CN109806268A - 哇巴因在制备抗非酒精性脂肪肝药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及哇巴因在制备抗非酒精性脂肪肝药物中的应用。本发明人首次采用植物来源的哇巴因，经实验表明，其能减轻高脂喂养的小鼠体重，并减轻高脂喂养小鼠以及Ob/0b小鼠的肝脏重量，降低小鼠血清中甘油三酯以及胆固醇的含量，减少肝脏中的脂肪含量，并改善肝组织学变化。此外，哇巴因还能够逆转由高脂诱导以及Ob/ob小鼠血清中转氨酶升高，缓解肝损伤。在表现出上述作用的同时，该浓度的哇巴因对小鼠的心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压都没有表现出明显影响，也未对小鼠的心脏以及主动脉的组织学结构产生明显的毒性作用。因此，小剂量的哇巴因在非酒精性脂肪肝疾病中表现出良好的保护作用，在该疾病的治疗方面有良好的开发价值与应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及钠钾ATP酶抑制剂哇巴因在治疗非酒精性脂肪肝疾病状态下肝脏中脂肪堆积以及肝细胞损伤中的新用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种临床疾病状态，其在1980年首次被提出，表现为没有明确的酒精摄入或其他导致慢性肝病病因的人肝脏中出现5％或者更多的肝细胞大泡型脂肪变性。NAFLD是全球发病率最高的肝病，在发达国家以及发展中国家，NAFLD是导致血清转氨酶升高的最常见原因。在大多数研究中，其发病率在25％-45％之间，并且该比率随着缺乏运动的生活方式的增多以及西方饮食的全球化等原因正呈逐年上升趋势。目前估计全球NAFLD的患者高达10亿，在美国大约影响到8千万到1亿人口，中国的NAFLD发病率近年来也逐渐上升，大约为15％-30％。
根据组织病理学特点，NAFLD被分为2种亚型：(1)非酒精性脂肪肝(Nonalcoholicfatty liver，NAFL)，表现为单纯肝细胞脂肪变性以及脂肪变性伴随轻度炎症，是一种脂肪肝的非进展性模式；(2)非酒精性脂肪肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，表现为肝细胞脂肪变性、肝细胞气球样变以及肝脏局灶炎症反应，可伴随窦周纤维化的发生。NASH是一种脂肪肝的进展形式，会导致肝硬化、肝细胞癌以及肝病相关的死亡。
肝纤维化是NAFLD预后的重要决定因素，在NAFLD患者中，有NASH表现的患者与仅有肝细胞脂肪变性的患者相比更容易进展为肝硬化。以往的研究显示，从2001年到2009年，NASH相关的肝移植从1.2％增长到9.7％，成为美国第三大肝移植病因。2013年，NASH已经成为美国等待肝移植成人中第二大病因，并且在不久的将来可能成为肝移植的头号病因。NASH是一种由多种机制诱导的代谢、基因、环境以及肠道微生物因素有关的复杂疾病。肝脏中脂肪的积累是NAFLD进展的始因，内脏的脂肪组织可以产生多重信号以改变脂质代谢以及糖代谢，从而促进肝脏中脂肪的堆积以及炎症反应的发生，导致肝细胞以及其他组织细胞损伤。若不能减轻损伤的过程，比如氧化应激、未折叠蛋白反应、脂毒性以及凋亡通路的激活等，则会导致肝损伤、进展性纤维化进而引起肝硬化，在一些患者中还会发展为肝细胞癌。因此，若能从源头上调节机体的糖脂代谢，减少脂肪在肝脏中的积累，则能减轻NAFLD疾病状态下肝脏中的炎症反应并减少由此引起的肝细胞损伤、肝纤维化以及肝硬化的发生。
