CN110129258B - 一种含有紫云英苷的组合物及其应用 - Google Patents
一种含有紫云英苷的组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种改善人精子受精能力和顶体反应的含有紫云英苷的组合物,该组合物包括缓冲液和紫云英苷。对离体后纯化的人精子进行培养,除了维持精子运动还能显著提高正常人精子的受精能力和顶体反应,为改进辅助生育技术提供了有意义的参考。在缓冲液中加入紫云英苷,能够显著提高临床弱精子症患者精子的受精能力,在重度弱精子症时受精能力改善程度最为明显,并且使部分培养的精子受精能力达到正常精子受精能力范围,其中对重度弱精子症改善程度最为明显,同时,显著提高精子顶体反应。这充分说明紫云英苷的使用能够改善弱精症患者精子的受精能力低下。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有紫云英苷的组合物,具体涉及一种提高体外培养精子受精能力的组合物及其应用。
背景技术
世界卫生组织80年代中末期组织的一次有关不孕症调查表明,不孕率发达国家为5%~8%,发展中国家的某些地方甚至达到30%。据不完全统计,中国育龄夫妇中不孕症患者约占2%~6%,且还有逐渐增加的趋势。人类辅助生殖技术出现,逐步解决了困扰医学界多年的不孕不育难题,给无数家庭带来了喜悦。人类辅助生殖技术是指利用处理卵子、精子、受精卵以及胚胎以治愈不能怀孕症状的技术。目前主要包括宫内受精、体外受精-胚胎移植、人工授精、卵子体外成熟、卵胞浆单精子注射、卵子、精子以及胚胎冻融技术、移植前遗传学诊断等。然而,这些技术均涉及到精子的体外培养和操作,在体外培养和操作的过程中,维持甚至提高精子的功能对于提高辅助生殖的成功率有着重要的作用。
体外授精-胚胎移植技术 (in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)目前已广泛应用于不孕不育的治疗,其中胚胎培养对胚胎生长与妊娠结局有重要影响。早期胚胎的体外培养受许多因素的影响,主要影响因素有配子因素、控制性超促排卵方案及药物剂量、实验室操作环境、培养系统等。而培养液不同营养成分和pH值变化等可对配子、体外受精和胚胎培养结局产生不同影响。目前商品化的培养基主要有Vtrolife、Cook、Quinn’s 和 HTF等。目前已有比较各种商业化的成品培养基、半成品培养基和改良培养基对胚胎生长和妊娠结局影响的报道。IVF过程中存在受精失败的风险,尤其是在少弱精患者当中。提高受精能力培养基暂时还没有成熟产品。
精子的各种功能状态反应了精子的受精能力。精子活力是指精子群体运动状态与寿命长短,是反映精子质量的重要指标。精子活力的评价是研究精子生理特性、精子受精、精子保存等的基础。精子活力与受精率呈正相关,活力越高精子受精能力越强。目前,临床上主要依据精子浓度、活力、形态等参数来初步判断男性的生育能力。早有学者提出人类精子的顶体形态及功能与临床妊娠率相关。顶体是一个膜包裹的细胞器,储存着顶体反应的各种酶。顶体反应是精子与卵透明带结合之后,顶体破裂,释放一系列顶体酶的过程。顶体反应是受精的先决条件,只有完成顶体反应的精子才能与卵母细胞融合,实现受精。因此,本发明使用计算机辅助精液分析仪CASA,对精子活力进行评估;使用FITC-PSA染色对精子顶体的完整性进行评估,以精子活力和精子顶体反应作为评价精子受精能力的指标。
紫云英苷(Astragalin)是一种天然黄酮醇苷类化合物,具有利胆、利尿、抗氧化的的作用。研究发现菟丝子的水提取物具有抗氧自由基活性; 对羟自由基及超氧阴离子自由基均有良好的清除作用,可能抑制精子尾部膜脂质过氧化反应,可能对精子膜结构和功能起保护作用,菟丝子可能有益于治疗男性不育,并可能有助于提高人工授精的成功率。但是,由于菟丝子水提取物成分复杂,菟丝子水提物含有蒽醌、香豆素、黄酮、甙类、甾醇、鞣酸、糖类等,难以受到国际认可,因此,寻求成分单一、功效明确的化合物用于改善精子活力和提高人精子顶体反应是本领域需要解决的技术难题。
本发明公开了紫云英苷的新医药用途,还提供了一种含有紫云英苷的组合物及其应用。在缓冲液中加入紫云英苷,能够显著提高临床弱精子症患者精子的受精能力,尤其是重度弱精子症患者的精子受精能力改善程度最为明显,并且使部分培养的精子受精能力达到正常精子受精范围,同时,显著提高精子顶体反应。这充分说明紫云英苷的使用能够改善弱精症患者精子的受精能力低下的作用。因此开发一种能显著提高精子受精能力的含有紫云英苷的组合物,显著增加受精率、优质胚胎率和IVF成功率,具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是发现了紫云英苷的新医药用途。
本发明还提供了一种提高体外培养精子受精能力的含有紫云英苷的组合物及其应用,对不同运动能力的人类精子培养结果表明,精子顶体反应与运动能力均有显著的提高,即精子受精能力有显著提高。
一种含有紫云英苷的组合物,该组合物包括紫云英苷和缓冲液。
优选地,所述缓冲液是pH在7.0以上的多种缓冲溶液:磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硫酸钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液、hepes缓冲溶液等,也可以是商品化的IVF培养基。
优选地,所述缓冲液由以下组分组成:NaCl,NaHCO3,KCl,MgSO4·7(H2O),KH2PO4,丙酮酸钠,乳酸钠和CaCl2·2(H2O)。
