CN112294794B

CN112294794B - 甲基麦冬黄酮a在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途

Info

Publication number: CN112294794B
Application number: CN201910708313.5A
Authority: CN
Inventors: 余璐; 王凌; 蒋学华
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2039-08-01
Also published as: CN112294794A

Abstract

本发明提供了一种甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途。实验结果表明，甲基麦冬黄酮A是一种Nrf2的激动剂，其可通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，同时降低肝细胞中ROS水平，降低氧化应激反应与炎症反应，维持肝细胞功能，从而起到治疗NAFLD的作用。此外，甲基麦冬黄酮A可通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，从而起到预防由于NAFLD增加的正常剂量APAP的肝脏毒性。因此，甲基麦冬黄酮A在制备NAFLD治疗药物以及APAP肝毒性预防药物中都具有很好的应用前景。

Description

甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与遗传易感和胰岛素抵抗相关的代谢应激性肝损伤。该临床疾病的病理特征为肝脂肪变性且患者无过量饮酒史。NAFLD的疾病谱包括：非酒精性的单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。NAFLD不仅可以导致与肝病相关的残疾和死亡，还与代谢综合征、II型糖尿病以及动脉硬化性心血管疾病等的高发性密切相关。NAFLD是21世纪全球重要的公共健康问题之一。根据2018 版中国《非酒精性脂肪性肝病防治指南》的最新资料显示，目前NAFLD也已成为我国第一大慢性肝病，严重危害人民的生命健康。

NAFLD的病因主要是高脂高糖饮食、肥胖、糖尿病以及久坐少动等生活方式导致的人体内自由脂肪酸堆积。堆积的脂肪酸过氧化形成过多的自由基而导致的氧化应激反应(Oxidative stress，OS)，心磷脂过氧化导致的线粒体功能障碍和更多活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的生成，以及促炎性细胞因子的形成等，最终导致肝细胞的坏死和凋亡。NAFLD可通过饮食和运动等干预措施得到一定的缓解，但目前并没有已批准的药物治疗方法。

Nrf2(Nuclear factor erythroid 2–related factor 2，NF-E2相关因子2)是抗氧化应激与抗炎症反应中的关键调控因子，主要负责调节如醌氧化还原酶 (NADPH:quinone oxidoreductase-1,NQO1)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH) 合成与代谢相关酶类、血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)、ATP-转运体(ATP binding cassettetransporter)等抗氧化蛋白、II相解毒酶以及转运体的表达，有助于清除内/外源性有毒物质和活性氧自由基，从而起到保护细胞的作用。目前有研究表明：Nrf2能够通过抑制脂肪在肝脏中堆积、调节胆固醇和胆汁酸的代谢以及对抗自由脂肪酸(Free fatty acids，FFAs)诱导的肝细胞脂肪变性等途径对NAFLD起到预防和治疗的作用。此外，NAFLD可以明显诱导肝脏组织中CYP2E1(细胞色素P450 2E1)的水平，使得通过其代谢所产生的有毒有害物质明显增加。

对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol，APAP)为一种非甾体解热镇痛药，是大多数OTC类抗感冒药的主要活性成分之一。作为治疗感冒的一线用药，将近80％的该类药物均含有APAP成分。虽然APAP的解热镇痛效果良好，安全性高，但临床上由于服用过量的APAP而引起肝脏损伤的案例屡见不鲜。根据 2015年版《中华人民共和国药典临床用药须知》，成人一次口服APAP的剂量为0.3～0.6g，最大量不得超过一日2.0g。临床研究报道显示，每日APAP的服用剂量超过4g即能引起明显的肝脏损伤，严重的还可能造成生命危险。NAFLD 患者服用正常剂量的对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol，APAP)时，其通过CYP2E1代谢产生的N-乙酰对苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinonimine，NAPQI) 的量会明显增加。该代谢产物能够与肝脏中的还原性GSH相结合，最后通过肾脏排出至体外，但大量NAPQI会使得肝脏中GSH被消耗殆尽，过量的NAPQI 会与细胞蛋白结合，从而引起氧化应激反应，导致进一步的肝脏损伤。Nrf2调控的谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽合成酶等均可以增加细胞中还原型GSH的水平；同是Nrf2下游的MRP2(多药耐药相关蛋白2)和 MRP4(多药耐药相关蛋白4)则是负责NAPQI谷胱甘肽结合物的主要外排转运体；此外其下游的抗氧化蛋白NQO1和HO-1等则可以对抗由于过量NAPQI 引起的过氧化应激反应。所以激活Nrf2信号通路可以中和过多NAPQI、促进有毒物质外排以及对抗氧化应激反应这三条途径来缓解APAP的肝脏损伤。

中药与天然药物是创新药物发现的重要途径，对其有效成分的研究一直备受科研工作者的关注。虽然目前已有很多中药与天然药物单体类的Nrf2激动剂 (如姜黄素和白藜芦醇等)正在进行临床试验，但在其开发的过程中仍然面临着诸多困难与挑战。

因此，探索开发新的可活化Nrf2信号通路的药物，对于改善目前严峻的 NAFLD现状以及预防由该疾病所致的APAP肝毒性增加具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途。

本发明提供了甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途。

进一步地，所述肝损伤是由化学药物引起的肝损伤。

进一步地，所述肝损伤是由服用对乙酰氨基酚引起的。

进一步地，所述肝损伤是由服用正常剂量的对乙酰氨基酚引起的。

“正常剂量对乙酰氨基酚”：根据2015年版《中华人民共和国药典临床用药须知》，成人一次口服对乙酰氨基酚(APAP)的剂量为0.3～0.6g，最大量不得超过一日2.0g。

进一步地，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性的单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化和肝细胞癌。

进一步地，所述药物能够诱导Nrf2、及其下游调控基因与外排转运体的表达。

进一步地，所述Nrf2下游调控基因为NQO1、HO-1、MRP2和MRP4；所述外排转运体为MRP2和MRP4。

进一步地，所述药物能够对抗非酒精性脂肪肝病导致的氧化应激反应和炎症反应。

进一步地，所述药物能够降低肝脏细胞内的ROS水平；所述药物能够增加肝脏细胞内的GSH水平。

进一步地，所述药物能够促进有毒物质外排以及中和N-乙酰对苯醌亚胺，减少肝脏细胞内的氧化应激损伤，保护肝细胞。

本发明还提供了甲基麦冬黄酮A作为Nrf2激动剂的用途。

实验结果表明，甲基麦冬黄酮A是一种Nrf2的激动剂，其可通过上调Nrf2 及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，同时降低肝细胞中ROS水平，降低氧化应激反应与炎症反应，维持肝细胞功能，从而起到治疗NAFLD的作用。此外，甲基麦冬黄酮A可通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，从而起到预防由于NAFLD增加的正常剂量APAP的肝脏毒性。因此，甲基麦冬黄酮A在制备NAFLD治疗药物以及APAP肝毒性预防药物中都具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.2个月高脂饮食对野生型和Nrf2敲除小鼠血清中ALT和AST的影响(n＝6, **p<0.01,与对照组相比；#p<0.05,与NAFLD(Nrf2+/+)组相比)。

图2.2个月高脂饲料喂养对野生型和Nrf2敲除小鼠肝脏外观特征的影响。

图3.2个月高脂饲料喂养对野生型和Nrf2敲除小鼠肝比重的影响(n＝6，** p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，与NAFLD(Nrf2+/+)组相比)。

图4.2个月高脂饲料喂养后，野生型和Nrf2敲除小鼠肝脏组织HE染色结果图。红色箭头：点状坏死；黑色箭头：炎性细胞浸润；绿色箭头：空泡变性；蓝色箭头：脂肪变性。

图5.2个月高脂饲料喂养后，野生型和Nrf2敲除小鼠肝脏组织的油红O染色结果图。黄色箭头：细胞核空洞；绿色箭头：脂滴。

图6.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型血清中ALT的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比)。

图7.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型血清中AST的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，##p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比)。

图8.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝脏外观特征的影响。

图9.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝比重的影响(n＝6,*p<0.05,**p<0.01,与相同基因型的对照组相比；# p<0.05,##p<0.01,与相同基因型的NAFLD组相比)。

图10.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR后野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝脏组织HE染色结果图。红色箭头：点状坏死；黑色箭头：炎性细胞浸润；绿色箭头：空泡变性；蓝色箭头：脂肪变性。

图11.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR后野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝脏组织油红O染色结果图。黄色箭头：细胞核空洞；绿色箭头：脂滴。

图12.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝组织中GSH水平的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比)。

图13.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型(A)和Nrf2敲除(B)的 NAFLD小鼠模型肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4 mRNA水平的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比； #p<0.05，##p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比)。

图14.分别灌胃给予1周EA、MoA、CUR对野生型(A，Nrf2(+/+))和Nrf2 敲除(B，Nrf2(-/-))的NAFLD小鼠模型肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、 Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4蛋白水平的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，##p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比)。

图15.小鼠Nrf2的核苷酸序列(SEQ ID NO.37)。

图16.100、500、1000μM FFAs处理24h后，L02，THLE-3及HepG2细胞油红O染色结果图。

图17.0～100μM EA、MoA及CUR对L02、THLE-3及HepG2细胞活力的影响 (n＝5)。

图18.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中ROS水平的影响情况(n＝3,*p<0.05,**p<0.01，与对照组相比；# p<0.05,##p<0.01，与NAFLD组相比；$p<0.05，与50μM EA组相比)。

图19.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中GSH水平的影响情况(n＝3,*p<0.05,**p<0.01,与对照组相比；# p<0.05,##p<0.01,与NAFLD组相比；$p<0.05,与50μM EA组相比；@@p<0.01, 与10/25μMMoA组相比))。

图20.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1mRNA 表达的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与NAFLD组相比；$p<0.05，$$p<0.01，与50μM EA组相比；@p<0.05， @@p<0.01，与10/25μMMoA组相比)。

图21.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1蛋白表达的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与NAFLD组相比；$p<0.05，$$p<0.01，与50μM EA组相比；@p<0.05， @@p<0.01，与10/25μMMoA组相比)。

图22.500μM FFAs处理24h后，NRF2敲减的L02、THLE-3及HepG2细胞(转染了NC-siRNA或NRF2-siRNA)的油红O染色结果图。

图23.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)NRF2敲减的NAFLD细胞模型中ROS水平的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与NAFL+NC-siRNA组相比)。

图24.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NRF2 敲减的NAFLD细胞模型中GSH水平的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，与NAFL+NC-siRNA组相比)。

图25.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1mRNA 表达的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与NAFL+NC-siRNA组相比)。

图26.EA、MoA及CUR对L02(A)、THLE-3(B)及HepG2(C)的NAFLD 细胞模型中NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1蛋白表达的影响情况(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与NAFLD组相比)。

图27.连续3天分别于上午9点和下午5点灌胃给予150mg/kg APAP对野生型小鼠血清中ALT和AST浓度的影响(n＝6，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，与AM组相比)。

图28.连续3天分别于上午9点和下午5点灌胃给予150mg/kg APAP后对野生型小鼠肝脏外观特征的影响。

图29.连续3天分别于上午9点和下午5点灌胃给予150mg/kg APAP后野生型小鼠肝脏组织的HE染色结果图。黑色箭头：炎细胞浸润；绿色箭头：空泡变性。

图30.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，小鼠血清中ALT浓度的变化情况 (n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与APAP组相比；$p<0.05，与NAFLD+APAP组相比；@@p<0.01，与APAP(Nrf2+/+) 组相比；％p<0.05，与NAFLD+APAP(Nrf2+/+)组相比)。

