CN109394767A

CN109394767A - 化合物在制备药物中的用途

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Publication number: CN109394767A
Application number: CN201811436621.9A
Authority: CN
Inventors: 郗乔然; 张力伟; 孙晔; 孙宇
Original assignee: Tsinghua University; Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Tsinghua University; Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明涉及式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药在制备药物中的用途。该药物用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，

Description

化合物在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及化合物在制备药物中的用途。

背景技术

脑干胶质瘤是一类低度恶性胶质瘤，95％以上是星形细胞来源。在儿童脑肿瘤中占10％，以纤维型星形细胞瘤为主，多位于脑桥基底部。脑干胶质瘤有沿脑干内长传导束神经纤维弥散性生长的特性。这类肿瘤有去分化趋势，可以发展为间变性星形细胞瘤，甚至发展为多形性胶质母细胞瘤。脑干胶质瘤大致分为四类，其中弥漫内生性脑干胶质瘤大多位于桥脑，是最典型的脑干胶质瘤，占80％的比例，也是预后最差的类型。令人遗憾的是，目前还没有能够有效治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤的药物。

因此，能够有效治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤的药物急需开发。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

2015年，美国FDA批准辉瑞公司的Palbociclib(帕博西尼)胶囊上市，与来曲唑联合用于雌激素受体阳性(ER+)、人表皮生长因子受体2阴性(HER2-)的妇女晚期乳腺癌，是首个获批的细胞周期蛋白依赖激酶4和6(CDK4/6)抑制剂。Ibrance的成功上市对CDKs抑制剂的研发具有里程碑意义，科学界掀起了一股CDKs抑制剂的研究热潮，其中，研究人员希望CDKs抑制剂对弥漫内生性脑干胶质瘤的治疗或预防可以发挥作用。然而，CDK4/6类抑制剂对弥漫内生性脑干胶质瘤的治疗是否同样能够发挥作用？而且CDK4/6类抑制剂种类繁多，具体又是哪些或哪个CDK4/6类抑制剂对弥漫内生性脑干胶质瘤的治疗能起作用，效果又会如何？基于以上问题的发现，发明人进行了无数的实验探索，惊喜地发现，帕博西尼(Palbociclib)对于弥漫内生性脑干胶质瘤病人来源的临床细胞样本具有很好的抑制生长的作用，有望给脑干胶质瘤的少儿患者带来福音。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，

根据本发明的实施例，所述药物可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药。根据本发明的实施例，该药物组合物可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、混悬液、胶束，白蛋白纳米粒、脂质体、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体、膏剂、气雾剂、喷雾剂、酊剂或贴剂的形式。根据本发明的实施例，该药物组合物可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可以接受的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂，媒介物的至少之一。根据本发明的实施例，所述药物组合物可进一步有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：附加治疗剂，这些附加治疗剂包括化学治疗药物，抗增殖剂，免疫抑制剂，免疫刺激剂，抗炎性试剂以及其他用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的药物的至少之一。根据本发明的实施例，所述药物组合物可进一步有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述其他用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的药物包括选自替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷的至少之一。根据本发明的实施例，所述药物组合物可进一步有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药作为第一活性剂；不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物作为第二活性剂，所述不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物具有治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的功能。根据本发明的实施例，该药物联合可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种药盒。根据本发明的实施例，所述药盒用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：第一容器，所述第一容器中设置有式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药。根据本发明的实施例，该药盒可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

根据本发明的实施例，上述药盒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，进一步包括：第二容器，所述第二容器中设置有不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物，所述不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物具有治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的功能。根据本发明的实施例，该药盒可有效用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤。

附图说明

图1是根据本发明实施例的临床病人信息及预后、基因突变情况示意图；

图2是根据本发明实施例的比较病人来源的组织样本建立的脑干胶质瘤、流产胎儿脑桥部位正常细胞系、以及商品化成人幕上胶质瘤细胞系中CDK4/6转录组水平表达量示意图；

图3是根据本发明实施例的CDK4/CDK6基因沉默的脑干胶质瘤细胞系相比对照组的生长曲线和细胞周期检测示意图；

图4是根据本发明实施例的100nM Palbociclib处理前后脑干胶质瘤体外成球实验结果示意图；

图5是根据本发明实施例的经过100nM Palbociclib处理前后的2株脑干胶质瘤细胞TT150630和TT150728的IC₅₀曲线结果示意图；

图6是根据本发明实施例的经过100nM Palbociclib处理后的脑干胶质瘤细胞相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞的CDK4/6催化激活的蛋白磷酸化RB-Ser780的变化情况示意图；

图7是根据本发明实施例的经过100nM Palbociclib处理后的脑干胶质瘤细胞相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞的增殖相关的核抗原标记物Ki67变化情况示意图；

图8是根据本发明实施例的100nM Palbociclib处理后的脑干胶质瘤细胞相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞的细胞周期检测示意图；

图9是根据本发明实施例的经过100nM Palbociclib处理后的脑干胶质瘤细胞相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞的细胞衰老变化情况示意图；

