CN113975254A - Dmso在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用 - Google Patents
Dmso在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供DMSO在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用。本发明通过构建小鼠放射性睾丸损伤模型，发现DMSO可显著增加5Gy辐照后小鼠精子数量，降低精子畸形率、促进辐照后雄性小鼠生殖能力的恢复。从机制上，DMSO降低辐照后生精细胞内氧化应激水平，抑制生精细胞的凋亡，促进生精细胞增殖，进一步地，DMSO还可以通过减轻细胞DNA损伤来减轻精原干细胞和精原细胞的放射损伤，促进辐照后精子生成的快速恢复。DMSO有望成为一种非常有前景的辐射防护剂，应用于放射诱导的雄性生殖系统损伤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及DMSO在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用。
背景技术
近年来，核及其相关技术在医学、能源、军事等领域应用日益广泛，与此同时放射损伤的风险也日益增加。睾丸是生成精子的器官，对电离辐射高度敏感。男性接受肿瘤放疗、骨髓移植前全身照射，暴露于核泄漏事故、遭受核恐怖袭击均可造成放射性睾丸损伤(radiation-induced testicular injury,RITI)，引发精子数量和质量下降，继发暂时性乃至永久性的不育。此外，育龄男性的睾丸防护也一直是放射相关工作人员防护的重点。精子的发生主要是在睾丸的曲细精管中进行，从精原干细胞、精原细胞、精母细胞、精细胞，历经增殖、分化及减数分裂等精密的时间和空间调控，生成成熟的精子。精原干细胞对电离辐射最为敏感，精原细胞次之。高能射线电离细胞内水分子形成的自由基可破坏生精细胞内的DNA、蛋白质、膜脂质等生物大分子的结构，改变细胞代谢和功能，诱导细胞损伤、凋亡、坏死，迟滞或阻断精子发生过程，造成少精或无精症。据报道，0.15Gy辐照即可造成生精细胞明显损伤，0.35Gy辐照可诱发少精症，受到2Gy以上剂量辐照后可引起10-24月的暂时性绝育，且恢复时间随照射剂量增大而增大，大于6Gy辐照可造成终身绝育。
辐照前使用辐射防护剂可有效提高肿瘤患者放疗的效果，提升生活质量，降低放射相关工作人员及核事故现场应急人员的放射损伤风险。遗憾的是，目前不管是国外还是国内，都没有防护RITI的药物批准上市。清除射线生成的自由基是预防RITI的有效措施之一，文献已报道的RITI防护剂也多为自由基清除剂或抗氧化剂，比如氨磷汀，富氢生理盐水、绿茶多酚、Genistein等，其中含硫化合物氨磷汀是目前研究最为深入的氧自由基清除剂，几乎可以防护所有正常组织的放射损伤，但同时氨磷汀的毒性大，被批准的使用范围局限，不能应用于RITI。此外免疫调节剂如Cblb502、细胞因子如GCSF、中药等均被报道有一定的防护作用。即便如此，这些化合物也存在效应低、毒性大、价格高、不易保存等诸多不足。因此，寻找开发高效低毒、价格低廉易保存的新型RITI防护剂非常重要。与氨磷汀类似，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)也是一种含硫的自由基清除剂。DMSO在常温下为无色透明液体，在189℃沸点以下性质稳定，其化学结构简单，合成方便，价格便宜，已产业化生产，全球每年产量超过十万吨，被广泛应用于医药、石油、化工、冶金、电子、涂料和高分子材料等领域。除清除自由基外，文献报道DMSO有多种生物活性，包括止痛、镇静、利尿、抑菌等。1978年FDA批准DMSO用于治疗间质性膀胱炎。DMSO的毒性已做广泛研究，未发现其对健康实验动物和人体有严重毒副作用。DMSO静脉给药(10～20％DMSO溶液)曾用于控制脑损伤和脊髓损伤病人颅内积水和颅内高压的治疗以及晚期癌症患者难治性疼痛的治疗，病人依从性好，未报道有严重的副作用。发明人在前期实验中也发现，Blb/c小鼠按10g/kg剂量连续口服DMSO两个月未发现明显毒性。目前，DMSO在RITI防护中的应用未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供DMSO在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供DMSO在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用。
优选地，DMSO的给药方式为腹腔注射。也可以采用灌胃给药的方式，但效果不如腹腔给药。
以小鼠为实验对象，DMSO的给药剂量约为6g/kg，腹腔照射前1h给药。
所述损伤包括但不限于睾丸萎缩、精子数量减少、精子质量降低、精原细胞损伤、精原干细胞损伤、生精细胞损伤、精细胞凋亡、精细胞内氧化应激水平升高。
本发明还提供DMSO在制备减轻电离辐射引起精细胞DNA损伤以及促进DNA修复的药物中的应用。
