CN108524555A - 一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，该方法采用治疗高血脂和动脉硬化的药物月见草油，以来曲唑灌胃构建多囊卵巢综合征为动物模型，利用患者口服剂量换算的合适剂量灌胃动物模型，达到改善多囊卵巢综合征模型动物的内分泌和氧化应激水平。本发明的方法利用月见草油的抗氧化的特性，从PCOS本身的病理特性出发，采用不同剂量的月见草油胶囊用于改善多囊卵巢综合症模型动物的内分泌和氧化应激水平，并且卵巢组织形态学也显示月见草油使用后改善了模型动物卵巢形态结构，因此，该方法增加了月见草油胶囊在妇产科和生殖医学领域的适应症，服用方法简便，重复性好，达到了增加药物适用范围的目的。

Description

一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法。

背景技术：

多囊卵巢综合征(PCOS)是孕龄妇女不排卵的常见原因，临床主要表现为月经失调、不孕、多毛与痤疮、肥胖、高血压、高脂血症以及糖代谢异常，已报道这些异常特征都与氧化应激密切相关。多囊卵巢综合征(PCOS)患者的氧化应激标记物包括脂质过氧化作用和蛋白质羟基含量升高，总抗氧化能力减低，抗氧化物谷胱甘肽、结合珠蛋白表达减少。有学者通过临床研究推断，氧化应激损伤可能是PCOS发病的重要环节，并通过直线回归分析发现：反映肥胖的内脂素水平与氧化应激水平间具有良好的线性关系，并进一步推测氧化应激与肥胖PCOS患者的发病有密切关系。PCOS严重影响女性的身心健康，近年来中医药治疗多囊卵巢综合征经济实惠，安全可靠，受到越来越多的关注。已证明月见草油(EPO)能调节女性内分泌，恢复月经周期并减少痛经的发生，对中年更年期也有显著的改善疗效，很多学者通过动物实验研究也表明EPO直接调整了实验动物的氧化应激平衡，间接维护了内分泌物质的平衡。为此，本发明提供一种关于月见草油改善多囊卵巢综合征氧化应激的方法。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法。

为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，该方法采用治疗高血脂和动脉硬化的药物月见草油，以来曲唑灌胃构建多囊卵巢综合征为动物模型，利用患者口服剂量换算的合适剂量灌胃动物模型，达到改善多囊卵巢综合征模型动物的内分泌和氧化应激水平。具体如下：

(1)将试验动物适应性喂养7天后，正常对照组的实验动物用1％羧甲基纤维素灌胃，模型组的实验动物用1mg/kg的来曲唑和1％羧甲基纤维素钠，分别连续灌胃21天，并给予高脂饲料喂养，进行PCOS动物模型构建；

(2)待PCOS动物模型构建成功后，阳性对照组对模型成功的实验动物连续灌胃60mg/kg的二甲双胍4周，治疗组对模型成功的实验动物按照大、中、小剂量每天连续灌胃月见草油胶囊4周，灌胃期间均给予正常饲料和饮用水；

(3)按人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表计：二甲双胍治疗PCOS常用剂量为每次口服500mg，每日3次；换算后实验动物给药量为135mg/kg/d，连续用药4周。

利用月见草油的特性和多囊卵巢综合征的病理特征，通过上述具体步骤采用大鼠灌胃的方法，针对利用来曲唑构建的PCOS模型为研究对象，采用不同剂量的月见草油给予模型大鼠，改善多囊卵巢综合征模型大鼠的内分泌和氧化应激水平，具体步骤如下：

(1)动情周期的观察：大鼠的发情周期为4～5d，不同阶段阴道涂片脱落细胞呈现的细胞类型不同。吸取少量生理盐水，滴入大鼠阴道，吹打数次后吸出阴道液，再吹打均匀后进行涂片，在显微镜下观察记录细胞类型，并判断发情周期的阶段。