图10是根据本发明实施例的经过100nM Palbociclib处理后的脑干胶质瘤细胞相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞的全转录组水平测序处理后的基因富集分析情况示意图，

其中，Cell cycle指细胞周期，Centriole replication指中心体复制，Nucleotide-excision repair指核苷酸切除修复，DNA gap filling指DNA缺口填充，Strand displacement指核酸链置换，Double-strand break repair指双链断裂修复，Regulation of transcription involved in G1/S transition指涉及细胞周期G1/S转变的转录调节，DNA strand elongation involved in DNA replication指DNA复制中的DNA链延伸，Mitotic sister chromatid segregation指有丝分裂姐妹染色单体分离，DNAsynthesis involved in DNA repair指DNA修复中的DNA合成，Telomere maintenance viarecombination指通过重组进行端粒维持，G1/S transition of mitotic cell cycle指有丝分裂细胞周期的G1/S转换，Sister chromatid cohesion指姐妹染色单体结合，Celldivision指细胞分裂，Normalization Z-score指Z-score标准化，Enrichment score指富集得分；

图11是根据本发明实施例的经过150mg/kg Palbociclib灌胃后的脑干胶质瘤细胞TT150630异种移植小鼠相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠活体成像实验结果示意图，其中，luminescence指荧光值，radiance指辐射，color scale指色标，before指之前，after指之后；

图12是根据本发明实施例的经过150mg/kg Palbociclib灌胃后的脑干胶质瘤细胞TT150630异种移植小鼠相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠生存期实验结果示意图；

图13是根据本发明实施例的TT150630异种移植小鼠模型的H&E染色检测结果示意图及磷酸化RB-Ser780免疫组化检测结果示意图，其中，vehicle对照组指溶剂对照组；

图14是根据本发明实施例的经过150mg/kg/day Palbociclib灌胃后的脑干胶质瘤细胞TT150728异种移植小鼠相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠活体成像及荧光采集实验结果示意图；

图15是根据本发明实施例的经过150mg/kg Palbociclib灌胃后的脑干胶质瘤细胞TT151201异种移植小鼠相比无药物处理的脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠活体成像及荧光采集实验结果示意图；

图16是根据本发明实施例的TT150728异种移植小鼠模型的H&E染色检测结果示意图及磷酸化RB-Ser780免疫组化检测结果示意图；

图17是根据本发明实施例的TT151201异种移植小鼠模型的H&E染色检测结果示意图及磷酸化RB-Ser780免疫组化检测结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例以及附图是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

现在详细描述本发明的某些实施方案，本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry",Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和"March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,JohnWiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

本发明所使用的术语“受试对象”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试对象，例如也指灵长类动物(例如人类，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。

本发明所使用的术语“患者”是指人(包括成人和儿童)或者其他动物。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺/反)异构体、阻转异构体，等等。

本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；andEliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。

术语“药学上可接受的”是指当给人施用时生理上可耐受的并且一般不产生过敏或相似不适当的反应，例如肠胃不适、眩晕等的分子实体和组合物。优选地，本文所用的术语“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可的药典上列举的在动物中、更特别在人体中使用的。

术语“载体”指与所述化合物一同施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或基质。这些药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水和水性溶液盐水溶液和水性葡萄糖与甘油溶液优选用作载体、特别是可注射溶液。适宜的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington′s PharmaceuticalSciences”中。

本发明的“水合物”是指本发明所提供的化合物或其盐，其还包括化学量或非化学当量通过非共价分子间力结合的水，也可说是溶剂分子是水所形成的缔合物。

本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。

本发明的“氮氧化物”是指当化合物含几个胺官能团时，可将1个或大于1个的氮原子氧化形成N-氧化物。N-氧化物的特殊实例是叔胺的N-氧化物或含氮杂环氮原子的N-氧化物。可用氧化剂例如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺形成N-氧化物(参见Advanced Organic Chemistry,Wiley Interscience,第4版,Jerry March,pages)。尤其是，N-氧化物可用L.W.Deady的方法制备(Syn.Comm.1977,7,509-514)，其中例如在惰性溶剂例如二氯甲烷中，使胺化合物与间氯过氧苯甲酸(MCPBA)反应。

本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式(I)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。例如一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：T.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs as Novel DeliverySystems,Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series,Edward B.Roche,ed.,BioreversibleCarriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and PergamonPress,1987,J.Rautio et al,Prodrugs:Design and Clinical Applications,NatureReview Drug Discovery,2008,7,255-270,and S.J.Hecker et al,Prodrugs ofPhosphates and Phosphonates,Journal of Medicinal Chemistry,2008,51，2328-2345。

除非其他方面表明，本发明的化合物的所有互变异构形式都包含在本发明的范围之内。

另外，除非其他方面表明，本发明所描述的化合物的结构式包括一个或多个不同的原子的富集同位素。本发明包括同位素标记的化合物，它们等同于式(I)所述的化合物，但其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子所代替。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如²H、³H、¹³C、¹¹C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐都属于本发明的范围。同位素标记的本发明式(I)所示化合物及其前体药物一般可以这样制备，在进行下述流程和/或实施例与制备例所公开的工艺时，用容易得到的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。