对于大多数NAFLD患者来说，锻炼和合理饮食是治疗的最重要方式。数据显示，每周120min的有氧运动可以改善NAFLD患者的胰岛素敏感性，增加糖摄取。严格的饮食控制也能够改善NAFLD患者的肝组织学结构。对于一些严重的NAFLD患者(比如已发展至NASH以及肝硬化)，则需要进行一定的医学干预，而药物干预是最重要的方式。现临床主要的药物包括抗氧化剂如维生素E；胰岛素增敏剂如吡格列酮以及二甲双胍；降脂药物如他汀类药物；细胞保护剂如熊去氧胆酸；PPARγ激动剂如噻唑烷二酮类药物；改善脂肪肝以及纤维化的制剂奥贝胆酸等。这些药物中，维生素E以及吡格列酮的作用较为确切。维生素E是仅有的对非糖尿病NASH有益的制剂，其可以通过抑制脂质过氧化以及氧化应激反应，改善NASH相关的炎症以及肝细胞损伤。吡格列酮在临床试验中显示出具有肝组织学改善作用，包括对脂肪变性、小叶炎症以及肝细胞气球样变的逆转作用。但是，没有前瞻性的证据表明这两种药物对纤维化具有改善作用。
强心苷是一类天然来源的能与Na+/K+-ATPase结合并抑制其活性的化合物。该类化合物显示出相当大的结构多样性，但是它们都有一个共同的甾体母核结构。该甾体母核在17位的不饱和内酯环以及3位的糖基上可以发生双取代，其中内酯部分表现出苷类特性。根据取代基不同，有以下几种研究较为广泛的强心苷类化合物：地高辛(Digoxin，C41H64O14)、洋地黄毒苷(Digitoxin，C41H64O13)、哇巴因(Ouabain，C29H44O12)以及夹竹桃苷(Oleandrin，C32H48O9)。有超过100种强心苷被认为是植物中的二次代谢产物，它们大多来源于被子植物。随着质谱技术等分离手段的发展，人们发现在哺乳动物体内也存在内源性强心苷，统称为洋地黄样物质。该类物质主要存在于哺乳动物组织及体液中，如ouabain被发现存在于人的血浆、肾上腺皮质以及下丘脑中，地高辛则能够在人的尿液中被检测到。
1785年，William Withering首次提出使用洋地黄提取物治疗心脏疾病。到目前为止，该家族成员地高辛仍是临床治疗心衰的重要药物。此外，最近的研究表明Na+/K+-ATPase可作为信号转导分子发挥作用。强心苷类化合物与Na+/K+-ATPase结合能够激活下游多个信号通路，在多个重要的细胞过程的调节中发挥重要作用。有研究显示ouabain能够通过触发钙-核因子κB信号通路，保护肾脏免受营养不良的负面影响。此外，ouabain可通过激活Src激酶，保护线粒体外膜的完整性以及减少ROS的产生，保护缺血再灌注引起的大鼠心脏损伤。在肿瘤治疗方面，低浓度的ouabain可通过起始Src/MAPK信号通路，抑制p53的蛋白合成，用于治疗有p53突变的人类肿瘤。然而，至今没有ouabain对NAFLD作用的研究报道，我们在工作中发现ouabain在不影响心率以及血压的前提下，能够减轻高脂饲养小鼠的肝脂含量，同时减轻该疾病状态下小鼠的肝损伤，从而显示ouabain在治疗脂肪肝方面具有较好的应用价值与前景。
发明内容
本发明的目的是提供Na+/K+-ATPase抑制剂哇巴因在治疗非酒精性脂肪肝中的新用途。
本发明所述的哇巴因，其分子式为C29H44O12·gH2O，分子量为728.77，英文名称为ouabain，其化学结构式见图1。
本发明所述的哇巴因治疗非酒精性脂肪肝，主要表现在其减轻非酒精性脂肪肝疾病状态下肝脏中脂肪的积累以及由此导致的肝损伤。
本发明所述的哇巴因治疗非酒精性脂肪肝，在高脂诱导的以及Ob/ob肥胖小鼠非酒精性脂肪肝模型中，哇巴因的给药方式为腹腔注射，给药剂量为0.1mg/kg。
本发明人首次采用植物来源的哇巴因，经实验表明，该化合物能减轻高脂喂养的小鼠体重，并减轻高脂喂养小鼠以及Ob/ob肥胖小鼠的肝脏重量，降低小鼠血清中甘油三酯以及胆固醇的含量，减少肝脏中的脂肪含量，并改善肝组织学变化。此外，哇巴因还能够逆转由高脂诱导以及Ob/ob小鼠血清中转氨酶升高，缓解肝损伤。在表现出上述作用的同时，该浓度的哇巴因对小鼠的心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压都没有表现出明显影响，也未对小鼠的心脏以及主动脉的组织学结构产生明显的毒性作用。因此，小剂量的哇巴因在非酒精性脂肪肝疾病中表现出良好的保护作用，在该疾病的治疗方面有良好的开发价值与应用前景。
附图说明
图1：哇巴因的化学结构式。
