CN108853121A - 诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用，属于药物制备技术领域。本发明提供了提供诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。诺米林能够通过改善胆汁酸代谢、抗炎、抗氧化应激、降低脂质合成等对肝脏损伤起到明显的改善作用。

Description

诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药 物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。

背景技术

随着社会经济的发展，人们生活水平、饮食结构的改变，代谢性疾病的发病率日趋增加，如肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、高血脂等。而肝脏是调节体内糖、脂肪、蛋白质、胆汁酸等代谢的重要器官，也是维持体内平衡的中央机关。若肝脏损伤，使肝细胞活力下降，解毒功能减弱，对氧化应激等损伤因子的敏感性增加，进一步导致炎症、纤维化等。代谢性疾病所致的肝脏损伤主要表现为肝内脂质堆积的非酒精性脂肪肝(NAFLD)和胆汁酸淤积所致的肝损伤。肝脏脂类超过肝湿重的10～15％，即定义为脂肪肝。NAFLD是一个慢性的持续发展过程，可分为单纯脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)，肝硬化，甚至为肝癌。而胆汁淤积所致的肝损伤会进展为肝纤维化甚至肝硬化。由于代谢性疾病的发病机制复杂，目前临床上未有安全有效的药物能治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。诺米林能够通过改善肝脏胆汁酸代谢、抗炎、抗氧化应激、降低脂质合成等对肝脏损伤起到明显的改善作用。

本发明提供了诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。

优选的是，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg。

本发明还提供了诺米林在制备改善肥胖所致肝脏损伤的药物中的应用。

优选的是，所述肥胖包括高脂诱导的肥胖。

本发明还提供了诺米林在制备改善脂肪性肝炎的药物中的应用。

优选的是，所述脂肪性肝炎包括MCD诱导的脂肪性肝炎。

本发明还提供了诺米林在制备改善胆汁淤积所致肝脏损伤的药物中的应用。

优选的是，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg。

优选的是，所述胆汁淤积包括α-萘异硫氰酸酯诱导的剂型肝内胆汁淤积和胆管结扎所致的胆汁淤积。

本发明还提供了诺米林在制备改善肝纤维化的药物中的应用。

本发明提供了诺米林在制备改善胆汁淤积和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。诺米林能够通过抗炎、抗氧化应激对肝脏损伤起到明显的改善作用。通过进行多种代谢疾病模型的小鼠体内药效研究，试验结果表明，诺米林对高脂餐诱导的肥胖C57BL/6小鼠(DIO)、MCD饲料诱导的C57BL/6脂肪性肝炎(NASH)小鼠、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的C57BL/6急性肝内胆汁淤积小鼠和胆管结扎C57BL/6胆汁淤积小鼠动物模型中的肝脏损伤均具有改善作用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的DIO小鼠肝脏HE染色和油红染色(200)结果图；

图2为本发明实施例1提供的DIO小鼠血清中ALT和AST水平结果图；

图3本发明实施例1提供的DIO小鼠肝脏的SOD、MDA、GSH的水平结果图；

图4本发明实施例2提供的ob/ob小鼠肝脏HE染色和肝脏TC、TG的含量结果图；

图5本发明实施例3提供的MCD小鼠肝脏HE染色(200)和评分结果图；

图6本发明实施例3提供的MCD小鼠血清中ALT和AST的水平结果图；

图7本发明实施例3提供的MCD小鼠肝脏的SOD、MDA和GSH还原酶的水平结果图；

图8本发明实施例4提供的ANIT小鼠肝脏Tunel和HE染色(200)结果图；

图9本发明实施例4提供的ANIT小鼠血清中ALT、AST和ALP的水平结果图；

图10本发明实施例4提供的ANIT小鼠肝脏中SOD、GSH、MDA和TBA的水平结果图；

图11本发明实施例5提供的BDL小鼠肝脏HE染色结果图；

图12本发明实施例5提供的BDL小鼠肝脏Tunel染色结果图；

图13本发明实施例5提供的BDL小鼠肝脏内的总胆汁酸结果图；

图14本发明实施例5提供的BDL小鼠肝脏MDA、SOD和GSH还原酶的水平结果图；

图15为本发明实施例6提供的肝脏纤维化Masson染色结果图。

具体实施方式

本发明提供了诺米林在制备改善胆汁酸代谢和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。在本发明中，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg，更优选为50～100mg/kg，最优选为70～80mg/kg。诺米林通过抗炎、抗氧化应激等改善代谢性疾病所致肝脏损伤。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。

