体(CL)，表明排卵增加(图14A、14B)。
处于发情后期(M)阶段的治疗表明，治疗后12小时，所有治疗组中都发现许多黄体(CL)，但是在用化合物70、79或化合物68治疗的小鼠中，发现卵泡更发达(白色箭头)，且在卵母细胞周围发现多层颗粒细胞(GC)；而在对照组中，大多数检测到原始卵泡(蓝色箭头)(图14C)。用化合物68在间情期(D)阶段的治疗在治疗后12小时显示多个黄体(CL)，且化合物79显示卵母细胞周围的多层颗粒细胞(GC)(图14D)。
使用抗PCNA抗体(一种已知的增殖标记物)对各种治疗后的卵巢中细胞增殖进行检查。结果显示，处于发情期的未经治疗或经溶媒治疗的小鼠在各种卵泡的GC中均表现出显著的PCNA染色(图15A)，而在治疗后，出现了CL的外观，更少地检测到GC的PCNA染色，这与卵巢的发情后期相适应(图15A)。当对处于发情后期的小鼠用实施方式的化合物进行治疗时(图15B)，与未治疗或载体治疗的小鼠相比，表明PCNA染色的卵泡中GC量增加，表明所述化合物激活了卵泡。
本发明的化合物诱导孕酮的分泌。为了确定用所述化合物治疗后观察到的CL数的增加是否产生分泌孕酮的功能性黄体，在治疗后12小时从处死的小鼠中采集血样，并分析血清的孕酮水平。结果表明，在发情周期的P、E和M阶段用化合物79治疗的小鼠中，治疗后12小时孕酮的分泌显著增加(与DMSO或UT相比，高达5倍)(图16)。仅当在发情后期和发情前期给予时，用化合物80的治疗展示出孕酮增加。这些数据与上述结果相适应，所述结果证明在发情前期和发情后期用指定化合物进行区别治疗和一般治疗加速了根据文献显示出高孕酮分泌的发情后期的出现。
本发明的化合物增加了胚胎的数量。卵巢组织的组织学检查显示，与处于相同发情周期阶段的未治疗的小鼠相比，用实施方式的化合物治疗后黄体数量高，这表明排卵卵母细胞数量增加。为了检查在治疗后排卵卵母细胞是否存活，我们测试了在各种治疗后生成的胚胎数量：化合物79、或化合物68、DMSO、和未处理、和化合物70。单次皮下注射各化合物(6mg/kg)或DMSO(0.5％)后，将雌性单只小鼠放入装有雄性小鼠的笼子中。14天后，处死雌性小鼠并确定每只经治疗的小鼠子宫中的胚胎数目。图17中示出的数据显示，与对照(DMSO或UT)相比，经治疗的小鼠中的胚胎数量显著增加(高达50％)。
综上所述，该实施例表明，小鼠卵巢中存在端粒酶活性，其随着年龄的增长而降低，在18天龄时达到峰值，而在发情周期的每个阶段，TERT表达水平似乎并未明显改变。
与未处理(naive)的小鼠相反，用本发明的实施方式的化合物治疗的小鼠在所有年龄、特别是在被认为是雌性小鼠的峰值生育力年龄的3个月龄均表现出端粒酶活性的增加。端粒酶活性的增加除了高的卵巢重量和尺寸之外，还显示出颗粒细胞更多的增殖、以及窦房和排卵前卵泡的更多发育。我们观察到，在所有发情期，但并非在发情后期，实施方式的化合物在小鼠卵巢中均显著增加端粒酶的表达和活性，在发情期和发情前期，根据单次治疗12小时后所有阶段的典型阴道细胞和黄体卵泡总数增加，实施方式的化合物的增量促进了发情后期的出现。不论发情周期的阶段如何，实施方式的化合物也像黄体期一样对孕酮的分泌有影响。配对后，我们观察到这些化合物增加了胚胎的数量，支持了这些化合物加速了排卵过程，并发育出更多的具有成熟卵母细胞的排卵前卵泡。
因此，实施方式的化合物明显改善并促进了雌性的生育力，并且极大地有助于提高生育力治疗策略，并且在一些方面中，还考虑到下一实施例中提供的数据，特别适合于支持IVF治疗。
实施例4
接受IVF手术的雌性的颗粒细胞端粒酶活性的变化
背景、材料和方法：
尽管端粒酶(Telo)具有具备逆转录酶(RT)活性的催化亚基-TERT，其在经典作用中进行端粒DNA的一条链的从头合成，还已知非经典作用，例如包括细胞增殖、基因表达和调控、线粒体功能(如抗氧化应激和凋亡的保护)、信号传导通路、双链RNA的产生以使线粒体RNA沉默。端粒酶在长寿生物的体细胞中被抑制，但在人类生殖细胞中被检测到。该酶是存在于所有活生物体中的必不可少的核酶，在基因组稳定性中起着至关重要的作用。然而，关于发育中的颗粒细胞(GC)中的酶知之甚少。就在影响不育的病况中、例如在IVF疗法中对其进行调节而言，甚至知道更少。
为了评估酶在IVF治疗期间的作用/调节，在采集卵母细胞用于IVF流程后，从接受IVF的女性的卵泡液中收集GC。在显微镜下分离GC，并用盐水洗涤。使用TRAP测定确定源自患者GC的提取物(WC-全细胞和DB-DNA结合级分)中的端粒酶活性。使用特定的ELISA试剂盒检查TERT蛋白的水平，由此确定各种提取物中端粒酶的表达。
结果：