“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。

本发明化合物的各种药学上可接受的盐形式都是有用的。术语“药学上可接受的盐”是指那些盐形式对于制药化学家而言是显而易见的，即它们基本上无毒并能提供所需的药代动力学性质、适口性、吸收、分布、代谢或排泄。其他因素，在性质上更加实用，对于选择也很重要，这些是：原材料的成本、结晶的容易、产率、稳定性、吸湿性和结果原料药的流动性。简单地讲，药物组合物可以通过有效成分与药学上可接受的载体制备得到。

本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为发明人所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，硝酸盐等，和有机酸盐如乙酸盐，丙酸盐，乙醇酸盐，草酸盐，马来酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，富马酸盐，酒石酸盐，枸橼酸盐，苯甲酸盐，扁桃酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，甲苯磺酸盐，磺基水杨酸盐等，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。

其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、苹果酸盐、2-羟基丙酸、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊基丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐、等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N⁺(C_1-4烷基)₄的盐。

本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C_1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。胺盐，例如但不限于N,N’-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，氨，二乙醇胺和其它羟烷基胺，乙二胺，N-甲基还原葡糖胺，普鲁卡因，N-苄基苯乙胺，1-对-氯苄基-2-吡咯烷-1’-基甲基-苯并咪唑，二乙胺和其它烷基胺，哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱土金属盐，例如但不限于钡，钙和镁；过渡金属盐，例如但不限于锌。

本发明提供药物组合物，包含治疗有效量的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。当本发明的化合物以药物的形式施用于哺乳动物例如人时，其可以以化合物本身的形式被给予或者可以以含有例如0.1至99.5％(更优选0.5至90％)活性成分以及药学可接受的载体的药物组合物的形式被给予。

“有效量”是治疗或预防与脑干胶质瘤有关的病症例如预防与脑干胶质瘤有关的病症的各种形态和躯体症状和/或本文所述的疾病或情况所需的或者足够的量。在一个实例中，本发明的化合物的有效量是足以治疗个体的与脑干胶质瘤有关的病症的量。有效量可以根据诸如个体的大小和体重、疾患的类型或本发明的具体化合物等因素而变化。本领域普通技术人员将能研究本文所包含的因素和在不进行过度实验的情况下确定本发明的化合物的有效量。

施用方案可影响有效量的构成。本发明的化合物可在与脑干胶质瘤有关的病症发作之前或之后被施用于个体。此外，可以每天或相继施用多个分剂量以及错开的剂量，或者可以连续输注给药，或者可以推注给药。此外，本发明的化合物的剂量可以根据治疗或预防的情形的紧迫性按比例酌情增加或减少。

本发明的化合物可用于治疗本文所述的状态、病症或疾病，或用于制备治疗这些疾病的药物组合物。本发明的化合物在这些疾病治疗中的使用方法或用于治疗这些疾病的含有本发明的化合物的药物制剂。

“药物组合物”包括适于施用于哺乳动物例如人的制剂。当本发明的化合物以药物的形式施用于哺乳动物例如人时，其可以以化合物本身的形式被给予或者可以以含有例如0.1至99.5％(更优选0.5至90％)活性成分以及药学可接受的载体的药物组合物的形式被给予。

“药学可接受的载体”在本领域中是公认的，包括适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。所述载体包括参与携带主题物质或将其从一个器官或机体的一部分转移到另一个器官或机体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。各载体在与制剂中的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中所用的其它无毒的可相容的物质。

在组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

药学可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的制剂包括适于口服、鼻、局部、口含、舌下、直肠、阴道和/或胃肠外施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与载体物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的化合物的量。一般而言，以百分之一为单位，该量为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10至约30％。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的化合物与载体、任选地和一种或多种辅助成分结合的步骤。一般而言，制剂是通过将本发明的化合物与液体载体或很细的固体载体或这二者均匀且紧密地结合在一起、然后如果需要的话，将该产物成型来制备的。

适于口服施用的本发明的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味的基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂、或者在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或者水包油或油包水型液体乳剂、或者酏剂或糖浆剂、或者软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等的形式，其各自含有既定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物还可以以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式施用。

在用于口服施用的本发明的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学可接受的载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任何下列物质混合：填充剂或增量剂，如淀粉类、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐类、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸和碳酸钠；溶液阻滞剂(solution retarding agent)，如石蜡；吸收促进剂，如季铵化合物；润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；吸附剂，如高岭土和皂土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，以及其混合物；和着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可在使用赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中用作填充物。

片剂可以通过压制或模制来制备，可任选地使用一种或多种辅助成分。压制片可以用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片可以通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物在合适的机器中进行模制来制备。