本发明还提供了诺米林在制备改善肥胖所致肝脏损伤的药物中的应用。诺米林通过抗炎、抗氧化应激、降脂改善肥胖所致肝脏损伤。在本发明中，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg，更优选为50～100mg/kg，最优选为70～80mg/kg。在本发明中，所述肥胖包括高脂诱导的肥胖。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。

本发明还提供了诺米林在制备改善脂肪性肝炎的药物中的应用。诺米林通过抗炎、抗氧化应激、降脂改善脂肪性肝炎。在本发明中，所述脂肪性肝炎包括MCD诱导的脂肪性肝炎。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。

本发明还提供了诺米林在制备改善胆汁淤积所致肝脏损伤的药物中的应用。诺米林通过抗炎、抗氧化应激、改善胆汁酸代谢治疗胆汁淤积所致肝脏损伤。在本发明中，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg，更优选为50～100mg/kg。在本发明中，所述胆汁淤积包括α-萘异硫氰酸酯诱导的剂型肝内胆汁淤积和胆管结扎所致的胆汁淤积。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。

本发明还提供了诺米林在制备改善肝纤维化药物中的应用。诺米林通过抗炎、抗氧化应激、调节胆汁酸代谢治疗肝纤维化。在本发明中，所述肝纤维化包括胆汁淤积性肝纤维化。在本发明中，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg，更优选为50～100mg/kg。本发明对所述药物的剂型没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规药物剂型即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的诺米林在制备改善胆汁酸代谢和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

本发明在实施例中对各动物模型进行多项检测，所述检测包括：动物标本采集、血清生化指标测定、肝脏组织HE染色、肝脏组织油红染色、肝脏Tunel染色、肝脏组织Masson染色、肝脏组织TG、TC含量测定、肝脏内脂质氧化(MDA)的含量检测、肝脏内总SOD活性的检测和肝脏内GSH还原酶的含量测定，具体操作步骤和参数如下：

动物标本采集

药物治疗结束后，进行动物大处理，采取组织样本供后续实验的进行。

1)小鼠禁食过夜12h；

2)隔天处理，称取小鼠体重，按0.1mL/10g腹腔注射20％乌拉坦麻醉剂，即10g乌来糖粉末+50mL生理盐水,涡旋或超声至溶解完全。

3)将麻醉后的小鼠四肢固定在泡沫板上。

4)打开胸腔，用1mL注射器在心尖搏动部位扎针取血，并收集于1.5mL的离心管中。室温至少静止2h，4℃离心，3000rpm，15min。小心取血清，分装，于-80℃保存。

5)小心剥离整个肝脏，放于锡箔纸上称重，后剪取左肝最大叶的同一部位，于含有4％多聚甲醛的10mL离心管中固定，用于制作HE染色切片；另在同一位置剪取肝脏组织适量，锡箔纸包好，放置液氮内，用于制作油红切片；另在同一位置剪取肝脏组织50mg左右，万分之一天平称重，冻于液氮中，用于肝脂含量的测定；最后多余的肝脏组织全部放于2mL的离心管内，冻于液氮中。

6)取同一部位腹部白色脂肪于含有4％多聚甲醛的10mL离心管中固定；

多余的肝脏组织放于2mL的离心管内，冻于液氮中。

7)剥离背部褐色脂肪于1.5mL离心管，冻于液氮。

8)剪取同一位置的小肠，剖开，于生理盐水或PBS溶液中清洗，用滤纸吸干，放于1.5mL离心管内，冻于液氮。结束后，将冻于液氮的组织样本全部转移到-80℃冰箱中长期保存。固定液中的肝脏和白色组织于常温，摇床上晃动，并换液2-3次。

