CN110613851A - 二至方在制备防治良性前列腺增生症的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中医药领域，涉及二至方在制备防治良性前列腺增生症的药物中的用途。具体地，本发明涉及包含女贞子和墨旱莲的组合物或该组合物的提取物在制备选自如下的药物中的用途：(1)治疗和/或预防良性前列腺增生症的药物；(2)抑制人前列腺增生上皮细胞增殖的药物；或(3)抑制PCNA蛋白表达和/或抑制其mRNA表达的药物。本发明还涉及一种提取物。包含女贞子和墨旱莲的组合物或该组合物的提取物能够有效地治疗和/或预防良性前列腺增生症。
Description
技术领域
本发明属于中医药领域，涉及二至方或其提取物在制备防治良性前列腺增生症的药物中的用途。本发明还涉及一种二至方提取物。
背景技术
良性前列腺增生症(Benign prostatic hyperplasia，BPH)是中老年男性的常见病、多发病，流行病学研究表明，随着年龄的增长，BPH发病率逐年提高，50岁左右的男性患BPH的几率为50％左右，80岁及其以上男性患BPH的概率高达85％以上[1]。随着我国经济的快速发展，人口老龄化的日益加剧，与年龄增长密切相关的疾病受到越来越多的关注，BPH位列其中。BPH主要的临床表现为尿频、尿急、排尿困难等症状，同时伴随膀胱梗阻以及下尿路症状等兼证，更有严重者会引起泌尿系统感染、急性尿储留、肾功能障碍等，严重影响了中老年男性患者的生活质量[2]。BPH发病机制复杂，现代学者提出BPH较为公认的学说主要包括：“胚胎再唤醒学说”、“细胞凋亡-基因调控学说”、“生长因子学说”、“激素-内分泌学说”、“维生素D学说”以及“炎症-氧化应激学说”等[3]。其中“细胞凋亡-基因调控学说”、“激素-内分泌学说”以及“炎症-氧化应激学说”是当下研究BPH作用机制的热点方向。
由于BPH患者年龄普遍较大，不具备手术指征的为多，因此药物治疗成为首选。目前临床使用的药物(西药)多是围绕BPH发病机制来设计的，主要归纳为5α-还原酶抑制剂、α1-肾上腺素受体阻滞剂、抗雌激素、雄激素类药物等，具有成分单一、靶点明确的优势，但长期服用会给BPH患者带来不同程度的不良反应，轻者伴随疼痛、恶心呕吐等症状，重者会造成心血管并发症、性功能障碍等[4]，还有待于进一步改善，因此应用传统中药治疗BPH已成为当下研究的热点。
前列腺增生在中医治疗中属于“精隆”、“癃闭”范畴，认为BPH属于本虚标实的疾病，根据中医辨证论治的基础理论，临床上将BPH分为湿热下注型、脾肾气虚型、气滞血瘀型、肾阴亏虚型、肾阳不足型等基本证型[5]，其病因病机可归咎于中老年人年老体衰、肾气不足，命门火衰，中气虚弱，痰瘀互结水道等方面。中医治疗BPH多采用温肾益气、活血利水等作为其治疗的基本原则。用于治疗BPH的中药包括复方和单味药，复方主要包括补肾祛瘀汤[6]、三草舒癃汤[7]、桂枝茯苓方[8]、知柏地黄方[9]等，单味药主要涉及锁阳水煎液[10]、桂枝水煎液[11]、凤尾草颗粒[12]等，均取得了良好的抗BPH效果。
二至方由女贞子和墨旱莲等质量配伍组成，女贞子以果实入药，冬至时节采收，而墨旱莲以全草入药，夏至季节采收；制成丸剂称为二至丸。全方具有补益肝肾、滋阴止血之功，其与BPH肾阴亏虚型的病因病机相契合。现代研究表明，二至方的药理作用主要包括免疫调节作用、抗氧化以及抗衰老作用、保肝作用、抗骨质疏松的作用、抗炎作用、抗肿瘤作用，激素样作用等[13]。
方中女贞子为木樨草科植物女贞的果实，味甘，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾，明目乌发之功，多用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明等症的治疗。现代研究表明女贞子含有丰富的药效物质主要包括三萜类化合物，环烯醚萜类化合物，苯乙醇类化合物，黄酮类化合物，女贞子多糖等，2015年版《中国药典》将环烯醚萜苷类化合物特女贞苷作为女贞子的质量检测成分[14]。研究表明三萜类化合物齐墩果酸，以及黄酮类化合物木犀草素、芹菜素、山奈酚等均对前列腺癌细胞的增殖有一定的抑制作用[15-18]。
方中墨旱莲是菊科植物鳢肠的全草，味甘酸，性凉，归肝、肾经。具有滋补肝肾、凉血止血的功效，主要用于凉血，止血，补肾，益阴等疾病的治疗。现代研究表明其药效物质主要包括黄酮类化合物，三萜及其衍生物、香草醚类化合物、噻吩类化合物、甾体类化合物、挥发油等。2015年版《中国药典》将香草醚类化合物蟛蜞菊内酯作为墨旱莲的质量检测成分[19]。研究表明蟛蜞菊内酯、黄酮类化合物槲皮素、三萜类化合物熊果酸均对前列腺癌细胞增殖有一定的抑制作用，值得关注的是，有研究表明熊果酸通过抑制大鼠前列腺的重量、降低血中以及前列腺组织中睾酮和双氢睾酮的水平进而抑制前列腺增生[20-23]。
目前，尚需要开发新的用于治疗BPH的手段。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现女贞子和墨旱莲两者配伍，相须为用，能够有效地治疗或预防BPH。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及包含女贞子和墨旱莲的组合物或该组合物的提取物在制备选自如下的药物中的用途：
(1)治疗和/或预防良性前列腺增生症的药物；
(2)抑制人前列腺增生上皮细胞增殖的药物；或
(3)抑制PCNA蛋白表达和/或抑制其mRNA表达的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)，或者为1：1(即二至方)；
优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述提取物中：
毛蕊花糖苷的含量为0.052mg/g－5.2mg/g，优选为0.26mg/g－1.04mg/g；
刺囊酸的含量为0.00057mg/g－0.057mg/g，优选为0.00285mg/g－0.0104mg/g；和/或
木犀草素的含量为0.03mg/g－3mg/g，优选为0.15mg/g－0.6mg/g。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述提取物由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中女贞子提取物通过包含步骤(1)、(1)-(2)、(1)-(3)或者(1)-(4)的方法制得：
(1)取女贞子药材，加入3－15倍量的50％－90％的乙醇回流提取1次或多次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
(2)合并提取液；
(3)将提取液浓缩得到浓缩液；
(4)将浓缩液干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其特征在于如下的①-⑥项中的任意一项或者多项：
①步骤(1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
②步骤(1)中，加入75％-85％的乙醇，优选加入80％的乙醇；
③步骤(1)中，提取2或3次；
④步骤(1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
⑤步骤(1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃、大于或等于95℃、96℃、96℃、98℃、99℃或100℃；
⑥步骤(4)中，将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，女贞子提取物通过如下方法制得：
取女贞子药材，加入10倍量的80％乙醇，加热回流提取2次，每次2h；合并提取液；将提取液浓缩得到浓缩液；将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述提取物由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中墨旱莲提取物通过包含步骤1)、1)-2)、1)-3)、1)-4)或者1)-5)的方法制得：
1)取墨旱莲药材，加入3－15倍量的50％－80％的乙醇提取1－4次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
2)合并提取液；
3)将提取液用乙酸乙酯萃取1－6次，得到萃取液；
4)将萃取液浓缩得到浓缩液；
5)将浓缩液干燥，得墨旱莲浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其特征在于如下的A-G项中的任意一项或者多项：
A.步骤1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
B.步骤1)中，加入55％-65％的乙醇，优选加入60％的乙醇；
C.步骤1)中，提取2或3次；
D.步骤1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
E.步骤1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃、大于或等于95℃、96℃、96℃、98℃、99℃或100℃；
F.步骤3)中，将提取液用乙酸乙酯萃取3或4次，得到萃取液；
G.将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，墨旱莲提取物通过如下方法制得：
取墨旱莲药材，加入10倍量的60％乙醇，加热回流提取2次，每次2h；合并提取液；将提取液用乙酸乙酯萃取4次，得到萃取液；将萃取液浓缩得到浓缩液；将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
本发明的另一方面涉及一种提取物，其由包含女贞子和墨旱莲的组合物制得，其中，按照重量百分比计算，所述提取物中：
毛蕊花糖苷的含量为0.052mg/g－5.2mg/g，优选为0.26mg/g－1.04mg/g；
刺囊酸的含量为0.00057mg/g－0.057mg/g，优选为0.00285mg/g－0.0104mg/g；和/或
木犀草素的含量为0.03mg/g－3mg/g，优选为0.15mg/g－0.6mg/g。