图2：哇巴因减轻高脂喂养的小鼠体重。小鼠分别用对照饲料(NFD)以及高脂饲料(HFD)喂养6周后，每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，每周监测小鼠体重变化(n＝8)；同样，6周龄的Ob/ob小鼠每天也给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，每周监测小鼠体重变化(n＝8)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与NFD组或Ob/con组相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与HFD组或Ob/ob组相比。
图3：哇巴因减轻高脂喂养以及Ob/ob小鼠的肝重。小鼠分别用对照饲料(NFD)以及高脂饲料(HFD)喂养6周后，每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射；同样，6周龄的Ob/ob小鼠每天也给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射。两种模型小鼠均在第12周末处死，取出肝脏并称重(n＝8)。上侧两幅图为NFD以及HFD小鼠肝重以及肝重/体重比值；下侧两幅图为Ob/con以及Ob/ob小鼠肝重以及肝重/体重比值。*P＜0.05，***P＜0.001，与NFD组或Ob/con组相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与HFD组或Ob/ob组相比。
图4：哇巴因降低高脂喂养以及Ob/ob小鼠血清中的TG与TC水平以及小鼠肝脏中的TG水平。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。取小鼠血清以及肝脏，检测血清中的TG与TC水平，以及肝脏中的TG水平(n＝8)。上侧三幅图为NFD以及HFD小鼠血清中的TG、TC水平以及肝脏中的TG水平；下侧三幅图为Ob/con以及Ob/ob小鼠血清中的TG、TC水平以及肝脏中的TG水平。**P＜0.01，***P＜0.001，与NFD组或Ob/con组相比；#P＜0.05，##P＜0.01，与HFD组或Ob/ob组相比。
图5：哇巴因减轻高脂喂养以及Ob/ob小鼠肝脏脂肪变性、小叶炎症反应以及肝细胞气球样变。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。取小鼠肝脏制备石蜡切片进行HE染色。上半部分为NFD以及HFD小鼠肝脏HE染色结果，黑色箭头指肝细胞脂肪变性，红色箭头指肝细胞气球样变；下半部分为Ob/con以及Ob/ob小鼠肝脏HE染色结果，黑色箭头指肝细胞脂肪变性，红色箭头指小叶炎症反应。
图6：哇巴因减少脂肪在高脂喂养以及Ob/ob小鼠肝脏中的堆积。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。取小鼠肝脏制备冰冻切片进行油红O(Oil O Red)染色。上半部分为NFD以及HFD小鼠肝脏油红O染色结果；下半部分为Ob/con以及Ob/ob小鼠肝脏油红O染色结果。箭头所指红色区域为堆积在肝脏中的脂肪成分。
图7：哇巴因降低高脂喂养以及Ob/ob小鼠血清中AST、ALT以及ALP水平。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。取小鼠血清分别检测AST、ALT以及ALP水平。上侧三幅图从左至右分别为NFD以及HFD小鼠血清AST、ALT以及ALP水平；下侧三幅图从左至右分别为Ob/con以及Ob/ob小鼠血清ASL、ALT以及ALP水平。**P＜0.01，***P＜0.001，与NFD组或Ob/con组相比；#P＜0.05，###P＜0.001，与HFD组或Ob/ob组相比。
