CN109091488B - 紫云英苷治疗糖尿病性睾丸功能损伤的制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了紫云英苷(Astragalin)在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤损伤药物中的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时,剂量为30mg/kg的紫云英苷可以显著保护糖尿病模型诱发的精子损伤,改善睾丸组织病理学变化并且增强抗氧化能力和调控炎性细胞因子的蛋白表达,证明紫云英苷具有改善糖尿病小鼠生精功能损伤的作用。
Description
技术领域
本发明涉及紫云英苷的应用,特别涉及紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种由多种病因引起并以高血糖为显著特征的代谢性疾病。近年来研究发现长期患有糖尿病的患者会随着高血糖的发生,产生严重的并发症甚至可以导致患者器官的功能性障碍和衰竭。随着研究的不断深入,糖尿病引起的男性生殖损伤受到了人们的极大关注。目前,糖尿病性男性生殖功能损伤临床表现为性功能障碍、生育力低下、生精功能损伤等,其中生精功能损伤引起的精子质量降低、精子畸形增加、以及与生精功能密切相关的睾丸标志酶分泌不足等一系列问题是研究糖尿病性男性生殖损伤的一大热点及重点。临床上,治疗糖尿病生精功能损伤的药物目前多为激素类药物,其疗效不佳,常伴有恶心、呕吐、肝毒性等不良反应。因此,寻找具有疗效佳、毒性小的治疗药物,是目前研究糖尿病生精功能损伤的核心问题。
中药菟丝子(Cuscuta chinensis L.)在《神农本草经》书中被列为上品具有温补肾阳、滋补肝肾、固精缩尿、养肝明目、补肾益精之功效。菟丝子总黄酮具有生精保护作用,其中紫云英苷(Astragalin)是其主要黄酮成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗真菌等作用。紫云英苷的化学名称是3,5,7,4’-四羟基黄酮-3-葡萄糖苷,分子式为C21H20O11,相对分子质量为448.38,常温下呈黄色针晶状,熔点218-220℃,沸点823.2℃(760mm Hg),不溶于水,溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂。近年来,国内外研究发现紫云英苷还具有抗炎、抗氧化等多种药理活性作用和临床功 能,但关于其对糖尿病性睾丸功能损伤,尤其是生精功能损伤的保护作用目前未见文献报道。将其发展为治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物具有极高的潜在价值与社会意义。
发明内容
本发明的目的是通过对紫云英苷的药理作用研究,提供紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途。
本发明通过以下技术方案来实现发明目的:
本发明提供紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途,所述紫云英苷的结构式如式(1)所示:
具体地,所述糖尿病性睾丸功能损伤为糖尿病性的生精功能损伤。
具体地,所述紫云英苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。
具体地,所述紫云英苷单次应用剂量为3.3-30mg/kg。
优选地,所述紫云英苷单次应用剂量为10-30mg/kg。
优选地,所述紫云英苷单次应用剂量为30mg/kg。
具体地,所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型或注射剂型。
具体地,所述的紫云英苷作为唯一活性成分在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途。
本发明提供的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途具有以下有益效果:
(1)紫云英苷能显著提高精子数目、活力、活率、每日生精量以及降低精子畸形率;
(2)紫云英苷能改善睾丸组织变化,显著提升了睾丸组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的水平,降低了脂质过氧化物MDA和NO的含量,以及抑制了睾丸组织中TNF-ɑ和iNOS蛋白的表达。
本发明首次证实,紫云英苷具有治疗链脲佐菌素所致糖尿病小鼠生精功能损伤的保护作用,可用于制备糖尿病性生精功能损伤的治疗药物。
附图说明
图1为紫云英苷对糖尿病小鼠脏器的影响图。
图2为紫云英苷对糖尿病小鼠精子数目的影响图。
图3为紫云英苷对糖尿病小鼠精子活力的影响图。
图4为紫云英苷对糖尿病小鼠精子活率的影响图。
图5为紫云英苷对糖尿病小鼠精子畸形率的影响图。
图6为紫云英苷对糖尿病小鼠精子每日生精量的影响图。
图7为紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织中MDA、NO的影响图。