发明人在前期实验中发现，DMSO显著增加5Gy辐照后小鼠精子数量，降低精子畸形率、促进辐照后雄性小鼠生育能力的恢复。从机制上，DMSO降低辐照后生精细胞内氧化应激水平，抑制生精细胞的凋亡，促进生精细胞增殖，进一步地，DMSO还可以通过减轻细胞DNA损伤来减轻精原干细胞和精原细胞的放射损伤，促进辐照后精子生成的快速恢复。
DMSO效果突出，与药物氨磷汀相比毒性更低，此外，DMSO还具备稳定性高，价格低廉的优点，可作为一种理想的睾丸放射损伤防护剂。综上，DMSO可以作为一种非常有前景的辐射防护剂，应用于放射诱导的雄性生殖系统损伤。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中DMSO减轻照射后小鼠的睾丸萎缩，C57小鼠5Gy照后45d小鼠睾丸大体观。
图2为本发明较佳实施例中DMSO减轻照射后小鼠的睾丸萎缩，C57小鼠非照射、5Gy照射后30d、45d条件下睾丸脏器指数(n＝3)。
图3为本发明较佳实施例中DMSO促进5Gy全身照射后小鼠生精上皮的组织结构恢复，c57小鼠非照射、5Gy照射后30d、45d条件下睾丸HE染色情况。
图4为本发明较佳实施例中DMSO促进5Gy全身照射后小鼠生精上皮的组织结构恢复，5Gy照后不同时间点生精上皮厚度比较(n＝3)。
图5为本发明较佳实施例中DMSO促进5Gy全身辐照后小鼠精子数量和质量的恢复，5Gy照后不同时间点精子数量比较(n＝3)。
图6为本发明较佳实施例中DMSO促进5Gy全身辐照后小鼠精子数量和质量的恢复，5Gy照后不同时间点精子畸形率比较(n＝3)。
图7为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸组织和生精细胞的氧化应激水平，DMSO对5Gy全身照射后6小时小鼠睾丸超氧化物歧化酶含量的影响(n＝3)。
图8为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸组织和生精细胞的氧化应激水平，DMSO对5Gy全身照射后6小时小鼠睾丸脂质氧化水平的影响(n＝3)。
图9为本发明较佳实施例中DCFHDA法检测DMSO对10Gy照射后12小时GC2细胞氧化应激水平的影响。
图10为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原细胞损伤。Kit免疫组化方法检测DMSO对5Gy全身照射后小鼠睾丸组织精原细胞数量的影响，免疫组化图片，可见Kit表达于细胞质内，Kit+精原细胞沿生精小管底部排列(箭头示)。
图11为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原细胞损伤。Kit免疫组化方法检测DMSO对5Gy全身照射后小鼠睾丸组织精原细胞数据的影响，Kit+精原细胞定量结果(n＝3)。
图12为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原干细胞损伤。GFR-α免疫组化方法检测DMSO对5Gy全身照射后小鼠睾丸组织精原干细胞数量的影响，免疫组化图片，可见GFR-α表达于细胞核内，GFR-α+精原干细胞沿生精小管底部排列(箭头示)。
图13为本发明较佳实施例中DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原干细胞损伤。GFR-α免疫组化方法检测DMSO对5Gy全身照射后小鼠睾丸组织精原干细胞数量的影响，GFR-α+精原细胞定量结果(n＝3)。
图14为本发明较佳实施例中DMSO减轻体外培养的生精细胞的放射损伤。CCK8法检测0.5％DMSO(v/v)对非照射，10Gy、12Gy照射后小鼠精母细胞系GC-1细胞生长的影响(n＝6)。
图15为本发明较佳实施例中DMSO减轻体外培养的生精细胞的放射损伤。CCK8法检测0.5％DMSO(v/v)对非照射，10Gy、12Gy照射后小鼠精原细胞系GC-2细胞生长的影响(n＝6)。
图16为本发明较佳实施例中DMSO抑制放射引起的GC2细胞凋亡。流式检测0.5％DMSO对非照射、10Gy照射后24小时GC2细胞凋亡的影响，流式示意图。
图17为本发明较佳实施例中DMSO抑制放射引起的GC2细胞凋亡。流式检测0.5％DMSO对非照射、10Gy照射后24小时GC2细胞凋亡的影响，总凋亡细胞，即早期凋亡和晚期之和，定量结果(n＝4)。
图18为本发明较佳实施例中DMSO抑制5Gy全身辐照引起的小鼠生精细胞凋亡。
图19为本发明较佳实施例中DMSO抑制5Gy全身辐照引起的小鼠生精细胞凋亡，Tunel法检测5Gy全身辐照后12小时睾丸组织细胞凋亡及定量，Cleaved Caspase3免疫组化法检测5Gy全身辐照后12小时睾丸组织细胞凋亡及定量。
图20为本发明较佳实施例中DMSO减轻照后睾丸细胞DNA损伤并促进DNA损伤相关修复蛋白的表达。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
1.材料和方法
1.1材料、试剂与仪器
1.1.1实验动物