(2)大鼠体重和空腹血糖的检测：用电子天平称量大鼠体重，动物禁食不禁水8h后，取大鼠尾部血进行血糖测定，并于造模前后进行血糖监测。

(3)胰岛素敏感性测定：各组大鼠禁食12h后称重，采尾静脉血用Biomine末梢血糖仪测定空腹血糖水平以及采用ELISA试剂盒复孔测定空腹胰岛(FINS)水平。药物干预结束后再次测定以上指标。

(4)ELISA试剂盒检测血清中激素水平和氧化水平：最后一次给药后，实验动物禁食不禁水，次日经麻醉后进行心脏取血，全血样置4℃冰箱次日经3000g离心20min后收集上层血清并分装，依据ELISA试剂盒说明书通过酶标仪测定激素浓度和氧化因子浓度，剩余血清可放置至-80℃保存。

(5)HE染色鉴定PCOS模型卵巢组织形态改变：各组大鼠灌药结束后禁食不禁水，第二天经水合氯醛(7％)麻醉后取其背部两侧卵巢，剥掉其表面的脂肪组织，多聚甲醛固定过夜，常规脱水，石蜡包埋，烤片结束后进行常规HE染色鉴定。

(6)免疫组化技术检测卵巢组织氧化应激蛋白表达定位：将卵巢组织进行常规脱水，并切片后，60℃烤箱中烤片，经脱蜡液，复水，枸橼酸抗原修复，山羊血清封闭，一抗4℃过夜孵育，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片晾干。

(6)免疫印迹技术检测氧化应激蛋白表达水平：按照蛋白提取试剂盒提取各组大鼠的卵巢组织总蛋白，BCA测定蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜并封闭，一抗孵育，二抗孵育，ECL显影，并扫描拍照，图像分析。

以月见草油胶囊中月见草油不同剂量(试验中按照小剂量、中剂量和大剂量；灌胃剂量以60kg患者口服6粒(0.3g/粒月见草油剂量)，每天3次的月见草油胶囊换算)灌胃大鼠，以中剂量0.1g～1g为最佳剂量使用，改善PCOS效果最佳。结果显示：

(1)按照中剂量PCOS模型大鼠灌胃，可改善PCOS模型大鼠动情周期；

(2)按照中剂量PCOS模型大鼠灌胃，可改善PCOS模型大鼠血清内分泌水平；

(3)按照中剂量PCOS模型大鼠灌胃，可改善PCOS模型大鼠血清氧化应激水平；

(4)按照中剂量PCOS模型大鼠灌胃，可改善PCOS模型大鼠卵巢组织氧化应激表达水平。

本发明的方法利用月见草油的抗氧化的特性，从PCOS本身的病理特性出发，采用不同剂量的月见草油胶囊用于改善多囊卵巢综合征患者的内分泌和氧化应激水平，并且卵巢组织形态学也显示月见草油使用后改善了卵巢形态结构，因此，该方法增加了月见草油胶囊在妇产科和生殖医学领域的适应症，服用方法简便，重复性好，达到了增加药物适用范围的目的。

附图说明：

图1是实施例中模型大鼠连续10天大鼠阴道脱落细胞检查结果显示图；

图2是实施例中卵巢组织的HE染色特征(100×)结果显示图；

图3是实施例中SOD1分别在卵巢组织中的表达(100×)结果显示图；

图4是实施例中GST-px分别在卵巢组织中的表达(100×)结果显示图；

图5是实施例中SOD1和GST-px分别在各组卵巢组织中的表达水平。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1.分组及给药：所有大鼠适应性喂养7天后，正常对照组大鼠用1％羧甲基纤维素灌胃，连续灌胃21天；模型组用来曲唑(1mg/kg+1％羧甲基纤维素钠)连续灌胃21天，在这期间所有老鼠均给予高脂饲料喂养；大鼠造模成功后，阳性对照组连续灌胃二甲双胍(60mg/kg)6周，治疗组按照大、中、小剂量每天灌胃月见草油胶囊连续6周，所有治疗组灌胃期间均给予正常饲料和饮用水。按人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表；二甲双胍治疗PCOS常用剂量为每次口服500mg，每日3次；换算后大鼠给药量为135mg/kg/d，连续用药4周。