片剂和本发明的药物组合物的其它固体剂型如糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可任选地被刻痕或用包衣和壳如肠溶衣和制药领域公知的其它包衣来制备。也可以将它们用例如提供所需释放性质的各种比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球进行配制以便提供其中的活性成分的缓慢释放或控制释放。可将它们例如通过用截留细菌的滤器过滤或通过在使用前即刻掺入可溶解于无菌水或一些其它可注射无菌溶媒中的无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌。这些组合物还可任选地含有遮光剂并且可以是仅在或优先在胃肠道的某个部分中释放活性成分、任选以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物物质和蜡类。活性成分也可以是微囊化的形式，如果适宜的话，使用一种或多种上述赋形剂。

用于口服施用的本发明的化合物的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳、溶液、混悬液、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯以及其混合物。

除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包含辅剂(adjuvant)如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性化合物以外，混悬剂还可包含助混剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、皂土、琼脂和西黄蓍胶以及其混合物。

用于直肠或阴道施用的本发明的药物组合物的制剂可以以栓剂的形式存在，其可以通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的无刺激的赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，并且其在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此将在直肠或阴道腔中熔化并释放出活性化合物。

适于阴道施用的本发明的制剂还包括含有本领域中已知适宜的载体的阴道栓、卫生栓、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。

本发明的化合物的用于局部或透皮施用的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以将活性成分在无菌条件下与药学可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。

除本发明的活性化合物以外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可包含赋形剂，如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡类、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇类、硅氧烷类、皂土类、硅酸、滑石粉和氧化锌、或其混合物。

除本发明的化合物以外，散剂和喷雾剂还可包含赋形剂如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可包含常规抛射剂如氯氟烃类和挥发性的未被取代的烃类，如丁烷和丙烷。

透皮贴剂具有为机体提供本发明的化合物的控制传递的另外的优点。该类剂型可以通过将化合物溶解或分散于合适的溶媒中来制备。还可以使用吸收促进剂来增加通过皮肤的化合物通量。可以通过提供控速膜或将活性化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制该类流动的速度。

在本发明的范围内还包括眼用制剂、眼用软膏剂、散剂、溶液剂等。

适于胃肠外施用的本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的化合物以及一种或多种药学可接受的无菌的等张的水性或非水性溶液、分散物、混悬剂或乳剂、或者可在使用前即刻被重组到无菌的可注射溶液或分散物中的无菌粉末，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与接受者的血液等张的溶质或助悬剂或增稠剂。

可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及其合适的混合物、植物油类如橄榄油和可注射的有机酯类如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散物的情况下通过维持所需的粒度、和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。

这些组合物还可包含辅剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如尼泊金酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保预防微生物的作用。还可能需要在组合物中包含等张剂如糖类、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来造成可注射药物形式的延长吸收。

在一些情况中，为了延长药物的作用，需要减慢自皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶性或无定形物质的液体混悬液来实现。这样，药物的吸收速率将取决于其溶出速率，溶出速率又可能取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或混悬于油性基质中来实现胃肠外施用的药物形式的延长吸收。

可注射的储库形式是通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微囊基质来制备的。根据药物与聚合物的比例以及所用的具体化合物的性质，可以控制药物释放速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的储库制剂也可以通过将药物包在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

本发明的制剂可以被口服、胃肠外、局部或直肠施用。它们当然是以适合于各施用途径的形式被给予。例如，它们以片剂或胶囊剂的形式被施用，通过注射剂、吸入剂、眼用洗剂、软膏剂、栓剂等被施用，通过注射、输注或吸入被施用；通过洗剂或软膏剂被局部施用；通过栓剂被直肠施用。优选的是口服和/或静脉内施用。

本文所用的措辞“胃肠外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射施用，非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的措辞“全身施用”和“外周施用”意指化合物、药物或其它材料的除直接施用于中枢神经系统以外的施用，从而使得其进入患者的系统中并因此进行代谢和其它相似过程，例如皮下施用。

这些化合物可通过任何合适的施用途径被施用于人和其它动物来进行治疗，包括口服、鼻(例如以喷雾剂形式)、直肠、阴道内、胃肠外、脑池内和局部(以散剂、软膏剂或滴剂形式)施用，所述局部施用包括口含和舌下施用。

不管所选择的施用途径如何，用本领域技术人员已知的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受的剂型。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得对特定患者、组合物和施用方式而言可有效实现所需治疗响应、对患者无毒的活性成分的量。

所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用的具体的本发明的化合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的具体化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、情况、一般健康状况和既往医学史以及医学领域中公知的类似因素。

具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定和开具出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于获得所需治疗作用所需要的剂量的水平开始药物组合物中所用的本发明的化合物的剂量并逐渐增加其剂量直至实现所需的作用。

一般而言，本发明的化合物的合适的日剂量将是有效产生治疗作用的最低剂量的化合物量。该类有效剂量一般将取决于上述因素。一般而言，当用于所示的镇痛作用时，本发明的化合物用于患者的静脉内和皮下剂量为约0.0001至约100mg/kg体重/天，更优选约0.01至约50mg/kg/天，还更优选为约1.0至约100mg/kg/天。有效量是治疗与脑干胶质瘤有关的病症的量。