图31.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，小鼠血清中AST浓度的变化情况(n＝6， *p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与APAP组相比； $$p<0.05，与NAFLD+APAP组相比，@@p<0.01，与APAP(Nrf2+/+)组相比；％p<0.05，与NAFLD+APAP(Nrf2+/+)组相比)。

图32.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，对小鼠肝脏外观特征的影响。

图33.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，小鼠肝脏组织的HE染色结果图。红色箭头：点状坏死；黑色箭头：炎性细胞浸润；绿色箭头：空泡变性；蓝色箭头：脂肪变性。

图34.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，小鼠肝脏组织油红O染色结果图。黄色箭头：细胞核空洞；绿色箭头：脂滴。

图35.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，对小鼠肝组织中GSH水平的影响 (n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比；$p<0.05，与相同基因型的NAFLD+APAP组相比； @p<0.05，与APAP(Nrf2+/+)组相比；％p<0.05，与NAFLD+APAP(Nrf2+/+)组相比)。

图36.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，对野生型(A)和Nrf2敲除(B) 小鼠肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4mRNA水平的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05， ##p<0.05，与相同基因型的NAFLD组相比；$p<0.05，$$p<0.01，与相同基因型的NAFLD+APAP组相比)。

图37.连续1周分别灌胃给予EA、MoA及CUR，并在倒数第三天于给药后1h 灌胃给予150mg/kg APAP，连续给药3天，对野生型(A)和Nrf2敲除(B) 小鼠肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4蛋白水平的影响(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与相同基因型的对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与相同基因型的APAP组相比；$$p<0.01，与相同基因型的NAFLD+APAP组相比)。

图38.EA和MoA治疗NAFLD的作用机理图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

其中，鞣花酸(EA)，CAS：476-66-4，购买于百灵威科技。

甲基麦冬黄酮A(MoA)，CAS：74805-90-6，购买于成都普瑞法科技开发有限公司。

姜黄素(CUR)，CAS：458-37-7，购买于百灵威科技。姜黄素是一种已知的Nrf2激动剂，在本发明中作为阳性对照药物。

实施例1、EA与MoA对NAFLD小鼠模型的治疗作用及其机制的初步研究

1、NAFLD小鼠模型的建立与验证

1.1实验动物分组、饲养及样品收集

选用野生型和Nrf2敲除纯合子(Nrf2-/-)的C57BL/6小鼠(由本实验室繁育) 各12只，小鼠随机分为2组(相同基因型)，每组6只，雌雄各半。以12h 照明、12h黑暗交替适应性饲养1周后，给予高脂饲料饲养2个月，分组及饲养方案见表2-1。

表2-1 小鼠的分组和饲养方案(n＝6)。

饲养2个月后，向小鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.5g/kg)进行麻醉，待其麻醉成功后，迅速进行心脏取血和灌流，取出肝脏，将用生理盐水清洗干净的部分肝脏组织放入4％多聚甲醛固定液中浸泡，剩余的肝脏组织保存于-70℃待用。全血置于干净的1.5mL离心管中，于4℃静置过夜后，室温离心10min(4000 rpm)，分离得到血清。记录各组小鼠体重和肝脏重量。

1.2小鼠肝功能生化指标分析

1.2.1样品处理

使用全自动生化分析仪测定“1.1”项下得到的血清中肝功能生化指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的浓度情况。

1.2.2数据处理

实验结果采用Graphpad prism 7软件进行数据整理与单因素方差分析 (ANOVA)，p<0.05则差异有统计学意义。

1.2.3实验结果

各组小鼠血清中ALT和AST的浓度结果如图1所示。

如图1所示，使用高脂饲料喂养2个月的NAFLD模型组与空白对照组相比，两种基因型小鼠的血清中ALT和AST的浓度均明显升高(p<0.01)，且除 NAFLD(Nrf2+/+)组小鼠的AST之外，其余NAFLD模型组的指标均高于其正常水平(ALT:30～110U/L，AST:60～220U/L)。同时，相较于NAFLD(Nrf2 +/+)组而言，NAFLD(Nrf2-/-)组小鼠血清中AST的浓度更高(p<0.05)。上述结果说明：2个月的高脂饲料喂养可对野生型和Nrf2敲除小鼠的肝脏造成明显的损伤，且Nrf2的缺失会加重其所致小鼠肝损伤的程度。

1.3小鼠肝损伤及肝组织切片染色分析

1.3.1小鼠肝脏损伤情况

高脂饲料喂养2个月后，两种基因型小鼠的肝脏外观特征如图2所示。从图2结果可以看出，各组小鼠肝组织虽无肉眼可见损伤，但较对照组而言，经过2个月高脂饲料喂养的野生型和Nrf2敲除的NAFLD组小鼠，其胆囊均明显肿大。同时，相较于NAFLD(Nrf2+/+)组而言，NAFLD(Nrf2-/-)组小鼠胆囊肿大程度更为明显。以上结果说明：2个月的高脂饲料喂养可导致野生型和 Nrf2敲除小鼠胆囊明显肿大，且Nrf2的缺失会增加其所致小鼠胆囊肿大的程度。

1.3.2小鼠肝比重分析

肝比重是评价NAFLD严重程度的一个指标，比重越大说明肝脏中油脂蓄积越严重。其计算公式如下：

肝比重＝肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100％

按照上述公式所计算得到的各组小鼠肝比重结果如图3所示。

由肝比重统计结果图可以看出，与基因型相同的对照组相比，NAFLD组的野生型和Nrf2敲除小鼠的肝比重均明显的增加，且具有统计学差异(p<0.01)。同时，相较于NAFLD(Nrf2+/+)组而言，NAFLD(Nrf2-/-)组小鼠肝比重增加的更为显著(p<0.05)。以上结果说明：2个月的高脂饲料喂养可显著增加野生型和Nrf2敲除小鼠的肝比重，且Nrf2的缺失会加重其所致小鼠肝比重增加的程度。

1.3.3 HE染色分析

将肝脏组织于4％多聚甲醛固定液中浸泡24～48h后，进行脱水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片。在光学显微镜下观察肝组织细胞的形态学变化，观察结果见如图4所示。

由图4可以看出，相较于对照组而言，经过2个月高脂饲料喂养的野生型和Nrf2敲除的NAFLD组小鼠肝脏组织中均出现不同程度的空泡变性以及脂肪变性，发生脂肪变性的肝细胞胞质内可见含少量大小不一、圆形且轮廓较为明显的脂滴。同时NAFLD(Nrf2-/-)组小鼠的肝脏细胞还出现少量炎性细胞浸润，且部分肝细胞呈不同程度的点状坏死。上述结果说明：2个月高脂饲料喂养可导致野生型和Nrf2敲除小鼠肝脏发生不同程度的病变且Nrf2的缺失会加重其所致的小鼠肝脏损伤。

1.3.4油红O染色分析

1.3.4.1冰冻切片

调节低温恒冷箱温度至-20℃，待标本置载台制冷达所需温度后，从-70℃冰箱中取出收集的肝脏组织，并将其安放在切片机推进器上。调整切片刀的角度，调定切片厚度为10～15μm，即可切片。将切好的样品切片放置于防脱载玻片中央，密封保存至-20℃待用。

1.3.4.2油红O染色

1)从-20℃冰箱取出预先制作好的冰冻切片，放置于切片架上室温放置10min，待染。

2)配制油红O染色应用液，操作步骤如下：按照油红O储备液:稀释液＝5:2 的比例(体积比)，根据样品数量配制适量的应用液。配置好的应用液需用慢速滤纸过滤掉杂质，并在2h内使用。

3)将回温的冰冻切片直接放入装有油红O染色应用液的染缸中染色10～15 min，再用37℃左右温度的UP水漂洗5～20s。

4)将切片放入装有复染液的染缸中染色3～5min，UP水漂洗30～60s。

5)待切片表面水未干透时，即可滴加三水性封固剂(预先在60℃水浴中加热至液态)于玻片表面，进行封片。

6)在光学显微镜下观察肝组织切片的染色情况及形态学变化，脂肪被染成鲜红色，细胞核被染成深蓝色，其余组织被染成淡蓝色。观察结果如图5所示。

由图5可以看出，相较于对照组而言，经过2个月高脂饲料喂养的野生型和Nrf2敲除的NAFLD组小鼠肝脏细胞中均出现不同程度的细胞核空洞和脂肪变性，发生脂肪变性的肝细胞胞质内可见大小不一、圆形、轮廓较为明显且被染成红色的脂滴。同时，相较于NAFLD(Nrf2+/+)组而言，NAFLD(Nrf2-/-) 组小鼠肝脏细胞中细胞核空洞和脂肪变性更为明显。上述结果说明：2个月高脂饲料喂养可导致野生型和Nrf2敲除小鼠的肝脏发生不同程度的病变，且Nrf2 的缺失会加重其所致小鼠肝脏损伤的程度。

综上所述，结合小鼠肝生化指标、肝损伤和肝比重分析、HE染色以及油红O染色的结果，可较为充分的证明通过2个月高脂饲料喂养的方法可以成功构建野生型及Nrf2敲除小鼠的NAFLD模型。

2、EA与MoA对NAFLD的治疗作用及其机制探索

2.1实验动物分组、给药及样品收集

选用本实验室繁育得到的野生型(Nrf2+/+)和Nrf2敲除纯合子(Nrf2-/-) C57BL/6小鼠各30只，基因型相同的小鼠分别随机分为5组，每组6只，雌雄各半。以12h照明、12h黑暗交替适应性饲养1周后，给予高脂饲料饲养2个月。2个月后开始给药，分组及给药方案见表2-2，给药方案为连续1周分别灌胃给予EA、MoA或CUR，每日一次。

表2-2 小鼠的分组和给药方案(n＝6)。

由于EA、MoA及CUR均较难溶于水，为避免药物分散不匀造成灌胃剂量不准确，采用乳化的方式对这三种药物进行增溶，乳剂处方见表2-3。

表2-3 乳剂配方。

2.2小鼠肝功能生化指标分析

2.2.1样品处理

操作同“1.2.1”项下内容。

2.2.2数据处理

操作同“1.2.2”项下内容。

2.2.3实验结果

肝功能生化指标ALT和AST的检测数据结果分别如图6与图7所示。

由图6和7的结果可以看出，与相同基因型的空白对照组相比，NAFLD组的小鼠血清中ALT和AST的浓度均显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，表明NAFLD小鼠模型构建成功。在继续分别灌胃给予小鼠模型EA、MoA及 CUR后，野生型NAFLD小鼠模型的血清中ALT和AST的浓度较相同基因型的单纯NAFLD组相比均出现不同程度的降低。除NAFLD+EA(Nrf2+/+)组小鼠的ALT外，其余变化均具有统计学意义(p<0.05)。但对于Nrf2敲除小鼠而言，在继续分别灌胃给予小鼠模型EA、MoA及CUR后，其血清中ALT和 AST的浓度均没有发生明显的变化。上述结果说明：灌胃给予EA、MoA及CUR 可不同程度的降低野生型NAFLD小鼠模型血清中ALT和AST的浓度，且Nrf2 在该过程中发挥着重要作用。