SPF级C57BL/6J雄性小鼠，6-8周龄，体重22～24g购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK(京)2019-0010。小鼠饲养于火箭军特色医学中心研究部动物中心，饲养温度22±2℃，湿度55±5％，饲养垫料经γ射线杀菌，每周更换两次。每日光照/黑暗各12h，每笼3-5只小鼠，饲以γ射线消毒的标准饲料，自由饮水。所有小鼠购回后均在动物房饲养一周适应环境后开展实验。
1.1.2主要试剂
(1)二甲基亚砜(DMSO)(Alfa，货号：042780-1L)。
(2)5％山羊血清封闭液：封闭用正常羊血清原液(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9021)0.5ml，加1×TBST溶液9.5mL，充分混匀，-20℃保存。
(3)20％山羊血清封闭液：封闭用正常羊血清原液(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号ZLI-9021)1ml，加1×TBST溶液9mL，充分混匀，-20℃保存。
(4)c-Kit抗体(Abcam；货号：ab256345)。
(5)GFRα-1抗体(E-11)(santa cruz；货号：sc-271546)。
(6)苏木素(Sigma-Aldrich,Germany；货号：ZLI-9610)。
(7)伊红(北京中衫金桥，China；货号：ZLI-9613)。
(8)中性树胶(北京中衫金桥，China；货号：ZLI-9555)。
(9)DAB kit 20×(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9018)。
(10)Anti-BrdU Rat mAb(Abcam，USA；货号：ab6326)。
(11)辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-6001)。
(12)辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-6002)。
(13)Alexa
488标记山羊抗兔IgG(H+L)(亲和纯化)(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZF-0511)。
(14)Alexa
594标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(亲和纯化)(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZF0513)。
(15)D-PBS缓冲液(biosharp，货号：BL310A)。
(16)0.5M EDTA(pH8.0)(solarbio，货号E1170)。
(17)TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：(Beyotime/碧云天，货号C1098)。
(18)总SOD活性检测试剂盒(WST-8)：(Beyotime/碧云天，货号S0101S)。
(19)脂质氧化(MDA)检测试剂盒：(Beyotime/碧云天，货号S0131S)。
(20)Muse Annexin V&Dead Cell Kit:(Luminex；货号：MCH100105)。
(21)BCA蛋白浓度测定试剂盒：(Beyotime/碧云天，货号P0012)。
(22)特级胎牛血清(翱擎，货号AQmv09900-500ml)。
(23)CCK8(翱擎，货号AQ308-500t)。
(24)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)(碧云天，货号：P0015L)。
(25)SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly,10×)(碧云天，货号：P0014D)。
(26)SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天，货号：P0012AC)。
(27)Anti-53BP1 antibody(abcam,货号：ab36823)。
(28)Anti-BRCA1 antibody-C-terminal(abcam,货号：ab191042)。
(29)Anti-gamma H2AX antibody(abcam；货号：ab2893)。
(30)GAPDH Rabbit Polyclonal antibody(Proteinech；货号：10494-1-AP)。
(31)Rad51(D4B10)Rabbit mAb(Cell Signaling technology，货号：8875T)。
(32)Cleaved Caspase-3(Asp175)(5A1E)Rabbit mAb(Cell Signalingtechnology，货号：9664S)。
1.1.3仪器与耗材
(1)X射线机(美国Rad Source Technologies，型号RS-2000)。
(2)生物组织自动脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-TS1A)。