本发明还涉及一种提取物，其由包含女贞子和墨旱莲的组合物制得。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其中，女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；
优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中女贞子提取物通过包含步骤(1)、(1)-(2)、(1)-(3)或者(1)-(4)的方法制得：
(1)取女贞子药材，加入3－15倍量的50％－90％的乙醇回流提取1次或多次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
(2)合并提取液；
(3)将提取液浓缩得到浓缩液；
(4)将浓缩液干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其特征在于如下的①-⑥项中的任意一项或者多项：
①步骤(1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
②步骤(1)中，加入75％-85％的乙醇，优选加入80％的乙醇；
③步骤(1)中，提取2或3次；
④步骤(1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
⑤步骤(1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃、大于或等于95℃、96℃、96℃、98℃、99℃或100℃；
⑥步骤(4)中，将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其中，女贞子提取物通过如下方法制得：
取女贞子药材，加入10倍量的80％乙醇，加热回流提取2次，每次2h；合并提取液；将提取液浓缩得到浓缩液；将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中墨旱莲提取物通过包含步骤1)、1)-2)、1)-3)、1)-4)或者1)-5)的方法制得：
1)取墨旱莲药材，加入3－15倍量的50％－80％的乙醇提取1－4次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
2)合并提取液；
3)将提取液用乙酸乙酯萃取1－6次，得到萃取液；
4)将萃取液浓缩得到浓缩液；
5)将浓缩液干燥，得墨旱莲浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其特征在于如下的A-G项中的任意一项或者多项：
A.步骤1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
B.步骤1)中，加入55％-65％的乙醇，优选加入60％的乙醇；
C.步骤1)中，提取2或3次；
D.步骤1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
E.步骤1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃、大于或等于95℃、96℃、96℃、98℃、99℃或100℃；
F.步骤3)中，将提取液用乙酸乙酯萃取3或4次，得到萃取液；
G.将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
在本发明的一些实施方式中，所述的提取物，其中，墨旱莲提取物通过如下方法制得：
取墨旱莲药材，加入10倍量的60％乙醇，加热回流提取2次，每次2h；合并提取液；将提取液用乙酸乙酯萃取4次，得到萃取液；将萃取液浓缩得到浓缩液；将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的组合物或其提取物，所述组合物包含女贞子和墨旱莲；
可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物还包含选自如下药物中的一种或多种：
α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、依立雄胺或度他雄胺)、α肾上腺受体阻滞剂(例如坦索罗辛或奈哌地尔)和M受体拮抗剂(例如托特罗定或索利那新)、补肾祛瘀汤、三草舒癃汤、桂枝茯苓方、知柏地黄方、锁阳水煎液、桂枝水煎液和凤尾草颗粒；
优选地，所述组合物中的女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成；
优选地，所述提取物为本发明中任一项所述的提取物；
优选地，其中组合物或其提取物的量能够满足连续给药大于28天、大于或等于30天、大于或等于35天、大于或等于40天、或者大于或等于45天。
本发明的再一方面涉及一种组合药物产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，
其中，
所述第一产品包含有效量的组合物或其提取物，所述组合物包含女贞子和墨旱莲；
所述第二产品包含选自如下药物中的一种或多种：
α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、依立雄胺或度他雄胺)、α肾上腺受体阻滞剂(例如坦索罗辛或奈哌地尔)和M受体拮抗剂(例如托特罗定或索利那新)、补肾祛瘀汤、三草舒癃汤、桂枝茯苓方、知柏地黄方、锁阳水煎液、桂枝水煎液和凤尾草颗粒；
优选地，所述组合物中的女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成；
优选地，所述提取物为本发明中任一项所述的提取物；
优选地，其中组合物或其提取物的量能够满足连续给药大于28天、大于或等于30天、大于或等于35天、大于或等于40天、或者大于或等于45天。
本发明的再一方面涉及一种选自如下的方法，包括给予有需求的受试者(例如BPH患者或BPH潜在患者)或者施加给人前列腺增生上皮细胞以有效量的组合物或其提取物的步骤，其中所述组合物包含女贞子和墨旱莲：
(1)治疗和/或预防良性前列腺增生症的方法；
(2)抑制人前列腺增生上皮细胞增殖的方法；或
(3)抑制PCNA蛋白表达和/或抑制其mRNA表达的方法；
优选地，所述组合物中的女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成；
优选地，所述提取物为本发明中任一项所述的提取物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的治疗和/或预防良性前列腺增生症的方法，其中，连续给药大于28天、大于或等于30天、大于或等于35天、大于或等于40天、或者大于或等于45天。
本发明中，如果没有特别说明，术语“二至方”是指女贞子和旱莲草构成的方剂，术语“二至丸”是指通过工业生产获得的制剂。
本发明中，如果没有特别说明，术语“女贞子”是指女贞子生药，女贞子以果实入药。
本发明中，如果没有特别说明，术语“墨旱莲”是指墨旱莲生药，墨旱莲以全草入药。
本发明中，术语“PCNA”是指增殖细胞核抗原(Proliferating Cell NuclearAntigen)，PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA的氨基酸序列可以参考Genbank P04961。
本发明中涉及的乙醇，如果没有特别说明，均指乙醇的水溶液。
本发明中涉及的乙醇的浓度，如果没有特别说明，均指体积百分比浓度。
通常本发明的药物组合物含有作为主药的0.1重量％－90重量％的包含女贞子和墨旱莲的组合物(例如二至方)或其提取物(例如二至方的提取物)。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将主药与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
术语“辅料”在本申请中是指用以将主药给药的赋形剂或者媒介物，其包括但不限于稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、包衣材料等。辅料在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中被一般性描述。辅料的实例包括但不限于单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基硬脂酸羟基二十八酯、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素等。
二至方或二至方提取物可配制成药物制剂，包括适用于口服给药的剂型，适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的剂型(例如作为溶液剂)，适用于表面给药的剂型(例如作为软膏剂、贴剂或者乳膏剂)，以及适用于直肠给药的剂型(例如作为栓剂)等。
取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径，本发明的药物制剂可以以不同剂量每日一次或者多次给药。给药剂量取决于许多因素，例如所要治疗或辅助治疗的BPH的严重程度，患者的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三、四个剂量形式给药。
可改变本发明药物组合物中各主药的实际剂量水平，以便能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“连续给药”是指一段时间之内实现每天都至少给药1次。每天的给药次数并不特别限定，例如1次、2次、3次或以上。优选地，每一天给药的总剂量相同。
发明的有益效果
包含女贞子和墨旱莲的组合物(例如二至方)或其提取物(例如二至方的提取物)能够有效地治疗和/或预防良性前列腺增生症的药物；有效地抑制人前列腺增生上皮细胞增殖。
附图说明
图1：二至方给药45天的实验流程图。
图2：二至方给药45天大鼠的表现及体重的变化(n＝10)。
图3A－3D：二至方给药45天对前列腺形态、前列腺系数以及提肛肌、精囊腺系数的影响。与Sham比较**P<0.01，*P<0.05；与Model比较##P<0.01，n＝10。其中：
图3A，前列腺形态图；图3B，前列腺系数；图3C提肛肌系数；图3D精囊腺系数。
