CN117159526A - 鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途。实验结果表明，鼠尾草酸能显著提高精子数量及活力；能显著抑制睾丸内部RANKL介导的细胞凋亡通路，对生精功能障碍小鼠具有保护作用。

Description

鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途

技术领域

本申请属于生殖系统疾病领域，具体地，本申请提供了鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途。

背景技术

近些年来全球老龄化现象严重，不孕不育俨然成为国际的研究热点。研究发现，在不孕不育患者中，男性不育发病率逐年增高，比重逐渐增加。男性不育症主要包括生精功能障碍、性功能障碍、内分泌紊乱及睾丸组织损伤。临床上不育患者中，大部分患者表现为睾丸生精功障碍(Testicular spermatogenic dysfunction)。生精功能障碍是指因各种原因导致睾丸内生精上皮生精能力下降，生精细胞部分或全部发育阻滞，表现为少精子或无精子，是导致男性不育的重要病因。睾丸生精功障碍病因复杂，且往往不是由单一因素所致，其主要与药物、环境、遗传、内分泌、感染、疾病及生活方式有关。目前临床上治疗生精功能障碍的方法有手术治疗、辅助生殖技术及药物治疗。辅助生殖技术(AssistedReproductive Technology，ART)ART技术主要面向较多大龄和常年不育妇女，包括部分严重无精症男性患者，虽然为生精功能障碍的患者提供了生育的可能，但其成功率仍然较低，子代畸形率较高，价格昂贵，普通家庭难以承担。手术治疗主要针对精道阻塞、睾丸病变及睾丸位置不正常等患者，治疗面较窄。临床治疗药物种类较多，主要有雄激素(睾丸酮，长期使用会导致睾丸萎缩)、抗雌激素药物(克罗米芬，长期使用可出现视力障碍)及抗氧化药物(左卡尼汀引起胃肠反应，长期使用维生素E可引起恶心，眩晕，视力模糊等)。药物治疗对患者具有一定的积极治疗作用，一定程度上改善了患者的生活，但改善精子质量及男性生育力依旧有限，甚至部分药物副作用较多，具有局限性。因为其多为经验性治疗，疗效欠佳的同时一些药物临床疗效还存在争议。因此，研发针对性强、疗效好、毒性低的治疗生精功能障碍的药物具有重大的社会价值和研究意义。

迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)又被称为艾菊，属双子叶植物纲唇形科迷迭香属灌木。在我国，迷迭香记载最早见于《本草拾遗》。迷迭香的主要需求来自食品工业和医药、化妆品领域、医药领域的需求约占全球迷迭香总需求量的14％。研究表明，迷迭香具有抗菌、抗艾滋病、抗肿瘤、抗肝炎，及抗氧化、降血脂、抗炎镇痛、免疫调节、防腐、抗血栓等作用。2019年，夏俊等人发现，在给予肥胖大鼠有氧运动联合迷迭香给药治疗后，可以改善大鼠睾丸损伤以及改善大鼠精子质量，陈美杰等人同时发现在给予猪精液丹参素及迷迭香酸之后，可以显著改善精液常温保存效果。Tousson E发现迷迭香提取物可以改善依托泊苷诱导的生精功能障碍大鼠的生育能力以及精子质量，降低精子DNA碎片指数，改善生精细胞的增殖情况。鼠尾草酸是迷迭香中的二萜类主要生物活性成分，具有抗凋亡、抗炎症、抗氧化等较好的生物活性作用，具有良好的脂溶性。Gungor Sukru等人发现，鼠尾草酸可以改善冷冻解冻山羊精子的质量。因此将其发展为治疗生精功能障碍药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对鼠尾草酸的药理作用研究，发现鼠尾草酸能提高生精功能障碍小鼠模型的精子数量、活力及生殖器官脏器系数，从而提供鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途。

一方面，本发明提供了鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途，所述鼠尾草酸的结构式如式(1)所示：

进一步地，所述药物中鼠尾草酸为唯一活性成分。

进一步地，所述生精功能障碍为生精功能损伤。

进一步地，所述生精功能障碍为精子数量和活力低下并精子畸形，或睾丸组织中的RANKL介导的细胞凋亡。

进一步地，所述药物为注射或者口服剂型；优选剂型为片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂；特别优选口服剂型。