(3)生物组织冷冻包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-BM、BL)。
(4)生物组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P)。
(5)生物组织烘片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P)。
(6)轮转式切片机(德国Leica公司，型号RM2235)。
(7)正置荧光显微镜(德国Leica公司，型号DB4000)。
(8)高品质盖玻片(世泰，货号10212432C)。
(9)连体包埋盒(世泰，货号1050102W)。
(10)70μm白色细胞滤网(biosharp，货号BS-70-XBS)。
(11)电泳仪(北京市六一仪器厂型号：DYY-8C型)。
1.1.4实验方法
1.1.4.1石蜡包埋的睾丸样本的制备
(1)采用颈部脱臼法处死小鼠，浸没于75％酒精2min。
(2)处死小鼠，打开腹腔，找到腹壁两侧的脂肪，用镊子轻轻提起，找到与脂肪紧密相连的睾丸与附睾结构。
(3)小心剥离脂肪，将睾丸与附睾分离。
(4)取出小鼠双侧睾丸，拍照、称重并记录；浸泡于睾丸固定液，固定时间不少于12h。
(5)固定后的睾丸清水冲洗30min以上，将睾丸以最大面横切，注意横切面平整，切面与整个睾丸垂直。
(6)睾丸脱水，程序如下：
70％酒精30min→80％酒精30min→90％酒精30min→95％酒精30min→95％酒精30min→100％酒精20min→100％酒精20min→二甲苯15min→二甲苯30min→石蜡20min→石蜡20min→石蜡120min，石蜡温度65℃。
(7)将睾丸竖直摆放，切面垂直朝下，石蜡包埋。
1.1.4.2 HE染色
(1)石蜡样本切片，切片厚度为4μm。
(2)60℃烤片30min，使样本贴附在载玻片上。
(3)脱蜡：二甲苯I，7min；二甲苯II，7min；二甲苯III，7min；100％酒精I，5min；100％酒精II，5min；90％酒精，3min；80％酒精，3min；70％酒精，3min；60％酒精，3min；蒸馏水，5min。
(4)苏木素染色4min，清水冲净多余苏木素后置于盐酸酒精中10s，立即转移至清水中返蓝6min。
(5)将玻片浸没于伊红染液2min，清水冲洗多余染液。
(6)封片：70％酒精30s，80％酒精30s，90％酒精10s，100％酒精I2min，100％酒精II4min，二甲苯5min，中性树脂封片。
1.1.4.3精子计数与畸形染色
(1)处死小鼠，睾丸与附睾分离。
(2)将分离干净的附睾放入1ml HEPES培养液的EP管中，用眼科剪将其剪成几段，37℃水浴锅中孵育10分钟，孵育完毕后，各吸取10μl的上清液于细胞计数板内，进行精子计数。
(3)另吸取EP管中的上清液50μl，滴在载玻片上进行涂片，80％酒精固定10秒后风干，用1％伊红溶液染色30分钟，80％酒精再固定10秒，用蒸馏水冲洗掉多余的伊红染液，风干。
(4)显微镜下观察，每只老鼠至少观察200个精子。观察时先用低倍镜找寻背景干净，染色清晰，精子重叠部分较少的地方，再用高倍镜辨认精子的形态，识别畸形的精子，少勾，无勾，短尾，香蕉，折叠，无定形等。
1.1.4.4总SOD活性检测(WST-8)
(1)小鼠睾丸组织匀浆制备：
取冻存的睾丸组织，称重后，按照每10mg组织加入100μl PBS，加入组织研磨珠，在4℃进行匀浆，70Hz研磨10秒，重复一次。4℃约12,000g离心3-5分钟，取上清作为待测样品。
(2)BCA蛋白浓度测定
(3)配制WST-8/酶工作液：按照每个反应160μl的体积配制适量的WST-8/酶工作液。均匀混合151μl SOD检测缓冲液、8μl WST-8和1μl酶溶液，即可配制成160μl WST-8/酶工作液。
(4)配制反应启动工作液：把试剂盒中的反应启动液(40X)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40×)加入39μl SOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。
(5)准备96孔板，设置3个空白对照孔和16个样本孔，参照说明书表格依次加入待测样品和其他溶液。37℃孵育30分钟，孵育完毕后用酶标仪测450nm处的吸光值。
(6)根据所得的吸光值计算出抑制百分率，抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2)×100％；根据所得抑制百分率计算出SOD酶的活力单位；SOD酶活力单位(units)＝抑制百分率/(1－抑制百分率)
(7)根据所得样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/mg蛋白。
脂质氧化(MDA)测定：
(1)小鼠睾丸组织匀浆制备：同上。
(2)BCA蛋白浓度测定：同上。
(3)配制TBA储存液：称取适量TBA，用TBA配制液配制成浓度为0.37％的TBA储存液。配好的TBA储存液需加热到70℃，Vortex剧烈混匀，促进溶解。