图4A－图4F：二至方给药45天对BPH大鼠各脏器系数的影响。与Sham比较**P<0.01；与Model比较##P<0.01，#P<0.05，n＝10。其中：
图4A肝脏系数；图4B，心脏系数；图4C，脾脏系数；图4D肺脏系数；图4E肾脏系数；图4F膀胱系数。
图5：二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织病理形态的影响。bar＝50μm，n＝10。
图6A－6B：二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织平滑肌细胞层厚度的影响。与Sham比较*P<0.05；与Model比较##P<0.01，#P<0.05，bar＝50μm，n＝10。其中：
图6A，α-SMA定位表达；图6B，α-SMA半定量统计。
图7A－图7D：二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织PCNA表达的影响。与Sham比较**P<0.01；与Model比较##P<0.01，#P<0.05，bar＝50μm，n＝10。其中：
图7A，PCNA蛋白表达；图7B，PCNA mRNA表达；图7C，PCNA免疫荧光染色；图7D，PCNA免疫荧光半定量统计。
图8：二至方提取物给药45天与给药28天前列腺系数抑制率比较。
图9：来源于女贞子中的化合物对BPH-1细胞的增殖抑制作用。与Ctrl比较，*P<0.05。
图10A－图10O：来源于女贞子中的化合物对E2刺激的BPH-1细胞的增殖抑制作用。与Ctrl比较，**P<0.01；与Model(E2)比较，##P<0.01。其中：
图10A：LLA-8有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10B：LLA-8有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10C：LLA-8抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图10D：LLA-14有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10E：LLA-14有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10F：LLA-14抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图10G：LLA-20有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10H：LLA-20有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10I：LLA-20抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图10J：LLA-22有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10K：LLA-22有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10L：LLA-22抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图10M：LLA-29有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10N：LLA-29有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图10O：LLA-29抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图11：来源于墨旱莲中的化合物对BPH-1细胞的增殖抑制作用。与Ctrl比较，*P<0.05。
图12A－图12I：来源于墨旱莲中的化合物对E2刺激的BPH-1细胞的增殖抑制作用。与Ctrl比较，**P<0.01；与Model(E2)比较，##P<0.01。
图12A：EPA-16有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12B：EPA-16有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12C：EPA-16抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图12D：EPA-19有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12E：EPA-19有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12F：EPA-19抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
图12G：EPA-23有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12H：EPA-23有效抑制E2刺激的BPH-1细胞增殖。
图12I：EPA-23抑制乳酸脱氢酶LDH的释放。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
预实验：二至方给药28天抑制大鼠良性前列腺增生的研究
本发明人参照下面的实施例1中的方法，除了给药时间为28天，随机选取6只实验动物作为正常对照组，对其进行假手术，其余30只(n＝6)经去势手术后随机分为五组之外，其余方法与实施例1完全相同。
实验结果发现：
雌激素、雄激素共同诱导能显著增加大鼠前列腺重量以及前列腺系数(PI)，增加前列腺平滑肌细胞层厚度，促进PCNA蛋白和mRNA的表达，提示大鼠BPH模型构建成功。
二至方提取物给药28天可以减轻雌激素和雄激素诱导的大鼠前列腺重量和PI，但无差异显著性，减少前列腺平滑肌细胞层厚度，抑制PCNA蛋白及其mRNA的表达，对精囊腺和提肛肌系数无影响。
实施例1：二至方给药45天抑制大鼠良性前列腺增生的研究
1.材料与方法
1.1主要的仪器
如下面的表1所示。
表1：主要的仪器
1.2主要的试剂
如下面的表2所示。
表2：主要的试剂
1.3二至方提取物的制备
1.3.1女贞子的提取工艺
取女贞子药材3kg(河北安国顺全隆药材公司提供)，加入10倍量的80％乙醇，加热至沸腾，回流提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏760.8g，经计算其出膏率为25.36％。
1.3.2墨旱莲的提取工艺
取墨旱莲药材3kg(河北安国顺全隆药材公司提供)，加入10倍量的60％乙醇，加热至沸腾，回流提取2次，每次2h，合并提取液，提取液浓缩至约3000mL，将浓缩液用乙酸乙酯萃取4次，将萃取液浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏64.18g，经计算其出膏率为2.16％。
1.4主要溶液的配制
1.4.1造模激素的配制
玉米油为溶剂配制雌激素/雄激素(E2/T)1:100的溶液，丙酸睾酮注射液(T，25mg/mL)，苯甲酸雌二醇注射液(E2，1mg/mL)，且混合液中E2的浓度固定为100μg/mL。高压灭菌，4℃保存。
1.4.2二至方提取物的配制
按大鼠体重10mL/kg来计算，大鼠的平均体重按照300g来计算，女贞子提取物的出膏率为25.36％；墨旱莲提取物的出膏率为2.16％。按照女贞子、墨旱莲药材质量比1:1的比例混合，得到二至方提取物的三个剂量分别为6g/kg、3g/kg和1.5g/kg，4℃保存，使用前要充分混匀。
1.4.3阳性药氟他胺的配制
阳性药氟他胺购自江苏天士力帝益药业有限公司，剂量为30mg/kg，配制的具体要求同1.4.2二至方提取物的配制。
1.4.4PBS磷酸盐缓冲液的配制
配制1L 10×PBS储液：分别称取85g氯化钠，29.01g十二水合磷酸一氢二钠，2.964g二水合磷酸二氢钠，并使用1M氢氧化钠调溶液PH值至PH 7.4，使用蒸馏水最终定容至1L，高压灭菌后常温保存。
配1×PBST工作液，以500mL为例：量取50mL 10×PBS储液并加蒸馏水定容至50mL，加入500μL Tween-20。
1.4.5柠檬酸抗原修复液的配制
100mL的0.1mol/L柠檬酸溶液储液：称取2.101g柠檬酸粉末溶于100mL蒸馏水中，充分混匀后，高压灭菌，常温保存。
500mL 0.1mol/L柠檬酸钠溶液：称取14.705g柠檬酸钠粉末溶于500mL蒸馏水中，充分混匀后，高压灭菌，常温保存。
柠檬酸修复液：量取9mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与41mL0.1mol/L柠檬酸钠溶液混合定容到500mL，调节PH值至6.0。
1.4.6 3％过氧化氢溶液的配制
以配制50mL的3％过氧化氢溶液为例，量取5mL 30％过氧化氢溶液加蒸馏水定容至50mL。
1.4.7 10％牛血清封闭液
以配制1mL10％牛血清封闭液为例，用移液器吸取100μL正常牛血清加900μL 1×PBST，混合后置于冰上备用。
1.4.8 1％盐酸酒精溶液
以配制100mL的1％盐酸酒精溶液为例，量取99mL无水乙醇加入1mL浓盐酸。
1.5良性前列腺增生大鼠模型的制备及给药
1.5.1实验动物
8周龄SPF级Wistar雄性大鼠，体重270±20g左右，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物饲养于中国医学院放射医学研究所，动物房的温度和湿度分别维持在23±2℃和58-65％范围内。实验动物适应性饲养一周后开始去势手术。
1.5.2雄性大鼠去势手术
将60只SPF级Wistar雄性大鼠适应性饲养一周后，进行去势手术。用10％水合氯醛注射液按0.3mL/100g体重进行麻醉，待实验动物躺倒示麻醉成功。
随机选取10只实验动物作为正常对照组，对其进行假手术：在无菌环境下逐层切开麻醉大鼠的阴囊皮肤、包膜组织以及提睾肌，并牵拉睾方后送回到包膜组织内，再逐层缝合，在实验动物的腿部腓肠肌肌肉处注射青霉素0.3mL/只。