2.3小鼠肝脏损伤及肝脏组织切片染色

2.3.1小鼠肝脏损伤情况

打开小鼠胸腔后，肉眼观察小鼠肝脏外观特征，小鼠肝损伤结果如图8所示。

由图8的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，NAFLD组的小鼠胆囊显著变大，表明NAFLD小鼠模型构建成功。在灌胃给予EA，MoA和CUR 1 周之后，野生型NAFLD组的小鼠胆囊较相同基因型的单纯NAFLD组相比明显变小，但Nrf2敲除小鼠的并没有太大的变化。该结果说明：灌胃给予EA、MoA 及CUR 1周可明显缓解野生型NAFLD小鼠模型的胆囊肿大情况，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

2.3.2小鼠肝比重分析

操作同“1.3.2”项下内容。小鼠肝比重分析结果如图9所示。

由图9的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，NAFLD组的小鼠肝比重均显著升高，差异具有统计学意义(p<0.01)，表明NAFLD小鼠模型构建成功。在灌胃给予EA、MoA及CUR 1周之后，野生型NAFLD组的小鼠肝比重较相同基因型的单纯NAFLD组相比有明显下降的趋势，且EA与CUR处理组的差异具有统计学意义(p<0.05)，但Nrf2敲除小鼠组的并没有太大的变化。该结果说明：灌胃给予EA、MoA及CUR 1周可显著降低野生型NAFLD小鼠模型的肝比重，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

2.3.3 HE染色分析

操作同“1.3.3”项下内容。小鼠肝脏HE染色伤分析结果如图10所示。

由图10的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，NAFLD组的小鼠肝脏细胞均出现不同程度的空泡变性、脂肪变性及炎性细胞浸润，表明NAFLD 小鼠模型构建成功。同时NAFLD(Nrf2-/-)组小鼠的肝细胞中还出现了不同程度的点状坏死，说明Nrf2的缺失会增加NAFLD的严重程度。在灌胃给予EA、 MoA及CUR 1周之后，野生型NAFLD组的小鼠肝细胞中的空泡变性、脂肪变性及炎性细胞浸润现象较相同基因型的单纯NAFLD组相比有所改善，但该现象在Nrf2敲除小鼠组中却并没有太大的变化。该结果说明：灌胃给予EA、MoA 及CUR 1周可改善野生型NAFLD小鼠模型的肝脏细胞中出现的空泡变性、脂肪变性及炎细胞浸润等病变，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

2.3.4油红O染色分析

操作同“1.3.4”项下内容。小鼠肝脏油红O染色结果如图11所示。

由图11的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，NAFLD组的小鼠肝脏细胞均出现不同程度的细胞核空洞和脂肪变性，表明NAFLD小鼠模型构建成功。在灌胃给予EA、MoA及CUR 1周之后，野生型NAFLD组的小鼠肝细胞中的细胞核空洞和脂肪变性现象较相同基因型的单纯NAFLD组相比有所改善，但该现象在Nrf2敲除小鼠组中却并没有太大的变化。该结果说明：灌胃给予EA、MoA及CUR 1周可改善野生型NAFLD小鼠模型的肝脏细胞中出现的细胞核空洞和脂肪变性现象，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

2.4 EA与MoA对小鼠肝组织中GSH水平的影响

使用谷胱甘肽测试盒检测小鼠肝组织中GSH的水平，测定原理如下：

二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，该化合物可通过比色定量测定。

2.4.1试剂配制

1)试剂一：甲粉1瓶，乙液50mL 1瓶，4℃保存6个月。第一次使用时，向甲粉中加入170mL预热至90～100℃的UP水，使其充分溶解。

2)试剂二：粉剂1瓶，用时加入200mL UP水，充分溶解，可室温密封保存 6个月。

3)试剂三：粉剂1支，用时加入50mL UP水，充分溶解，可室温密封避光保存6个月。

4)试剂四：粉剂1支，用时加入10mL UP水，充分溶解，可避光密封冷藏保存5天。

5)试剂五：GSH标准品粉剂3.07mg，4℃保存6个月。

6)试剂六：GSH标准品溶剂储备液10mL，4℃保存6个月。

7)试剂一应用液的配制：将已配好的甲液与乙液充分混合。该溶液为过饱和溶液，于室温静置冷却后可能会有沉淀出现，取上清进行实验即可。该溶液可室温密封保存6个月。

8)GSH标准溶剂应用液的配制：按GSH标准品溶剂储备液:UP水＝1:9的比例(体积比)进行稀释，现配现用。

9)1mM GSH标准溶液的配制：每次测定前将3.07mg GSH标准品加入到10 mL的GSH标准品溶剂应用液中，充分混匀，现配现用。

10)20μM GSH标准溶液的配制：取0.2mL 1mM GSH标准溶液加入到9.8mL GSH标准溶剂应用液中，现配现用。

2.4.2样品处理

1)10％匀浆液的制备：准确称取组织重量，按组织重量(g):生理盐水体积 (mL)＝1:9的比例，冰水浴条件下机械匀浆，2500rpm 4℃离心10min，取上清进行测定。

2)上清液的制备：取上述得到的10％匀浆液上清0.5mL，加入2mL试剂一应用液，充分混匀，4000rpm 4℃离心10min，取上清液1mL进行显示反应。

3)显色反应：根据表2-4加入相应试剂，分别配制空白管、标准管及测定管。配制完成后，充分混匀，室温静置5min，于420nm处，1cm光径，UP 水调零，测定各管吸光度值。

表2-4 显色反应的溶液组成

2.4.4.3数据处理

根据公式计算组织中GSH的含量，计算公式如下：

其中，样品测试前稀释倍数＝上清液制备过程中的稀释倍数(5倍)。采用 BCA试剂盒检测10％小鼠肝匀浆样品中蛋白含量。

采用Microsoft Excel 2019对所得到的数据进行整理统计，实验结果用Graphpad prism 7软件进行单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05则差异有统计学意义。

2.4.4实验结果

按照上述步骤得到的各组小鼠肝组织中GSH浓度结果如图12所示。

由图12的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，NAFLD模型组的小鼠肝组织中GSH水平均显著下降，且差异具有统计学意义(p<0.05)。在灌胃给予EA、MoA及CUR 1周之后，野生型NAFLD组的小鼠肝组织中GSH水平较相同基因型的单纯NAFLD组相比有不同程度的增加，且该变化具有统计学意义(p<0.05)，但Nrf2敲除小鼠组的并没有太大的变化。该结果说明：灌胃给予EA、MoA及CUR 1周可显著增加野生型NAFLD小鼠模型肝组织中GSH 的水平，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

2.5 EA与MoA对小鼠肝组织中各目的基因mRNA水平的影响

2.5.1引物的设计与合成

从NCBI的Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中获得小鼠源的Nrf2、Keap1(Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1)、Ho-1、Nqo1、Mrp2、Mrp4、Cyp2e1 以及Gapdh的mRNANCBI Reference Sequences参考编号，通过Integrated DNATechnologies(IDT,https://sg.idtdna.com/pages)网站设计qPCR引物，引物序列见表2-5。

表2-5 小鼠Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1、Gapdh、Mrp4、Cyp2e1及Mrp2的qPCR引物序列

2.5.2组织总RNA提取

该实验所需的各种耗材均经过0.1％DEPC水浸泡24～48h，高温高压灭菌后烘干使用。操作步骤如下:

1)将冻存的小鼠肝脏组织恢复至室温，使用干净的滤纸吸干组织上多余的水分，将预冷的生理盐水按照组织重量(g):生理盐水体积(mL)＝1:1的比例加入，将样品置于冰上，使用手持电动组织匀浆器进行匀浆，每间隔 10～15s，匀浆10s，直至得到均匀体系。

2)向500μL TRNzol中加入50μL匀浆液，涡旋振荡直至无明显沉淀。室温静置5min。

3)4℃离心5min(12000rpm)。

4)向100μL氯仿中加入上述离心后得到的上清液，涡旋振荡至溶液充分乳化，室温静置3min。

5)4℃离心15min(12000rpm)。

6)离心完毕后，将三层中的最上层透明液体转移至1.5mL离心管中。

7)将500μL异丙醇加入到上述离心管中，充分混匀，室温静置10min。

8)4℃离心10min(12000rpm)。

9)弃掉上清后加入700μL 75％的乙醇，颠倒洗涤离心管。

10)4℃离心5min(7500rpm)。

11)吸尽管中的乙醇。

12)将样品干燥5min，加入20μLRNasefree水溶解沉淀。

13)使用Nanodrop 2000测定各组织样品的RNA浓度以及OD260/280值。将各样品的RNA终浓度调至1μg/mL左右，保存于-70℃待用。

2.5.3 cDNA的合成

采用

Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒对“2.4.5.2”项下得到的各样品RNA进行逆转录以合成cDNA。具体操作步骤以及加入各试剂的体积详见试剂盒说明书(https://www.yeasen.com/products/detail/ 105)。随后将所得样品放置于-20℃保存待用。

2.5.4荧光聚合酶链反应(Real-time Quantitative PCR，qPCR)

采用

qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)试剂盒对“2.4.5.3”项下所得的cDNA样品进行荧光定量检测。具体操作步骤以及加入各试剂的体积详见试剂盒说明书(https://www.yeasen.com/products/detail/861)。将装有配制好样品的八连管放入荧光定量PCR仪中进行扩增。采用说明书推荐的三步法扩增程序。扩增结束后收集Ct值进行计算。

2.5.5数据处理

采用Microsoft Excel 2019进行数据整理，计算2^△△Ct以比较各实验组小鼠肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4mRNA的表达差异。实验结果用Graphpadprism 7软件进行单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05 则差异有统计学意义。

2.5.6实验结果

各组小鼠肝组织中Keap1、Cyp2e1、Nrf2、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4的 mRNA表达情况如图13所示。

由图13的结果可看出，经高脂饲料喂养2个月后的野生型NAFLD小鼠模型肝脏中，Nrf2的mRNA水平较对照组有显著的增加，且差异具有统计学意义 (p<0.05)，说明：NAFLD会诱导野生型小鼠肝脏中Nrf2的mRNA的表达。在分别给予EA、MoA及CUR处理之后，野生型NAFLD小鼠模型的肝脏中 Nrf2的mRNA水平较相同基因型的对照组和单纯的NAFLD组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中Nrf2的mRNA 水平并没有明显的变化；同样的，在分别经过EA、MoA及CUR处理的野生型 NAFLD小鼠模型肝脏中，Nrf2的下游基因：Nqo1、Ho-1、Mrp2和Mrp4的mRNA 水平均不同程度的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且表现出了与Nrf2 相似的变化趋势，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中并没有明显的变化规律。上述结果说明：EA、MoA与CUR一样，是Nrf2的激动剂。

较空白对照组而言，野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝脏中，Cyp2e1 的mRNA水平均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA 及CUR处理之后没有太大的变化，说明NAFLD确实可以诱导小鼠肝脏中 Cyp2e1的表达，且EA、MoA及CUR对Cyp2e1的mRNA水平没有太大的影响。

在经过上述各种处理之后，各组小鼠肝脏中Keap1的mRNA水平并没有出现明显的变化。

2.6 EA与MoA对小鼠肝组织中各目的基因蛋白水平的影响

2.6.1溶液配制

1)RIPA蛋白裂解液：1mL RIPA Lysis Buffer+10μL PMSF，放置于冰上待用。

2)5×SDS-PAGE缓冲液：向2.5mL UP水中分别加入0.5g SDS、0.15g Tris-HCl、25mg BPB以及2.5mL甘油后充分混匀。

3)1640完全培养基：向900mL UP水中分别加入培养基粉末、2.435g NaHCO3、100mg链霉素、10000U青霉素以及3.571g HEPES后充分溶解并混匀。使用0.22μm滤器过滤，分装密封保存。在使用前加入10％(体积比)胎牛血清。