血清生化指标测定

从-80℃冰箱中取出血清，于室温融化，轻涡，短暂离心。用全自动生化分析仪测定相关指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)；总胆汁酸(TBA)，总胆红素(TBIL)和碱性磷酸酶(ALP)。

肝脏组织HE染色

1)脱水透明：用由低浓度到高浓度的梯度酒精作为脱水剂，对多聚甲醛固定好的肝脏组织进行脱水，后置于透明剂二甲苯中进行透明处理。

2)浸蜡包埋：将透化过的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱内保温。期间制备好包埋的容器，并倒入已溶化的石蜡。后迅速夹取出溶蜡箱中浸透完全的石蜡组织块放入其中，待其冷却凝固成块即成。

3)切片和贴片：包埋后变硬的组织块固定于切片机上，切成薄片(5-8μm)，后将薄片放于热水中烫平，再贴到载玻片上。于45℃恒温箱中进行烘干。

4)脱蜡染色：切片经二甲苯脱去石蜡，后由高浓度到低浓度的梯度酒精清洗，再蒸馏水清洗。后开始染色，先放入苏木精溶液中染色数分钟，酸水及其氨水中分色适当时间。后经流水冲洗1h，入蒸馏水中片刻。于70％和90％酒精中各脱水10min。最终利用酒精伊红染液染色2-3min。

5)脱水透明：染色的切片用纯酒精脱水，后用二甲苯使切片透明。

6)封片：透明的切片滴加拿大树胶1-2滴，盖上盖玻片封片，等待树胶自然风干，并标记。

7)拍照观察：于蔡氏显微镜下拍照观察，切片于常温保存。

肝脏组织油红染色

1)包埋：固定好的肝脏组织，经OCT冰冻包埋。

2)切片和干燥：于切片机上切成薄片(6-10μm)，常温干燥10min，后用75％酒精孵育10s。

3)油红染色：油红工作液孵育10-15min，75％的酒精中漂洗2s，再水洗1min。苏木精复染，水洗、盐酸酒精分化以及氨水返蓝，最终用纸巾吸去周边水分。

4)封片：甘油明胶封片。

5)拍照观察：于蔡氏显微镜下拍照观察，切片短时间可于4℃保存。

肝脏Tunel染色

1)取肝脏蜡片于二甲苯中脱蜡5-10min，换用新鲜的二甲苯，重复操作一次。无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

2)滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟。

3)PBS洗涤3次，彻底洗净蛋白酶K。

4)于PBS配制的3％过氧化氢溶液(3％H₂O₂in PBS)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS洗涤3次。

5)参考说明书配制适量的生物素标记液，后充分混匀，现配现用。

6)在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60min。

7)用PBS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10min。

8)用PBS洗涤3次。

9)按说明书配制Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液

10)在样品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30min。

11)用PBS洗涤3次。

12)滴加0.2-0.5ml DAB显色液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。

13)用PBS洗涤3次。

14)拍照观察：于蔡氏显微镜下拍照观察。

肝脏组织Masson染色

1.取肝脏蜡片于二甲苯中脱蜡5分钟，换用新鲜的二甲苯，重复操作一次。无水乙醇5分钟，90％乙醇2分钟，70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

2.用Regaud苏木精染液染核5分钟，充分水洗。

3.用Masson丽春红酸性复红液5分钟。

4.以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，1％磷钼酸水溶液分化3分钟，苯胺蓝液染5分钟，0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。