(4)配制MDA工作液：按照每个反应203μl的体积配制适量的MDA工作液。均匀混合150μl TBA稀释液、50μlTBA储存液和3μl抗氧化剂，即可配制成203μl MDA工作液。MDA工作液较难溶解，需加热到70℃，Vortex剧烈混匀，促进溶解。
(5)标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线。
(6)在EP管内加入0.1ml PBS作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后各加入0.2ml MDA检测工作液。混匀后100℃金属浴加热15分钟，冷却至室温，1000g室温离心10分钟。
(7)取200μl上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。将吸光值代入标准曲线中计算MDA的含量，根据所得样品的蛋白浓度和稀释倍数，将MDA含量换算为μmol/mg蛋白。
精母细胞GC-2的ROS测定：
1.制备适宜浓度的GC-2细胞，浓度为105-106/ml左右。
2.配制Hank’s液，其中Hank’s：H2DCFDA＝999：1(体积比)；37℃孵育30分钟。
3.用Hank’s液洗细胞3次，加入DMEM培养基；37℃孵育30分钟。
4.孵育完毕后，消化并收集细胞，800rpm离心3分钟。
5.加入Hank’s液重悬细胞，并移入流式管中；上机检测。
1.1.4.5免疫组织化学
(1)小鼠睾丸取材、包埋、切片、脱蜡：同上。
(2)抗原修复：切片浸没于pH9.0 EDTA抗原修复液，高压修复5min。
(3)滴加3％H2O2处理8min，去除内源性过氧化物酶干扰。
(4)滴加5％山羊血清封闭液，室温孵育1h。
(5)用抗体稀释液将Anti-c-Kit antibody按1:200稀释，将稀释好的一抗滴加在玻片样本上，4℃过夜孵育。
(6)用抗体稀释液将山羊抗大鼠二抗按1:200稀释，室温孵育1h。
(7)将DAB试剂盒(购自中衫金桥，货号ZLI-9019)中的A液和B液按1:30体积比混合，得到DAB工作液。
(8)甩掉玻片上的液体，滴加DAB工作液，镜下观察，阳性细胞出现棕色沉淀后立即浸没于PBS中停止反应。
(9)苏木素细胞核染色，脱水后中性树胶封片。
1.1.4.6体外细胞增殖检测
(1)制备浓度为2×103/ml GC-1单细胞悬液，和浓度为1×103/ml GC-2单细胞悬液。
(2)标记6块96孔板，每块96孔板，设置两种不同细胞类型，但同一种组别，分别为0Gy+Control，0Gy+DMSO,10Gy，10Gy+DMSO，12Gy，12Gy+DMSO，每个组别分别设置6个复孔。
(3)每个孔加200ul细胞，周围一圈加入PBS，5％CO2，37℃孵箱进行细胞孵育。
(4)细胞贴壁后进行照射。
(5)配制CCK-8试剂，CCK-8原液：DMEM培养基＝1：10(体积比)。
(6)吸出96孔板中每孔DMEM培养基。
(6)将配制好的CCK-8试剂，加入各块96孔板的细胞中，110μl/孔。
(7)5％CO2，37℃孵箱进行细胞孵育2小时。
(8)孵育完毕后测450nm处OD值。
1.1.4.7 GC-2细胞凋亡检测
(1)准备浓度在1×105-1×106/mL GC-2单个悬浮细胞。
(2)将
Annexin V&Dead Cell Reagent试剂恢复至室温。
(3)每管加入适当浓度100μL GC-2悬浮细胞。
(4)每管加入100μL的Muse Annexin V&Dead Cell Reagent。
(5)通过上、下移液3-5秒彻底混合。
(6)室温下避光孵育20分钟。
(7)用
Cell Analyzer流式上机检测。
1.1.4.8小鼠睾丸TUNEL染色
(1)小鼠睾丸石蜡切片脱蜡同前。
(2)胃蛋白酶溶液37℃孵育20分钟。
(3)PBS清洗三次，每次3min。
(4)滴加3％H2O2处理20min，去除内源性过氧化物酶干扰。
(5)PBS清洗三次，每次3min。
(6)配制生物素标记液：按照每个反应样品配制50μl生物素标记液，均匀混合5μlTdT酶、45μl Biotin-dUTP，即可配制成50μl生物素标记液。在样品上滴加50μl生物素标记液，盖上防蒸发膜，37℃避光孵育60分钟。
(7)PBS清洗一次，每次3min。
(8)滴加100μl标记反应终止液，室温孵育10分钟。
(9)PBS清洗三次，每次3min。
(10)配制Streptavidin-HRP工作液：按照每个反应样品配制50μlStreptavidin-HRP工作液，均匀混合1μl Streptavidin-HRP、49μl Streptavidin-HRP稀释液，即可配制成50μlStreptavidin-HRP工作液。在样品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，盖上防蒸发膜，室温孵育30分钟。
(11)PBS清洗三次，每次3min。