图8为紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织中SOD、GSH-Px和CAT的影响图(SOD:超氧化物歧化酶;GSH-Px:谷胱甘肽过氧化物酶;CAT:过氧化氢酶)。
图9为紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织HE病理变化的影响图(图9A为正常组,图9B为糖尿病组,图9C为氯米芬组(5mg/kg),图9D为紫云英苷组(3.3mg/kg),图9E为紫云英苷组(10mg/kg),图9F为紫云英苷组(30mg/kg))。
图10为紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织PAS病理变化的影响图(图10A为正常组,图10B为糖尿病组,图10C为氯米芬组(5mg/kg),图10D为紫云英苷组(3.3mg/kg),图10E为紫云英苷组(10mg/kg),图10F为紫云英苷组(30mg/kg))。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明,以下实施例中使用的紫云英苷均为前述式(1)所示的化合物,可通过商购获得。
实施例1
紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途,其中,糖尿病性睾丸功能损伤为糖尿病性的生精功能损伤,紫云英苷单次应用剂量为小鼠3.3mg/kg,药物的剂型为口服剂型。
实施例2
紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途,其中,糖尿病性睾丸功能损伤为糖尿病性的生精功能损伤,紫云英苷单次应用剂量为小鼠10mg/kg,药物的剂型为口服剂型。
实施例3
紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤药物中的用途,其中,糖尿病性睾丸功能损伤为糖尿病性的生精功能损伤,紫云英苷单次应用剂量为小鼠30mg/kg,药物的剂型为口服剂型。
下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果:
一、实验材料
1.1动物处理
体重23-27g之间的SPF级ICR雄性成年小鼠,宁夏医科大学实验动物中心繁殖(动物孵育合格批号:SCXK(宁)2017-0001)。动物饲养参照实验动物饲养标准,饲养房12h人工控制昼夜交替,小鼠自由饮水。
1.2实验药品及仪器
本实验中会涉及到的主要药品和试剂包括:紫云英苷(购自上海源叶生物公司,纯度≥98%),链脲佐菌素(购自美国Sigma公司);羧甲基纤维素钠(购自北京索莱宝公司);柠檬酸(购自天津大茂化学试剂厂);柠檬酸钠(购自天津大茂化学试剂厂);龙胆紫(购自上海源叶生物公司);糖原染色液(购自北京益利精细化学品有限公司)。SOD、MDA、GSH-px、CAT、NO试剂盒(购自南京建成生物工程研究所),兔抗TNF-α(购自proteintech公司)、iNOS多克隆抗体(购自cell signer公司),酶标仪(1510,Thermo Fisher公司),血球计数仪、水浴锅、电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公司),凝胶成像分析仪(JS-860B,上海培清公司)。
1.3实验动物分组及给药
1.3.1糖尿病小鼠模型建立
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水,配成A液;2.94g柠檬酸钠溶于100ml蒸馏水,配成B液,按28ml:22ml混匀后,用pH计调节pH在4.2-4.5之间。
小鼠适应性饲养1周后,造模前隔夜禁食不禁水12h。在给予链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)前一天,快速称重分组分装避光。给药时,冰浴保存带入动物房,不得与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合。临用时,在冰浴 中用0.1mol/L pH值为4.2-4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制成浓度为1%的STZ注射液。每天早上,腹腔注射STZ45mg/kg,连续给STZ 5天。末次给药3d后剪尾取血,用强生血糖仪测定小鼠尾尖血糖,以随机血糖超过16.7mmol/L者且有糖尿病典型症状“三多一少”现象者纳为糖尿病小鼠。
1.3.2实验分组
模型构建成功后,按血糖高低、体重大小进行完全随机分组进行分配,随机分为6组,依次为:正常对照组(Control)、糖尿病模型组(DM)、氯米芬(5mg/kg)组、紫云英苷(3.3mg/kg)组、紫云英苷(10mg/kg)组、紫云英苷(30mg/kg)组,每组15只。氯米芬组和紫云英苷各给药剂量组于每天上午固定时间点连续给药8周,以每0.1ml/10g的给药容积灌胃给药;Control组和DM组小鼠均给予相同容量(0.1ml/10g)的0.5%CMC-Na;其余实验条件相同。
二、实验过程
(一)体重及脏器测定