4)Co-IP(免疫共沉淀)裂解缓冲液：将0.5μL蛋白酶抑制剂混合物、1μL PMSF 与500μL NP40裂解液置于冰上混匀待用(此为配制一个10cm皿细胞的用量)。

5)0.25％胰酶：0.25％胰酶：向100mL PBS中加入20mg EDTA-2Na，超声溶解，再加入250mg胰酶粉末，轻轻摇匀，待其充分溶解后，使用0.22μm 滤膜滤过，分装备用。

6)1×电泳缓冲液：向1L UP水中分别加入3g Tris-HCl、1g SDS和14.4g甘氨酸后充分混匀，保存于室温待用。

7)1×转膜缓冲液：向900mL UP水中分别加入14.4g甘氨酸、3g Tris-HCl以及100mL甲醇，充分混匀后保存于室温待用。

8)TBS缓冲液：向1L UP水中分别加入8g NaCl与2.42g Tris-HCl，充分混匀后保存于室温待用。

9)TBST缓冲液：向1L UP水中分别加入8g NaCl、2.42g Tris-HCl以及1mL 吐温-20，充分混匀后保存于室温待用。

2.6.2组织总蛋白的提取与样品制备

采用RIPA Lysis Buffer对小鼠肝组织进行裂解，具体步骤如下:

1)将冻存的小鼠肝脏组织恢复至室温，使用干净的滤纸吸干组织上多余的水分，将预冷的生理盐水按照组织重量(g):生理盐水体积(mL)＝1:1的比例加入，将样品置于冰上，使用手持电动组织匀浆器进行匀浆，每间隔10～15s，匀浆10s，直至得到均匀体系。

2)向200μL含PMSF的RIPA裂解液中加入上述得到的50μL肝组织匀浆液。 (PMSF的最终浓度为1mM)。

3)将各组织样品振荡涡旋30s后置于冰上，静置3min后继续振荡涡旋30s，总共操作30min。

4)4℃离心10min(10000rpm)。

5)采用BCA试剂盒对各样品进行蛋白定量。

6)向样品中加入适当的PBS与5×loading buffer，充分混合，使最终蛋白的浓度为10μg/μL。

7)将上述得到的各样品置于沸水中水浴10min，置于-70℃保存待用。

2.6.3蛋白免疫印迹试验(Western Blot)

利用Bio-Rad Mini-Protean系统进行蛋白免疫印迹试验。操作步骤如下:

1)配制SDS-PAGE凝胶：根据凝胶配方说明书配制12％分离胶(5mL/每块胶) 和4％浓缩胶(2mL/每块胶)。

2)电泳：每上样孔内加入20μL样品，先90V恒压电泳至Marker泳道出现不同条带后，增加电泳电压至120V，继续电泳直至得到满意的条带距离。

3)转膜：①裁剪大小适宜的PVDF膜，置于甲醇中浸泡1min；②按照一定顺序将PVDF膜、滤纸、SDS-PAGE凝胶、以及海绵一起浸泡于转膜缓冲液中，随后置于转膜用的塑料夹板中；③将组装好的塑料夹板置于装满转膜液的电泳槽中。转膜条件：恒流300mA，60min。

4)封闭：将转膜完成的PVDF膜放入含2％BSA的TBST溶液中，于37℃下封闭1～3h(80rpm，)。

5)一抗孵育：将封闭完成的PVDF膜放入装有一抗稀释液(用2％BSA稀释) 的抗体孵育盒中。摇床4℃振摇过夜。

6)二抗孵育：①将一抗孵育完毕的PVDF膜用TBST漂洗3次，每次5min；②将PVDF膜放入装有适量二抗稀释液(用TBST稀释)的抗体孵育盒中摇床4℃振摇90min。

7)漂洗：将二抗孵育完毕的PVDF膜用TBST漂洗3次，再用TBS漂洗2次，每次均为5min。

显影与拍照：取出清洗干净的PVDF膜，用干净纸巾吸去膜上多余的液体，在膜上滴加ECL显影液(A液:B液＝1:1)，当PVDF膜上均匀浸润了ECL显影液后于凝胶成像仪上显影，通过SageCapture采集显影图像。

2.6.4数据处理

使用LANE1D软件对得到的蛋白条带进行灰度分析。

采用Microsoft Excel 2019进行数据整理，比较各实验组小鼠肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4蛋白的表达差异。实验结果用 Graphpad prism 7软件进行单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05则差异有统计学意义。

2.6.5实验结果

各组小鼠肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、Mrp2及Mrp4的蛋白表达情况如图14所示。

由图14的结果可看出，经高脂饲料喂养2个月后的野生型NAFLD小鼠模型肝脏中，Nrf2的水平较对照组有显著的增加，且差异具有统计学意义(p<0.05)，这是因为：NAFLD会诱导野生型小鼠肝脏中Nrf2的蛋白的表达。在分别给予 EA、MoA及CUR处理之后，野生型NAFLD小鼠模型的肝脏中Nrf2的蛋白水平较相同基因型的对照组和单纯的NAFLD组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中Nrf2的蛋白水平并没有明显的变化；同样的，在分别经过EA、MoA及CUR处理的野生型NAFLD小鼠模型肝脏中，Nrf2的下游基因：Mrp2、Mrp4、Nqo1以及Ho-1的蛋白水平均不同程度的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且表现出了与Nrf2相似的变化趋势，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中并没有明显的变化规律。上述结果说明：EA、 MoA与CUR一样，是Nrf2的激动剂。

较空白对照组而言，野生型和Nrf2敲除的NAFLD小鼠模型肝脏中，Cyp2e1 的蛋白水平显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA及 CUR处理之后没有太大的变化，说明NAFLD确实可以诱导小鼠肝脏中Cyp2e1 的表达，且EA、MoA及CUR对Cyp2e1的蛋白水平没有太大的影响。

上述实验表明，EA与MoA确实是Nrf2的激动剂，且两者很可能是通过诱导Nrf2来上调其下游抗氧化蛋白、II相解毒酶以及转运体的表达，进而起到对抗NAFLD所致氧化应激反应和炎症反应等的作用。

实施例2、体外细胞模型验证EA与MoA经Nrf2通路对NAFLD的治疗作用

本实施例中除以下药物外，其余药物来源均与上文中相同：

活性氧(ROS)测试盒(E004，南京建成)；无脂肪酸-BSA(B2064，美国SIGMA)；油酸(O1383，美国SIGMA)；棕榈酸(P0500，美国SIGMA)。

1、NAFLD细胞模型的建立与验证

1.1溶液配制

1)1640完全培养基：同实施例1。

2)DMEM完全培养基：同实施例1。

3)0.25％胰酶：同实施例1。

4)PBS溶液：取一袋PBS粉末，按照说明书要求加入1L UP水，充分混匀，待用。

5)20％无脂肪酸-BSA溶液：称取0.6g无脂肪酸-BSA，置于50mL离心管中，加入3mL预热至55℃的PBS溶液，直接8000rpm室温(25℃左右)离心20min，即可完全溶解，得到棕黄色的澄清溶液。注意刚加入PBS溶液时切忌震荡或者混合，否则会导致BSA结成块状结晶不溶解。

6)40％无脂肪酸-BSA溶液：称取1.2g无脂肪酸-BSA，置于50mL离心管中，加入3mL预热至55℃的PBS溶液，直接8000rpm室温离心20min，即可完全溶解，得到棕黄色的澄清溶液。

7)0.1M NaOH溶液：称取0.04g NaOH粉末，加入10mL UP水，充分混匀，即得到10mL0.1M NaOH溶液。

8)20mM油酸溶液：在25℃时用移液枪量取19.04μL油酸加入到3mL 0.1M NaOH溶液中，随后放置于75℃水浴中充分皂化约30min，直至得到无色透明澄清溶液，即为20mM油酸钠皂化液。将保温的油酸钠皂化液迅速地加入到3mL 20％无脂肪酸-BSA溶液中，得到6ml20mM油酸+20％BSA 溶液。适当混匀，置于55℃以下助溶30min，得棕黄色澄清样溶液，与原BSA溶液性状无差异，无固体或絮状杂质，且性状稳定。该溶液于超净台中过滤(0.22μM)，密封后置于4℃长期存储。

9)40mM棕榈酸溶液：称取0.0307g棕榈酸加入到3mL 0.1M NaOH溶液中，随后置于75℃水浴中充分皂化约30min，直至得到无色透明澄清溶液，即为40mM棕榈酸钠皂化液。将保温的棕榈酸钠皂化液迅速地加入到3mL 40％无脂肪酸-BSA溶液中，得到6ml 40mM油酸+40％BSA溶液。适当混匀，置于55℃以下助溶30min，得棕黄色澄清样溶液，与原BSA溶液性状无差异，无固体或絮状杂质，且性状稳定。该溶液于超净台中过滤(0.22μM)，密封后置于4℃长期存储。

10)标准排查溶液：取3mL 20％无脂肪酸-BSA溶液与3mL 0.1M NaOH溶液充分混合，于超净台中过滤(0.22μM)，密封后置于4℃长期存储。用于排查BSA、pH值及溶液中其他物质对于细胞的影响。

11)自由脂肪酸储备液(Free fatty acids，FFAs)：以20mM油酸溶液:40mM 棕榈酸溶液＝4:1的比例配制4mM的FFAs储备液，密封后置于4℃长期存储。

1.2细胞株和细胞培养

THLE-3细胞，购于中国科学院上海细胞生物学研究所，采用1640完全培养基进行培养。

HepG2细胞，购于中国科学院上海细胞生物学研究所，采用DMEM完全培养基进行培养。

1.3 NAFLD细胞模型的建立与验证

1.3.1细胞给药

分别将L02、THLE-3及HepG2细胞按1×10⁶个/mL的密度接种于六孔板中，待细胞生长面积占培养皿总面积的80％左右时，分别用含标准排查溶液的空白培养基(空白对照)、100/500/1000μM FFAs含药培养基进行给药处理，将给药后的六孔板置于细胞培养箱中继续培养24h后取出进行后续实验。

1.3.2油红O染色对NAFLD细胞模型的验证

1)样品处理

①照实施例1中的方法配制油红O染色应用液。

②使用PBS将6孔板中的细胞轻轻漂洗3次，吸尽剩余液体。每孔加入200μL 油红O染色应用液，染色15min。随后用37℃左右的UP水漂洗15s。

③吸尽UP水，每孔加入200μL复染液继续染色3～5min，随后用UP水漂洗 30～60s。

④加入适量UP水液封，并尽快于倒置光学显微镜下观察细胞的染色情况及形态学变化。

2)实验结果

按照上述步骤得到的L02、THLE-3及HepG2细胞油红O染色结果如图16 所示。

由图16油红O染色结果可看出，经100、500、1000μM FFAs处理24h后， L02，THLE-3及HepG2细胞的细胞质中均不同程度的出现了大小不一、圆形、轮廓较为明显且被染成红色的脂滴，表明这三种细胞系的NAFLD肝细胞模型均构建成功。同时，当FFAs的处理浓度为500μM时，细胞质中的红色脂滴较为密集且轮廓分明，故选择500μM浓度的FFAs为后续构建NAFLD肝细胞模型的处理条件。