如果需要的话，活性化合物的有效日剂量可以在一天中以分开施用的二、三、四、五、六或更多个亚剂量以适宜的时间间隔施用，任选地，所述亚剂量是单位剂型。

对于约50-70kg的个体，本发明的药物组合物或组合可以为约1-1000mg活性成分的单位剂量，或者约1-500mg或者约1-250mg或者约1-150mg或者约0.5-100mg或者约1-50mg的活性成分。化合物、其药物组合物或组合的治疗有效剂量取决于个体的种类、体重、年龄和个体条件、治疗的障碍或疾病或其严重程度。具有普通技术的医师、临床医师或兽医能够容易地确定预防、治疗或抑制障碍或疾病的进程所需的每种活性成分的有效量。

上述剂量性质在体外和体内试验中应用有利的哺乳动物，例如小鼠、大鼠、狗、猴或其相关器官、组织或制备物可进行说明。本发明化合物可以在体外以溶液剂例如水溶液剂的形式应用，并且可以在体内以肠内、非肠道、有利地以静脉内例如作为混悬剂或水溶液剂应用。体外剂量范围可以是约10^-3摩尔至10^-9摩尔浓度之间。体内治疗有效量范围可以取决于施用途径，为约0.1-500mg/kg或约1-100mg/kg之间。

本文所用的术语“个体”意指动物。通常，动物是哺乳动物。个体还意指例如灵长类(例如人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。

虽然本发明的化合物可以单独施用，但是优选以药物组合物的形式施用所述化合物。

使用本发明所提供的一种或多种化合物或组合物，或其药学上可接受的衍生物与其它的药物活化剂联合来组合治疗，用于治疗本文所述的疾病和病症。

将配制用于口服、全身性传递包括肠道外或静脉内传递或用于局部或表面施用的有效量的化合物或包含治疗有效浓度的化合物的组合物给予表现出疾病或病症症状而需要治疗的个体。所述量有效地治疗、控制或缓解了该疾病或病症的一种或多种症状。

本领域普通技术人员能够理解本发明所提供的化合物、异构体、前体药物和药学上可接受的衍生物，包括药物组合物和包含这些化合物的制剂，可广泛应用于联合治疗以治疗本发明所述的不适和疾病。因此，本发明预期将本发明所提供的化合物、异构体、前体药物和药学上可接受的衍生物与其它活性药物联合使用，以用于治疗本发明所述的疾病/不适。

本发明所提供的化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物可以在一种或多种其他活性药物给药的同时、之前或之后给药。其它活性药物特别是有用于治疗脑干胶质瘤的治疗剂。

在一些实施方案中，一种或多种其它活性药物选自抗癌剂(如细胞信号传导抑制剂，有丝分裂抑制剂，烷化剂，抗代谢药，嵌合(intercalating)抗癌剂，拓扑异构酶抑制剂，免疫治疗剂，或抗激素剂)，类固醇药物，甲氨蝶呤，来氟米特，抗TNF-α剂，钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂，抗组胺药物，化学治疗药物，抗增殖剂，免疫抑制剂，免疫刺激剂，抗炎性试剂或它们的组合。

在一些实施方案中，抗癌剂选自烷化剂(如环磷酰胺、一环磷酰胺、美法仑、白消安、尼莫司丁、雷莫司汀、达卡巴嗪、替莫唑胺、盐酸氮芥、二溴甘露醇等)、铂络合剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂等)、代谢拮抗剂(如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、替加氟、吉西他滨、卡倍他滨、氟维司群、培美曲塞等)、植物生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、依托泊苷、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、长春瑞滨、米托蒽醌、长春氟宁、拓扑替康等)、抗体药物(例如曲妥单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗等)、激素抗癌剂(例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、度他雄胺、地塞米松、他莫西芬等)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、来那度胺等)、芳香化没抑制剂(例如依西美坦、来曲唑、阿那曲唑等)、VEGFR抑制剂(例如舒尼替尼、索拉菲尼、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、凡德他尼、帕唑替尼、拉帕替尼等)、mTOR抑制剂(例如依维莫司、西罗莫司、佐他莫司等)。

在一些实施方案中，一种或多种其他活性药物是：替莫唑胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、替尼泊苷(VM-26)它们的组合。

在一些实施方案中，还提供了药物组合物，其包含本发明所提供的化合物或其药学上可接受的衍生物，和一种或多种其它活性药物，可作为单个剂量形式或者与化合物和组合物分开作为多剂量形式的一部分。其它活性药物可以与本发明公开的化合物同时给予或者不同时给予。在后一种情况下，给药可以错开，例如：6小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周、3周、1个月或2个月。

在一些实施方案中，还提供联合疗法，其治疗或预防症状、或与癌症和相关疾病和病症相关的并发症的发生，该疗法包括向有此种需要的个体给予一种本发明所公开的化合物或组合物、或其药学上可接受的衍生物，和一或多种其它活性药物。

在一些实施方案中，药物联合给药时，有两种方式：1)将本发明所述的化合物或药物组合物与可联用的其他活性药物分别制成单独的制剂，两种剂型可以相同或不同，使用时可以先后使用，也可以同时使用；先后使用时，给予第二种药物是第一种药物还未丧失其在体内的有效作用；2)将本发明化合物或药物组合物和可联用的其他活性药物制成单一制剂，同时给药。