5.95％酒精和无水酒精各1分钟。

6.二甲苯透明，中性树胶封固。

7.拍照观察。

肝脏组织TG、TC含量测定

1)精确称量肝脏组织重量，大约50mg。

2)每个样本加500μL配好的裂解液，放入钢珠2颗，于高通量组织研磨器中粉碎，64HZ，90s。

3)后加入等体积的氯仿500μL，涡旋20s，4℃离心，13200rpm，10min。

4)离心后观察分为三层，上层有色液体用移液枪弃去，中间蛋白层用注射器针头小心挑出，留取下层无色的氯仿层，于常温下自然风干。

5)检查氯仿层是否完全挥干，挥干后加入50μL异丙醇，涡旋，完全溶解，短暂离心。

6)96孔板加样：设立空白组(3个复孔)，标准组(3个复孔)，样本组(1个孔)，先快速加样本与标准品2μL，先加200μL的TG/TC工作液，

7)37℃孵育5min。

8)酶标仪上546nm和660nm波长处测定吸光值。

9)最后根据说明书处理数据，得出每个样本的TG、TC含量。

肝脏内脂质氧化(MDA)的含量检测

1)剪取肝脏组织样本50-100mg，加1mLPBS和2粒钢珠于1.5mL离心管内，高通量组织研磨器粉碎，64HZ，90s。

2)取出4℃，离心1600rcf，10min。

3)取上清BSA蛋白浓度测定

4)配TBA储存液：精确称取TBA粉末0.0185g，加5mLTBA配制液混合均匀，于70℃水浴溶解，并剧烈涡旋以促进溶解，锡箔纸避光。

5)按照说明书中，临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液。

6)取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线。

7)新编一套离心管加入100μL样品匀浆液、PBS空白对照和不同浓度标准品，后均加入200μLMDA检测工作液。

8)混匀后，封口膜封好，100℃或沸水浴加热15min。

9)冷却至室温，1000rcf室温离心10min。

10)取200μL上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。

11)根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，后计算单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。

肝脏内总SOD活性的检测

1)取1.5mL离心管中，先加入2颗钢珠，加入1mLPBS液，后剪取适量20-50mg的组织于离心管内。高通量组织研磨器粉碎，64HZ，90s。

2)后转移至新的离心管内，4℃离心10000rcf，10min。

3)取上清BSA蛋白浓度测定。

4)每个样品20μL体积的蛋白量需在20-100μg蛋白量之间，若过高，可用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。

5)最后根据说明书加96空板，37℃孵育30min。

6)450nm测定吸光度。

7)抑制百分率＝(A空白对照1A样品)/(A空白对照1A空白对照2)100％。尽量使样品的抑制百分率在30-70％范围内，否则需要把该样品重新测定。

8)待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units

肝脏内GSH还原酶的含量测定

1)取1.5mL离心管中，先加入2颗钢珠，加入300μLRaPa裂解液，后剪取适量10-20mg的组织于离心管内。高通量组织研磨器粉碎，64HZ，90s。

2)4℃离心，12000rpm，5min

3)取上清BSA蛋白浓度测定。

4)每个样品10-20μL体积的蛋白量需在20-200μg蛋白量之间，若过高，可用本试剂盒提供的样品稀释液适当进行稀释。

5)最后根据说明书加96空板，后酶标仪进行测定，每隔2分钟记录A412值，至少连续记录10分钟，获得5个点的数据。

6)GSH还原酶活力＝[A412/min(sapmle)A412/min(blank)]/0.01415，单位为mU/mL。[样品中谷胱甘肽还原酶活力]＝[检测体系中消耗谷胱甘肽还原酶活力][稀释倍数]/[样品中的蛋白浓度]，单位：U/mg蛋白或mU/mg蛋白。

实施例1

动物模型

高脂饲料诱导的肥胖小鼠(DIO)实验。

小鼠造模及分组

7周龄，C57BL/6SPF雌性小鼠，于动物房适应1周后，留下Chow组给予正常饲料，其余给予高脂饲料诱导肥胖，诱导3个月。后挑选30-40g已造模成功的肥胖小鼠，按照体重随机分组，每组8只，SPSS21.0软件分析，各组间体重无差异。分为：正常对照组，高脂对照组，高脂+奥贝胆酸组，高脂+诺米林组。

给药剂量及方式

奥贝胆酸：15mg/kg Bodyweight/day(0.2/1000高脂饲料)

诺米林：75mg/kg Bodyweight/day(1/1000高脂饲料)