2、EA与MoA对NAFLD人源肝细胞模型的影响

2.1 EA与MoA对L02、THLE-3及HepG2细胞活力的影响

对L02，THLE-3及HepG2细胞进行MTT实验，考察不同浓度的EA、MoA 及CUR(阳性对照药，Nrf2激动剂)处理24h后对L02，THLE-3及HepG2细胞活力的影响。结果如图17所示。

由MTT实验结果可看出，经过24h处理后，经0～100μM EA、0～25μM MoA 及0～25μMCUR处理的L02细胞的细胞活力均在90％以上，说明EA、MoA及 CUR在这些浓度范围内对L02细胞均无明显的生长抑制作用，故选用50、100μM EA，10、25μMMoA及10μM CUR作为后续L02细胞的处理条件。同样，经过 24h处理后，经0～100μM EA、0～50μM MoA及0～25μM CUR处理的THLE-3 细胞的细胞活力均在90％以上，说明EA、MoA及CUR在这些浓度范围内对 THLE-3细胞均无明显的生长抑制作用，故选用50、100μM EA，25、50μMMoA 及10μM CUR作为后续THLE-3细胞的处理条件。同理，选用50、100μM EA， 10、25μMMoA及10μM CUR作为后续HepG2细胞的处理条件。

2.2 EA与MoA对NAFLD细胞模型中ROS水平的影响

2.2.1细胞给药

分别将L02、THLE-3及HepG2细胞按5×10⁵个/mL的密度接种于12孔板中，待细胞贴壁且生长至70～80％融合时，分别用含标准排查溶液的空白培养基 (空白对照)、500μMFFAs含药培养基进行给药处理，将给药后的12孔板置于细胞培养箱中继续培养24h。取出12孔板，①分别在培养基中继续加入 0.1％DMSO(空白对照)、50、100μM EA，10、25μMMoA及10μM CUR对 L02细胞进行给药处理；②分别在培养基中继续加入0.1％DMSO(空白对照)、 50、100μM EA，25、50μMMoA及10μM CUR对THLE-3细胞进行给药处理；③分别在培养基中继续加入0.1％DMSO(空白对照)、50、100μM EA，10、 25μMMoA及10μM CUR对HepG2细胞进行给药处理。随后置于细胞培养箱中继续培养24h。

2.2.2样品处理

1)加入荧光探针：每孔加入适量的10mM DCFH-DA，使终浓度为500nM。加入等量的DMSO作为空白对照。加入适量12mM活性氧供氢体，使其终浓度为20μM，作为阳性对照。将12孔板放入细胞培养箱中37℃孵育 1h。

2)细胞收集：用0.25％胰酶消化细胞，加入对应的培养基终止消化，制成细胞悬液，用PBS洗涤细胞2次，1000rpm室温离心5min。加入适量的PBS 重悬细胞。

3)荧光检测：将200μL上述得到的细胞悬液加入到96孔板中，使用 Varioskan^TMLUX多功能微孔板读数仪及操作软件对细胞样品进行荧光检查。最佳激发波长：500±15nm，最佳发射波长：530±20nm。

4)使用BCA试剂盒对上述细胞悬液的蛋白浓度进行检测，即待10cm培养皿中L02细胞生长至80％左右融合时，加入适宜浓度的上述单体处理细胞24h，随后进行Co-IP实验。具体操作步骤如下:

a)取出处理完毕的细胞，使用预冷的PBS洗涤三次，吸尽剩余液体。

b)于冰上加入预冷的500μL Co-IP裂解缓冲液，每隔1～3min取出涡旋1 min，共计30min。

c)裂解完毕后，4℃离心15min(14000rpm)。

d)将离心得到的上清转移至1.5mL EP管中。

e)使用BCA蛋白定量试剂盒，按照说明书操作 (http://www.wanleibio.cn/index.php？m＝content&c＝index&a＝show&catid ＝199&id＝798)，使用酶标仪于562nm处测定其紫外吸收。根据由标准品计算得到的标准曲线计算出各样品的蛋白浓度。

f)加入适量的PBS，将总蛋白浓度稀释到10μg/μL左右，每管留存适量体积的细胞裂解液作为Input对照，保存于-70℃待用。

g)每份样品取细胞裂解液500μL分别与适量体积的NRF2一抗混合(根据抗体说明书)，阴性对照管则根据抗体说明书加入适量体积的IgG一抗。

h)每份样品均补加2.5μL蛋白酶抑制剂，随后4℃振摇过夜。

i)Protein A/G磁珠制备：用剪去前端的枪头轻柔吹打Protein A/G磁珠储备液直至其均匀分散，取出适量体积放置于另一个1.5mL EP管中。

j)将吸出的Protein A/G磁珠用PBS清洗两次，使用磁力架吸附磁珠，弃上清，随后根据需要加入适量体积的PBS，将其配制成50％浓度待用。

k)取出孵育完毕的细胞裂解液，加入50％的Protein A/G磁珠，混匀后4℃振摇2h。

l)将样品管静置于磁力架上2min，待磁珠-抗原抗体复合物凝聚成团时，弃掉上清，加入适量的预冷PBS重悬混匀，置于4℃摇床振摇5min。重复该步骤三次

m)弃掉上清，将磁珠-抗原抗体复合物用适量的2×Loading buffer重悬混匀，沸水浴加热10min。

n)将先前储存于-70℃的Input样品取出，恢复至室温，加入适量的 5×Loadingbuffer，混匀后将样品置于100℃沸水浴煮10min。

o)4℃离心1min(12000rpm)，收集上清，保存于-20℃待用。

2.2.3数据处理

用单位蛋白的荧光强度来计算细胞中ROS的水平，计算公式如下：

单位蛋白中ROS荧光强度＝(样品_荧光强度—空白_荧光强度)/样品_蛋白浓度

采用Microsoft Excel 2019进行数据整理，实验结果用Graphpad prism 7软件进行单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05则差异有统计学意义。

2.2.4实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中的ROS水平如图18所示。

由图18的结果可看出，经FFAs处理24h后，L02、THLE-3及HepG2细胞中ROS水平较对照组显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)，表明：FFAs 所构建的NAFLD细胞模型中氧化应激损伤会明显的增加。在分别给予EA、 MoA及CUR处理之后，较单纯的NAFLD组而言，三种细胞系中的ROS水平都出现了不同程度的下降趋势，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)，但仍然都高于对照组的ROS水平。上述结果提示：EA、MoA及CUR可以降低NAFLD 细胞模型中的ROS水平，减少细胞内的氧化应激损伤，起到保护肝细胞的作用。

2.3 EA与MoA对NAFLD细胞模型中GSH水平的影响

2.3.1细胞给药

参照上述“2.2.1”项下内容进行操作。

2.3.2溶液配制

参照实施例1中的方法进行操作。

2.3.3样品处理

1)取出12孔板，用0.25％胰酶消化细胞，加入对应的培养基终止消化，制成细胞悬液，用PBS洗涤细胞2次，1000rpm室温离心3min。加入适量的 UP水，充分混匀，直至透亮为止，即得细胞裂解液。

2)取上述得到的细胞裂解液100μL，加入400μL试剂一应用液，充分混匀， 4000rpm4℃离心10min，取上清液200μL进行显示反应。

3)显色反应：根据表2-4的比例加入相应试剂，分别配制空白样品、标准样品及测定样品。

4)配制完成后，充分混匀，室温静5min，取200μL样品加入到96孔板中。

5)使用Varioskan^TMLUX多功能微孔板读数仪于420nm处，测定各样品的吸光度值。使用UP水对仪器进行调零。

6)使用BCA试剂盒对上述细胞悬液的蛋白浓度进行检测。

2.3.4数据处理

根据公式计算组织中GSH的含量，计算公式如下：

其中，样品测试前稀释倍数＝上清液制备过程中的稀释倍数(5倍)×细胞裂解液制备时的稀释倍数。

采用Microsoft Excel 2019对所得到的数据进行整理统计，实验结果用Graphpadprism 7软件进行单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05则差异有统计学意义。

2.3.5实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中的GSH水平如图19所示。

由图19的结果可看出，经FFAs处理24h后，L02、THLE-3及HepG2细胞中GSH水平较对照组显著下降，差异具有统计学意义(p<0.01)，表明：FFAs 所构建的NAFLD细胞模型中GSH的消耗明显增加。在分别给予EA、MoA及 CUR处理之后，较单纯的NAFLD组而言，三种细胞系中的GSH水平都出现了不同程度的回升，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)，但仍然都低于对照组的GSH水平。上述结果提示：EA、MoA及CUR可以改善NAFLD细胞模型中GSH的过度消耗，增加GSH的水平，起到保护肝细胞的作用。

2.4 EA与MoA对NAFLD细胞模型中各目的基因mRNA水平的影响

2.4.1引物的设计与合成

从NCBI的Gene(https://www.ncbi.nlm..nih.gov/gene/)中获得人源的NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1以及GAPDF的mRNA NCBI Reference Sequences参考编号，通过Integrated DNATechnologies(IDT, https://sg.idtdna.com/pages)网站设计qPCR引物，引物序列见表3-1。

表3-1 人源NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、CYP2E1、MRP2、GAPDF以及 MRP4的qPCR引物序列。

2.4.2细胞给药

参照“2.2.1”项下内容进行操作。

2.4.3细胞总RNA提取

1)弃去6孔板中的培养基，使用PBS漂洗3次，吸尽多余液体。

2)每孔中加入200μL TRNzol，室温静置5min。

3)将上述液体转移至1.5mL离心管中并加入50μL氯仿，涡旋振荡至溶液充分乳化，室温静置3min。

4)4℃离心15min(12000rpm)。

5)离心完毕后，将三层中的最上层透明液体转移至1.5mL离心管中。

6)将200μL异丙醇加入到上述离心管中，充分混匀，室温静置10min。

7)4℃离心10min(12000rpm)。

8)弃掉上清后加入700μL 75％的乙醇，颠倒洗涤离心管。

9)4℃离心5min(7500rpm)。

10)吸尽管中的乙醇。

11)将样品干燥5min，加入20μLRNasefree水溶解沉淀。

12)使用Nanodrop 2000测定各组织样品的RNA浓度以及OD260/280值。将各样品的RNA终浓度调至1μg/mL左右，保存于-70℃待用。

2.4.4cDNA的合成

参照实施例1中的方法进行操作。

2.4.5荧光聚合酶链反应

参照实施例1中的方法进行操作。

2.4.6数据处理

参照实施例1中的方法进行操作。

2.4.7实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中NRF2、KEAP1、 HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1的mRNA表达情况如图20所示。

由图20的结果可看出，经FFAs处理24h后，L02、THLE-3及HepG2细胞中NRF2的mRNA水平较对照组有不同程度的增加，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)；在分别给予不同浓度的EA、MoA及CUR处理之后，三种细胞系中NRF2的mRNA水平较对照组和单纯的NAFLD组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且EA和MoA对NRF2的上调具有浓度依赖性。上述结果提示：NAFLD会增加三种肝细胞系中NRF2的mRNA水平；EA与 MoA很有可能是NRF2的激动剂，且其上调作用具有浓度依赖性。

同样，在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，三个细胞系中的 NRF2下游基因：NQO1、HO-1、MRP2和MRP4的mRNA水平均不同程度的增加，且表现出了与NRF2相似的变化趋势，部分差异具有统计学意义(p<0.05)。

经FFAs处理后，L02、THLE-3及HepG2细胞中CYP2E1的mRNA水平较对照组有2～4倍的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA 及CUR处理之后没有太大的变化，说明NAFLD确实可以诱导肝细胞中CYP2E1 的表达，且EA、MoA及CUR对CYP2E1的mRNA水平没有太大的影响。