优选地,每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成:5.5-6.0gNaCl, 2.0-2.5gNaHCO3, 0.3-0.4gKCl, 0.04-0.06g MgSO4·7(H2O), 0.04-0.06g KH2PO4,0.035-0.04g丙酮酸钠,3.8-4.0g乳酸钠,0.28-0.35g CaCl2·2(H2O)和0.045g/L的紫云英苷,余量用超纯水定容至1000mL。
本发明也公开了含有紫云英苷的组合物在制备提高精子活力和提高人精子顶体反应的人精液保护剂中的应用。
本发明公开了含有紫云英苷的组合物在制备提高弱精子症患者的精子活力的人精液保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提高精子活力和提高人精子顶体反应的人精液保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提高弱精子症患者的精子活力的人精液保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提供弱精子症患者的精子活力的IVF培养基中的应用。体外受精时,弱精子症患者IVF体外受精可能失败。因此,在IVF培养基中加入紫云英苷提高IVF时受精率。
本发明公开了紫云英苷在制备提高精子活力和提高人精子顶体反应的药物中的应用。
优选地,添加紫云英苷的组合物培养时间在1-3h。
优选地,所用精子为离体之后去除精浆的人精子。
有益效果:
1.本发明改善人精子受精能力的一种添加紫云英苷的组合物,所述中药单体是紫云英苷,在缓冲液中添加紫云英苷,对离体后的人精子进行培养,能够改善精子顶体反应与运动能力继而显著提高人精子受精能力,为改进辅助生育技术提供了有意义的参考,可有有效的降低IVF过程中受精失败的风险,提高IVF成功率。
2.本发明中的紫云英苷是直接用缓冲液进行稀释和培养的,不涉及乙醇等有机溶剂,避免了乙醇对精子的毒害作用。
3.本发明中,在缓冲液中加入的紫云英苷,能够显著提高临床弱精子症患者精子的受精能力,在重度弱精子症时受精能力改善最为明显,并且使部分培养的精子受精能力达到正常精子受精能力范围,其中对重度弱精子症改善程度最为明显,同时精子的顶体反应也有显著提高。这充分说明紫云英苷的使用具有改善弱精子症患者精子受精能力低下的作用。
与现有技术相比,本发明将紫云英苷添加到缓冲液中并筛选出紫云英苷与缓冲液的配比关系,制备出性能优异的组合物,该组合物可以有效改善精子活力,提高精子顶体反应。该组合物能够显著提高临床弱精子症患者精子的受精能力,在重度弱精子症时受精能力改善最为明显,并且使部分培养的精子受精能力达到正常精子受精能力范围,其中对重度弱精子症改善程度最为明显。
本发明还发现了紫云英苷的新医药用途,即紫云英苷可以有效改善精子活力,提高精子顶体反应,能显著提高临床弱精子症患者精子的受精能力,其中对重度弱精子症改善程度最为明显。
附图说明
图1是F10-含有紫云英苷的组合物对重度弱精子症的精子活力的作用图
图2是F10-含有紫云英苷的组合物对轻度弱精子症的精子活力的作用图
图3是 F10-含有紫云英苷的组合物对正常精子的精子活力的作用图
图4是F10-含有紫云英苷的组合物对不同运动能力的精子顶体反应的作用图
图示说明:X-轴是缓冲液(C)和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物;Y-轴是精子的活力(Progressive motility,以百分比计数)和精子顶体反应(Acrosomereaction, 以百分比计数)。*表示p< 0.05,F10-含有紫云英苷的组合物培养后的精子活力与缓冲液相比,有显著性差异,具有统计学意义。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应该理解为本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均购于上海榕柏生物技术有限公司。
实施例1 F10-含有紫云英苷的组合物对重度弱精子症的精子活动力的提高效果评估
样品制备
选择重度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精,用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样本水浴保持22-33℃,液化后的精液,根据WHO1999年的评价标准,使用电脑辅助精液分析仪CASA,对精子参数(体积,精子计数,活力和运动特性的百分比)进行评估。弱精子症被定义为A级精子数目<25%或A+B<50%,(世界卫生组织,1999年),而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱精子症精子的运动参数为(a+b)级<25%,其中a级精子<5%。
2.精子体外培养
(1)密度梯度离心从精液当中分选精子
在试管内放置1mL 60% (v/v)的Percoll分离液,在其上铺上1mL -1.5mL的精液,300g的离心力下离心5-10分钟,弃去上清液。重悬精子悬液于2mL HTF-S培养液,300g离心5-10分钟,重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到各种精子培养液中。
(2)精子培养
合适数量的精子(5×106左右)转移到各种精子培养液中之后,置于37℃,5%CO2的培养箱中1-3小时。