其余50只大鼠均做去势手术：将大鼠固定在手术台上，阴囊皮肤用碘伏进行常规消毒，在无菌条件下逐层切开雄性大鼠的阴囊皮肤、包膜组织以及提睾肌，使其睾方暴露，完全摘除双侧睾方及其附睾，并结扎残端使其彻底止血后再全层缝合，对皮后用棉球沾取生理盐水擦净阴囊外血迹，在腿部腓肠肌肌肉处注射青霉素0.3mL/只。将去势后尚未苏醒的大鼠放在保暖垫上保暖，苏醒后将大鼠再放回鼠笼中。
去势后的大鼠正常饲养21天，术后的3天之内给每只大鼠腹腔注射青霉素，同时用碘伏对其阴囊创口处皮肤伤口消毒5天，防止其伤口出现感染。
1.5.3实验动物分组及给药方式
除10只假手术组的实验大鼠作为正常对照组外，其他的50只(n＝10)经去势手术后的大鼠随机分为五组，BPH模型组(Model)、二至方6g/kg组(EZ-6g/kg)、二至方3g/kg组(EZ-3g/kg)、二至方1.5g/kg组(EZ-1.5g/kg)、氟他胺30mg/kg组(Flu)。其中二至方3g/kg组是由人临床用药剂量等量换算得到的。各组大鼠的给药方式见表3，连续给药45天，末次给药后24小时完成取材。
表3：具体分组以及给药方式情况
1.5.4二至方给药45天的实验流程图
如图1所示。
1.6取材后检测指标及方法
对大鼠称重、麻醉，剖开腹腔后进行腹主动脉取血，分离并取出前列腺组织，迅速放在冰袋上去掉前列腺组织周围的脂肪组织，用电子天平精确称量前列腺的湿重，计算前列腺指数。切一侧前列腺组织的腹叶迅速放于-80℃冰箱中，用于后期的分子生物学检测；另一侧放于4％多聚甲醛中进行固定，待石蜡包埋、切片用。
具体方法如下：
1.6.1各脏器系数的计算方法
前列腺、精囊腺、提肛肌等指数的计算公式：前列腺(精囊腺、提肛肌等)指数(PI)＝前列腺(精囊腺、提肛肌等)的湿重/大鼠体重×100％，其他脏器系数的计算同理。
1.6.2二至方对BPH大鼠前列腺组织病理形态学影响
A.用切片机将石蜡包埋的前列腺组织蜡块切至5μm/片。
B.二甲苯使石蜡切片脱蜡，经各级乙醇后至水洗，具体步骤如下：两个二甲苯的玻璃缸中，每个20min，无水乙醇16min，90％和80％乙醇各10min，蒸馏水浸泡2次，5min/次。
C.苏木素染色5min，大量自来水冲洗。
D.盐酸乙醇分化30s。
E.自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。
F.置伊红液染色2min。
脱水，透明直至封片，步骤如下：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封片。
1.6.3二至方对BPH大鼠前列腺组织α-SMA部位表达影响
A.60℃的电热恒温箱中烤片5小时。
B.切片脱蜡入水：两个二甲苯的玻璃缸中，每个20min，无水乙醇16min，90％和80％乙醇各10min，蒸馏水浸泡2次，5min/次。
C.将石蜡切片置于柠檬酸抗原修复液(PH 6.0)中，92℃-98℃反应15min，自然冷却至室温，用1×PBST洗两次，5min/次。
D.恢复室温的石蜡切片浸入3％过氧化氢溶液中10min，1×PBST洗三次，5min/次。
E.石蜡切片置于湿盒中，10％牛血清封闭，37℃孵育1h。
F.用封闭液对一抗α-SMA(博士德，BM0002)按照1-400比例稀释，将石蜡切片水平置于湿盒中，将稀释好的一抗小心滴加至组织的表面，4℃孵育过夜。
G.1×PBST洗三次，5min/次，二抗生物素化马抗小鼠IgG(中杉金桥，ZB2020)按照1-200比例稀释，滴加到组织上，37℃孵育30min。
H.1×PBST洗三次，5min/次，三抗辣根酶标记链霉卵白素(中杉金桥，ZB2404)按照1-200的比例稀释，滴加到组织上，37℃孵育30min。
I.1×PBST洗三次，5min/次，将DAB显色液滴加到组织块上，同时在正置光学显微镜下观察显色情况，显色时间约为1-5min，当确定有明显棕褐色的阳性染色后，用自来水反复冲洗，即终止显色。
J.将改良型苏木素染色剂滴加到组织上并反应1min，自来水反复冲洗以终止反应后将切片浸入1×PBST中返蓝，室温、1小时。
K.将返蓝后的切片浸入80％和90％乙醇各10min，无水乙醇16min，透明二甲苯2次，20min/次。
L.置于通风橱中使用中性树胶封片后使其自然干燥，正置光学显微镜观察组织染色的情况。
1.6.4二至方对BPH大鼠前列腺组织PCNA荧光强度的影响
A.用切片机将石蜡包埋的前列腺组织蜡块切至5μm/片。
B.烤片：烘箱60℃烤片5小时。
C.二甲苯I中脱蜡15分钟。换用新鲜的二甲苯II，再脱蜡15分钟，无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟，95％乙醇I 5分钟，95％乙醇II 5分钟，80％乙醇2分钟，75％乙醇I5分钟，75％乙醇II 5分钟，蒸馏水2分钟。
D.抗原修复：在高压锅里加热0.01M柠檬酸修复液(pH 6.0)至沸腾后将组织切片放入，5-10分钟，断电，5-10分钟后，再次加热至沸腾，5-10分钟，室温冷却40分钟双蒸水冲洗5分钟×3次，PBS冲洗5分钟×3次；滴加3％H2O2去离子水，室温孵育10分钟，消除内源性过氧化物酶影响。
E.封闭：PBS冲洗5分钟×3次，滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15分钟，进行封闭。
F.一抗孵育：倾去血清，滴加一抗PCNA，PCNA(Protein-tech，10205-Z-AP)按照1-200的比例稀释，片子平放保湿盒中4℃过夜。
G.二抗孵育：室温30分钟后PBST冲洗5分钟×3次，滴加羊抗兔荧光二抗(Protein-tech，SA00003-2)，稀释比例为1:500，避光室温孵育1h。
H.DAPI染核：PBST避光冲洗10分钟×3次，DAPI(1:500)，避光室温孵育10分钟，PBST避光冲洗3次，每次5分钟。
I.封片：抗荧光衰减封片剂避光封片。
J.拍照：倒置荧光显微镜下观察6个不同视野，拍摄照片，计算平均荧光强度值，采用Graph pad prism5进行数据统计分析并作图。
1.6.5二至方对BPH大鼠前列腺组织PCNA蛋白表达的影响
(1)大鼠前列腺组织总蛋白的提取
A.从-80℃冰箱中取出大鼠前列腺右侧腹叶组织切成1×1mm3的组织小方块，放入已提前预冷且装有100μL裂解液的1.5mL-Eppendorf离心管中，每个样品使用超声仪超声3次，每次超声时间10-15秒左右。
B.将各离心管置于冰上静置20分钟。
C.将各离心管置于低温离心机中以13,800×g、4℃下离心30分钟后取上清。吸取少量提取后的蛋白上清液用于浓度测定，其余分装放于-40℃保存。
(2)大鼠前列腺组织核蛋白以及胞浆蛋白的提取
A.取出大鼠前列腺右侧腹叶组织切成1×1mm3的组织小方块，将胞浆蛋白抽提试剂A和B按照20:1比例混合，加入PMSF使其终浓度为1mM，使用玻璃匀浆器在冰上充分研磨，冰浴放置15min，4℃1,500×g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中。
B.每20微升组织细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A，涡旋5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴10-15min。
C.加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10μL，涡旋5秒，冰浴1min，4℃12,000-16,000×g离心5min。离心后吸取上清为胞浆蛋白。
D.完全吸净上清后，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白提取抽提试剂，涡旋15-30秒，将细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴，每隔1-2min涡旋15-30秒，共30min。4℃ 12,000-16,000×g离心10min。取上清即为抽提得到的核蛋白。
(3)BCA(bicinchoninic acid)法测前列腺组织蛋白浓度
将待测的蛋白样品稀释20倍(根据样品提取的情况而定，也可以不稀释)。其它具体操作请参见实施例2中的1.6.5。
(4)Western blot具体操作请参见实施例2中的1.6.5。
1.6.6二至方对BPH大鼠前列腺组织PCNA mRNA表达的影响
(1)前列腺组织总RNA的提取(Trizol)及浓度测定
A.从-80℃冰箱中将取材获得的大鼠前列腺左侧腹叶组织切成1×1mm3的组织块，在匀浆器中加入100μL已预冷的Trizol试剂，使用匀浆器将前列腺组织在冰上反复研磨，至匀浆器中的液体浑浊为度。
B.在1.5mL-Eppendorf离心管中加入900μL已预冷的Trizol试剂，将步骤A中100μL含Trizol试剂的浑浊液体转移至此离心管中。
C.充分混匀后，每管加入200μL的氯仿，冰上静置10分钟，混合振荡器涡旋3次14,200×g、4℃离心20分钟。
D.吸取离心管上部的透明水相部分并转移至另一个离心管中，加入等体积的异丙醇，充分震荡混匀。
E.放置于-20℃冰箱中沉淀30分钟以上(也可过夜)，14,200×g、4℃离心30分钟，弃去上清。
F.在每个离心管中加入事先使用DEPC处理水配制的70％的乙醇1mL，14,200×g、4℃离心5分钟，吸取上清。
G.室温干燥60分钟左右，加入20μL的DEPC处理水，使底部的RNA沉淀充分溶解，放于-40℃冰箱中保存或者插于冰上待测定总RNA的浓度。
H.取1μL的RNA溶液测浓度，DEPC处理水作为空白对照。
I.在e-spect仪器上分别读取总RNA的浓度(ng/μL)以及OD260/OD280、OD260/OD230的数值。
(2)RNA逆转录合成cDNA
A.取2μg总RNA，加入1μL的随机引物Oligo-dT，再加入Thermo反转录试剂盒中的不含核酸酶纯水至12μL体系。
B.将A步骤中配制好的12μL反转录模板放入金属浴中65℃孵育5分钟。
C.按照表4配制反转录体系。
D.将12μL反转录模板与8μL反转录反应体系充分混合后置于42℃的金属浴中反应1小时，70℃金属浴中反应5分钟，反应结束后放于-40℃冰箱中保存。
表4：Thermo反转录体系的配方
| 试剂 | 加入量 |