图18A和B涉及接受IVF的女性的相对端粒酶活性。通过光密度测定法分析通过TRAP测定获得的端粒酶DNA产物(对于WC提取物的0.5μg蛋白质为图18A，且对于DB提取物的0.1μg蛋白质为图18B)。端粒酶活性被计算为永久阳性对照(来自胶质母细胞瘤细胞的蛋白提取物)所得数据的％。结果是至少3次独立的TRAP测定的平均值±SD。
高和低的血液雌激素水平与平均酶活性之间存在相关性。在图19中评估端粒酶(telo)活性：(A)(WC：p＝0.01，DB：p＝0.42)高时n＝9，低时n＝12。计算高和低雌激素水平时端粒酶(在WC和DB提取物中)的平均酶活性。高雌激素水平被确定为<1500ng/ml。
IVF患者的评估提供了以下发现：不育诊断与端粒酶活性之间存在相关性(图20)，其中雌性不育n＝9，雄性不育n＝12(p＝0.159)。类似地，评估了接受IVF的女性中的相对端粒酶表达(图21)，通过ELISA试剂盒(EIAab)分析WC蛋白提取物。图21A：端粒酶表达被计算为总蛋白表达的百分比，与血液雌激素水平相关。图21B：个体女性的端粒酶表达。
综上，这些研究支持接受IVF的女性(在WC和BD级分中)的端粒酶活性存在差异。相对于血液中雌激素水平，酶活性呈负相关。根据女性的不育原因进行的初步分析表明，端粒酶活性发生了变化，在“雌性不育因素”组而非“雄性不育因素”组中观察到端粒酶活性较低。这些结果进一步支持了实施方式的化合物在治疗接受IVF的患者时，作为不育管理的一部分是特别有用的。
实施例5
包含的化合物增加的端粒酶可以保护小鼠睾丸免受X射线辐射的损害
背景、材料和方法：
端粒酶负责染色体末端端粒的重新延伸并提供基因组稳定性。大多数体细胞含有低水平或未检测到的端粒酶表达，但是在精子发生过程中，端粒酶是活性的，并且其催化亚基TERT被表达。改变精子生成过程的因素(例如X射线辐射)会显著影响雄性生育力。因此，关注本发明实施方式的化合物是否能够补偿或以其他方式保护睾丸免受辐射暴露的破坏作用。
为此，向ICR小鼠(3个月龄)注射6mg/kg的化合物79、化合物68或化合物70，或使小鼠经受X射线辐射(2.5Gy)，然后立即注射各化合物。对照小鼠未经治疗或进行溶媒治疗，经受或不经受X射线辐射暴露。治疗后12小时移除睾丸，进行蛋白质提取或总RNA制备，用于通过TRAP测定来检查端粒酶活性、通过Western印迹和实时PCR来检查端粒酶表达。还使用各种精子发生标记物对睾丸进行免疫组织化学和免疫荧光分析。还采集附睾用于精子计数。
结果：
所述化合物保护小鼠睾丸免受X射线诱导的形态学损害。照射后，H&E染色显示睾丸组织、特别是精原细胞层中的形态发生了重大破坏(图22)。但是，化合物68治疗保护了精原细胞层免受X射线的损害影响，并且睾丸组织的形态仍保持完整。
化合物68和化合物70对X射线照射的睾丸组织中的CREM表达具有有益作用。在X射线辐射之前和之后检查睾丸中的CREM表达表明，与未经治疗的小鼠相比，在X射线处理的睾丸中表达模式发生了显著变化(图23)。化合物68和化合物70治疗复原了精子发生标记物的表达(分别为图23A和图23B)。
化合物70治疗也保护了小鼠睾丸免受X射线辐射损害(图24)。γ-Η2ΑX(绿色)标记的IF分析显示，与UT样品相比，照射后12小时DSB的形成显著增加。另外，仅用化合物70治疗不会引起DNA损伤。在受照射的小鼠中，化合物70治疗证明了各种细胞类型(主要是精原细胞)中γ-Η2ΑX的表达水平降低，表明化合物70治疗可以保护睾丸组织免受X射线辐射诱导的DNA损伤。
在X射线辐射后的不同时间，实施方式的化合物对精子计数具有有益作用(图25)。在未经照射然后用指定化合物治疗的小鼠中，测量附睾中精子细胞的数量显示，与DMSO相比，用化合物68和化合物70治疗后12小时显著增加。来自经X射线处理且未经治疗的小鼠的精子计数表明精子计数显著减少，而用化合物68和化合物70治疗经X射线照射的小鼠在照射12小时后，附睾中的精子数量显著增加1.5-2.7倍(图25A和B)。用化合物70治疗经照射的小鼠在照射后9和30天精子计数增加(图25C和D)。
在X射线辐射后的不同时间，也证明了实施方式的化合物对精子形态的有益作用(图26)。图26A基于X射线暴露后的形态学分析定量地证明了当用化合物68或化合物70治疗细胞时缺陷精子细胞数量的减少。图26B提供了精子形态的显微照片作为参考框架。因此，实施方式的化合物不仅增加了精子计数，而且还提高了精子质量。
图27证明了实施方式的化合物70对老年小鼠(16个月)中的精子计数(图27A)和活力(图27B)的积极作用。老年小鼠中的精子产量相对较低，并且与年轻小鼠不同，其对DMSO治疗敏感。但是，用实施方式的化合物治疗不仅克服了DMSO诱导的精子计数降低，还相对于老年小鼠中的基态水平增加了精子产量，这表明这些化合物在老年受试者中增加雄性生育力的潜力。