在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，三个细胞系中KEAP1的 mRNA水平并没有出现明显的变化。

2.5 EA与MoA对NAFLD细胞模型中各目的基因蛋白水平的影响

2.5.1溶液配制

参照实施例1中的方法进行操作。

2.5.2细胞给药

分别将L02、THLE-3及HepG2细胞按1×10⁶个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁且生长至70～80％融合时，参照“2.2.1”项下内容进行操作。

2.5.3细胞总蛋白提取与样品制备

采用RIPA Lysis Buffer对细胞进行裂解，具体步骤如下:

1)弃去6孔板中的培养基，使用PBS漂洗3次，吸尽多余液体。

2)每孔加入含PMSF的RIPA裂解液120μL(PMSF的最终浓度为1mM)。

3)将6孔板振荡涡旋30s后置于冰上，静置3min后继续振荡涡旋30s，总共操作30min。

4)将上述得到的细胞裂解液转移至1.5mL离心管中，4℃离心10min(10000 rpm)。

5)参照“1.5.2.3”项下的操作内容，采用BCA试剂盒对各样品进行蛋白定量。

2.5.4蛋白免疫印迹试验

参照实施例1中的方法进行操作。

2.5.5数据处理

参照实施例1中的方法进行操作。

2.5.6实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中NRF2、KEAP1、 HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1的蛋白表达情况如图21所示。

由图21的结果可看出，经FFAs处理24h后，L02、THLE-3及HepG2细胞中NRF2的蛋白水平较对照组有不同程度的增加，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)；在分别给予不同浓度的EA、MoA及CUR处理之后，三种细胞系中NRF2的蛋白水平较对照组和单纯的NAFLD组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且EA和MoA对NRF2的上调具有浓度依赖性。上述结果提示：NAFLD会增加三种肝细胞系中NRF2的蛋白水平；EA与MoA很有可能是NRF2的激动剂，且其上调作用具有浓度依赖性。

同样，在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，三个细胞系中的 NRF2下游基因：NQO1、HO-1、MRP2和MRP4的蛋白水平均不同程度的增加，且表现出了与NRF2相似的变化趋势，部分差异具有统计学意义(p<0.05)。

经FFAs处理后，L02、THLE-3及HepG2细胞中CYP2E1的蛋白水平较对照组有2～3倍的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA及 CUR处理之后没有明显的变化趋势，说明NAFLD确实可以诱导肝细胞中 CYP2E1的表达，且EA、MoA及CUR对CYP2E1的蛋白水平没有太大的影响。

在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，三个细胞系中KEAP1的蛋白水平并没有出现明显的变化。

3、NRF2敲减的NAFLD细胞模型的建立与验证

采用脂质体转染技术将NRF2特异性的小干扰RNA(NRF2-siRNA)导入 L02、THLE-3及HepG2细胞中，利用siRNA高效、特异性的抑制细胞内NRF2 的表达，从而观察EA、MoA及CUR(阳性药)对NAFLD的治疗作用是否也会受到影响，以再次验证EA与MoA确实是NRF2的激动剂，并且可通过激活 NRF2通路起到治疗NAFLD的作用。

L02、THLE-3及HepG2这三种细胞系分别进行如下处理：①空白对照组(只加

3000)；②阴性对照(NC-siRNA)组 (

3000+NC-siRNA)；③NRF2的小干扰RNA(NRF2-siRNA)实验组(

3000+NRF2-siRNA)。

实验室前期构建的NRF2-siRNA和NC-siRNA的碱基序列见表3-2。

表3-2 NRF2-siRNA和NC-siRNA的碱基序列

3.1溶液配制

1)MEM培养基：向900mL UP水中分别加入培养基粉末、2.431g NaHCO₃与3.572gHEPES，充分溶解混匀。使用0.22μm滤器过滤，分装密封保存。

2)siRNA工作溶液制备：用RNasefree水将siRNA粉末稀释至10μM的浓度，于-20℃避光保存备用。

3.2细胞株和细胞培养

进行L02、THLE-3及HepG2细胞的培养。待细胞生长至80％左右融合时进行传代培养或计数，稀释后点板用于给药实验。

3.3细胞NRF2-siRNA转染实验

1)细胞点板：于转染前1天，将L02、THLE-3及HepG2细胞按1×10⁶个/mL 的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁且生长至70～80％融合时进行后续操作。

2)制备siRNA-脂质体复合物：使用Lipofectamine^TM3000Transfection Reagent(L3000015，Invitrogen)试剂盒进行制备，具体操作详见试剂盒说明书 (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015SID＝srch-srp- L3000015)。

3)更换六孔板中的完全培养基，将siRNA-脂质体复合物分别加入到对应的孔中，设置空白对照组(Vehicle，仅加入转染试剂)置于细胞培养箱中继续培养24h后进行后续实验。

3.4 NRF2敲减的NAFLD细胞模型的建立与验证

3.4.1细胞给药

从孵箱中取出“3.3”项下得到的NRF2敲减的L02、THLE-3及HepG2细胞，分别用含标准排查溶液的空白培养基(空白对照)与500μM FFAs含药培养基进行给药处理，将给药后的六孔板置于细胞培养箱中继续培养24h后取出进行后续实验。

3.4.2油红O染色对NAFLD细胞模型的验证

3.4.2.1样品处理：按照“1.3.2”项下内容进行操作。

3.4.2.2实验结果

按照上述步骤得到的L02、THLE-3及HepG2细胞油红O染色结果如图22 所示。

由图22油红O染色结果可看出，转染了不同siRNA的L02，THLE-3及 HepG2细胞在经500μM FFAs处理24h后，其细胞质中均不同程度的出现了大小不一、圆形、轮廓较为明显且被染成红色的脂滴，表明这三种敲减了NRF2 的NAFLD肝细胞模型均构建成功。故选择上述处理条件进行后续的实验。

4、EA与MoA对NRF2敲减的NAFLD人源肝细胞模型的影响

4.1 EA与MoA对NRF2敲减的NAFLD细胞模型中ROS水平的影响

4.1.1细胞给药

参照“3.4”项下操作构建L02、THLE-3及HepG2细胞系NRF2敲减的NAFLD 细胞模型。构建完毕后，再按照如下条件进行细胞的给药处理：①分别在培养基中继续加入0.1％DMSO、100μM EA、25μMMoA及10μM CUR对L02细胞进行给药处理；②分别在培养基中继续加入0.1％DMSO、100μM EA、50μMMoA 及10μM CUR对THLE-3细胞进行给药处理；③分别在培养基中继续加入 0.1％DMSO、100μM EA、25μMMoA及10μM CUR对HepG2细胞进行给药处理。

将以上加药细胞置于细胞培养箱中继续培养24h后取出进行后续实验。

4.1.2样品处理

参照“2.2.2”项下进行操作。

4.1.3数据处理

参照“2.2.3”项下进行操作。

4.1.4实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中的ROS水平如图23所示。

由图23的结果可看出，经FFAs处理24h后，NAFLD组、NAFLD+NC-siRNA 组以及NAFLD+NRF2-siRNA组的三种细胞系中ROS水平均较空白对照组显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)，表明：FFAs所构建的NAFLD细胞模型中氧化应激损伤会明显的增加。较单纯的NAFLD组而言，在敲减了NRF2 之后，三种细胞系中的ROS水平均出现了不同程度的增加，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)，提示：NRF2的缺失可以增加NAFLD所引起的肝组织中的氧化应激损伤。同时，当敲减了细胞中的NRF2后，再分别给予EA、MoA 及CUR处理，三种细胞系中的ROS水平并没有出现太大的变化。上述结果提示：当NRF2敲减之后，EA、MoA及CUR不能降低NAFLD细胞模型中的ROS 水平，从而不能减少肝脏中的氧化应激损伤，起到保护肝脏的作用。

4.2 EA与MoA对NRF2敲减后的NAFLD细胞模型中GSH水平的影响

4.2.1细胞给药

参照“4.1.1”项下内容进行操作。

4.2.2溶液配制

参照实施例1中的方法进行操作。

4.2.3样品处理

参照“2.3.3”项下内容进行操作。

4.2.4数据处理

参照“2.3.4”项下内容进行操作。

4.2.5实验结果

NRF2敲减的L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中的 GSH水平如图24所示。

由图24的结果可看出，经FFAs处理24h后，NAFLD组、NAFLD+NC-siRNA 组以及NAFLD+NRF2-siRNA组的三种细胞系中GSH水平较空白对照组显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，表明：FFAs所构建的NAFLD细胞模型中GSH的消耗会明显增加。较单纯的NAFLD组而言，在敲减了NRF2之后，三种细胞系中的GSH水平均出现了不同程度的减少，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)，提示：NRF2的缺失可以加重NAFLD所引起的肝组织中GSH 的过度消耗。同时，当敲减了细胞中的NRF2后，再分别给予EA、MoA及CUR 处理，三种细胞系中的GSH水平并没有出现太大的变化。上述结果提示：当 NRF2敲减后，EA、MoA及CUR不能缓解NAFLD细胞模型中的GSH的消耗程度，使GSH继续维持在较低的水平，从而不能起到保护肝脏的作用。

4.3 EA与MoA对NRF2敲减后的NAFLD细胞模型中各目的基因mRNA水平的影响

4.3.1引物的设计与合成

参照“2.4.1”项下内容进行操作。

4.3.2细胞给药

参照“4.1.1”项下内容进行操作。

4.3.3细胞总RNA提取

参照“2.4.3”项下内容进行操作。

4.3.4cDNA的合成

参照实施例1中的方法进行操作。

4.3.5荧光聚合酶链反应

参照实施例1中的方法进行操作。

4.3.6数据处理

参照实施例1中的方法进行操作。

4.3.7实验结果

NRF2敲减的L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中NRF2、KEAP1、HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1的mRNA表达情况如图25所示。

由图25的结果可看出，经FFAs处理24h后，NAFLD组与 NAFLD+NC-siRNA组的L02、THLE-3及HepG2细胞中NRF2的mRNA水平较空白对照组有不同程度的增加，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)；在转染了NRF2-siRNA后，三种细胞系中NRF2的mRNA水平均显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)；在转染了NRF2-siRNA后，分别给予不同浓度的 EA、MoA及CUR处理，三种细胞系中NRF2的mRNA水平较空白对照组和 NAFLD组而言均显著降低，差异均具有统计学意义(p<0.05)，但较 NAFLD+NRF2-siRNA组而言并没有明显的变化。上述结果提示：NAFLD会增加三种肝细胞系中NRF2的mRNA水平；转染NRF2-siRNA可成功降低三种细胞系中NRF2的mRNA水平；转染了NRF2-siRNA可以减弱EA与MoA及CUR (已知的NRF2激动剂)对NRF2的诱导作用。

在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，转染了NRF2-siRNA的三个细胞系中的NRF2下游基因：NQO1、HO-1、MRP2和MRP4的mRNA水平均没有明显的变化规律。

同样，经FFAs处理后，L02、THLE-3及HepG2细胞中CYP2E1的mRNA 水平较对照组有2～4倍的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、 MoA及CUR处理和转染了siRNA之后也没有明显的变化趋势，表明：NAFLD 确实可以诱导肝细胞中CYP2E1的表达，且EA、MoA、CUR及siRNA对CYP2E1 的mRNA水平没有太大的影响。