图8：哇巴因对高脂喂养以及Ob/ob小鼠的心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压不产生明显影响。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。采用尾压法测定小鼠心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压。上侧四幅图从左至右分别为NFD以及HFD小鼠心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压水平；下侧四幅图从左至右分别为Ob/con以及Ob/ob小鼠心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压水平。
图9：哇巴因对高脂喂养以及Ob/ob小鼠的心脏以及主动脉结构不产生明显影响。饲喂NFD以及HFD饲料6周的小鼠以及6周龄的Ob/con与Ob/ob小鼠每天给予0.1mg/kg的哇巴因或等量的生理盐水腹腔注射，连续处理6周。处死小鼠并取小鼠心脏以及主动脉制备石蜡切片进行HE染色。选择心脏右心耳、心房肌以及心室肌三个视野来反映小鼠心脏结构变化。
具体实施方案
下面的实施方案可详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一 小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立
1.1实验材料
6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠以及6周龄的雄性Ob/ob小鼠来源于南京大学-模式动物研究所；60％高脂饲料(D12492)以及等热量对照饲料(D12450J)购自美国ResearchDiets公司。
1.2实验方法
1.2.1高脂饲料喂养诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型
6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠适应性喂养数天，随机分为低脂饲料组(NFD)以及高脂饲料组(HFD)。NFD组小鼠每天给予D12450J饲料连续喂养12周，HFD小鼠则每天给予D12492高脂饲料连续喂养12周。所有小鼠给予自由饮水，每周监测小鼠体重变化。
1.2.2 Ob/ob转基因小鼠非酒精性脂肪肝模型
Ob/ob小鼠是瘦素基因Ob自发突变的纯合子小鼠。纯合子突变的小鼠体重增加迅猛，可达野生型对照小鼠正常体重的三倍。该小鼠表现为摄食过量，脂肪细胞数量增多、体积增大，出现脂肪肝表型。后期由于体重增加会导致高胰岛素血症，表现为高血糖综合征、糖耐量不良等2型糖尿病特征，但其血糖水平会在14-16周后逐渐降低。这种小鼠的肥胖症与人类的肥胖症很相似，利用这种小鼠曾进行了许多关于肥胖症的生化、病理、激素及药物治疗等的研究。因此除了利用高脂饲料诱导，本研究同时采用这种转基因肥胖小鼠进行非酒精性脂肪肝的研究。
1.3实验结果
与NFD组小鼠相比，HFD组小鼠喂养2周后，即出现体重明显增加，且随着喂养时间的延长，体重增加更加明显，到第12周，HFD组小鼠约为NFD组小鼠的1.6倍(图2)；6周龄的Ob/ob小鼠与Ob/con组小鼠相比，体重大约增加1.5倍(图2)。
实施例二 哇巴因减轻非酒精性脂肪肝疾病状态下小鼠肝脏中脂肪的堆积
2.1实验材料
哇巴因购自美国Sigma公司；甘油三酯(TG)以及胆固醇(TC)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HE染色试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；油红O试剂购自美国Sigma。
2.2实验方法
2.2.1哇巴因的给药方法及样本采集
6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(每组8只)，NFD以及HFD饲料分别喂养2组小鼠。6周后，NFD饲料喂养的两组小鼠分别给予O.1mg/kg的哇巴因(NFD+Ouabain组)或者等量的生理盐水(NFD组)腹腔注射，连续注射6周；HFD饲养的两组小鼠同样也给予0.1mg/kg的哇巴因(HFD+Ouabain组)或等量的生理盐水(HFD组)连续腹腔注射6周，期间每周监测各组小鼠体重变化。