(12)配制DAB显色液：按照每个样品使用100μl显色液的比例配制适量DAB显色液。等体积混合适量DAB显色液A和DAB显色液B，充分混匀后即为DAB显色液。滴加100μl DAB显色液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间，出现阳性颗粒后立即浸没于PBS内终止反应。
(13)苏木素细胞核染色，脱水后中性树胶封片。
1.1.4.9 Western Blot
1.1.4.9.1蛋白PAGE胶的配制
(1)玻璃板装配，验漏。分离胶配制，并将配制好的分离胶灌入玻璃板，加入异丙醇压平分离胶。
(2)待凝固后直至分离胶与异丙醇出现明显分界线，倒出上层异丙醇，加入浓缩胶，直接插入梳子，待凝固。
1.1.4.9.2蛋白凝胶电泳
(1)取出PAGE胶，上推胶板以避免漏液，装入垂直槽固定架，装入电泳槽，加入电泳缓冲液。
(2)轻柔拔出梳子，以免破坏胶孔，将槽内电泳液补满。
(3)按照上样顺序进行点样，并加入蛋白分子量Marker。
(4)接通电源，先以80V电压电泳浓缩胶30min左右，进入分离胶后改为120V电压继续电泳，待溴酚蓝至凝胶边缘5cm处停止电泳。
1.1.4.9.3转膜
(1)裁剪PVDF膜泡入甲醇中待用，将电泳完的凝胶玻璃板取出，并按照蛋白Maker切割目的蛋白所在区域的凝胶。
(2)预冷转膜液里放入转膜用的夹子和两块海绵垫，将海绵垫浸湿润，以白色地板为底，按照滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸，黑色底板顺序进行放置，并用滚轮赶走气泡，确保滤纸、海绵与胶之间无气泡。
(3)将夹子放入转移槽中，转移槽中放入冰袋，200mA转膜120min。
1.1.4.9.4封闭
转膜后将膜于封闭液中封闭1h，封闭液用TBST配的5％脱脂牛奶。
1.1.4.9.5抗体孵育
(1)清洗后将膜按照目的蛋白位置剪切标记好，加入稀释的一抗，4℃过夜。
(2)再在摇床上用TBST液清洗膜3次，每次10min。
(3)清洗后将二抗用5％脱脂牛奶按照1:5000稀释，室温下孵育膜和二抗1h。
(4)摇床上用TBST清洗膜三次，每次10min。
1.1.4.9.6显影
(1)化学发光检测：将等体积的ECL化学发光试剂盒(购自Millipore，货号No.WBKLS0500)A液和B液混合。
(2)将显影液均匀涂在PVDF膜上，避光孵育，置入Bio-rad自动显影液仪器进行目的蛋白显影成像。
(3)凝胶图像分析:利用Image Lab软件处理系统分析目标带的密度值。
实施例1 DMSO促进辐照后雄性小鼠生育能力的恢复
1、实验分组：18只雄性C57小鼠随机抽取分为如下3组：
(1)正常对照组：腹腔注射对照溶剂(生理盐水，下同)0.3ml，不接受辐照，n＝6。
(2)5Gy照射对照组：辐照前1小时腹腔注射对照溶剂0.3ml，n＝6。
(3)5Gy DMSO组：辐照前1小时腹腔注射40％DMSO 0.3ml，剂量为6g/kg，n＝6。
照射条件：5.0Gy全身照射，剂量率约4Gy/min。
2、实验方法：C57雄性小鼠，6-8周龄，随机分为正常对照组、照射对照组与照射+DMSO给药组，正常对照组小鼠及照射后的小鼠正常饲养60天后，雄鼠与雌鼠按1:3配对，记录配对后雌鼠怀孕率、产仔周期及产仔数量。
实验结果：如表1所示，正常对照组雌鼠全部怀孕，从配对到产仔平均耗时(23.5±5.7)天，每只小鼠产仔约8.3只；相应地，5Gy照射后的雄鼠与雌鼠配对后，雌鼠怀孕率仅50％，产仔周期延长了54％，产仔数量减少了47％，提示5Gy辐照严重损伤雄鼠的生育能力。与DMSO给药组雄鼠配对后雌鼠怀孕率提高至93％，且相较于照射对照组，怀孕产仔耗时缩短15％，产仔数量增加64％，差异有统计学意义。以上结果说明DMSO能显著促进辐照后雄性小鼠生育能力的恢复。
表1 5Gy全身照射60天后雄性小鼠生育能力的评估
每组雌鼠数量n＝18；数值以平均数±标准差表示
ap＜0.001 for 5Gy vs.正常对照组
bp＜0.01 for 5Gy+DMSO vs.5Gy
cp＜0.001 for 5Gy vs.正常对照组
dp＜0.05 for 5Gy+DMSO vs.5Gy
实施例2 DMSO减轻辐照后小鼠睾丸萎缩
1、实验分组：24只雄性C57小鼠随机抽取分成下列4组：
(1)正常对照组：腹腔注射对照溶剂(生理盐水)0.3ml，于2h后取睾丸，n＝4。
(2)DMSO组：腹腔注射DMSO 0.3ml，剂量为6g/kg，给药后2h取睾丸，n＝4。
(3)5Gy照射对照组：腹腔注射对照溶剂0.3ml，照射前1h施用，照射后30d，45d取睾丸，n＝8。
(4)5Gy DMSO组：腹腔注射40％DMSO 0.3ml，剂量为6g/kg，于照射前1h施用，照射后30d，45d取睾丸，n＝8。
照射条件：5.0Gy全身照射，剂量率约4Gy/min。
2、实验方法：C57雄性小鼠，6-8周龄，随机分为对照组与DMSO给药组，DMSO按6g/kg辐照前1小时腹腔注射给药，对照组给予相应体积的对照溶剂。实验小鼠接受5.0Gy X射线全身辐照，非照射、辐照后30天、辐照后45天情况下记录小鼠体重后处死小鼠，取双侧睾丸组织，拍照、称重，计算睾丸指数。