| 5×Reaction Buffer | 4μL |
| Riblock RNase Inhibitor | 1μL |
| 10μM dNTP Mix | 2μL |
| Reverse Aid M-MLV RT | 1μL |
(3)实时定量RT-PCR反应体系
A.按照表5配制25μL的PCR反应体系。本实验中涉及的引物序列见表6均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
B.实时定量RT-PCR的反应循环条件为：95℃30min、95℃30s、退火温度(注意退火温度需根据引物序列的不同分别进行设定。)30s、72℃30s、共循环39次。熔解曲线：65℃到95℃之间每0.5℃5s。
表5：25μL PCR反应体系的配方
| 试剂 | 加入量 |
| 2×Mix Buffer | 12.5μL |
| 上游引物 | 0.5μL |
| 下游引物 | 0.5μL |
| cDNA模板 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 9.5μL |
表6：本部分实验使用的引物序列
(4)实时定量RT-PCR结果分析
经检测所得的Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时经历的循环数，其与拷贝量呈负对数的关系。ΔCt是待测基因Ct值与内参照基因Ct值的差值。应用美国Bio-Rad公司实时定量PCR仪相应的分析软件调整基线和阈值后分析反应板的数据，获得每个样品每次反应相应的Ct值，再计算得到其ΔCt，与对照组相比后，取2-ΔΔCt的数值进行统计即可。
1.7统计学方法
数据统计结果使用的SPSS17.0进行数据分析，计量资料以均值±标准差(Means±SD)来表示。呈正态分布的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别进行两两比较，当方差齐时选用LSD检验方法，当方差不齐时则选择Dunnett，s T3检验方法；呈非正态分布的数据则选择致和检验进行分析。所有的统计结果均采用双侧检验方法，P<0.05被认为检验结果有差异显著性，P<0.01被认为检验结果有极显著差异。体重部分统计使用的统计方法为多重测量的重复检验方法。
2.实验结果
2.1二至方给药45天大鼠表现及体重变化
实验大鼠的毛发较为光泽，分泌物均正常，大鼠情绪稳定，未见烦躁易怒等异常现象，组间未发现异常现象。在本实验中，各组大鼠的体重均会随着饲养时间的延长而相应变化，且呈现增长趋势的为多，其中Sham组(假手术组)大鼠体重增长较其他组更多。各给药组以及Model组(增生模型组)的体重增长如图2所示，经多重测量的重复检验统计未发现差异，提示二至方给药45天对大鼠体重没有影响。
2.2二至方给药45天对BPH大鼠各脏器系数的影响
2.2.1二至方给药45天对实验动物前列腺形态的影响以及雄激素依赖器官前列腺、提肛肌、精囊腺系数的影响
从图3A－图3B前列腺形态图以及前列腺系数(PI)可知，与Sham组相比，Model组大鼠前列腺体积以及前列腺系数明显增大(P<0.01)，与Model组比，各给药组前列腺的大小以及前列腺系数均有不同程度的减少(P<0.01，P<0.05)。提示二至方给药45天可有效抑制大鼠前列腺增生。提肛肌、精囊腺同前列腺一样是雄激素依赖的靶器官，如图3C－图3D所示，与Sham组相比，Model组精囊腺与提肛肌系数均明显上升(P<0.01，P<0.05)，提示BPH发生和发展过程对其他雄激素靶器官具有调控作用。与Model组比，三个剂量的二至方给药45天对提肛肌与精囊腺系数无影响；阳性药氟他胺显著抑制精囊腺以及提肛肌系数(P<0.01)。上述结果提示二至方对大鼠雄激素应答靶器官具有选择性，给药45天可明显抑制大鼠BPH进程。
2.2.2二至方给药45天对BPH大鼠肝、心、脾、肺、肾、膀胱各脏器指数的影响
如图4A－图4F所示，1.5g/kg、3g/kg以及6g/kg的二至方给药45天对肝脏系数、心脏系数、脾脏系数、肺脏系数、肾脏系数以及膀胱系数均没有影响。氟他胺可降低肾脏系数(P<0.05)以及膀胱系数(P<0.01)，对其他脏器系数没有影响。
2.3二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织病理形态的影响
如图5所示，Sham组腺泡扩张不明显，腺泡上皮细胞多呈现高柱状，间质成分较少，平滑肌细胞未见增生。与Sham组相比，Model组间质成分明显增多，腺泡体积增大，腺上皮细胞排列紊乱，结缔组织增生较为明显，腺泡内出现了复层上皮。与Model组相比，各给药组间质成分有所减少，腺上皮细胞排列紊乱的现象均得到不同程度的缓解，局部腺泡排列较为密集，接近Sham组。二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织病理形态的改变较给药28天更为明显。
如图6A－图6B所示，与Sham组相比，Model组平滑肌细胞层厚度显著增加(P<0.01)，与Model组相比，各给药组平滑肌细胞层厚度均显著减少(P<0.01)。提示二至方给药45天可有效减少前列腺腺泡周围的平滑肌细胞层厚度，较28天效果更为明显，进而抑制BPH的发展。
2.4二至方给药45天对BPH大鼠前列腺组织中PCNA表达的影响
如图7A－图7B所示，与Sham组相比，Model组的前列腺组织中PCNA蛋白以及mRNA表达明显上调(P<0.01)；与Model组相比，各给药组PCNA蛋白以及mRNA表达均有不同程度的下调(P<0.01)。如图7C－图7D所示，与Sham组相比，Model组PCNA荧光强度显著增加(P<0.01)，与Model组相比，各给药组PCNA的荧光强度明显下降(P<0.05)。提示二至方给药45天有效抑制前列腺细胞的增殖，比28天效果更明显。
2.5二至方给药45天与给药28天对比前列腺系数的抑制率
实验结果如图8所示，分别对二至方给药28天与给药45天的前列腺系数进行统计比较，计算出各组别的抑制率，结果表明二至方给药45天对BPH大鼠前列腺系数的抑制率优于给药28天。
结果显示，二至方提取物给药从28天延长至45天，可以明显减轻雌激素、雄激素诱导的大鼠前列腺重量以及前列腺系数，减少前列腺平滑肌细胞层厚度；抑制前列腺增生的增殖标志物PCNA的表达，其抑制效果优于28天，二至方给药45天对精囊腺以及提肛肌系数同样没有影响。
实施例2：二至方中化学成分抑制人前列腺增生上皮细胞增殖的研究
1.材料与方法
1.1主要的仪器
如下面的表7所示。
表7：主要的仪器
1.2主要的试剂
如下面的表8所示。
表8：主要的试剂
1.3来源于女贞子和墨旱莲的化合物见表9
表9：来源于女贞子和墨旱莲的化合物
1.4主要溶液的配制
1.4.1来源于女贞子以及墨旱莲的各化合物母液的配制
用十万分之一天平称取各种合物，根据其称取的量及相对分子质量加DMSO溶解至浓度100mM，分装，-20℃保存。
1.4.2 DHT母液的配制
用十万分之一天平称取DHT粉末，根据称取的质量及DHT相对分子质量加DMSO溶解至浓度100mM，分装，-20℃保存。实验时将其逐级稀释至10nM备用。
1.4.3 E2母液的配制
用十万分之一天平称取E2(苯甲酸雌二醇)粉末，根据称取的质量及E2相对分子质量加DMSO溶解至浓度100mM，分装，-20℃保存。实验时将其逐级稀释至100nM备用。
1.4.4各抑制剂母液的配制
用十万分之一天平称取各抑制剂粉末(比卡鲁胺、ICI、度他雄胺、非那雄胺)，根据其称取的量及相对分子质量加DMSO溶解至浓度100mM，分装，-20℃保存。实验时将其逐级稀释至10μM备用。
1.4.5 MTT母液的配制
250mg MTT加入无菌PBS(pH 7.4)定容至50mL，母液浓度为5mg/mL，按用量分装，-20℃避光保存。
1.4.6细胞裂解液Lysis Buffer的配制
RIPA裂解液(普通型)：PMSF体积比为100:1。
1.4.7 10％过硫酸铵(APS)的配制
称取0.1g过硫酸铵粉末，使其溶解于1ml超纯水中，待充分混匀后，放置于4℃保存。
1.4.8电泳缓冲液的配制
配制1L 1×MOPS电泳缓冲液为例：量取50mL 20×MOPS，加入950mL蒸馏水混匀。
1.4.9转膜缓冲液的配制
配制1L 1×转膜缓冲液为例：称取甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS0.37g，加入200mL甲醇和800mL蒸馏水混匀。
1.4.10洗膜缓冲液(TBST，PH7.6)的配制
配制1L 10×TBS储存液，称取Tris-碱60.57g和NaCl 85-90g，溶解于蒸馏水中，待溶解后定容至1L。
配制1L 1×TBST溶液时，先取100mL 10×TBS储液与900mL蒸馏水混合，再加入0.1％总体积的Tween-20试剂，剧烈震荡使其充分混匀。
1.4.11 Western blot封闭液(5％脱脂奶粉封闭液)的配制
配制100mLWestern blot封闭液为例：称取5g脱脂奶粉与100mL的1×TBST溶液混合，4℃保存。
1.5实验细胞
BPH-1细胞购自北京协和细胞库。
1.6主要的实验方法
1.6.1细胞培养方法
(1)细胞复苏
从液氮或者-80℃低温冰箱中取出含有细胞的冻存管，立即将其放入到37℃水浴锅中迅速溶解，将冻存管中细胞悬液加入到装有10％FBS(热灭活：水浴加热，56℃，30min)、100U/mL青霉素及100mg/mL链霉素的RPMI 1640培基中，离心，条件是：1000×rpm，5min，室温，离心后，弃去上清，用适量10％FBS RPMI 1640培基进行重悬，加入到新的培养瓶中，放入到37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞传代培养
取增殖生长状态良好的细胞，观察其状态，待细胞长满培养瓶底部90％左右时，弃去培养基，加入1×D-Hanks稀释的0.25％的胰蛋白酶后放入到37℃、5％CO2培养箱中消化，在显微镜下观察，待细胞呈现圆形，及时加入10％FBS RPMI 1640培基对0.25％的胰蛋白酶进行中和，在培养瓶内吹匀，制成细胞悬液，转移至离心管中，离心：1000×rpm，5min，室温，离心后，弃去上清，取适量10％FBS RPMI 1640培基进行重悬，按一定的比例(1:2—1:6等)传入新的培养瓶中，放入到37℃、5％CO2培养箱中进行培养。观察细胞状态，并选取细胞状态良好并处于对数生长期的细胞用于实验。