按照上面的剂量，先捣碎高脂饲料，后加入药物粉末，混合均匀后，做成圆柱形饲料。喂给老鼠吃，连续给药喂食7周。期间记录小鼠的摄食量与体重。

诺米林改善DIO小鼠肝脏脂肪变性

我们通过检测小鼠的组织形态学即肝脏HE染色和油红O染色。观察到高脂组小鼠肝脏出现明显的空泡和大量的脂滴堆积，而药物诺米林能有效的改善脂肪肝变形和减少脂滴积聚。(DIO小鼠肝脏HE染色和油红染色(200)结果如图1所示，其中，图1-1为正常对照组小鼠肝脏HE染色和油红染色病理切片，图1-2为高脂对照组小鼠肝脏HE染色和油红染色病理切片，图1-3为高脂+奥贝胆酸组小鼠肝脏HE染色和油红染色病理切片，图1-4为高脂+诺米林组小鼠肝脏HE染色和油红染色病理切片。

谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)是评价肝功能的两项指标。结果显示高脂组血清中的ALT水平明显高于正常小鼠，AST无差异，说明小鼠的肝脏受到一定程度的损害。经过诺米林的治疗后，血清ALT水平显著降低，诺米林可以有效的改善肝功能(DIO小鼠血清中ALT和AST水平结果如图2所示，其中，图2-1为DIO小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)水平，图2-2为DIO小鼠血清中的谷草转氨酶(AST)水平。注：与正常对照组(Chow)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(HF)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一系列肝病，它的发生发展是一个缓慢的过程，包括简单的脂肪肝，肝炎，肝纤维化和肝硬化，甚至是肝癌发展。它的发病机制较复杂，包括脂质堆积，炎症，以及慢性肝细胞损伤而导致的氧化应激等。故氧化产物丙二醛(MDA)和抗氧化的谷胱甘肽及超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化应激的重要指标。

经检测发现，与正常对照组比较，高脂组小鼠MDA指标显著增加，谷胱甘肽和SOD指标降低(DIO小鼠肝脏的SOD、MDA、GSH的水平如图3所示，其中，图3-1为DIO小鼠肝脏中谷胱甘肽还原酶的水平，图3-2为DIO小鼠肝脏中超氧化物歧化酶的水平，图3-3为DIO小鼠肝脏中丙二醛的水平。注：与正常对照组(Chow)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(HF)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))，说明高脂小鼠已经产生了氧化应激。在药物诺米林的治疗下，虽然不能降低MDA，但能显著增加谷胱甘肽和SOD水平，具有一定的抗氧化应激作用，进而改善脂肪肝。

实施例2

OB/OB瘦素缺乏的肥胖小鼠实验

小鼠造模及分组

ob/ob小鼠，12周龄，雌性，SPF级别，体重大约有80g。全部给予普通的饲料。按照体重随机分组，每组6只，SPSS21.0软件分析，各组间体重无差异。分为：正常组，ob/ob模型组，ob/ob+诺米林(75mg/kg)

给药剂量和方式

灌喂给药，每天一次，连续灌喂给药一个月，药物诺米林：75mg/kg，溶于0.5％CMCNa，于超声仪超声配成混悬液。

诺米林对ob/ob小鼠肝脏的影响

通过对ob/ob小鼠肝脏HE染色病理分析：与正常小鼠比较，模型组小鼠肝脏脂肪变性十分严重，出现了空泡变形(ob/ob小鼠肝脏HE染色和肝脏TC、TG的含量如图4所示，其中，图4-1为正常对照组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图4-2为ob/ob模型组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图4-3为ob/ob模型+诺米林组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图4-4为小鼠肝脏内甘油三酯的含量，图4-5为小鼠肝脏内总胆固醇的含量；注：**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝6))。且结果同肝脏TG、TC含量测定一致，诺米林对ob/ob的肝脏脂肪变性和脂质堆积无显著差异。