实验结果：如图1所示，5.0Gy辐照后30天、45天，照射组小鼠睾丸体积变小萎缩，而DMSO组小鼠睾丸萎缩程度明显减轻。如图2所示，5.0Gy辐照后30天，45d小鼠睾丸指数分别为0.22％±0.005，0.32％±0.039，低于非照射组0.73％±0.02，0.73％±0.06，而经DMSO预处理后的小鼠睾丸指数为0.24％±0.003，0.4％±0.030，高于照射组，差异均有统计学意义。
实施例3 DMSO促进辐照后小鼠生精上皮的组织结构恢复
1、实验分组：同实施例1。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.1石蜡包埋的睾丸样本的制备和1.1.4.2HE染色”。
3、实验结果：如图3所示，非照射情况下小鼠睾丸的曲精小管内细胞增殖活跃，可见从幼稚到成熟的生精细胞沿曲精小管底部紧密规律排列，中央见大量成熟精子。5.0Gy辐照后30天，大量生精上皮坏死萎缩，曲精小管直径缩小，出现空泡，成熟精子消失；辐照后45天，曲精小管部分恢复但仍不及照射前水平，提示放射性睾丸损伤模型建立成功。与对照相比，非照射情况下，DMSO对睾丸组织结构无明显影响，辐照后可减轻生精上皮的萎缩，减少无生精上皮曲精小管的比例，促进生精上皮快速恢复。如图4所示，辐照后30天及45天，DMSO显著促进生精上皮的恢复。
实施例4 DMSO促进辐照后小鼠精子数量和质量恢复
1、实验分组：同实施例1。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.3精子计数与畸形染色”。
3、实验结果：如图5所示，正常情况下小鼠精子浓度约1×107/ml，辐照后30天，精子减少最为严重，锐减约90％，辐照后45天也仅能恢复至正常的25％。DMSO给药组小鼠的精子浓度在辐照后30天及45天分别是照射对照的1.78倍和1.86倍。辐照后精子数量的降低还伴随畸形精子比例的增加，如图6所示，辐照后30天和45天，对照组畸形精子比例的数量分别从20.37％上升到42.80％和51.87％，而DMSO可显著降低畸形精子的比例。以上结果提示，DMSO能显著促进辐照后小鼠精子数量和和质量的恢复。
实施例5 DMSO在体内和体外水平降低辐照引起的氧化应激水平
1、实验分组：16只雄性C57小鼠随机抽取分成下列4组：
(1)正常对照组：小鼠腹腔注射对照溶剂(生理盐水)0.3ml，n＝4。
(2)DMSO组：小鼠腹腔注射40％DMSO 0.3ml，剂量为6g/kg，n＝4。
(3)5Gy辐射对照组：小鼠腹腔注射对照溶剂0.3ml，于照射前1h施用，n＝4。
(4)5Gy DMSO组：腹腔注射40％DMSO 0.3ml，剂量为6g/kg，于照射前1h施用，n＝4。
照射条件：5.0Gy全身照射，剂量率约4Gy/min。
取材时间：上述分组于照射后6h取睾丸，放入冻存管中，-80℃冻存，后续测氧化应激。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.4总SOD活性检测(WST-8)”。
实验结果：如图7和图8所示，辐照后小鼠的睾丸SOD显著下降，脂质过氧化显著升高，DMSO则可以抑制SOD的下降和脂质过氧化物水平的升高，差异有统计学意义。接着申请人又在体外细胞水平检测了DMSO对照后氧化应激水平的影响。小鼠精母细胞系GC2细胞用0.5％DMSO(v/v)预处理后接受10.0Gy辐照，流式检测发现细胞照后12h活性氧(ROS)的水平增加了5.59倍，而DMSO则显著抑制了ROS的产生(图9)。以上结果提示，DMSO可显著抑制辐照引起的睾丸组织氧化应激水平的升高。
实施例6 DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原细胞损伤
1、实验分组：同实施例1。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.5免疫组织化学”。
3、实验结果：Kit是一种受体酪氨酸激酶，在哺乳动物的睾丸中主要表达与间质细胞和精原细胞中。Kit免疫组化显示(图10)，对照组小鼠部分曲精小管内Kit+细胞稀疏排布，少数可见衰竭，进一步定量发现，给药组小鼠曲精小管内Kit+细胞的数量(19.9)是对照(12.1)的1.64倍，差异有统计学意义(图11)。
实施例7 DMSO减轻辐照引起的小鼠睾丸精原干细胞损伤
1、实验分组：同实施例1。
2、实验方法：参见实施例5，基本过程与Kit免疫组化相同，但抗原修复液改用为pH6.0柠檬酸钠修复液；GFR-α1一抗按1:50稀释，采用HRP标记的山羊抗小鼠二抗。
实验结果：GFRα1是一类胶质细胞来源的神经营养因子家族受体，对精原干细胞的维持及更新有非常重要的作用，主要表达与精原干细胞中。GFRα1免疫组化显示(图12)，辐照后曲精小管的GFRα1+细胞非常稀少，每10个曲精小管才有一个左右，DMSO给药后数量提高了一倍(图13)。以上结果提示，DMSO可有效保护小鼠睾丸精原干细胞。
实施例8 DMSO减轻体外培养的生精细胞的放射损伤
1、实验分组：将GC-1和GC-2细胞分别随机分成4组。
(1)0Gy正常对照组：未做任何处理的GC-1和GC-2细胞。
(2)0Gy DMSO组：将DMSO分别加入GC-1和GC-2细胞。