2.动情周期的观察：大鼠的发情周期为4～5d，不同阶段阴道涂片脱落细胞呈现的细胞类型不同。吸取少量生理盐水，滴入大鼠阴道，吹打数次后吸出阴道液，再吹打均匀后进行涂片，在显微镜下观察记录细胞类型，并判断发情周期的阶段。

参见图1，模型大鼠连续10天大鼠阴道脱落细胞检查结果显示：正常对照组大鼠阴道脱落细胞涂片均可见规律的动情周期。PCOS模型组中大鼠阴道脱落细胞涂片偶见少量有核上皮细胞及无核角化细胞，主要表现为大量中性粒细胞持续存在，提示不规则的动情周期，可见动情周期紊乱，延长或停滞。

3.大鼠体重和空腹血糖的检测：用电子天平称量大鼠体重，动物禁食不禁水8h后，取大鼠尾部血进行血糖测定，并于造模后和月见草油胶囊灌胃治疗后进行血糖监测。结果表1：

表1各组大鼠空腹血糖和空腹胰岛素的比较

#表示与正常对照组差异显著p＜0.05；*表示与模型组差异显著p＜0.05

由表1可知：PCOS模型组空腹血清血糖和胰岛素均升高，而经过二甲双胍和中剂量月见草胶囊治疗后，空腹血糖和空腹胰岛素均显著性下降。

4.灌胃处理完成后处死大鼠，将各组大鼠一侧卵巢组织行HE染色制片，观察卵巢组织形态学：卵巢组织的HE染色特征(100×)，其中：A表示空白组，B表示模型组，C表示阳性对照组，D表示小剂量组，E表示中剂量组，F表示大剂量组参见图2结果显示：

(1)正常对照组：大鼠卵巢皮髓质构造正常，可见较多的始基卵泡及各级发育中的卵泡和黄体，排卵前卵泡体积大，卵泡液含量多。

(2)模型空白对照组：肉眼观察大鼠卵巢体积较正常对照组明显增大，长径较长；镜下见大鼠卵巢组织内有较多数量的囊状扩张卵泡，卵泡内颗粒细胞层数显著减少甚至消失,不见卵母细胞及放射冠，黄体和发育各阶段的卵泡数量显著减少，卵泡膜细胞及间质细胞可见增生。

(3)二甲双胍组：肉眼观察大鼠卵巢体积较模型空白对照组稍缩小；镜下见大鼠卵巢原始卵泡及初级卵泡数量增多，黄体数量增加。

(4)月见草油组：肉眼观察大鼠卵巢体积也较模型空白对照组稍缩小；镜下见大鼠卵巢原始卵泡及初级卵泡数量增多，黄体数量增加。

5.大鼠灌胃给药28天完成后，再次观察各组大鼠阴道脱落细胞涂片10天，后禁食24h，不禁水，所有大鼠称量体重，仍按体重计算麻醉药物(10％的水合氯醛)剂量，给予麻醉，然后经心脏采血，用试管收集每只大鼠血液约8～10ml，静置，待血液凝固后以3000r/min速度离心20min，随后用移液枪分装血清，并放置冰箱内(-20℃)保存备检，用于ELISA法检测血清T、LH、FSH、SOD、MDA、T-AOC水平。结果见表2、表3：

表2治疗前后各组大鼠血清氧化应激水平比较

#表示与正常对照组差异显著p＜0.05；*表示与模型组差异显著p＜0.05

表3治疗前后各组大鼠血清性激素水平比较

#表示与正常对照组差异显著p＜0.05；*表示与模型组差异显著p＜0.05

由上表2、表3可知：与正常对照组相比，PCOS模型组血清SOD1水平下降，MDA水平上升；与PCOS模型组相比，二甲双胍和中剂量月见草胶囊治疗后SOD1水平显著性上升，MDA水平显著性下降。与正常对照组相比，PCOS模型组血清激素中T、FSH、LH水平显著性上升，与PCOS模型组相比，二甲双胍和中剂量月见草胶囊治疗后T、FSH、LH水平显著性下降。