综上所述，这些结果支持本发明的实施方式的化合物在X射线辐射的睾丸中显著复原组织形态、增加CREM表达并减少DSB形成的能力。进一步，在放射后的不同时间点用选择的化合物、如化合物68治疗增加了附睾中的精子计数，表明其有望作为复原受照射对象中的雄性生育力的疗法。最后，对老年小鼠的保护作用有望提高衰老或早衰群体中的生育力。
在雌性受试者中也观察到照射后对性腺组织的保护作用。图28描绘了经X射线照射的组织的H&E染色的卵巢切片，其中照射后的化合物70治疗清楚地拯救了暴露于辐射的卵巢组织。
实施方式的化合物还调节性激素产量(图29)。在源自小鼠垂体腺细胞中评价了促性腺激素LH和FSH的表达。如通过RT-PCR评价地，化合物79在治疗后6小时使LH的表达高于未治疗的水平，并在12小时降低FSH的水平，而化合物68和70在12小时使LH产量高于未治疗的水平，并且在6小时相对于未治疗的样品降低FSH的表达。
图29证明了垂体腺细胞系中化合物534对促性腺激素LH和FSH表达的影响。图30显示了用化合物534和对照动物治疗后12小时LH和FSH的表达结果，其中在对照和治疗小鼠中，端粒酶表达和促性腺激素表达之间存在相关性。发情前期(P)中的动物表现出最高的端粒酶表达(图30A)，并伴随着高水平的LH(图30C)和FSH(图30E)，并且经过发情期和发情后期的进展、类似地LH表达追随端粒酶表达的水平，并且还相对于FSH出现了趋势。在用化合物534治疗的动物中，在治疗后12小时，似乎有更多的动物经历了发情期(E)和发情后期(M)，即化合物似乎如上所述地加速了周期(对比图30B与30A，30D与30C，以及30F与30E)。
这些促性腺激素的表达的相对调节在雄性和雌性生育力中均起重要作用，其支持化合物活性的作用，以及在促性腺激素表达的调节中起重要作用。
尽管本文已经图示和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、改变和等同。因此，应当理解所附权利要求书旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和改变。

Claims (29)

1.一种在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原生育力的方法，其包括：使性腺或生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力在时机或数量或它们的组合方面，有益地调节促性腺激素表达或类固醇激素表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力在时机或数量或它们的组合方面，改善卵泡成熟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力改善精子数量、质量、活力或它们的组合。
5.由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其用于在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原生育力。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力在时机或数量或它们的组合方面，有益地调节促性腺激素表达或类固醇激素表达。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力在时机或数量或它们的组合方面，改善卵泡成熟。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，在受试者中促进、改善、恢复或复原生育力改善精子数量、质量、活力或它们的组合。
9.一种在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原性腺细胞或组织的功能的方法，其包括：使性腺或生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
10.由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其用于在需要的受试者中促进、改善、恢复或复原性腺细胞或组织的功能。
11.一种作为体外受精方案的一部分的促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织收率的方法，其包括：使所述生育力相关的细胞或组织与由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合接触：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基。