组分 | g/L |
NaCl | 5.9 |
NaHCO<sub>3</sub> | 2.1 |
KCl | 0.35 |
MgSO<sub>4</sub>7(H<sub>2</sub>O) | 0.05 |
KH<sub>2</sub>PO4 | 0.05 |
丙酮酸钠 | 0.036 |
乳酸钠 | 3.998 |
CaCl<sub>2</sub>2(H<sub>2</sub>O) | 0.294 |
紫云英苷 | 0.045 |
3.精子活动力检测
根据WHO1999年的评价标准,使用计算机辅助精液分析仪CASA,对精子活力进行评估。对于每个标本,选取6-10个视野,计数到的精子数目不小于500个。
最终结果:本发明中重度弱精子症患者的精子样本分别在对照组-F10缓冲液(C)和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后,测定精子活力发现,在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的精子活力均显著高于对照组,这表明在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高重度弱精子症的精子活力,这也表明F10-含有紫云英苷的组合物中的精子受精能力要显著高于对照组(图1)。
实施例2 F10-含有紫云英苷的组合物对中轻度弱精子症的精子活动力的提高效果评估
1. 样品准备
选择中轻度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精,用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样本水浴保持22-33℃,液化后的精液,根据WHO1999年的评价标准,使用电脑辅助精液分析仪CASA,对精子参数(体积,精子计数,活力和运动特性的百分比)进行评估。弱精子症被定义为A级精子数目<25%或A+B<50%,(世界卫生组织,1999年),而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱精子症精子的运动参数为(a+b)级<25%,其中a级精子<5%。
2. 精子体外培养
(1)密度梯度离心从精液当中分选精子。
在试管内放置1mL 60%(v/v)的Percoll分离液,在其上铺上1mL -1.5mL的精液,300g的离心力下离心5-10分钟,弃去上清液。重悬精子悬液于2mL HTF-S培养液,300g离心5-10分钟,重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到各种精子培养液中。
(2)精子培养
合适数量的精子(5×106左右)转移到各种精子培养液中之后,置于37℃,5%CO2的培养箱中1-3小时。
3. 精子活动力的检测
根据WHO1999年的评价标准,使用计算机辅助精液分析仪CASA,对精子活力进行评估。对于每个标本,选取6-10个视野,计数到的精子数目不小于500个。
最终结果:本发明中轻度弱精子症患者的精子样本分别在对照组-F10缓冲液(C)和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后,测定精子活力发现,在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高中轻度弱精子症的精子活力,在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的精子活力均高于对照组,尤其是在浓度为10-4 的培养液的精子活力显著高于对照组,表明F10-含有紫云英苷的组合物中的精子受精能力要显著高于对照组(图2)。
实施例3 F10-含有紫云英苷的组合物对正常精子的精子活动力的提高效果评估
1. 样品准备
选择健康男性捐赠的正常精子样本进行实验。手淫法排精,用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样本水浴保持22-33℃,液化后的精液,根据WHO1999年的评价标准,使用电脑辅助精液分析仪CASA,对精子参数(体积,精子计数,活力和运动特性的百分比)进行评估。弱精子症被定义为A级精子数目<25%或A+B<50%,(世界卫生组织,1999年),而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱精子症精子的运动参数为(a+b)级<25%,其中a级精子<5%。
2. 精子体外培养
(1)密度梯度离心从精液当中分选精子
在试管内放置1mL 60% (v/v)的Percoll分离液,在其上铺上1mL -1.5mL的精液,300g的离心力下离心5-10分钟,弃去上清液。重悬精子悬液于2mL HTF-S培养液,300g离心5-10分钟,重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到各种精子培养液中。
(2)精子培养
合适数量的精子(5×106左右)转移到各种精子培养液中之后,置于37℃,5%CO2的培养箱中1-3小时。
3. 精子活动力的检测
根据WHO1999年的评价标准,使用计算机辅助精液分析仪CASA,对精子活力进行评估。对于每个标本,选取6-10个视野,计数到的精子数目不小于500个。