进一步地，所述药物中包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂；优选辅料/赋形剂剂选自溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂中的一种或多种；特别优选用于口服剂型的辅料。

另一方面，本发明提供了增强生精功能和精子活力的非治疗方法，包括施用鼠尾草酸。

进一步地，鼠尾草酸单次应用剂量为2.5-5mg/kg。

进一步地，鼠尾草酸单次应用剂量为5-10mg/kg。

进一步地，鼠尾草酸单次应用剂量为10mg/kg。

本申请中的非治疗方法包括但不限于保健方法以及科学研究方法，实施对象可以为人或其他哺乳动物如鼠、兔、犬等。

本申请中生精功能障碍的症状或指症包括但不限于生精功能损伤、精子数量和活力低下和精子畸形，睾丸组织中的RANKL介导的细胞凋亡途径。

本申请的可用的药物剂型包括各种注射和口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂、透皮给药制剂，特别优选口服剂型。

除鼠尾草酸外，本申请中所述的药物还可以包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等，特别优选可用于口服剂型的各种辅料/赋形剂。

本发明的药物中可以包含其他治疗生精功能障碍的中西药药物或保健品，或者本发明的药物可以与这些中西药药物或保健品或手术等治疗手段联合使用。所述中西药药物或保健品包括但不限于抗感染药物、促性腺激素类药物、抗氧化剂类药物、能量代谢和血液循环改善剂。

本发明提供的鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途具有以下有益效果：

(1)鼠尾草酸能显著提高精子数量及活力；

(2)鼠尾草酸能抑制睾丸内部的的RANKL介导的细胞凋亡通路中的RANKL蛋白的表达以及升高睾丸组织中的Cleaved-Caspase3蛋白表达，改善生精功能障碍。

本发明首次证实，鼠尾草酸具有治疗生精功能障碍小鼠的作用，可用于制备生精功能障碍的治疗药物，为此类药物提供了一种新的选择。

附图说明

图1为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠精子参数的影响图；A：精子数量(个)；B：精子活率(％)；C：精子活力(％)；D：日生精量(％)；E：精子畸形率(％)；结果以Mean±SEM(n＝10)表示，^***p<0.001与正常组比较,^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001，与模型组比较。

图2为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠精子DNA碎片指数的影响。结果以Mean±SEM(n＝8)表示，^***p<0.001与正常组比较,^##p<0.01,^###p<0.001，与模型组比较。

图3为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠血清性激素的影响。结果以Mean±SEM(n＝8)表示，^**p<0.01与正常组比较,^#p<0.05,^##p<0.01，与模型组比较。

图4为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠组织形态的影响图：A-F:小鼠睾丸曲细精管HE染色代表性图像；G:睾丸约翰评分统计图；A:空白对照组；B:模型组；C:模型+左卡尼汀组组，D:模型+鼠尾草酸2.5mg/kg组，E:模型+鼠尾草酸5mg/kg组，F:模型+鼠尾草酸10mg/kg组，结果以mean±SEM(n＝6)表示.^***p<0.001表示与正常组比较,^###p<0.001表示与模型组比较。

图5为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠精子发生过程的影响图。

图6为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠睾丸组织中RANKL,Cleaved-Caspase3蛋白表达水平的影响图：A：不同组睾丸组织中RANKL,Cleaved-Caspase3的代表性蛋白质印迹分析图；B：RANKL,Cleaved-Caspase3蛋白表达统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.^**p<0.01表示与正常组比较,^#p<0.05,^##p<0.01表示与模型组比较。

图7为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠睾丸组织中细胞凋亡率的影响图：A：鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠睾丸组织TUNEL荧光染色代表性图像；B：阳性细胞数量统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.^***p<0.001表示与正常组比较,^###p<0.001表示与模型组比较。

图8为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠睾丸组织中RANKL阳性细胞数的影响图：A：鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠睾丸组织中RANKL免疫组化代表性图像；B：阳性细胞数量统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.^***p<0.001表示与正常组比较,^###p<0.001表示与模型组比较。

图9为鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠精母细胞线粒体的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的鼠尾草酸均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。

实施例1

鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途，其中，鼠尾草酸单次应用剂量为小鼠2.5mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例2

鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途，其中，鼠尾草酸单次应用剂量为小鼠5mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例3

鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途，其中，鼠尾草酸单次应用剂量为小鼠10mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

体重23-27g之间的SPF级ICR雄性成年小鼠，宁夏医科大学实验动物中心繁殖(动物孵育合格批号：SCXK(宁)2020-0001)。动物饲养参照实验动物饲养标准，饲养房12h人工控制昼夜交替，小鼠自由饮水。

1.2实验药品及仪器

本实验中会涉及到的主要药品和试剂包括：鼠尾草酸(购自上海源叶生物公司，纯度≥98％)；左卡尼汀(购自美国Alfasigma公司)；环磷酰胺(购自江苏盛迪医药有限公司)；生理盐水(购自天津大茂化学试剂厂)；吖啶橙(北京索莱宝生物科技有限公司)；β-actin山羊抗兔和FITC山羊抗兔(购自美国proteintech公司)；兔抗RANKL(购自美国proteintech公司)；兔抗Cleaved-Caspase3(购自美国proteintech公司)；DAPI(购自北京中杉金桥生物科技公司)；全蛋白提取试剂盒(购自南京凯基生物公司)；全蛋白定量试剂盒(购自南京凯基生物公司)；脱脂奶粉(购自北京索莱宝科技公司)；PVDF膜(购自美国Millipore公司)；ECL发光液(购自Advansta公司)；Marker(10-180KDa)(购自Thermo fisher)；动物睾丸组织固定液(购自Servicebio有限公司)；TUNEL染色试剂盒(购自中国碧云天有限公司)。

本实验中会涉及到的主要仪器包括：迈朗精子分析仪(购自南宁松景天伦生物科技有限公司)；精子计数板(购自南宁松景天伦生物科技有限公司)；酶标仪(购自Thermoscientific)；电热恒温水浴锅(购自上海精密实验设备有限公司)；全自动样品冷冻研磨仪(购自上海净信科技有限公司)；SDS-PAGE电泳仪(购自美国Bio-RAD公司)；可见荧光成像仪(购自美国Auzre Biosystems)；电热恒温鼓风干燥箱(购自上海琅玕实验设备有限公司)；荧光显微镜(OLYMPUS)；光学显微镜(OLYMPUS)；电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(德国Eppendorf)。

1.3实验动物分组及给药

体重24-28g之间的雄性成年ICR小鼠清洁级饲养间适应性喂养3天后，按体重梯度抽样法将其平均分至对照组、模型组、左卡尼汀组和鼠尾草酸2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组。各组动物除正常饲养外，模型组腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)120mg/kg，每周一次，持续四周。即构建雄性小鼠生精功能障碍模型。左卡尼汀组给予左卡尼汀(3.03ml/kg)灌胃，鼠尾草酸2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg组给予鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)灌胃，每组15只。左卡尼汀组和鼠尾草酸各给药剂量组于每天上午固定时间点连续给药4周，对照组和模型组小鼠均给予相同容量的生理盐水，其余实验条件相同。

二、实验过程

(一)脏器系数测定

1.1实验方法：

最后一次给药24h后称重并记录各组小鼠体重。实验结束后，处死小鼠，用手术剪迅速剪开小鼠腹部，充分暴露双侧睾丸，除去周围的脂肪组织及结缔组织，取出睾丸和附睾，吸干表面的血液后用电子天平准确称取其重量。

1.2实验结果：

结果如表1所示，模型组小鼠生殖器官睾丸，附睾和精囊腺的脏器系数与正常组相比显著下降(p<0.001)。给予鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)治疗的小鼠生殖器官的脏器系数比显著增加(p<0.001)，左卡尼汀治疗组也显著增加了生殖器官的脏器系数比(p<0.001)。提示鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠生殖器官有一定的改善作用。

表1鼠尾草酸对生精功能障碍小鼠生殖器官脏器系数的影响

^***p<0.001与正常组比较,^###p<0.001与模型组比较

(二)精子参数测定

2.1实验方法：

小鼠处死后快速取出一侧附睾，剪下附睾尾。用解剖剪将附睾剪碎在含1ml的生理盐水的EP管(提前预热到37℃)中，37℃孵育5分钟后用200目尼龙网缓缓过滤得精子原液，轻轻吹打混匀，所得的精子混悬液混匀后取10μL滴加于精子技术板上，使用精子分析仪分析精子数量，精子活率，精子活力，精子畸形率，日生精量等参数。