(3)细胞冻存
将细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后用10％FBS RPMI 1640培基进行中和，收集于离心管中，1000×rpm，5min，室温进行离心，弃去上清，加入冻存液(20％FBS、10％DMSO)，用吸管充分混匀后，移入冻存管，每管中加入1mL左右的细胞悬液，再按顺序逐级降温：4℃30min、-20℃1h，-80℃低温冰箱过夜，最后放入液氮中保存。
1.6.2 MTT实验方法
BPH-1细胞在10％FBS RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数期，提前一代更换1％CS-FBS RPMI 1640培养基，调整细胞密度为4×103个/孔，接种于96孔培养板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h，第一次筛选设置各化合物的终浓度分别为10μM、1μM，100nM，10nM，每个浓度设置6个平行孔(n＝6)，同时设空白对照组，完成加药后，将96孔板放入到37℃、5％CO2条件下的培养箱里继续培养72h，加入终浓度为0.5mg/mL MTT 10μL，培养4h后，吸净上清，每孔加入150μL DMSO，使用振板机充分震荡10min，用酶标仪测定570nm处的吸光度值。第二次筛选具体给药方法为：单独加10nM的DHT、100nM的E2，再加入DHT、E2与各化合物的混合物，设置各化合物的终浓度分别为1μM，100nM，10nM，每个浓度设置6个平行孔(n＝6)，同时设空白对照组，孵育及检测步骤同上。
1.6.3 CCK-8实验方法
BPH-1细胞在10％FBS RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数期，提前一代更换1％CS-FBS RPMI 1640培养基，调整细胞密度为4×103个/孔，接种于96孔培养板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入各化合物以及10nM的DHT、100nM的E2，设置各化合物的终浓度分别为1μM，100nM，10nM，每个浓度设置6个平行孔(n＝6)，同时设空白对照组，完成加药后，将96孔板放入到37℃、5％CO2的培养箱里继续培养24h，吸净上清，1×PBS洗一次，培养板中每孔加入100μL含10％CCK-8的RPMI 1640培养液(空白对照组为未接种细胞的培养孔)，37℃培养箱里避光孵育1h，测450nm波长处吸光度的数值。
1.6.4 LDH实验方法
BPH-1细胞在10％FBS RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数期，提前一代更换1％CS-FBS RPMI 1640培养基，调整细胞密度为4×103个/孔，接种于96孔培养板中，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入各化合物以及10nM的DHT、100nM的E2，设置各化合物的终浓度分别为1μM，100nM，10nM，每个浓度设置6个平行孔(n＝6)，同时设空白对照组，完成加药后，将96孔板放入到37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，依照说明书，每孔取50μL上清液平行转移至新的96孔空白培养板中，每孔加入配制好的CytoTox-ONETM Reagent溶液50μL，震荡混匀后室温避光孵育15min，避光孵育结束后每孔加入25μL Stop Solution，终止反应，震荡混匀后测490nm波长处吸光度的数值。
1.6.5 Western blot实验方法
(1)总蛋白的提取
A.BPH-1细胞在10％FBS RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数期，提前一代更换1％CS-FBS RPMI 1640培养基，调整细胞密度为2×106个/孔，接种于6孔培养板中，每孔2mL，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入各化合物以及10nM的DHT、100nM的E2，设置各化合物的终浓度分别为1μM，100nM，10nM，每个浓度设置3个平行孔(n＝3)，同时设空白对照组，完成加药后，将6孔板放入到37℃、5％CO2培养箱里继续培养48h。
B.6孔培养板每孔加入500μL 0.25％的胰蛋白酶消化BPH-1细胞，每孔加入500μL10％FBS RPMI 1640培养基中和，吹打混合均匀后，转移至离心管中进行离心，离心条件是300×g，5min，室温，吸净上清，用1×D-Hanks洗两次，每次洗后均离心，离心条件同上，最后一次离心后吸净上清。
C.在每个离心管细胞沉淀中加入已提前预冷的100μL裂解液(裂解液的配方：每1mL RIPA Buffer中含有10μL的PSMF)，冰上静置30min。
D.将各离心管置于低温离心机中以13,800×g，4℃条件下离心30分钟，离心结束后取上清。吸取少量提取后的蛋白上清液用于浓度测定，其余分装放于-40℃保存。
(2)BCA(bicinchoninic acid)法对细胞总蛋白浓度进行测定
A.BCA法测蛋白浓度的原理：蛋白在碱性条件下使得二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与BCA试剂可形成紫色的络合物，在562nm处测定其吸光度值，与标准曲线对比后，计算相应待测蛋白样品的浓度。
B.BCA工作液的配制：根据样品的数量，按照BCA试剂A 50体积加入1体积的BCA试剂B配制足够量的BCA工作液，充分混匀。
C.标准曲线的绘制：
①使用无酶水稀释蛋白标准液，具体稀释比例见表10。
表10：BCA法测蛋白浓度标准曲线样品制备
②按照浓度从低到高的顺序将配好的梯度稀释液加入到96孔酶标板中，再加入200μL已配好的BCA工作液。此处每个平衡点都要设置三个复孔。
③充分震荡混匀、避光，37℃孵育30分钟。
④反应结束后，使用酶标仪测定562nm处的吸光度值。
⑤以蛋白的含量(μg)为横坐标，所测得的三个平行复孔吸光度值的平均值为纵坐标来绘制标准曲线，并利用相应的软件生成线性的关系式以及线性相关系数R。
D.组织蛋白样品浓度的测定
①将待测的蛋白样品稀释5倍(根据样品提取的情况而定，也可以不稀释)。
②在96孔酶标板中，以稀释5倍的裂解液作为对照，将每个待测定的蛋白样品设置三个平行孔，每个样品取20μL，加入200μL的BCA工作液。
③充分震荡混匀、避光，37℃孵育30分钟。
④反应结束后，使用酶标仪测定562nm处的吸光度值。
⑤根据所测得的吸光度，并计算得到三个平行孔的平均吸光度值，带入到前面C⑤步骤中得到的标准曲线关系式计算出相应样品的蛋白含量。
⑥计算蛋白浓度的方法：将得到的蛋白含量数值比上样品体积(即20μL)，再乘以相应的稀释倍数得到待测蛋白样品的实际浓度。
(3)聚丙烯酰胺凝胶的配制
A.据上样蛋白体积选择合适的玻璃板和样品梳，安装并固定。
B.根据表11的配方配制10％的分离胶混合液，小心地将混合液在100mL烧杯中混匀，用移液枪加入到两片玻璃胶板之间，当液体的表面距短板上端2cm左右时停止。
C.在10％分离胶的上表面轻轻加入经高压后的超纯水，等待分离胶凝固。
D.分离胶凝固后，轻轻倒掉上层的超纯水，蒸馏水反复洗涤三次，使用滤纸小心吸干胶表面以及玻璃板之间的残留水分。
E.根据表12的配方配制4％的浓缩胶混合液，小心地将混合液在100mL烧杯中混匀，移液枪轻轻加入到两片玻璃胶板之间的分离胶上面，插入1.5mm厚度的塑料样品梳，室温放置使之凝固。
表11：10％分离胶的配方
| 试剂 | 体积 |
| 超纯水 | 2mL |
| 30％丙烯酰胺 | 1.67mL |
| 1.5mol/L Tris-HCl(PH＝8.8) | 1.33mL |
| 10％SDS | 50μL |
| 10％APS | 50μL |
| TEMED | 5μL |
表12：4％浓缩胶的配方
| 试剂 | 体积 |
| 超纯水 | 2.87mL |
| 30％丙烯酰胺 | 0.67mL |
| 0.5mol/L Tris-HCl(PH＝6.8) | 1.76mL |
| 10％SDS | 50μL |
| 10％APS | 50μL |
| TEMED | 5μL |
(4)上样蛋白样品溶液的配制
A.取40μg所提的蛋白样品，与5×loading buffer混合制成上样蛋白混合液。
B.将配好并混匀的蛋白溶液放置于沸水中(100℃)煮沸5min，离心之后待上样用。
(5)电泳
A.安装好电泳仪，在电泳槽中灌满1×电泳缓冲液，小心向上拔出样品梳，用1×电泳缓冲液反复冲洗电泳孔道，洗去孔道中未凝固的胶。
B.将已准备好的蛋白样品溶液小心地加入到上样孔道中，并且在适当泳道加入预染的蛋白分子量Marker。
C.上样完成后，电压调至55V，进行恒压电泳，待样品到达浓缩胶与分离胶的胶交界面时，将电压调整到110V，继续恒压电泳1-2小时，根据预染蛋白分子量Marker的条带和目的蛋白溶液中溴酚兰前沿的位置判断停止电泳的时间。
(6)转膜
A.电泳过程结束后，倒掉1×电泳缓冲液，小心拆下胶板，参照预染蛋白分子量Marker条带确定目的蛋白在凝胶中所处的位置后切去多余的凝胶，放于1×转膜缓冲液中。
B.根据切胶的大小剪取尺寸合适的PVDF膜，PVDF膜要先在无水甲醇中浸泡3-5min，再放于1×转膜缓冲液中备用。
C.在另一平皿中倒入1×转膜缓冲液浸润两片海绵，使用玻璃棒去除海绵中的气泡，将海绵平放于转膜槽中，每侧一块。
D.剪两张BIO-RAD的厚滤纸，且滤纸尺寸要大于PVDF膜，浸入1×转膜缓冲液中，对齐后用玻璃棒排出气泡。
E.将滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸共同放置在海绵中央，且膜所在的一侧为正极，胶所在的一侧为负极，放好另一侧海绵，安装好转膜的设备。
F.在转膜槽中灌上适量的1×转膜缓冲液，将确定好正负极的转膜设备安装于转膜槽中，装好电极放置于冰上，设定电流为300mA、4℃开始恒流转膜，转膜的具体时间一般根据目的蛋白的分子量(即1KDa转膜1min)。