辐射组：将GC-1和GC-2细胞进行照射，照射剂量为10Gy，12Gy。
DMSO预处理组：照射前两小时给予DMSO处理GC-1和GC-2细胞，照射剂量为10Gy，12Gy。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.6体外细胞增殖检测”。
3、实验结果：为进一步探究DMSO对幼稚生精细胞的放射防护作用，使用CCK8法检测了DMSO对不同剂量照射后GC1、GC2细胞生长的影响。如图14所示，0.5％DMSO预处理后的GC1细胞，在10Gy、12Gy照射后，存活率分别提高了10.3％、7.9％。相应地，同等照射剂量条件下，0.5％DMSO将GC2的存活率分别提高了10.8％，19.1％(图15)。结合实施例6和实施例7，DMSO可显著防护电离辐射引起的幼稚生精细胞的损伤。
实施例9 DMSO抑制放射引起的GC2细胞凋亡
1、实验分组：
将GC-1和GC-2细胞分别随机分成4组。
(1)正常对照组(Control)：未做任何处理的GC-2细胞。
(2)DMSO组：单纯给0.5％DMSO处理GC-2细胞。
(3)辐射组：将GC-2细胞进行照射，照射剂量为10Gy。
(4)DMSO预处理组：照射前两小时给予0.5％DMSO处理GC-2细胞，照射剂量为10Gy。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.7GC-2细胞凋亡检测”。
3、实验结果：GC2细胞用0.5％DMSO(v/v)预处理后接受10.0Gy辐照，辐照后24小时，使用Annexin V试剂盒流式检测细胞凋亡的改变。非照射情况下，DMSO对GC2细胞的凋亡无显著影响，单纯10.0Gy照射后，总凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)比例升高约5.08％，而使用DMSO以后，总凋亡的比例显著下降，下降幅度约为2.6％(图16和图17)。
实施例10 DMSO抑制5Gy全身辐照引起的小鼠生精细胞凋亡
1、实验分组：参见实施例4，但取材时间为照射后12h，取完睾丸直接放入睾丸固定液中进行固定。包埋，切片同上。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.8小鼠睾丸TUNEL染色”；Cleaved-Caspase 3免疫组化基本过程与Kit免疫组化相同，但抗原修复液改用为PH＝6.0柠檬酸钠修复液。anti-Cleaved Caspase 3一抗按1:200稀释，采用HRP标记的山羊抗兔二抗。
3、实验结果：Tunel染色发现，凋亡细胞主要位于曲精小管底部，位置分布看，多为精母细胞及更幼稚的生精细胞。DMSO给药后曲精小管内Tunel+细胞的数量下降了约54％(6.40±1.63vs 2.96±0.99)，差异有统计学意义。Cleaved Caspase3是介导细胞凋亡的关键执行蛋白，免疫组化显示，DMSO也能显著降低曲精小管内Cleaved Caspase3+细胞的数量(3.4±0.18vs 1.91±0.23)。以上结果表明，DMSO可显著抑制照射引起的小鼠睾丸生精细胞的凋亡(图18和图19)。
实施例11 DMSO减轻辐照引起的DNA损伤并促进DNA损伤的修复
1、实验分组：
将GC-1和GC-2细胞分别随机分成4组：
(1)正常对照组(Control)：未做任何处理的GC-2细胞。
(2)DMSO组：单纯给0.5％DMSO处理GC-2细胞，给完药后2h提蛋白。
(3)辐射组：将GC-2细胞进行照射，照射剂量为10Gy。
(4)DMSO预处理组：照射前两小时给予0.5％DMSO处理GC-2细胞，照射剂量为10Gy。
提蛋白时间点：照射完后3h,6h,12h,24h,48h提蛋白。
2、实验方法：参见“实验方法1.1.4.9Western Blot”。
3、实验结果：如图20所示，辐照后12小时，对照组γH2AX表达量显著升高并持续存在48小时，提示电离辐射引起的大量的DNA双键断裂，同时辐照后6h起，DNA损伤修复相关蛋白Rad51和Brca1表达逐渐升高，提示DNA损伤开始修复。对应地，DMSO组的γH2AX表达上升趋势更缓慢，而Brca1、Rad51的表达缺显著增加，以上结果提示DMSO可以显著抑制电离辐射引起的DNA损伤，并促进DNA损伤的修复。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (4)
1.DMSO在制备减轻电离辐射引发的雄性生殖系统损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，DMSO的给药方式为腹腔注射。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述损伤包括睾丸萎缩、精子数量减少、精子质量降低、精原细胞损伤、精原干细胞损伤、生精细胞损伤、精细胞凋亡、精细胞内氧化应激水平升高。
4.DMSO在制备减轻电离辐射引起精细胞DNA损伤以及促进DNA修复的药物中的应用。
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