最终结果:本发明正常的精子样本分别在对照组-F10缓冲液(C)和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后,测定精子活力发现:在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高正常精子的精子活力,在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的精子活力均高于对照组(图3)。
实施例4 F10-含有紫云英苷的组合物对精子顶体反应的提高效果评估
用FITC-PSA染色来评估精子顶体的完整性。各类精子在不同浓度的培养液中处理后经过干燥、固定等步骤,用FITC-PSA染色,通过在荧光显微镜下观察精子的染色情况来观察F10-含有紫云英苷的组合物对精子顶体结构的影响。
1. 样品收集
将上述培养后得到的重度弱精子症患者的精子样本、中轻度弱精子症患者的精子样本以及正常精子样本收集合适数量。
2. 简单的精子洗涤
充分混匀精液标本,取0.2ml,用0.9% 的氯化钠溶液稀释至10ml。
以800g 离心10 分钟,弃去上清液,仅留下20~40μl 上清液。轻柔吹打,将精子沉淀团重悬于留下的上清液中。重复以上精子洗涤操作步骤。
3. 已纯化精子的处理
用生理盐水将上游后或经过一次密度梯度离心的精子悬液稀释至10ml。以800g离心10分钟。弃去上清液,仅留下20~40μl上清液。轻柔吹打,将精子沉淀团重悬于留下的上清液中。
4. 精子涂片制备
取5μl 精子悬液,制成约1cm长的精子涂片,共做2张重复涂片。在400倍相差显微镜下观察湿涂片。确保精子均匀分布在玻片上,不聚集。空气中干燥玻片。95%(v/v)乙醇固定30分钟。空气中干燥玻片。
5. PSA-FITC 染色
加10ml PSA-FITC 工作液到垂直染色缸中。将已固定并空气干燥的涂片浸在PSA-FITC 荧光染料中。4℃,染色1小时以上。用纯净水洗涤每张玻片,并且用可溶于乙醇的封片剂封片。
6. 结果评估
用450~490nm激发光,于400倍油镜下观察精子涂片。精子分类如下:
顶体完整(acrosome-intact,AI):精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀;已发生顶体反应(acrosome-reacted,AR):精子仅在赤道带出现荧光带,或者顶体区根本没有荧光染色;顶体异常:除上述两类精子外的所有其他精子。
7. 已发生顶体反应精子的计数
借助实验室计数器,计数每种顶体类型精子(AI 和AR)的数目。每张涂片计数200个精子,以达到可接受的低取样误差。计算2 张重复涂片已发生顶体反应精子百分率的平均值和差异。根据WHO(第5版)来确定差异的可接受性(每个数值显示,预期发生在95%的标本中,仅由于取样误差所致的两个百分率之间的最大差异)。如果两个百分率之间的差异是可接受的,报告已发生顶体反应精子的平均百分率。如果差异太大,则重新评估两张涂片。以最接近的整数报告已发生顶体反应精子百分率。
实验结果表明:本发明正常的精子样本分别在对照组-F10缓冲液(C)和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后,对已发生顶体反应精子进行计数发现:在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高正常精子的顶体反应,在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的精子发生顶体反应的精子数目均高于对照组(图4)。
Claims (5)
1.一种含有紫云英苷的组合物在制备提高精子活力的人精液保护剂中的应用,所述组合物包括紫云英苷和缓冲液,紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
2.如权利要求1所述的一种含有紫云英苷的组合物在制备提高精子活力的人精液保护剂中的应用,其特征在于,每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成:5.5-6.0g NaCl,2.0-2.5g NaHCO3,0.3-0.4g KCl,0.04-0.06g MgSO4·7(H2O),0.04-0.06g KH2PO4,0.035-0.04g丙酮酸钠,3.8-4.0g乳酸钠,0.28-0.35g CaCl2·2(H2O);所述紫云英苷的浓度为0.045g/L。
3.一种含有紫云英苷的组合物在制备提高弱精症患者的精子活力的人精液保护剂中的应用,所述组合物包括紫云英苷和缓冲液,紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
4.如权利要求3所述的一种含有紫云英苷的组合物在制备提高精子活力的人精液保护剂中的应用,其特征在于,每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成:5.5-6.0g NaCl,2.0-2.5g NaHCO3,0.3-0.4g KCl,0.04-0.06g MgSO4·7(H2O),0.04-0.06g KH2PO4,0.035-0.04g丙酮酸钠,3.8-4.0g乳酸钠,0.28-0.35g CaCl2·2(H2O);所述紫云英苷的浓度为0.045g/L。
5.紫云英苷在制备提高弱精子症患者的精子活力的体外受精IVF培养基中的应用,所述紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
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