1.1实验方法:
每2周称重并记录各组小鼠体重。实验结束后,处死小鼠,用手术剪迅速剪开小鼠腹部,充分暴露双侧睾丸,除去周围的脂肪组织及结缔组织,取出睾丸、附睾以及精囊腺,吸干表面的血液后用电子天平准确称取其重量。
1.2实验结果:
结果如图1所示,糖尿病小鼠生殖器官睾丸,附睾和精囊腺比正常组迅速下降(p<0.01)。给予紫云英苷(30mg/kg,10mg/kg)治疗的小鼠生殖器官明显增加(p<0.01,p<0.05),而紫云英苷治疗组(3.3mg/kg)未改善精囊腺重量。而氯米芬治疗组也增加了生殖器官重量(p<0.01)。在实验开始之前,各组间没有显着差异。治疗8周后,糖尿病小鼠的体重明显低于正 常小鼠。与模型小鼠进行比较,紫云英苷治疗组(30mg/kg,10mg/kg)增重了糖尿病小鼠体重(p<0.01,p<0.05)(见表1)。氯米芬组治疗组对糖尿病小鼠也有一定增加体重的作用(p<0.01)。提示紫云英苷对糖尿病小鼠体重、生殖器官有一定的改善作用。
表1紫云英苷对糖尿病小鼠体重的影响
(二)精子参数测定
2.1实验方法:
精子数目:将盛有2ml生理盐水的小平皿置于恒温水浴箱内预热至37℃,将小鼠右侧附睾尾称重并在小平皿剪碎水浴5分钟,得到的精子原浆稀释50倍,在400倍光镜下计数血细胞计数板上4大格精子的数量并计算。
精子活率:将上述精子原浆采用0.5%龙胆紫染色,在400倍光镜下计数100个精子的存活率,其中死的精子呈深紫色,活的精子呈浅蓝紫色。
精子活力:半定量法评估精子活力,每个样本取20μl精子悬液,400倍光镜下观察大约100个精子的游动情况,计算游动精子的比例。
精子畸形率:精子原浆采用0.5%龙胆紫染色,记录光镜十个视野里精子的形态变化,其中(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等)、尾部中 段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双尾)、尾部主段畸形,然后分类计数。有的精子尾部发育未完成,为未成熟精子,可计为畸形精子。
每日生精量:取右侧上1/4睾丸称重并置于1ml生理盐水中剪碎;超声波处理,生精细胞均被粉碎后稀释50倍;血球计数器计数精子头的数量;根据公式计算每克睾丸组织所含的精子数。每日生精量用睾丸精子头数量和小鼠精细胞发育时间共同评估,小鼠精子细胞发育跨越4.84天。
每克睾丸组织所含精子数量=四大格精子头数量之和/4×稀释倍数(50)×原液体积(1ml)×104/组织块重量;
整个睾丸的精子数量=每克睾丸组织所含精子数量×睾丸重量;
每日生精量=睾丸精子头数量/4.84天。
2.2实验结果:
与正常对照组比较,模型组精子数目、活力、活率以及每日生精量明显降低以及精子畸形率显著增加(P<0.01)。如图2至图6所示,与糖尿病组比较,紫云英苷(30mg/kg)组小鼠精子数目、活力、活率以及每日生精量明显增加和精子畸形率明显降低(P﹤0.05,P﹤0.01);紫云英苷(10mg/kg)组小鼠精子数目、活力、活率以及每日生精量有所改善和精子畸形率有降低(P﹤0.05,P﹤0.01);而紫云英苷(3.3mg/kg)组小鼠精子活率和精子畸形率与模型组无差异性(P>0.05)。因此,提示紫云英苷对糖尿病小鼠精子参数有一定的保护作用。
(三)氧化应激指标检测
3.1实验方法:
将小鼠麻醉后冰上摘眼球处死快速取睾丸,生理盐水短暂清洗右侧睾丸后保存于-80℃液氮中待用。使用硫酸浸泡过的玻璃匀浆器按9:1(V/W)加入组织裂解液冰上操作,反复匀浆30-50次至肉眼不见组织块,离心取上清液。使用牛血清白蛋白按考马斯亮蓝法在酶标仪562nm处检测 待测样品吸光度,做总蛋白浓度标准曲线(R2>0.99),确定蛋白浓度。严格按照SOD、MDA、GSH-px、CAT、NO试剂盒的要求进行测定。
3.2实验结果:
研究紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸抗氧化应激的作用。与对照组相比,糖尿病小鼠睾丸组织中显示出高浓度的丙二醛(MDA)和NO浓度(p<0.01)(如图7)。与模型值相比,给予紫云英苷(30mg/kg)后糖尿病小鼠降低了高浓度的MDA和NO(p<0.01)。紫云英苷治疗组(10mg/kg)对NO浓度没有特别的影响(p<0.05)。STZ处理后,糖尿病小鼠睾丸组织SOD,GSH-Px和CAT水平显著降低(p<0.01)。紫云英苷显著恢复了糖尿病小鼠的睾丸组织中SOD,GSH-Px和CAT的抗氧化酶(p<0.01)。紫云英苷治疗(10mg/kg)组具有相同恢复SOD和GSH-Px的活性(p<0.01)(如图8)。提示说明紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织具有一定的抗氧化的作用。
(四)睾丸组织病理变化
4.1实验方法:
苏木素-伊红染色:石蜡切片于65℃烘箱中烘烤20min,之后将玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min),二甲苯Ⅱ(5min),无水乙醇Ⅰ(1min),无水乙醇Ⅱ(1min),95%乙醇(30s),80%乙醇(30s)和70%乙醇(30s),水洗3次,之后于苏木素中浸泡5min,水洗3次,在1%的盐酸酒精溶液中浸泡20s,水洗,伊红溶液中浸泡2min,水速洗,之后石蜡切片继续依次浸泡于80%乙醇(30s),95%乙醇(30s),无水乙醇Ⅰ(1min),无水乙醇Ⅱ(3min),二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min),最后用中性树胶封片。每组睾丸组织石蜡切片HE染色完成后,置于显微镜下观察,每张切片分别取200×和400×两个视野,每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。
糖原染色:睾丸组织石蜡切片脱蜡与上述方法一致,片子脱水至蒸馏水后,进入过碘酸溶液中,室温放置5-8min,不超过10min;自来水冲洗1min,再过蒸馏水2次;滴加schiff试剂,出现红色停止,10min;自来 水冲洗10min,在置于苏木素中,染细胞核1-2min,酸性乙醇分化液分化2-5s;返兰后脱水封片。每组睾丸组织石蜡切片HE染色完成后,置于显微镜下观察,每张切片分别取200×和400×两个视野,每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。
4.2实验结果
通过两种染色比较可以看出(如图9和10),正常对照组小鼠睾丸组织的曲细精管排列整齐紧密,精原细胞及不同发育阶段的精母细胞,管腔内可见密集成形精子,睾丸间质细胞排列紧密,生精小管基底膜PAS(+)阳性表达量正常并且没有结构增生。而糖尿病模型组小鼠睾丸组织曲细精管明显萎缩、空泡化严重,各级生精细胞层次不清、排列紊乱、数量明显减少,生精小管基底膜PAS(+)阳性表达量增多并且存在严重的增生现象,精子发生明显受到抑制。紫云英苷治疗组对糖尿病小鼠睾丸组织有一定的恢复作用,其中以紫云英苷(30mg/kg)组效果为佳。镜下表现曲细精管界膜完整外形较规则,各级生精细胞分布排列逐渐致密整齐,管腔内可见少量精子,结构接近于正常对照组,PAS(+)阳性表达量减少,生精小管基底膜增生得到改善。提示紫云英苷对糖尿病小鼠睾丸组织具有一定的保护作用。
(五)Western blot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织TNF-α、iNOS蛋白的表达
5.1实验方法:
使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白,BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,用将硝酸纤维素膜(NC膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜,将膜置入5%脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束孵育5%脱脂奶粉稀释的一抗,4℃过夜,室温复温1h,洗膜孵育二抗。用PBST洗NC膜3次,每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL),NC膜固定于片盒内, 压入胶片进行曝光。取出胶片,放入显影液和定影液中各1min,最后清水清洗。凝胶图像分析成像系统(培清,JS-860B)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。
5.2实验结果:
如图11,与正常对照组比较,糖尿病模型组TNF-α、iNOS蛋白表达明显增加(P<0.01);如图12所示,与糖尿病模型组比较,紫云英苷(30mg/kg)组小鼠睾丸组织TNF-α、iNOS蛋白表达明显减少(P﹤0.05,P﹤0.01);提示紫云英苷的保护作用可能通过降低TNF-α、iNOS的蛋白表达与活化,发挥抗炎作用,从而对糖尿病小鼠生精功能损伤产生保护作用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤的药物中的用途,其特征在于:所述紫云英苷单次应用剂量为不引起中枢抑制的剂量。
3.根据权利要求2所述的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤的药物中的用途,其特征在于:所述紫云英苷单次应用剂量为3.3-30mg/kg。
4.根据权利要求3所述的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤的药物中的用途,其特征在于:所述紫云英苷单次应用剂量为10-30mg/kg。
5.根据权利要求4所述的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤的药物中的用途,其特征在于:所述紫云英苷单次应用剂量为30mg/kg。
6.根据权利要求1-5任一项所述的紫云英苷在制备治疗糖尿病性睾丸功能损伤的药物中的用途,其特征在于:所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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