(7)免疫印迹反应及其化学发光的检测
A.转膜过程结束后，要将凝胶放于考马斯亮兰染液中染色，确定目的蛋白是否已完全转移到PVDF膜上。
B.将PVDF膜与凝胶的接触面朝上，放置于装有1×TBST的平皿中，在摇床上洗三次，5min/次。
C.弃去1×TBST缓冲液，并贴壁加入5％脱脂奶粉配制的封闭液，在室温条件下摇床孵育1.5h。
D.弃去封闭液，用1×TBST简单漂洗以除去膜上残留的奶粉颗粒。
E.根据不同目的蛋白对应的抗体，将PVDF膜分割成相应的部分，对应放入稀释好的一抗中，在4℃冰箱摇床上过夜。一抗的稀释比例见表13。
表13：一抗的稀释比例
F.应结束后，室温在摇床上先孵育至少半小时、回收一抗，用1×TBST洗膜30min，5min/次。
G.加入配制好的二抗稀释液，二抗的稀释比例见表14，室温条件下于摇床上孵育1小时。
表14：二抗的稀释比例
| 抗体名称 | 公司及货号 | 稀释比例 |
| 辣根酶标记山羊抗兔IgG | 中杉金桥ZB2301 | 1-10000 |
| 辣根酶标记山羊抗小鼠IgG | 中杉金桥ZB2305 | 1-5000 |
| 辣根酶标记兔抗山羊IgG | 中杉金桥ZB2306 | 1-10000 |
H.弃去二抗稀释液后，用1×TBST洗膜30min，5min/次。
I.取出PVDF膜，浸入到化学发光底物工作液中，染色1-3min，待膜完全浸润再用镊子取出，并在滤纸上轻沾吸去膜上液体。
J.将PVDF膜放入美国GE公司的超灵敏多功能成像仪Amersham Image 600中，通过调节相应参数进行成像。
K.通过Image J软件对成像所得条带光密度进行定量分析。
1.7统计学方法
数据统计结果使用的SPSS17.0进行数据分析，计量资料以均值±标准差(Means±SD)来表示。呈正态分布的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分别进行两两比较，当方差齐时选用LSD检验方法，当方差不齐时则选择Dunnett，s T3检验方法；呈非正态分布的数据则选择致和检验进行分析。所有的统计结果均采用双侧检验方法，P<0.05被认为检验结果有差异显著性，P<0.01被认为检验结果有极显著差异。
2.实验结果
2.1来源于女贞子的化合物抑制BPH-1细胞增殖的筛选
如图9所示，MTT结果表明，来源于女贞子的化合物LLA-8(达玛烯二醇)、LLA-14(对羟基苯乙醇)、LLA-20(女贞甙酸)、LLA-22(毛蕊花糖苷)、LLA-29(油苷甲酯)可有效抑制BPH-1本底细胞的增殖。本课题组前期对上述化合物进行AR、ER核转位的实验结果表明，上述5个化合物均促进ER入核，因此使用E2刺激BPH-1细胞，再加入相应化合物，如图10A-图10O所示，MTT、CCK-8实验结果显示，10nM、100nM、1μM上述5个化合物可有效抑制E2刺激的BPH-1细胞的增殖(P<0.01)，同时显著抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放(P<0.01)。
2.2来源于墨旱莲的化合物抑制BPH-1细胞增殖的筛选
如图11所示，MTT结果表明，来源于墨旱莲的化合物EPA-11(木犀草素)、EPA-16(鹰嘴豆芽素A)、EPA-19(刺囊酸)、EPA-23(刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖)可显著抑制BPH-1本底细胞的增殖。本课题组前期对上述化合物进行AR、ER核转位的实验结果表明，上述4个化合物中木犀草素促进AR入核，其他均促进ER入核，因此研究木犀草素时加入DHT刺激BPH-1细胞，其他化合物均使用E2刺激BPH-1细胞，再加入相应化合物，如图12A-图12I所示，MTT、CCK-8实验结果显示，10nM、100nM、1μM上述4个化合物显著抑制DHT或者E2刺激的BPH-1细胞的增殖(P<0.01)，同时显著抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放(P<0.01)。
结果显示，来源于女贞子的达玛烯二醇、对羟基苯乙醇、女贞甙酸、毛蕊花糖苷、油苷甲酯，来源于女贞子或墨旱莲的木犀草素，以及来源于墨旱莲的鹰嘴豆芽素A、刺囊酸、刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖对正常BPH-1细胞的增殖有抑制作用。
实施例3：女贞子提取物中的化合物的含量测定
1.实验样品和实验仪器
实验样品：实施例1中的1.3.1中的女贞子80％乙醇回流提取样品。
实验仪器：高效液相仪(Agilent 1260)、色谱柱Agilent 5TC-C18(5μm，4.6×250mm)，Mill-Q超纯水制备仪(Millipore公司)、离心机
2.实验方法
2.1对照品溶液制备
用移液枪分别准确吸取1mg/ml羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、女贞甙酸、酪醇、木樨榄苷-11甲酯、毛蕊花糖苷、木犀草苷、女贞苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素、齐墩果酸各50μl于1.5ml离心管中，并加入250μl的甲醇，使之成为50μg/ml的标准混合溶液，涡旋混匀。
2.2测定
色谱条件：
流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表15，流速1ml/min；柱温35℃；进样量10μl。
表15：UPLC梯度洗脱程序
| 时间(min) | 0 | 5 | 15 | 60 | 80 | 85 |
| 乙腈比例/％ | 7 | 7 | 10 | 35 | 90 | 100 |
女贞子80％乙醇回流提取样品用80％乙醇稀释10倍；稀释液离心(14000ppm*10min)、过膜(0.22μm)。上清液与混合对照品溶液(50μg/ml)转移100μl于进样小瓶内存管中，待仪器压力稳定后进样测定，进样量10μL，记录各样品峰面积，外标一点法计算羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、女贞甙酸、酪醇、木樨榄苷-11甲酯、毛蕊花糖苷、木犀草苷、女贞苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素、齐墩果酸的含量。
3.实验结果
如下面的表16所示。
表16：女贞子提取物样品中的化合物含量(稀释前的含量)
| 化合物 | 含量μg/g |
| 羟基酪醇 | 412.07 |
| 原儿茶酸 | 76.94 |
| 红景天苷 | 540.69 |
| 女贞甙酸 | 1342.05 |
| 酪醇 | 482.25 |
| 木樨榄苷-11甲酯 | 1551.27 |
| 毛蕊花糖苷 | 564.84 |
| 木犀草苷 | 94.70 |
| 女贞苷+特女贞苷 | 2362.86 |
| 橄榄苦苷 | 1642.38 |
| 女贞苷G13 | 812.62 |
| 木犀草素 | 321.19 |
| 芹菜素 | 58.66 |
| 齐墩果酸 | 1565.10 |
实施例4：墨旱莲提取物中的化合物的含量测定
1.实验样品和实验仪器
实验样品：实施例1中的1.3.2中的墨旱莲60％乙醇回流提取样品。
实验仪器：UPLC-MS-Q-TOF、色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm 2.1×100mm)，Mill-Q超纯水制备仪(Millipore公司)、离心机
2.实验方法
2.1对照品溶液制备
用移液枪分别准确吸取1mg/ml蟛蜞菊内酯、木犀草素、芹菜素、槲皮素、木犀草苷、芦丁、齐墩果酸、鹰嘴豆牙素A、三联噻吩、旱莲苷A、旱莲苷C、刺囊酸、[2,2':5',2”-terthiophene]-5-carboxylicacid、3-酮-16α-羟基-12-烯-28-齐墩果酸、3-hydroxybiochanin A各50μl于1.5ml离心管中，并加入250μl的甲醇，使之成为50μg/ml的标准混合溶液，涡旋混匀。分别吸取100μl的50μg/ml的标准混合溶液和900μl甲醇于离心管中，涡旋混匀得最终浓度为5μg/ml的标准混合溶液。
2.2测定方法
色谱条件：
流动相为乙腈(A)-0.1％乙酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表17，流速0.3ml/min；柱温35℃；进样量5μl。
表17：UPLC梯度洗脱程序
| 时间(min) | 0 | 22 | 33 | 34 |
| 乙腈比例/％ | 10 | 53 | 100 | 100 |
质谱条件
如下面的表18所示。
表18：质谱条件
| 项目 | 选择 |
| 离子源 | ESI<sup>-</sup> |
| 载气压力 | 30psig |
| 检测范围 | 150 to 1500m/z |
| 干燥气流速 | 10L/min |
| 干燥气体温度 | 320℃ |
| 毛细管电压 | 3.5KV |
| 离子传输电压 | 130V |
| 锥孔电压 | 65V |
墨旱莲60％乙醇回流提取样品，用60％乙醇稀释5倍后离心(14000ppm*10min)、过膜(0.22μm)。上清液与混合对照品溶液(5μg/ml)转移100μl于进样小瓶内存管中，待仪器压力稳定后进样测定，进样量5μL，记录各样品峰面积，外标一点法计算蟛蜞菊内酯、木犀草素、芹菜素、槲皮素、木犀草苷、芦丁、齐墩果酸、鹰嘴豆牙素A、三联噻吩、旱莲苷A、旱莲苷C、刺囊酸、[2,2':5',2”-terthiophene]-5-carboxylic acid、3-酮-16α-羟基-12-烯-28-齐墩果酸、3-hydroxybiochanin A的含量。
3.实验结果
如下面的表19所示。
表19：墨旱莲提取物样品中各成分含量(稀释前的含量)
参考文献：
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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津中医药大学
<120> 二至方在制备防治良性前列腺增生症的药物中的用途
<130> IDC190077