下面将进一步结合实施例对本发明的方案进行解释。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

一、实验材料

病人来源的弥漫内生性脑干胶质瘤细胞系，苏木精伊红染料，碘化丙啶细胞周期检测试剂盒，Ki67流式分析染料，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，B-NDG免疫缺陷小鼠，免疫组化试剂盒，CCNA，CCNE，CDK4、CDK6检测引物，药物Palbociclib，乳酸，立体定位仪，p-RB-Ser780抗体，基底膜基质(356243，BD，1％，4-12h at 37℃)，DMEM(C11995500BT，Invitrogen)，B27(1：50)，N2(1：100)，胰岛素(20μg/mL)，bFGF(20ng/mL)，EGF(20ng/mL)，PDGF-AB(20ng/mL)(PeproTech)。

二、实验过程

1、建立病人来源的弥漫内生性脑干胶质瘤细胞系。

将手术所得的脑干胶质瘤样本消化成原代细胞系培养。首先用缓冲液冲洗，去除血块及坏死组织。将样本剪碎，用缓冲液冲洗数次，37℃酶解30-60分钟，离心后去上清。加入红细胞裂解液去除红细胞，离心后去上清。加入特定培养基得到细胞悬液，铺入细胞皿中培养。实时观察细胞生长情况(一般形态、传代时间、生长曲线、分裂指数及倍增时间)并记录传代时间。检测细胞系的基因突变类型是否与原始肿瘤样本中突变类型一致。分析脑干胶质瘤细胞系的生物学特性与原始肿瘤临床特征，如肿瘤恶性程度，迁移范围等的相关性。

2、鉴定palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞中引起的生物学效应。

(1)成球实验检测细胞自我更新能力；

脑干胶质瘤细胞的成球实验是衡量细胞自我复制更新能力的金标准。发明人设置对照组与实验组(100nM palbociclib处理)，每组3个重复。在96孔细胞培养板中每孔种入起始2000个细胞，隔天在实验组中加入100nM palbociclib处理，两周后观察细胞成球状况。

(2)palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞中IC₅₀测定。

IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度，是指一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞死亡50％，该浓度称为50％抑制浓度。在96孔细胞培养板中每孔种入起始2000个细胞，在实验组中分别加入等体积的palbociclib处理，浓度分别为6.25nM、25nM、100nM、400nM、1600nM、6400nM以及25600nM，在对照组中加入相同体积的0.01％DMSO。分别在加药前(T0)和加药后72小时(T72)用CellTiter-Glo(G7572，Promega)检测细胞生存力，生存能力_{不同浓度药物}＝T72_加药组-T0_加药组/T72_DMSO-T0_DMSO，IC₅₀为该生存能力-药物浓度曲线中半数抑制所对应的药物浓度。

(3)碘化丙啶(PI)染色流式细胞分析技术检测细胞周期变化；

碘化丙啶(PI)染色是通过定量测定细胞中DNA含量来分析细胞周期的有效方法。发明人选取对照组和实验组(100nM palbociclib处理48h)细胞，运用碘化丙啶(PI)染色后流式细胞分析得到实验结果。

(4)Ki67染色流式分析技术检测细胞增殖能力；

Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少。Ki67作为标记细胞增殖状态的抗原，阳性率越高说明癌细胞增殖越活跃。发明人选取对照组和实验组(100nM palbociclib处理48h)细胞，70％乙醇固定，细胞穿核后孵育Ki67一抗，后孵育带有荧光标记的二抗，流式细胞分析得到前期结果。

(5)细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒观察细胞衰老情况；

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时SA-β-Gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。发明人选取对照组和实验组(100nMpalbociclib处理5天)样品采用β-半乳糖苷酶染色，得到结果。

(6)实时荧光定量核酸扩增检测系统检测CDK4/6及下游激活基因的转录本水平；

palbociclib作为一种CDK4/6的抑制剂，在乳腺癌的治疗上有良好的效果，能够明显降低CDK4/6下游激活基因的转录本水平。本发明检测了palbociclib处理48小时后，弥漫内生性脑干胶质瘤中CCNA/CCNE的转录水平。

(7)蛋白质免疫印迹法检测CDK4/6作为激酶的催化活性；

palbociclib作为一种CDK4/6的抑制剂，发明人通过蛋白印记法检测palbociclib处理48小时后，弥漫内生性脑干胶质瘤中磷酸化RB-Ser780蛋白水平。

(8)建立免疫缺陷小鼠的原位脑干成瘤模型，验证palbociclib药物作用；

将脑干胶质瘤细胞注射到小鼠脑干区域，2周后通过活体成像手段呈现脑干胶质瘤细胞在小鼠原位成瘤情况。待脑瘤生成后，实验组小鼠持续给药3周，对照组小鼠持续给乳酸3周(palbociclib溶于乳酸灌胃给药)。每周利用活体成像技术检测相比对照组小鼠，实验组给药小鼠的成瘤情况是否有明显缓解，同时观察两组小鼠的体重及身体状况，检测药物对小鼠有无毒副作用。