2.2实验结果：

精子参数结果如图1显示，模型组小鼠精子数量、精子活力、精子活率及日生精量与正常组相比显著下降(p<0.001)，精子畸形率显著上升(p<0.001)，而给予鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)和左卡尼汀治疗组治疗后，小鼠精子数量、精子活力、精子活率及日生精量与模型组相比显著提高(p<0.05，p<0.01，p<0.001)(图1)，精子畸形率显著降低(p<0.001)，提示鼠尾草酸对于生精功能障碍小鼠的精子质量有很好的保护作用。

(三)精子DNA损伤的变化

3.1实验方法：

吖啶橙以1mg/mL的浓度溶于蒸馏水中。总共将10μL该溶液放在预热(约70℃)的清洁载玻片上，通过来回移动玻璃棒并风干铺展。涂有吖啶橙的载玻片在室温下储存。然后，将上述精子原液轻轻滴到载玻片上，用盖玻片覆盖，并放入有一层湿纸的培养皿中，静置2小时，让精子沉淀并使染色最大化，于荧光显微镜下观片、采片。

3.2实验结果

精子DNA碎片指数结果如图2显示，模型组小鼠精子DNA碎片指数与正常组相比显著上升(p<0.001)，而给予鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)治疗后，小鼠精子DNA碎片指数与模型组相比显著降低(p<0.01，p<0.001)，提示鼠尾草酸对于生精功能障碍小鼠的精子DNA损伤有很好的保护作用。

(四)小鼠血清中性激素的检测

4.1实验方法：

实验操作时，取小鼠采用眼球取血法取血至EP管中，室温自然凝固2小时，4000r/min离心15min，小心收集上清，取血清分装保存备用。之后采用ELISA法测定小鼠血清中T、LH、FSH含量。

4.2实验结果：

小鼠血清性激素水平结果如图显示，模型组小鼠T、LH水平与正常组相比显著下降(p<0.05、p<0.01)，FSH水平与正常组相比显著上升(p<0.05)，而给予左卡尼汀(3.03ml/kg)及鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)治疗后，小鼠T、LH水平与正常组相比显著上升(p<0.05)，FSH水平与模型组相比显著降低(p<0.05)，提示鼠尾草酸对于生精功能障碍小鼠的性激素紊乱一定的改善作用(见图3)。

(五)睾丸组织病理结构的检测

5.1实验方法：

实验结束后，处死小鼠，用手术剪迅速剪开小鼠腹部，充分暴露双侧睾丸，除去周围的脂肪组织及结缔组织，取出睾丸，将其浸泡在动物睾丸组织固定液中，送至里来生物科技有限公司进行H.E染色及切白片。

5.2实验结果：

5.2.1睾丸组织结构

睾丸组织进行H.E染色可以看出，对照组小鼠曲细精管形态完整，管腔内可见大量密集成熟精子，各级生精细胞排列整齐(见图4A)。模型组睾丸曲细精管萎缩，管腔直径表变小，各级生精细胞排列紊乱，发育停滞，间质组织脱落严重，管腔内精子数量减少或无，整个精子发生过程明显受到抑制(见图4B)。给予左卡尼汀(3.03mL/kg)及鼠尾草酸(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)治疗后，与模型组相比，在镜下观察到曲细精管形态逐渐恢复正常，管腔中可见不同时期的生精细胞，排列紧密(见图4C、D、E、F)。约翰评分统计图(见图4G)。

5.2.2精子发生过程

如图所示，正常精子发生过程分为早、中、晚三大期，分为变形精子细胞形成的早期(IX-XII期)，变形精子细胞形成的中期(I-VI期)，精子释放期(VI-VIII)；模型组中，管腔内第VIII期精子数量明显减少，表明精子发生过程明显受阻，在精子发生过程早期(XI-XII期)，精母细胞减少发生脱落；在精子发生中期(IV-V)，依然可见精母脱落情况，精子细胞较少明显；环磷酰胺影响整个精子发生过程，其主要影响精子形成过程的中后期精母细胞的分化，在给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗之后，生精过程明显得到恢复，精母细胞脱落情况明显改善(见图5)。