实施例3

MCD饲料诱导的脂肪性肝炎(NASH)小鼠实验

小鼠造模及分组

7周龄，C57BL/6SPF雌性小鼠，于上海中医药大学动物房饲养至20-25g后除去正常组给予MCS饲料，剩下的全部喂养MCD饲料，造模3周后，按照体重随机分组，每组8只，SPSS21.0软件分析，各组间体重无差异。分为：MCS对照组，MCD模型组，奥贝胆酸组，诺米林(75mg/kg)。

给药剂量及方式

灌喂给药，每天一次，连续灌喂4周。诺米林：75mg/kg，溶于0.5％CMCNa，于超声仪超声配成混悬液。

诺米林改善MCD饲料诱导小鼠的肝脏脂肪变性

为了进一步研究诺米林对酒精性脂肪肝的治疗作用，我们采用了MCD饲料诱导的脂肪肝炎模型NASH，在MCD诱导3周后的C57BL/6，进行灌胃给药，药物诺米林以75mg/kg/day的剂量溶于0.5％的CMC-Na溶液中制备成药物混悬液，按照0.1ml/10g Bodyweight的给药剂量，每天灌胃一次，连续4周，自由摄食和饮水。小鼠处理进行肝脏组织HE染色，结果显示MCD饲料诱导后，小鼠肝脏出现明显的脂质变性和炎症因子积聚(MCD小鼠肝脏HE染色(200)和评分如图5所示，其中，图5-1为MCS对照组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图5-2为MCD模型组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图5-3为奥贝胆酸药物组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图5-4为诺米林药物组小鼠肝脏HE染色的病理切片，5-5为小鼠肝脏HE染色病理切片的脂肪变性评分，5-6为小鼠肝脏HE染色病理切片的气球样变评分，5-7为小鼠肝脏HE染色病理切片的炎症因子评分。注：与正常对照组(Chow)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(HF)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))，而诺米林能显著改善脂肪肝变形，与病理评分结果一致。

对MCD诱导的脂肪肝炎模型的小鼠测定血清中肝功能两项ALT和AST，结果发现诺米林可显著降低ALT和AST指标(MCD小鼠血清中ALT和AST的水平如图6所示，其中，图6-1为MCD小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)水平，图6-2为MCD小鼠血清中的谷草转氨酶(AST)水平。注：与正常对照组(Chow)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(HF)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))，说明药物能改善肝功能异常。

同时，我们也检测了氧化应激相关指标MDA，SOD和GSH还原酶的水平。谷胱甘肽GSH的在生理状态下98％为还原性谷胱甘肽，其生理功能主要是抗氧化和解毒。SOD能够清除超氧阴离子自由基，MDA的量可以反映机体内脂质过氧化的程度。结果显示诺米林药物可以明显增加SOD指标，虽不能显著改善GSH还原酶和MDA指标，但具有改善的趋势(MCD小鼠肝脏的SOD、MDA和GSH还原酶的水平如图7所示，其中，图7-1为MCD小鼠肝脏中超氧化物歧化酶的水平，图7-2为MCD小鼠肝脏中丙二醛的水平，图7-3为MCD小鼠肝脏中谷胱甘肽还原酶的水平。注：与正常对照组(Chow)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(HF)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))。

实施例4

α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的急性肝内胆汁淤积小鼠实验

小鼠造模及分组

7周龄，C57BL/6SPF雄性小鼠，于上海中医药大学动物房饲养至25g左右，饲料是普通饲料，后按照体重随机分组，每组8只，SPSS21.0软件分析，各组间体重无差异。分为：正常组，正常+诺米林(50mg/kg)，ANIT模型组，ANIT+奥贝胆酸组(20mg/kg)，ANIT+诺米林(50mg/kg)，ANIT+诺米林(100mg/kg)。