(9)小鼠模型的生化指标检测

持续给药3周后取对照组与药物处理组小鼠脑干，分别制作石蜡切片并HE染色后检测其病理类型。免疫组织化学技术检测磷酸化RB-Ser780在对照组与药物处理组的表达差异。

三、实验结果

发明人发现，Palbociclib对于弥漫内生性脑干胶质瘤病人来源的临床细胞样本具有很好的抑制生长的作用(各附图中*代表p《0.05；**代表P《0.01；***代表P《0.001；****代表P《0.0001)。

1、建立病人来源的弥漫内生性脑干胶质瘤细胞系。

发明人用8株临床病人来源的原代细胞系，具体病人信息及预后、基因突变情况参考图1。

2、建立CDK4/CDK6基因沉默细胞系，阐述CDK4/CDK6对弥漫内生性脑干胶质瘤细胞的生物学效应。

(1)比较病人来源的组织样本建立的脑干胶质瘤细胞系、流产胎儿脑桥部位正常细胞系、以及商品化成人幕上胶质瘤细胞系中CDK4/6表达量，发明人发现，在弥漫内生性胶质瘤组织及细胞系中，CDK4/6表达量普遍高于正常细胞系及商品化成人幕上胶质瘤细胞系。参考图2，其中R开头的9个样品为病人脑干胶质瘤组织，T开头的10个样品为病人来源的脑干胶质瘤细胞系，U87是商品化的成人脑瘤细胞系，PPC是10周龄流产胎儿脑干区正常细胞系。

(2)CDK4/CDK6基因沉默的脑干胶质瘤细胞系相比对照组，生长迟缓，CDK4/CDK6基因沉默对临床细胞样本具有很好的抑制生长的作用。参考图3中的a，CDK4 sh1，CDK4 sh2是CDK4较低的两株细胞系，CDK6 sh1，CDK6 sh2是CDK6较低的两株细胞系，与对照Ctr相比这四株细胞系生长迟缓。参考图3中的b，其中G1,S,G2分别代表细胞处在G1期，S期，G2期，CDK4/CDK6基因沉默能够明显延长细胞的G1期，缩短细胞的S期，这就表明了CDK4/CDK6基因沉默是通过调控脑干胶质瘤细胞的细胞周期，使细胞进入S期DNA复制受阻来实现抑制细胞生长的作用。

3、鉴定palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞中引起的生物学效应。

(1)成球实验检测细胞自我更新能力；前期结果表明100nM palbociclib能够明显抑制细胞成球，说明palbociclib能够明显抑制这些临床病人来源的脑干胶质瘤细胞的自我复制更新能力，参考图4，其中TT150630，TT150714，TT160518，TT160511，TT150728，TT151201，TT160310，TT160818代表8株病人来源的脑干胶质瘤细胞系，与对照Ctr相比，加入100nM palbociclib能够明显抑制细胞成球。

(2)palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞中IC₅₀；参考图5，检测palbociclib在2株弥漫内生性脑干胶质瘤细胞系TT150630/TT150728中IC₅₀分别为75.36nM和448.8nM。通过对活性检测数据IC₅₀进行分析，发明人发现，palbociclib对弥漫内生性脑干胶质瘤细胞的抑制效果显著。

(3)蛋白质免疫印迹法检测CDK4/6作为激酶的催化活性；CDK4/6作为激酶催化下游的RB蛋白磷酸化水平下降，说明100nM Palbociclib很好地抑制了细胞中CDK4/6的活性，CDK4/6催化激活的磷酸化RB-Ser780蛋白减少。参考图6，TT150630，TT150714，TT160518，TT160511，TT150728，TT151201，TT160310，TT160818代表8株病人来源的脑干胶质瘤细胞系，与对照相比，加入100nM palbociclib能够明显降低RB-Ser780蛋白水平。

(4)Ki67染色流式分析技术检测细胞增殖能力；参考图7，palbociclib处理48h能够明显抑制Ki67阳性率，说明palbociclib能够降低脑干胶质瘤细胞的增殖能力，增殖相关的核抗原标记物Ki67明显下降，其中，TT150630，TT150714，TT160518，TT160511，TT150728，TT151201，TT160310，TT160818代表8株病人来源的脑干胶质瘤细胞系，PPC是10周龄流产胎儿脑干区正常细胞系。

(5)碘化丙啶(PI)染色流式细胞分析技术检测细胞周期变化；palbociclib处理48h能够明显延长细胞的G1期，缩短细胞的S期，这就表明了palbociclib是通过调控脑干胶质瘤细胞的细胞周期，使细胞进入S期DNA复制受阻来实现抑制细胞生长的作用，其中，8株脑干胶质瘤细胞系TT150630，TT150714，TT160518，TT160511，TT150728，TT151201，TT160310，TT160818以及2株对照细胞系PPC和U87加药前后细胞周期检测结果参考图8。