(六)Western blot检测小鼠睾丸组织RANKL、Cleaved-Caspase3蛋白的表达

6.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将硝酸纤维素膜(PVDF膜)进行湿法转膜。转膜结束后将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭2h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗RANKL(1:1000)、Cleaved-Caspase3(1:800)，4℃过夜，洗膜孵育二抗2h。用PBST洗膜3次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)进行曝光。采用Image J图像分析软件计算目标蛋白的灰度值，并利用相对应的内参灰度值校正误差。

6.2实验结果：

如图6所示，与正常对照组比较，模型组睾丸中RANKL、Cleaved-Caspase3蛋白表达明显增多(p<0.01)；鼠尾草酸(10mg/kg)组小鼠睾丸组织RANKL、Cleaved-Caspase3蛋白表达与模型组比较明显减少(p<0.01、p<0.05)；提示鼠尾草酸的保护作用可能通过RANKL、Cleaved-Caspase3蛋白的表达与活化，对生精功能障碍小鼠产生保护作用。

(七)TUNEL染色检测小鼠睾丸生精细胞的凋亡情况

7.1实验方法：

1.组织切片在65℃烘箱中烤组织切片1小时30分钟；2.脱蜡水化：①二甲苯Ⅱ:20min；②二甲苯Ⅰ:10min；③无水乙醇Ⅰ：15分钟；④无水乙醇Ⅱ：10分钟；⑤95％乙醇：5分钟；⑥80％乙醇：5分钟；⑦70％乙醇：5分钟；⑧50％乙醇：5分钟；⑨蒸馏水：洗涤2分钟；3.将洗好的切片放入0.85％的生理盐水(85ml 0.9％生理盐水+5ml蒸馏水)中浸泡5min。4.抗原修复：将切片置入预先用微波炉煮沸好的0.01％的柠檬酸钠溶液中(PH＝6.0)，煮15min；浸泡后用PBS清洗3×5min。5.之后滴加400μg/mL不含DNase的蛋白酶K(100mg/mL)，用碧云天免疫染色洗涤液稀释为100μg/mL的蛋白酶K，50℃反应10min；自行使用自封袋覆盖在滴加蛋白酶K检测液上防止其蒸发。PBS洗涤片子三次，每次5min。6.避光加入TUNEL反应液37℃避光反应60min。自行使用自封袋覆盖在滴加TUNEL检测液上防止其蒸发。7.PBS洗涤3次，每次5min，每张片子滴加一滴含DAPI的封片剂；

7.2实验结果：

与正常组相比，模型组中睾丸细胞凋亡数量显著增加，在给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗后，睾丸内细胞凋亡数量显著降低，且凋亡主要发生在精母细胞；通过统计TUNEL阳性细胞数结果表明，模型组小鼠TUNEL阳性细胞数与正常组相比显著上升(p<0.001)，而给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗后，小鼠TUNEL阳性细胞数与模型组相比显著降低(p<0.001)，提示鼠尾草酸对于生精功能障碍小鼠睾丸内精母细胞凋亡具有较好的保护作用(见图7)。