在分别经过上述各种处理之后，三个细胞系中KEAP1的mRNA水平并没有出现明显的变化。

4.4 EA与MoA对NRF2敲减后的NAFLD细胞模型中各目的基因蛋白水平的影响

4.4.1溶液配制

参照实施例1中的方法进行操作。

4.4.2细胞给药

参照“4.1.1”项下内容进行操作。

4.4.3细胞总蛋白提取与样品制备

参照“2.5.3”项下内容进行操作。

4.4.4蛋白免疫印迹试验

参照实施例1中的方法进行操作。

4.4.5数据处理

参照实施例1中的方法进行操作。

4.4.6实验结果

L02、THLE-3及HepG2细胞经不同给药方案处理后细胞中NRF2、KEAP1、 HO-1、NQO1、MRP2、MRP4、CYP2E1的蛋白表达情况如图26所示。

由图26的结果可看出，经FFAs处理24h后，NAFLD组与 NAFLD+NC-siRNA组的L02、THLE-3及HepG2细胞中NRF2的蛋白水平较空白对照组有不同程度的增加，且部分差异具有统计学意义(p<0.05)；在转染了NRF2-siRNA后，三种细胞系中NRF2的蛋白水平均显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)；在转染了NRF2-siRNA后，再分别给予不同浓度的EA、 MoA及CUR处理，三种细胞系中NRF2的蛋白水平较空白对照组和NAFLD组而言均显著降低，差异均具有统计学意义(p<0.05)，但较NAFLD+NRF2-siRNA 组而言并没有明显的变化。上述结果提示：NAFLD会增加三种肝细胞系中NRF2 的蛋白表达水平；转染NRF2-siRNA可成功降低三种细胞系中NRF2的蛋白水平；转染了NRF2-siRNA可以明显减弱EA与MoA及CUR(已知的NRF2激动剂)对NRF2的诱导作用。

在分别经过FFAs、EA、MoA及CUR处理之后，转染了NRF2-siRNA的三个细胞系中的NRF2下游基因：NQO1、HO-1、MRP2和MRP4的蛋白水平均没有明显的变化规律。

同样，经FFAs处理后，L02、THLE-3及HepG2细胞中CYP2E1的蛋白水平较对照组有2～3倍的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、 MoA及CUR处理与转染了siRNA之后也没有明显的变化趋势，表明：NAFLD 确实可以诱导肝细胞中CYP2E1的表达，且EA、MoA、CUR及siRNA对CYP2E1 的蛋白水平没有太大的影响。

在分别经过上述各种处理之后，三个细胞系中KEAP1的蛋白水平并没有出现明显的变化。

综上，通过上述实验可知，EA、MoA及CUR均能降低由FFAs所引起的细胞内增加的ROS水平，并且NRF2是EA、MoA及CUR发挥该作用的关键因素。EA、MoA及CUR均能减少由FFAs所引起的细胞内增加的GSH消耗水平，并且NRF2是EA、MoA及CUR发挥该作用的关键因素。EA与MoA确是Nrf2的激动剂，两者对于NQO1、HO-1、MRP2和MRP4的诱导作用依赖于 Nrf2的存在；EA与MoA通过诱导NRF2来上调其下游抗氧化蛋白、II相解毒酶以及转运体的表达，减少细胞中ROS的产生，同时增加还原性GSH的水平，进而起到对抗NAFLD所致的氧化应激反应和炎症反应等作用。

实施例3、EA与MoA对NAFLD小鼠模型APAP肝损伤的预防作用及其机制研究

本实验例中除以下药物外，其余药物来源均与上文中相同：对乙酰氨基酚混悬滴剂(泰诺林，上海强生制药有限公司)。

1.1 APAP给药时间的确定

1.1.1实验动物分组、给药及样品收集

选用本实验室繁育得到的野生型C57BL/6小鼠18只，随机分为3组，每组6 只，雌雄各半。以12h照明、12h黑暗交替适应性饲养1周后，处理组分别于早上9点(APAP-AM)和下午5点(APAP-PM)灌胃给予最大安全剂量的APAP (150mg/kg)，连续给药3天，每日一次。分组及给药方案见表4-1。

表4-1 小鼠的分组和给药方案(n＝6)

于最后一次给药的次日早上9点，向小鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.5g/kg)，待其麻醉成功后，迅速进行心脏取血和灌流，取出肝脏，将用生理盐水清洗干净的部分肝脏组织放入4％多聚甲醛固定液中浸泡，剩余的肝脏组织保存于-70℃待用。全血置于洁净的1.5mL离心管中，于4℃静置过夜后，室温离心10min (4000rpm)，分离得到血清。记录各组小鼠体重和肝脏的重量。

1.1.2小鼠肝功能生化指标分析

1.1.2.1样品处理

操作同实施例1。

1.1.2.2数据处理

操作同实施例1。

1.1.2.3实验结果

肝功能生化指标ALT和AST的数据处理结果如图27所示。

由图27的结果可以看出，所有APAP处理组的小鼠血清中ALT和AST的浓度均在正常范围之内(ALT：30～110U/L，AST：60～220U/L)，说明150mg/kg 的给药剂量不会对小鼠肝脏造成明显的损伤，是安全的给药剂量。与对照组相比，每天于下午5点给药的5PM组的小鼠血清中ALT和AST的浓度均显著升高，且差异具有统计学意义(p<0.01)；而上午9点给药的9AM组的小鼠血清中ALT和AST的浓度虽有增加的趋势，但该变化没有统计学意义。上述结果提示：连续3天灌胃给予150mg/kg的APAP会对小鼠肝脏造成轻微的损伤。同时，与9AM组相比，5PM组小鼠血清中ALT和AST的浓度均显著升高，且差异具有统计学意义(p<0.05)，提示：下午5点给药对小鼠肝脏产生的损伤程度更大。

1.1.3小鼠肝脏损伤及肝脏组织切片染色

1.1.3.1小鼠肝脏损伤情况

打开小鼠胸腔后，肉眼观察小鼠肝脏外观特征，小鼠肝损伤分析结果如图 28所示。

由图28的结果可以看出，各组小鼠肝脏均呈暗红色，表面较为光亮平滑，且胆囊无肿大的现象。该结果提示：于不同时间点，连续3天灌胃给予150mg/kg APAP后对野生型小鼠的肝脏外观没有明显的影响。

1.1.4 HE染色分析

操作同实施例1。小鼠肝脏HE染色分析结果如图29所示。

由图29的结果可以看出，与对照组相比，APAP处理组的小鼠肝脏细胞均出现轻微的炎细胞浸润，且5PM组的小鼠肝脏细胞还发生了轻微的空泡变性。上述结果提示：连续3天灌胃给予150mg/kg的APAP会对小鼠肝脏造成轻微的损伤，并且下午给药所导致的损伤更为严重。

综上所述，连续三天灌胃给予150mg/kg的APAP不会对小鼠肝脏造成明显的损伤，所以该剂量为安全的给药剂量。此外，不同时间点给药所造成小鼠肝损伤程度不同，且下午5点给药所导致的小鼠肝损伤更为严重。由于小鼠为夜行动物，大多是在傍晚及夜间进食，所以为了更好的模拟人类多在白天服药的实际情况，后续实验均采用下午5点灌胃给予150mg/kg APAP的给药方案。

1.2 EA与MoA对APAP所致NAFLD小鼠模型肝损伤的预防作用

1.2.1实验动物分组、给药及样品收集

选用本实验室繁育得到的野生型和Nrf2敲除纯合子(Nrf2-/-)C57BL/6小鼠各36只，将相同基因型的小鼠随机分为6组，每组6只，雌雄各半。以12h 照明、12h黑暗交替适应性饲养1周后，给予高脂饲料饲养2个月。2个月后开始给药，给药方案为：每天下午4点，分别灌胃给予EA、MoA或CUR，连续给药1周，每日一次；在倒数第三天，于给药后1h(下午5点)继续灌胃给予最大安全剂量的APAP(150mg/kg)，连续给药3天，每日一次。分组及给药方案见表4-2。EA、MoA及CUR仍然采用乳化的方式增溶，乳剂处方见“2.4.1”项下表2-3。

表4-2 小鼠的分组和给药方案(n＝6)

1.2.2小鼠肝功能生化指标分析

1.2.2.1样品处理

操作同实施例1。

1.2.2.2数据处理

操作同实施例1。

1.2.2.3实验结果

肝功能生化指标ALT和AST的数据处理结果分别如图30和图31所示。

由图30和31的结果可以看出，与相同基因型的对照组相比，经APAP单独处理的小鼠血清中ALT和AST的浓度均有所升高，差异具有统计学意义 (p<0.05)，但只有野生型小鼠血清中ALT和AST的浓度仍保持在正常范围内。该现象提示：150mg/kg APAP对野生型小鼠没有太大的影响，但对Nrf2敲除小鼠具有明显的肝脏毒性。

与相同基因型的APAP组相比，NAFLD+APAP组的小鼠血清中ALT和AST 的浓度均显著升高并超出了正常范围，差异具有统计学意义(p<0.01)。该现象提示：NAFLD确实可以显著增加APAP的肝毒性。同时，NAFLD+APAP组的Nrf2敲除小鼠的血清中ALT和AST浓度均显著高于野生型小鼠血清中的浓度，且具有统计学意义(p<0.05)，这说明Nrf2的存在对缓解APAP的肝毒性具有一定作用。

在分别灌胃给予小鼠EA、MoA及CUR后，野生型NAFLD+APAP小鼠模型的血清中ALT和AST的浓度较相同基因型的单纯NAFLD+APAP组而言均出现不同程度的降低，该变化均具有统计学意义(p<0.05)。但对于Nrf2敲除小鼠而言，在分别灌胃给予EA、MoA及CUR后，其血清中ALT和AST的浓度较相同基因型的单纯NAFLD+APAP组而言均没有发生明显的变化。上述结果提示：灌胃给予EA、MoA及CUR可显著降低野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP肝损伤，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

1.2.3小鼠肝脏损伤及肝脏组织切片染色

1.2.3.1小鼠肝脏损伤情况

肉眼观察小鼠肝脏外观特征，小鼠肝损伤结果如图32所示。

由图32的结果可以看出，经APAP单独处理的野生型小鼠肝脏的外观与对照组相同，均呈暗红色，表面较为光亮平滑，但Nrf2敲除小鼠肝脏上出现了明显大面积的小白斑。上述结果提示：150mg/kg APAP对野生型小鼠没有太大的影响，但对Nrf2敲除小鼠具有明显的肝脏毒性。当给予NAFLD组小鼠APAP 后，野生型和Nrf2敲除小鼠的肝脏上均出现了明显大面积的小白斑，表明 NAFLD确实可以增加APAP的肝毒性。在分别给予EA、MoA和CUR后，野生型小鼠肝脏上的小白斑基本消失，外观特征基本恢复正常，而Nrf2敲除小鼠肝脏上仍可见明显大面积的小白斑。该结果提示：EA、MoA及CUR可显著的降低野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP肝损伤，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