6周龄的Ob/con以及Ob/ob小鼠均随机分为两组(每组各8只)，Ob/con以及Ob/ob小鼠均分别给予0.1mg/kg的哇巴因(Ob/con+Ouabain或Ob/ob+Ouabain组)或等量的生理盐水(Ob/con或Ob/ob组)腹腔连续注射6周，期间每周监测各组小鼠体重变化。
给药结束后，采用摘眼球取血，3000rpm离心10min分离血清，用于检测其中TG以及TC水平(详细方法见2.2.2)。分离并完整取出小鼠肝脏，预冷PBS洗去肝脏表面血渍，吸水纸吸干水分后，称重并记录肝脏重量。取一叶肝脏于4％多聚甲醛中固定，梯度脱水，石蜡包埋并切片，用于后期病理学形态的检测。取另一叶肝脏组织，OTC包埋并切冰冻切片，切片于-20℃保存。剩余组织分装于冻存管中，于-80℃保存。
2.2.2小鼠血清以及肝脏中TG以及TC含量的检测
本实验采用TG测定试剂盒(GPO-PAP酶法)以及TC测定试剂盒(COD-PAP法)测定小鼠血清以及肝脏中的TG以及TC水平。血清样本根据试剂盒说明直接测定，肝脏样本按重量(g)∶体积(ml)＝1∶9的比例，加入9倍体积的无水乙醇，冰浴条件下机械匀浆，2500rpm，离心10min，取上清液按照说明书步骤测定。
2.2.3小鼠肝脏HE染色
肝脏石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化(浓度从高到低)，蒸馏水洗1min，切片于苏木素中染色15min，流水冲洗，1％盐酸酒精分化1-3s，流水冲洗，稀氨水反蓝数秒，蒸馏水洗1min，随后切片于伊红中染色3-5min，梯度乙醇脱水(浓度从低到高)，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下细胞核呈蓝色，胞浆呈红色。
2.2.4小鼠肝脏油红O染色
油红O储备液配制：100％异丙醇100ml+0.5g油红O粉末，充分溶解，过滤，于4℃避光保存。
油红O工作液配制：开始染色前，将储备液与蒸馏水按3∶2的比例稀释，滤纸过滤，工作液呈酒红色且无沉淀即可使用。
取出冰冻切片，室温回温数分钟，蒸馏水浸洗，以脱去包埋剂，室温晾干；60％异丙醇浸洗2min，便于油红O染色；随后使用新鲜配制的油红O工作液染色15min，60％异丙醇调色(这一步在显微镜下进行)，调色结束后立即水洗；苏木素复染1min，1％盐酸酒精分化1s，蒸馏水反蓝；染色结束后用甘油明胶立即封片。显微镜下细胞核呈蓝色，脂滴呈红色。
2.3实验结果
HFD喂养6周的小鼠给予哇巴因腹腔注射，3周后即出现体重明显下降，且随着给药时间的延长，与对照组的差异愈加明显；而哇巴因对NFD组小鼠的体重没有明显影响(图2)。HFD组小鼠与NFD组小鼠相比，肝脏重量明显上升，且肝重/体重比值也明显增加，而哇巴因能明显降低HFD组小鼠的肝重以及肝重/体重比值；与HFD小鼠类似，哇巴因也能降低Ob/ob小鼠的肝脏重量(图3)。对小鼠血清中TG以及TC水平的检测结果显示，HFD饲料喂养12周的小鼠以及Ob/ob小鼠血清TG以及TC水平较对照组均有明显升高，哇巴因的处理能不同程度地降低两种小鼠血清中的TG以及TC水平；除了出现高甘油三酯与高胆固醇血症，HFD以及Ob/ob小鼠肝脏中的TG水平也明显增加，与在血清中的结果一致，哇巴因连续处理6周能有效减少肝脏中TG的堆积(图4)。以上结果表明，小剂量的哇巴因能明显降低高脂导致的小鼠体重增加，并且减轻高脂喂养以及Ob/ob小鼠的肝脏重量。此外，哇巴因的连续给药能明显降低两种小鼠模型的血清与肝脏中的TG水平以及血清的TC水平，对非酒精性脂肪肝表现出良好的治疗活性。