(八)免疫组化检测小鼠睾丸生精细胞的中RANKL表达情况

8.1实验方法：

将石蜡切片置入65℃恒温烘箱中烤片2-3小时至石蜡层充分融化；待在组织切片的表明见到肉眼可见的融化的液滴时，将组织切片分别放入盛有二甲苯溶液I和溶液II的容器中，各放置10分钟，浸烯脱蜡；将切片依次置入100％，95％，80％，75％的梯度酒精中各浸泡5分钟，然后使用缓冲液PBS溶液浸洗切片3分钟/次，共两次；每张切片组织上滴加2-3滴新鲜配制的3％过氧化氢溶液(30％H₂O₂ 0.3ml+2.7mLddH2O)消除内源性过氧化物酶活性，室温避光封闭10-20分钟(湿盒)，甩干切片后置入PBS缓冲液漂洗5分钟×2次。切片置入预先用微波炉煮沸好的0.01％的柠檬酸钠溶液中(PH＝6.0)，煮15min；整体取出加热容器放置于室温环境内待其自然冷却(20分钟后可以冷水冲洗容器加快降温)，然后用PBS缓冲液漂洗5分钟×2次。取出充分冷却后的切片甩干，每张切片滴加2-3滴山羊血清封闭液，37℃或室温条件下封闭20-30min，倾去勿洗；根据试剂说明每张片子滴加50-100μL稀释至一定浓度的一抗，然后将切片放入4℃冰箱中过夜；过夜孵育后，在室温下，将切片复温30min，然后用PBS缓冲液额漂洗切片，10分钟/次，共洗涤3次，甩干切片组织上多余液体并用试纸擦净组织周围区域，每张切片滴加50-100μL生物素标记的二抗，湿盒中室温孵育30-60min。PBS缓冲液漂洗5分钟共三次。滴加辣根酶标记链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液2-3滴置室温孵育30min；PBS缓冲液漂洗5分钟共4次；甩干切片组织后滴加适量约100μL新鲜配制好的显色液到切片上，然后将切片放到显微镜下，观察显色情况，根据切片组织的显色情况，对显色时间做出适当调整，显色时间一般为10min左右(注意：DAB显色液应该现用现配制，方法为：避光条件下在1mL双蒸水中分别各加入试剂A一滴，然后加入B试剂一滴，最后加入试剂C溶液一滴)显色完全后，自来水下冲洗2分钟终止显色；滴加2-3滴苏木素染色液复染2-5分钟；PBS浸洗反蓝60-90秒，自来水缓慢冲洗5分钟；依次置入梯度乙醇溶液中浸洗，(75％-80％-95％-100％)，各放置2分钟，之后置入二甲苯溶液I、II中各放置5分钟；通风橱风干后，中性树脂封片显微镜下观察染色形态，染色特征，判断阳性表达情况。

8.2实验结果：

与正常组相比，模型组睾丸中RANKL阳性细胞数显著增加，在给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗后，睾丸内RANKL阳性细胞数显著降低，且RANKL蛋白主要表达在精母细胞；通过统计RANKL阳性细胞数结果表明，模型组小鼠RANKL阳性细胞数与正常组相比显著上升(p<0.001)，而给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗后，小鼠RANKL阳性细胞数与模型组相比显著降低(p<0.001)，提示鼠尾草酸对于生精功能障碍小鼠睾丸内RANKL蛋白具有调控作用(见图8)。

(九)透射电镜观察小鼠精母细胞的线粒体的损伤情况

9.1实验方法：

将实验小鼠处死后，快速分离出睾丸，取出睾丸组织在盛有生理盐水的皿中漂洗3次，主要是洗干净其表面的血液和鼠毛。睾丸组织固定将洗干净的睾丸组织切成大块置于含有2％戊二醛溶液的小瓶子中4℃固定30min。待睾丸组织快慢慢变硬后，再将其修成体积大约为1x1x1cm ³的小块，且修块时尽量保持睾丸组织白膜的完整性。随后置于固定液中4℃固定2h。然后放入二甲砷酸钠缓冲液中，每2h换1次缓冲液，共3次，再用锇酸浸泡2h，二甲砷酸钠缓冲液洗3次，每次15min。送至Servicebio有限公司进行电镜下观察睾丸组织精母细胞超微结构的变化，并拍片。

9.2实验结果：

与正常组相比，同等倍数下模型组精母细胞线粒体明显肿胀，数量减少，染色质凝集固缩成月牙状，在给予鼠尾草酸(10mg/kg)治疗后，精母细胞线粒体肿胀恢复，数量增加，染色质凝集现象减少；提示鼠尾草酸可能通过改善精母细胞内线粒体凋亡途径改善小鼠生精功能障碍(见图9)。

Claims (12)

1.鼠尾草酸在制备治疗生精功能障碍药物中的用途，所述鼠尾草酸的结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物中鼠尾草酸为唯一活性成分。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述生精功能障碍为生精功能损伤。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述生精功能障碍为精子数量和活力低下并精子畸形，或睾丸组织中的RANKL介导的细胞凋亡。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述药物为注射或者口服剂型。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物为片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述药物中包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述辅料/赋形剂剂选自溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂中的一种或多种。

9.增强对象生精功能和精子活力的非治疗方法，包括对对象施用鼠尾草酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中鼠尾草酸单次应用剂量为2.5-5mg/kg。

11.根据权利要求9所述的方法，其中鼠尾草酸单次应用剂量为5-10mg/kg。

12.根据权利要求11所述的方法，其中鼠尾草酸单次应用剂量为10mg/kg。