(6)细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒观察细胞衰老情况；参考图9，与对照Vehicle相比，实验组加入palbociclib处理48小时细胞样品(TT150630，TT150728为不同的两株病人来源的脑干胶质瘤细胞)中SA-β-Gal活性水平上调，这就表明了palbociclib通过增加细胞的衰老实现对脑干胶质瘤细胞抑制生长的作用。

(7)Palbociclib处理前后脑干胶质瘤全转录组测序(RNA-seq)比较；参考图10中的a，100nM Palbociclib处理48h后全转录组测序(RNA-seq)相比处理前发现306个基因显著下调，65个基因显著上调。说明100nM Palbociclib处理细胞主要是抑制基因的表达，参考图10中的b，基因富集分析(GSEA)显示细胞周期相关激酶CDK4/CDK6下游E2F的靶基因显著下调，参考图10中的c，MYC相关基因显著下调，有丝分裂、G2M相关基因下调，说明Palbociclib是通过限制细胞周期很好地抑制了细胞生长。

4、鉴定palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠模型中引起的生物学效应。发明人发现，palbociclib可以使免疫缺陷的小鼠的弥漫内生性脑干胶质瘤明显减小或消失，治疗效果显著。

(1)建立免疫缺陷小鼠的原位脑干异种移植成瘤模型，验证palbociclib药物作用；脑干胶质瘤细胞TT150630原位异种移植2周检测有肿瘤信号后，对照组小鼠灌胃3周乳酸，实验组小鼠灌胃3周Palbociclib，参考图11中的a，小鼠活体成像结果显示，小鼠灌胃3周Palbociclib实验组小鼠的原位脑瘤明显减小或消失，并且对小鼠无重大毒理作用及副作用，参考图11中的b，统计小鼠活体成像结果，Palbociclib实验组小鼠脑部肿瘤荧光值相比对照组明显下降。参考图12生长曲线，Palbociclib实验组小鼠喂药处理后相比对照组生存期明显延长。

(2)小鼠模型的生化指标检测；参考图13中的a，H&E染色，相比对照组，实验组脑桥切片苏木精着色变浅，核型正常；参考图13中的b，磷酸化RB-Ser780免疫组化，相比对照组，实验组脑桥切片CDK4/6激活的下游磷酸化RB-Ser780下降，说明实验组小鼠脑桥组织细胞中CDK4/6催化活性下降，且palbociclib药物能有效通过血脑屏障。

(3)多株细胞验证palbociclib在弥漫内生性脑干胶质瘤细胞异种移植小鼠模型中引起的生物学效应；脑干胶质瘤细胞TT150728/TT151201原位异种移植小鼠模型建立后，与上述(1)中的脑干胶质瘤细胞TT150630原位异种移植小鼠模型进行相同的给药处理，参考图14中的a(注入脑干胶质瘤细胞TT150728的异种移植小鼠模型)，参考图15中的a(注入脑干胶质瘤细胞TT151201的异种移植小鼠模型)小鼠活体成像结果显示，palbociclib实验组小鼠的原位脑瘤明显减小或消失，并且对小鼠无重大毒理作用及副作用。参考图14中的b(注入脑干胶质瘤细胞TT150728的异种移植小鼠模型)；参考图15中的b(注入脑干胶质瘤细胞TT151201的异种移植小鼠模型)统计小鼠活体成像结果，Palbociclib实验组小鼠脑部肿瘤荧光值相比对照组明显下降。另外参考图16中的a(注入脑干胶质瘤细胞TT150728的异种移植小鼠模型)，图17中的a(注入脑干胶质瘤细胞TT151201的异种移植小鼠模型)，苏木精&伊红染色(H&E染色)，相比对照组，实验组脑桥切片苏木精着色变浅，核型正常。参考图16中的b，图17中的b，磷酸化RB-Ser780免疫组化，相比对照组，Palbociclib实验组脑桥切片CDK4/6激活的下游磷酸化RB-Ser780下降，说明实验组小鼠脑桥组织细胞中CDK4/6催化活性下降，且palbociclib药物能有效通过血脑屏障。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、混悬液、胶束，白蛋白纳米粒、脂质体、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体、膏剂、气雾剂、喷雾剂、酊剂或贴剂的形式。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学上可以接受的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂，媒介物的至少之一。

5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括附加治疗剂，这些附加治疗剂包括化学治疗药物，抗增殖剂，免疫抑制剂，免疫刺激剂，抗炎性试剂以及其他用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的药物的至少之一。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述其他用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的药物包括选自替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、替尼泊苷的至少之一。

7.一种药物联合，其特征在于，所述药物联合用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：

式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药作为第一活性剂；

不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物作为第二活性剂，所述不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物具有治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的功能。

8.一种药盒，其特征在于，所述药盒用于治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤，包括：

第一容器，所述第一容器中设置有式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药。

9.根据权利要求8所述的药盒，其特征在于，进一步包括：

第二容器，所述第二容器中设置有不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物，所述不同于式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化物，水合物，溶剂化物，代谢产物，药学上可接受的盐或前药的药物具有治疗或预防弥漫内生性脑干胶质瘤或脑干胶质瘤的功能。