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 1
atgattctac ccacggcaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctggaagatg gtgatgggtt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
gagcaacttg gaatcccaga acagg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
ccaagctccc cactcgcaga aaact 25
Claims (15)
1.包含女贞子和墨旱莲的组合物或该组合物的提取物在制备选自如下的药物中的用途：
(1)治疗和/或预防良性前列腺增生症的药物；
(2)抑制人前列腺增生上皮细胞增殖的药物；或
(3)抑制PCNA蛋白表达和/或抑制其mRNA表达的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；
优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成。
3.根据权利要求1－2中任一权利要求所述的用途，其中，所述提取物中：
毛蕊花糖苷的含量为0.052mg/g－5.2mg/g，优选为0.26mg/g－1.04mg/g；
刺囊酸的含量为0.00057mg/g－0.057mg/g，优选为0.00285mg/g－0.0104mg/g；和/或
木犀草素的含量为0.03mg/g－3mg/g，优选为0.15mg/g－0.6mg/g。
4.根据权利要求1－3中任一权利要求所述的用途，其中，所述提取物由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中女贞子提取物通过包含步骤(1)、(1)-(2)、(1)-(3)或者(1)-(4)的方法制得：
(1)取女贞子药材，加入3－15倍量的50％－90％的乙醇回流提取1次或多次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
(2)合并提取液；
(3)将提取液浓缩得到浓缩液；
(4)将浓缩液干燥，得女贞子浸膏。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于如下的①-⑥项中的任意一项或者多项：
①步骤(1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
②步骤(1)中，加入75％-85％的乙醇，优选加入80％的乙醇；
③步骤(1)中，提取2或3次；
④步骤(1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
⑤步骤(1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃或者大于或等于95℃；
⑥步骤(4)中，将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
6.根据权利要求1－5中任一权利要求所述的用途，其中，所述提取物由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中墨旱莲提取物通过包含步骤1)、1)-2)、1)-3)、1)-4)或者1)-5)的方法制得：
1)取墨旱莲药材，加入3－15倍量的50％－80％的乙醇提取1－4次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
2)合并提取液；
3)将提取液用乙酸乙酯萃取1－6次，得到萃取液；
4)将萃取液浓缩得到浓缩液；
5)将浓缩液干燥，得墨旱莲浸膏。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于如下的A-G项中的任意一项或者多项：
A.步骤1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
B.步骤1)中，加入55％-65％的乙醇，优选加入60％的乙醇；
C.步骤1)中，提取2或3次；
D.步骤1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
E.步骤1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃或者大于或等于；
F.步骤3)中，将提取液用乙酸乙酯萃取3或4次，得到萃取液；
G.将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
8.一种提取物，其由包含女贞子和墨旱莲的组合物制得，其中，按照重量百分比计算，所述提取物中：
毛蕊花糖苷的含量为0.052mg/g－5.2mg/g，优选为0.26mg/g－1.04mg/g；
刺囊酸的含量为0.00057mg/g－0.057mg/g，优选为0.00285mg/g－0.0104mg/g；和/或
木犀草素的含量为0.03mg/g－3mg/g，优选为0.15mg/g－0.6mg/g。
9.根据权利要求8所述的提取物，其中，女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；
优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成。
10.根据权利要求8或9所述的提取物，其由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中女贞子提取物通过包含步骤(1)、(1)-(2)、(1)-(3)或者(1)-(4)的方法制得：
(1)取女贞子药材，加入3－15倍量的50％－90％的乙醇回流提取1次或多次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
(2)合并提取液；
(3)将提取液浓缩得到浓缩液；
(4)将浓缩液干燥，得女贞子浸膏。
11.根据权利要求10所述的提取物，其特征在于如下的①-⑥项中的任意一项或者多项：
①步骤(1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
②步骤(1)中，加入75％-85％的乙醇，优选加入80％的乙醇；
③步骤(1)中，提取2或3次；
④步骤(1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
⑤步骤(1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃或者大于或等于95℃；
⑥步骤(4)中，将浓缩液真空50℃干燥，得女贞子浸膏。
12.根据权利要求8－11中任一权利要求所述的提取物，由女贞子提取物和墨旱莲提取物合并得到，其中墨旱莲提取物通过包含步骤1)、1)-2)、1)-3)、1)-4)或者1)-5)的方法制得：
1)取墨旱莲药材，加入3－15倍量的50％－80％的乙醇提取1－4次，每次0.5h－5h，提取的温度为大于或等于80℃；
2)合并提取液；
3)将提取液用乙酸乙酯萃取1－6次，得到萃取液；
4)将萃取液浓缩得到浓缩液；
5)将浓缩液干燥，得墨旱莲浸膏。
13.根据权利要求12所述的提取物，其特征在于如下的A-G项中的任意一项或者多项：
A.步骤1)中，加入8-12倍量的乙醇，优选加入10倍量的乙醇；
B.步骤1)中，加入55％-65％的乙醇，优选加入60％的乙醇；
C.步骤1)中，提取2或3次；
D.步骤1)中，每次提取为1-3小时，优选2小时；
E.步骤1)中，提取的温度为大于或等于85℃、大于或等于90℃或者大于或等于95℃；
F.步骤3)中，将提取液用乙酸乙酯萃取3或4次，得到萃取液；
G.将浓缩液真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏。
14.一种药物组合物，其包含有效量的组合物或其提取物，所述组合物包含女贞子和墨旱莲；
可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物组合物还包含选自如下药物中的一种或多种：
α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、依立雄胺或度他雄胺)、α肾上腺受体阻滞剂(例如坦索罗辛或奈哌地尔)和M受体拮抗剂(例如托特罗定或索利那新)、补肾祛瘀汤、三草舒癃汤、桂枝茯苓方、知柏地黄方、锁阳水煎液、桂枝水煎液和凤尾草颗粒；
优选地，所述组合物中的女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成；
优选地，所述提取物为权利要求8至13中任一权利要求所述的提取物；
优选地，其中组合物或其提取物的量能够满足连续给药大于28天、大于或等于30天、大于或等于35天、大于或等于40天、或者大于或等于45天。
15.一种组合药物产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，
其中，
所述第一产品包含有效量的组合物或其提取物，所述组合物包含女贞子和墨旱莲；
所述第二产品包含选自如下药物中的一种或多种：
α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、依立雄胺或度他雄胺)、α肾上腺受体阻滞剂(例如坦索罗辛或奈哌地尔)和M受体拮抗剂(例如托特罗定或索利那新)、补肾祛瘀汤、三草舒癃汤、桂枝茯苓方、知柏地黄方、锁阳水煎液、桂枝水煎液和凤尾草颗粒；
优选地，所述组合物中的女贞子和墨旱莲的质量比为(1：20)至(20：1)、(1：10)至(10：1)、(1：5)至(5：1)、(1：3)至(3：1)、(1：2)至(2：1)、(1：1.5)至(1.5：1)、(1：1.2)至(1.2：1)或者为1：1；优选地，所述组合物由女贞子和墨旱莲组成；
优选地，所述提取物为权利要求8至13中任一权利要求所述的提取物；
优选地，其中组合物或其提取物的量能够满足连续给药大于28天、大于或等于30天、大于或等于35天、大于或等于40天、或者大于或等于45天。
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