给药剂量和方式

灌喂给药，每天一次，药物诺米林，两个剂量：50mg/kg和100mg/kg；OCA20mg/kg。均溶于0.5％CMCNa，于超声仪超声配成混悬液。

ANIT 75mg/kg：称取75mgANIT粉末，加橄榄油10mL，后超声仪超声30min，混合均匀。

连续灌喂给药5天后，灌喂ANIT，剂量75mg/kg，0.1ml/10g，诱导急性胆汁淤积模型，造模48h，同时伴随着给药，共一周，最后处理动物。

诺米林改善ANTI急性胆汁淤积所致的肝损伤

对ANIT小鼠肝脏组织进行病理形态学研究，从Tunel染色和HE染色中(ANIT小鼠肝脏Tunel和HE染色(200)如图8所示，其中，图8-1为正常对照组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片(上图和下图的放大比例不同)，图8-2为ANIT模型组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片，图8-3为诺米林50mg/kg药物组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片，图8-4为诺米林100mg/kg药物组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片，图8-5为正常对照组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图8-6为ANIT模型组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图8-7为ANIT+奥贝胆酸组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图8-8为正常+诺米林50mg/kg药物组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图8-9为ANIT+诺米林50mg/kg药物组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图8-10为ANIT+诺米林100mg/kg药物组小鼠肝脏HE染色的病理切片，我们观察到经ANIT诱导后的模型组小鼠的肝脏出现明显的肝细胞坏死病灶和细胞凋亡，而药物诺米林的治疗能有效的改善了所致的病理损伤。

对血清肝功能进行测定，结果显示(ANIT小鼠血清中ALT、AST和ALP的水平如图9所示，其中，图9-1为ANIT小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)水平，图9-2为ANIT小鼠血清中的谷草转氨酶(AST)水平，图9-3为ANIT小鼠血清中的碱性磷酸酶(ALP)水平。注：与正常对照组(Control)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(ANIT)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝9)，模型ANTI组血清中的ALT、AST和ALP水平显著增加，说明ANIT诱导后小鼠的肝功能出现了异常。而在药物诺米林治疗后，虽然ALT水平的减少具有统计学差异，而AST和ALP水平有降低的趋势，证明药物可一定程度的改善肝功能的异常。

在ANIT诱导胆汁淤积模型中肝损伤与氧化应激相关，故对相关指标进行测定(ANIT小鼠肝脏中SOD、GSH、MDA和TBA的水平如图10所示，其中，图10-1为ANIT小鼠肝脏中超氧化物歧化酶的水平，图10-2为ANIT小鼠肝脏中谷胱甘肽还原酶的水平，图10-3为ANIT小鼠肝脏中丙二醛的水平。图10-4为ANIT小鼠肝脏内总胆酸的含量。注：与正常对照组(Control)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(ANIT)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝9)。与正常对照组比较，ANIT模型组的SOD显著降低，MDA增加，而诺米林治疗后，可逆转其异常，对GSH呈现改善趋势。

同时对ANIT小鼠肝脏内的总胆汁进行测定，发现模型组肝脏内胆汁酸含量高于正常对照组。而诺米林的治疗可有效的减少肝脏内胆汁酸含量。

实施例5

胆管结扎所致的胆汁淤积小鼠实验

小鼠造模及分组

7周龄，C57BL/6SPF雄性小鼠，于上海中医药大学动物房饲养至25g左右，后按照体重随机分组，每组9只，SPSS21.0软件分析，各组间体重无差异。分组为：假手术对照组，BDL模型组，诺米林(50mg/kg)，诺米林(100mg/kg)，小鼠禁食12h，按0.1mL/10g腹腔注射戊巴比妥钠(60mg戊巴比妥钠粉末+10mL生理盐水)麻醉，后腹部皮肤消毒，无菌操作沿腹部正中线剪开腹腔，分离出胆管，在胆管近端和远端2处结扎，中间未剪断。手术完成后腹部双线缝合，先缝内皮后缝外皮。手术在一天内完成，后连续三天肌肉注射青霉素，同时灌胃给药一周。