6.将卵巢组织冲洗干净，脱水、包埋、连续切片，片厚5μm；石蜡切片脱蜡至水；3％H₂O₂室温孵育10min，PBS冲洗5min×3次；滴加适当比例稀释的SOD1、GST-PX抗体，37℃孵育2h，PBS冲洗5min×3次；25℃孵育2h，4℃过夜，PBS洗2min×3次；滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温下20min，PBS洗2min×3次；滴加SABC复合物，室温20℃，PBS洗5min×4次。DAB显色10min左右，蒸馏水多次洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。阴性对照不加一抗，以正常山羊血清和PBS代替SOD1、GST-PX抗体作孵育。参见图3：SOD1分别在卵巢组织中的表达(100×)和图4：GST-px分别在卵巢组织中的表达(100×)，其中：A表示空白组，B表示模型组，C表示小剂量组，D表示中剂量组，E表示大剂量组，F表示阳性对照组。

结果显示：SOD1、GST-PX蛋白在各组颗粒细胞、黄体细胞和间质细胞中均有表达，SOD1在各个细胞的细胞浆中表达，GST-PX在细胞核和细胞浆中均有表达。

将组织从-70℃冰箱中取出，并准备液氮及研磨工具，将研磨过的卵巢组织装入1.5mLDolf管内并称重，加入增强型RIPA与PMSF混合液(两者比例100∶1)，加入混合液的量与组织的比重为5:1，放入4℃高速离心机下13000r/min离心30min，取上清，即为所提取之大鼠卵巢组织总蛋白。BCA法蛋白定量，调整使各样品总蛋白含量一致，采用5倍上样缓冲液蛋白变性，5％浓缩胶及10％分离胶SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转印，5％TBST脱脂奶粉封闭2小时，加入SOD1、GST-PX抗体(工作浓度1:400)4℃孵育过夜；洗涤后加入相应辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗(工作浓度1:10000)，37℃孵育2h；ECL法显色，胶片压片。采用Photoshop图像分析软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值β-actin来表示蛋白相对表达水平。参见图5：SOD1和GST-px分别在各组卵巢组织中的表达水平，其中：A表示空白组，B表示模型组，C表示小剂量组，D表示中剂量组，E表示大剂量组，F表示阳性对照组。

结果显示：SOD1、GST-PX蛋白在各组卵巢组织中均有表达，其中模型组为保护不被氧自由基损伤，机体SOD1、GST-PX表达较高，而当二甲双胍和中剂量月见草胶囊治疗后SOD1、GST-PX表达降低。

Claims (5)

1.一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，其特征在于：该方法是采用月见草油胶囊，以来曲唑灌胃构建多囊卵巢综合症动物模型，利用患者口服剂量换算的合适剂量灌胃动物模型，以达到改善多囊卵巢综合征模型动物的内分泌和氧化应激水平。

2.根据权利要求1所述的改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1)将试验动物适应性喂养7天后，正常对照组的实验动物用1％羧甲基纤维素灌胃，模型组的实验动物用1mg/kg的来曲唑和1％羧甲基纤维素钠，分别连续灌胃21天，并给予高脂饲料喂养，进行PCOS动物模型构建；

2)待PCOS动物模型构建成功后，阳性对照组对模型成功的实验动物连续灌胃60mg/kg的二甲双胍4周，治疗组对模型成功的实验动物按照大、中、小剂量每天连续灌胃月见草油胶囊4周，灌胃期间均给予正常饲料和饮用水；

3)按人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表，采用二甲双胍治疗PCOS常用剂量换算得出患者口服剂量及实验动物的给药量。

3.根据权利要求2所述的改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，其特征在于：所述采用二甲双胍治疗PCOS常用剂量换算得出患者口服剂量为每次口服500mg，每日3次。

4.根据权利要求2所述的改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，其特征在于：所述换算后实验动物给药量为135mg/kg/d，连续用药4周。

5.根据权利要求1所述的一种改善多囊卵巢综合征内分泌和氧化应激水平的方法，其特征在于：所述月见草油胶囊用于改善多囊卵巢综合征的内分泌和氧化应激水平。