12.由式I的结构表示的化合物、或其异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物、晶体或其任意组合的用途：
其中
Z为碳、氮、磷、砷、硅或锗；
R1至R9相同或不同，是H、D、OH、卤素、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷基、烷基卤代烷基、卤代芳基、芳氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；或R3、R4或R7与主芳环形成稠合的环烷基、杂环烷基、芳族或杂芳族环；且
R10是无、H、D、OH、卤素、氧代、硝基、CN、氰胺基、酰胺基硫醚、氨基、醛、取代的酮、-COOH、酯、三氟甲基、酰胺、取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、芳基磺酰基、芳基亚烷基磺酰基、烷氧基、卤代烷基、卤代芳基、环烷基、烷基环烷基、芳氧基、单烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰胺基、芳基氨基、芳基酰胺基、烷硫基、芳硫基、杂环烷基、烷基杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基；
其作为体外受精方案的一部分，用于促进、增强或改善生育力相关的细胞或组织的收率。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式IV的结构表示：
其中R1、R3、R4、R6、R7、R9和R10如上所述。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式VI的结构表示：
其中R1'、R3'、R4'、R6'、R7'、和R9'相同或不同地包含卤素、芳基、烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、单烷基氨基、二烷基氨基或芳基氨基；且
R10如上所述。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式VII的结构表示：
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式VIII的结构表示：
17.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式IX的结构表示：
18.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式X的结构表示：
19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XI的结构表示：
20.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XII的结构表示：
21.根据权利要求1至14中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XIII的结构表示：
22.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XIV的结构表示：
23.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XV的结构表示：
24.根据权利要求1至12中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由式XVI的结构表示：
25.根据权利要求1至612中任一项所述的方法或用途，其中，所述化合物由下式表示：
或它们的组合。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法或用途，其中所述细胞或组织与包含所述化合物的药物组合物接触。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法或用途，其中，所述细胞或组织从受试者中分离或在其体内，所述受试者患有癌性或癌前病况、患有对类固醇生成产生负面影响的内分泌失调、患有不育症或易患不育症、或患有导致性腺细胞或组织早衰的遗传性病症或其他病症。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的方法或用途，其中，所述细胞或组织从受试者中分离或在其体内，所述受试者已经暴露于电离辐射。
29.根据权利要求1至26中任一项所述的方法或用途，其中，所述受试者正在接受AIF、GIF或IVF。
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