给药剂量和方式

灌喂给药，每天一次，连续灌喂给药一周，药物诺米林，两个剂量：50mg/kg和100mg/kg，药物溶于0.5％CMCNa，于超声仪超声配成混悬液。

诺米米改善胆管结扎小鼠的肝脏损伤

对胆管结扎手术的小鼠肝脏进行HE染色和Tunel染色(BDL小鼠肝脏HE染色结果如图11所示，其中，图11-1为假手术对照组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图11-2为BDL模型组小鼠肝脏HE染色的病理切片，图11-3为诺米林50mg/kg药物组小鼠肝脏HE染色的病理，图11-4为诺米林100mg/kg药物组小鼠肝脏HE染色的病理。假手术对照组肝小叶结构正常，无变形坏死。BDL模型组观察到大面积的肝细胞坏死，而药物诺米林的治疗两个剂量均具有减少肝细胞坏死的作用。

Tunel是对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，能准确反映细胞凋亡的形态特征。如图组织切片上凋亡的细胞为棕褐色(BDL小鼠肝脏Tunel染色如图12所示，其中，图12-1为假手术对照组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片，图12-2为BDL模型组小鼠肝脏Tunel染色的病理切片，图12-3为诺米林50mg/kg药物组小鼠肝脏Tunel染色的病理，图12-4为诺米林100mg/kg药物组小鼠肝脏Tunel染色的病理。模型组BDL可看见较多的棕褐色染色，而药物诺米林的治疗显著减少了棕褐色的染色情况。证明诺米林可有效的改善胆管结扎所致的小鼠肝脏细胞的凋亡。

胆管结扎会造成胆汁淤积，而积聚于肝内，对肝脏产生毒性作用。故我们检测了肝脏内总胆汁酸的含量(BDL小鼠肝脏内的总胆汁酸如图13所示)。发现模型BDL组肝内总胆汁酸含量显著高于假手术组，诺米林的高剂量100mg/kg的剂量可有效的降低肝内总胆汁酸的含量。说明诺米林对肝脏具有一定的保护作用。

研究表明氧化应激与肝脏损伤具有密切关系。氧化应激是指机体或细胞内氧化物质过度产生和或抗氧化防御功能减弱，引起两者之间平衡严重破坏，造成组织、细胞损伤的一种状态。而SOD、MDA和GSH还原酶是检测氧化应激的常用指标。实验对其进行测定，结果显示与BDL模型组比较，诺米林100mg/kg的剂量可显著降低MDA含量，而SOD和GSH没有显著差异(BDL小鼠肝脏MDA、SOD和GSH还原酶的水平如图14所示，其中，图14-1为小鼠肝脏中超氧化物歧化酶的水平，图14-2为小鼠肝脏中丙二醛的水平，图14-3为小鼠肝脏中谷胱甘肽还原酶的水平。图10-4为肝脏内总胆酸的含量。注：与假手术组(Sham)比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组(BDL)比较，**P<0.01，*P<0.05(Means±SE，n＝8))。

实施例6

诺米林减轻胆汁淤积形成的肝脏纤维化

胆管结扎造成胆汁淤积性肝损伤，进而形成肝脏纤维化。Masson染色可以对肝脏的胶原纤维进行染色以判断纤维化程度。肝脏纤维化Masson染色结果如图15所示，其中，图15-1为胆管结扎假手术组，图15-2为胆管结扎14天后结果图，图15-3为胆管结扎导致肝脏纤维化明显后的诺米林治疗组。图15显示胆管结扎假手术组小鼠肝脏无明显的纤维化改变，而胆管结扎14天后肝脏纤维化明显，经诺米林治疗的小鼠肝脏纤维化则明显改善。提示诺米林具有显著的阻止小鼠胆汁淤积性肝纤维化的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.诺米林在制备改善胆汁酸代谢和代谢性疾病所致肝脏损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg。

3.诺米林在制备改善肥胖所致肝脏损伤的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肥胖包括高脂诱导的肥胖。

5.诺米林在制备改善脂肪性肝炎的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脂肪性肝炎包括MCD诱导的脂肪性肝炎。

7.诺米林在制备改善胆汁淤积所致肝脏损伤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，诺米林的有效作用浓度为10～100mg/kg。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述胆汁淤积包括α-萘异硫氰酸酯诱导的剂型肝内胆汁淤积和胆管结扎所致的胆汁淤积。

10.诺米林在制备改善肝纤维化的药物中的应用。