HE染色结果显示，HFD组小鼠与NFD组小鼠相比，肝脏中出现明显的大泡性脂肪变性，同时部分肝细胞出现气球样变，肝脏结构紊乱。哇巴因能逆转HFD导致的小鼠肝脏的结构改变，减轻肝细胞脂肪变性程度以及肝细胞气球样变。与HFD小鼠相似，哇巴因同样能明显改善Ob/ob小鼠肝细胞大泡性脂肪变性以及小叶炎症反应(图5)。肝脏油红O染色进一步证实了上述结果：HFD以及Ob/ob小鼠肝脏中有大量的脂滴堆积，且Ob/ob小鼠肝脏中的脂滴体积更大，哇巴因能显著地减少脂滴在这些小鼠肝脏中的沉积，表现为脂滴的体积以及数量均明显减少(图6)。
实施例三 哇巴因减轻非酒精性脂肪肝疾病状态下小鼠肝脏损伤
3.1实验材料
实验小鼠同实施例1；哇巴因来源同实施例2；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
3.2实验方法
3.2.1小鼠造模及给药方法
小鼠的造模以及哇巴因的给药方法同实施例1以及实施例2。
3.2.2小鼠血清中AST、ALT以及ALP活力的检测
分离小鼠的血清，根据试剂盒说明书测定两种小鼠模型血清中的AST、ALT以及ALP的活力。
3.3实验结果
高脂诱导以及Ob/ob转基因小鼠血清中AST、ALT以及ALP活力明显升高，预示这两种非酒精性脂肪肝小鼠模型均能出现一定程度的肝损伤，连续的小剂量哇巴因能逆转上述变化，且该变化在高脂诱导的小鼠中表现得更为明显(图7)，以上结果间接地说明哇巴因能部分改善非酒精性脂肪肝导致的肝损伤。
实施例四 哇巴因对小鼠心血管系统不产生明显影响
4.1实验材料
实验小鼠同实施例1；哇巴因以及HE染色试剂盒来源同实施例2；大小鼠智能无创血压计(BP-2010A)购自日本Softron公司。
4.2实验方法
4.2.1尾压发检测小鼠心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压
血压和心率的测量跟环境因素有关，通常小鼠自身的血压波动都在±10mmHg以上。因此，应尽可能在同等客观条件下对小鼠进行测量，以减小测量误差，保证结果稳定。
测量前准备：保证测量环境安静、温暖，事先将小鼠移到测量地点，使其适应测量环境，且不能将测试台放在地上或者通风的地方，应于血压测定仪放置于同样的高度。
使用合适大小的鼠袋固定好小鼠，放入保温桶中，尽量使小鼠尾巴伸出来。接好加压感应器的空气胶管接口，信号接口和保温桶，使加压感应器标志的尖端与尾巴尖端的方向保持一致，将加压感应器置于尾根处。鼠尾插入传感器后，出现脉波，按下Start/Stop键，开始测量。设备会自动判断鼠尾是否插入传感器，在没有插入鼠尾时，加压感应器不会开始加压，测量也无法开始。测量结束后会显示所测小鼠的心率(HR)、收缩压(SBP)、平均动脉压(MBP)以及舒张压(DBP)水平，为确保测量的准确性，每只小鼠重复测量5次，取三次相近数值的平均值。
4.2.2小鼠心脏以及主动脉HE染色
小鼠的造模以及给药方法同实施例2，小鼠处死后取心脏以及主动脉，心脏称重后与主动脉一起于4％多聚甲醛中固定，梯度脱水后石蜡包埋并切片。HE染色方法同实施例2。
4.3实验结果
哇巴因作为一种强心甾类化合物，临床长期用于心衰以及心律失常的治疗。本实验中，小剂量哇巴因连续注射6周对HFD以及Ob/ob小鼠的心率、收缩压、平均动脉压以及舒张压均没有表现出明显影响(图8)。心脏HE染色结果也显示，哇巴因未表现出对小鼠的心耳、心房肌、心室肌的结构有明显影响。与心脏一致，主动脉HE染色也表明，本实验所用的哇巴因浓度未明显改变小鼠的主动脉结构、厚度等组织学形态(图9)。
Claims (4)
1.哇巴因在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：哇巴因减少非酒精性脂肪肝状态下肝脏中脂肪含量，减轻肝细胞损伤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述哇巴因的分子式为：C29H44O12·8H2O，化学结构式如下：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：哇巴因以注射剂或输液剂的方式给药。
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