1.2.3.2 HE染色分析结果

操作同实施例1。小鼠肝脏HE染色分析结果如图33所示。

由图33的结果可以看出，与对照组相比，经APAP单独处理的小鼠肝脏细胞均出现了不同程度的空泡变性，且Nrf2敲除小鼠的肝细胞还出现了较为明显的炎细胞浸润，提示：150mg/kg APAP对野生型小鼠的肝脏没有太大的影响，但对Nrf2敲除小鼠具有一定的肝脏毒性。当给予NAFLD组小鼠APAP后，野生型和Nrf2敲除小鼠的肝细胞中均出现了较为严重的空泡变性、脂肪变性、点状坏死及炎细胞浸润的现象，表明NAFLD确实可以增加APAP的肝毒性。在分别给予EA、MoA和CUR后，野生型小鼠肝细胞上的点状坏死现象基本消失，且空泡变性、脂肪变性及炎细胞浸润的现象也有所改善，而Nrf2敲除小鼠组并没有太大的变化。该结果提示：EA、MoA及CUR可显著的降低野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP肝损伤，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

1.2.3.3油红O染色分析结果

操作同实施例1。小鼠肝脏油红O染色结果如图34所示。

由图34的结果可以看出，与对照组相比，经APAP单独处理的小鼠肝脏细胞均出现了不同程度的细胞核空洞，且Nrf2敲除小鼠更为严重，提示：150mg/kg APAP对野生型小鼠的肝脏没有太大的影响，但对Nrf2敲除小鼠具有一定的肝脏毒性。当给予NAFLD组小鼠APAP后，野生型和Nrf2敲除小鼠的肝细胞中均出现了较为严重的细胞核空洞及脂肪变性的现象，表明NAFLD确实可以增加APAP的肝毒性。在分别给予EA、MoA和CUR后，野生型小鼠肝细胞中细胞核空洞及脂肪变性的现象有所改善，而Nrf2敲除小鼠组并没有太大的变化。该结果提示：EA、MoA及CUR可显著降低野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP 肝损伤，且Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

1.2.4 EA与MoA对小鼠肝组织中GSH水平的影响

1.2.4.1试剂配制

操作同“实施例1。

1.2.4.2样品处理

操作同实施例1。

1.2.4.3数据处理

操作同实施例1。

1.2.4.4实验结果

各组小鼠肝组织中GSH浓度结果如图35所示。

由图35的结果可以看出，与相同基因型的空白对照组相比，经APAP单独处理的小鼠肝脏中GSH浓度均显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)，并且Nrf2敲除小鼠的GSH浓度也明显低于野生型小鼠(p<0.05)，该现象提示： 150mg/kg APAP可显著降低小鼠肝脏中的GSH水平，且对Nrf2敲除小鼠的影响更大。

与相同基因型的APAP组相比，NAFLD+APAP组的小鼠肝脏中GSH的浓度均显著降低，差异具有统计学意义(p<0.01)，该现象提示：NAFLD确实可以显著增加APAP的肝毒性，产生更多的NAPQI，从而消耗更多的GSH。同时， NAFLD+APAP组的Nrf2敲除小鼠肝脏中GSH的浓度显著低于野生型小鼠肝脏中GSH的浓度，且具有统计学意义(p<0.05)，这说明Nrf2的存在可缓解APAP 对肝脏中GSH的消耗。

在分别灌胃给予小鼠EA、MoA及CUR后，野生型小鼠肝脏中GSH的浓度较相同基因型的单纯NAFLD+APAP组相比出现不同程度的回升，但对于Nrf2 敲除小鼠而言，并没有太大的影响。上述结果提示：灌胃给予EA、MoA及CUR 可显著的缓解野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP对GSH的过度消耗，且 Nrf2在该过程中发挥着重要作用。

1.2.5 EA与MoA对小鼠肝组织中各目的基因mRNA水平的影响

1.2.5.1引物的设计与合成

操作同实施例1。

1.2.5.2组织总RNA提取

操作同实施例1。

1.2.5.3 cDNA的合成

操作同实施例1。

1.2.5.4荧光聚合酶链反应

操作同实施例1。

1.2.5.5数据处理

操作同实施例1。

1.2.5.6实验结果

小鼠经不同给药方案处理后肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、 Mrp2及Mrp4的mRNA表达情况如图36所示。

由图36的结果可看出，经APAP单独处理的野生型小鼠肝脏中Nrf2的 mRNA水平较相同基因型的对照组而言有所增加，差异具有统计学意义 (p<0.05)；在给予野生型NAFLD小鼠模型APAP处理后，其肝脏中的Nrf2 的mRNA水平较对照组和单纯APAP处理组均有所增加，差异具有统计学意义 (p<0.05)；在继续分别给予EA、MoA及CUR处理之后，野生型NAFLD小鼠模型的肝脏中Nrf2的mRNA水平较相同基因型的对照组、单纯的APAP组及NAFLD+APAP组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)，但上述处理对于Nrf2敲除小鼠的肝脏中Nrf2的mRNA水平并没有明显的影响。

同样，在分别经过EA、MoA及CUR处理的野生型小鼠肝脏中，Nrf2的下游基因：Nqo1、Ho-1、Mrp2和Mrp4的mRNA水平均不同程度的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且表现出了与Nrf2相似的变化趋势，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中并没有明显的变化规律。

上述结果提示：APAP可以诱导野生型小鼠肝脏中Nrf2的mRNA表达； NAFLD可以加强APAP对Nrf2的诱导作用；EA、MoA与CUR一样，是Nrf2 的激动剂。

较空白对照组而言，单纯APAP处理的野生型和Nrf2敲除的小鼠肝脏中， Cyp2e1的mRNA水平有上升的趋势，但在经过NAFLD处理之后，Cyp2e1的 mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA及 CUR处理之后没有太大的变化。由此说明：NAFLD确实可以明显的诱导小鼠肝脏中Cyp2e1的表达，且EA、MoA及CUR对Cyp2e1的mRNA水平没有太大的影响。在经过上述各种处理之后，各组小鼠肝脏中Keap1的mRNA水平并没有出现明显的变化。

1.2.6 EA与MoA对小鼠肝组织中各目的基因蛋白水平的影响

1.2.6.1溶液配制

操作同“实施例1。

1.2.6.2组织总蛋白提取与样品制备

操作同实施例1。

1.2.6.3蛋白免疫印迹试验

操作同实施例1。

1.2.6.4数据处理

操作同实施例1。

1.2.6.5实验结果

小鼠经不同给药方案处理后肝组织中Nrf2、Keap1、Cyp2e1、Ho-1、Nqo1、 Mrp2及Mrp4的蛋白表达情况如图37所示。

由图37的结果可看出，经APAP单独处理的野生型小鼠肝脏中Nrf2的蛋白水平较相同基因型的对照组而言有所增加，差异具有统计学意义(p<0.05)；在给予野生型NAFLD小鼠模型APAP处理后，其肝脏中的Nrf2的蛋白水平较对照组和单纯APAP处理组均有所增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，但上述处理对于Nrf2敲除小鼠肝脏中Nrf2的蛋白水平并没有明显的影响；在继续分别给予EA、MoA及CUR处理之后，野生型NAFLD小鼠模型的肝脏中 Nrf2的蛋白水平较相同基因型的对照组、单纯的APAP组及NAFLD+APAP组而言均显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中Nrf2的蛋白水平并没有明显的变化。

同样，在分别经过EA、MoA及CUR处理的野生型小鼠肝脏中，Nrf2的下游基因：Mrp2、Mrp4、Nqo1以及Ho-1的蛋白水平均不同程度的增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且表现出了与Nrf2相似的变化趋势，但在Nrf2敲除小鼠的肝脏中并没有明显的变化规律。

上述结果提示：APAP可以诱导野生型小鼠肝脏中Nrf2的蛋白表达；NAFLD 可以加强APAP对Nrf2的诱导作用；EA、MoA与CUR一样，是Nrf2的激动剂。

较空白对照组而言，单纯APAP处理的野生型和Nrf2敲除的小鼠肝脏中， Cyp2e1的蛋白水平有上升的趋势，但在经过NAFLD处理之后，Cyp2e1的蛋白水平显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在经EA、MoA及CUR处理之后没有太大的变化。由此说明NAFLD确实可以明显的诱导小鼠肝脏中 Cyp2e1的表达，且EA、MoA及CUR对Cyp2e1的蛋白水平没有太大的影响。

在经过上述各种处理之后，各组小鼠肝脏中Keap1的蛋白水平并没有出现明显的变化。

通过上述实验可以看出，30mg/kg EA，10mg/kgMoA及100mg/kg CUR均能起到预防野生型小鼠由于NAFLD所致的APAP肝毒性，并且Nrf2是EA与 MoA预防APAP肝毒性的关键因素。EA与MoA确是Nrf2的激动剂；两者对于Nqo1、Ho-1、Mrp2和Mrp4的诱导作用依赖于Nrf2的存在；EA与MoA能通过诱导Nrf2及其下游抗氧化基因与外排转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，从对抗氧化应激反应、促进有毒物质外排以及中和过多的NAPQI这三条途径来预防由于NAFLD诱导Cyp2e1所致APAP肝脏毒性。

综上，本发明证明了甲基麦冬黄酮A是一种Nrf2的激动剂，其可通过上调 Nrf2及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，同时降低肝细胞中ROS水平，降低氧化应激反应与炎症反应，维持肝细胞功能，从而起到治疗NAFLD的作用。此外，甲基麦冬黄酮A可通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子和转运体的表达，增加肝脏中GSH的水平，从而起到预防由于NAFLD 增加的正常剂量APAP的肝脏毒性(机理图如图38所示)。因此，甲基麦冬黄酮A在制备NAFLD治疗药物以及APAP肝毒性预防药物中都具有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 甲基麦冬黄酮A在制备预防和或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用

途

<130> GYKH1353-2019P017257CC

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

acagaggaac acaaagacca g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

gtgtctggga tgagctagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gaacggattt ggccgtattg 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

ctggaacatg tagaccatgt agt 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gaatgctatg acccggacag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

tcaggtattc caagtgcttc ag 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

aggacatgga gcaagtttgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

ttctgtcagt gtggcttctg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

cagatccagg accaagagat tt 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

gacaggtcta tggctgctaa a 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

tatccttccg agtcatctct agca 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

tctgcagctt ccagcttctt g 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

tcactggaca tcaactgcc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

tggtctctgt tcctgcaaag 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

acctctgctc gcgcgtgttc t 21

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

ccagtaccgt tgaagctcct ctcc 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

cctgccattc tgaaaggctg gt 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

gtggtgatgg aaagcactgc ct 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 19

ccaggcagag aatgctgagt tc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 20

aagactgggc tctccttgtt gc 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 21

caacttcgct gagcagattg gc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 22

tgatgagggt caccagttgg ca 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 23

gcgacggaaa gagtatgagc 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 24

agcatctgat ttgggaatgt g 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 25

gaaaggatcc tacagtgctc tc 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 26

gcccatagtc atcgtcttct t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 27

tgttcttctg gtggctcaat c 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 28

tcttctggca gcactgaata c 21

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 29

tcggagtcaa cggatttggt cgt 23

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 30

tgccatgggt ggaatcatat tgga 24

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 31

gagcaccatc aatctctgga cc 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 32

cacggtgata ccgtccattg tg 22

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 33

cgcucaguua caacuagaut t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 34

aucuaguugu aacugagcgt t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 35

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 36

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 37

<211> 2544

<212> DNA

<213> 小鼠（ Mus musculus ）

<400> 37

atcagtgata acatgtagtg aactaacccg tgtggaccat cttaaccatg gcttctcctt 60

ccttttctgt tttaaacata ggacatggat ttgattgaca tcctttggag gcaagacata 120

gatcttggag taagtcgaga agtgtttgac tttagtcagc gacagaagga ctatgagctg 180

gaaaaacaga aaaaactcga aaaggaaaga caagagcaac tccagaagga acaggagaag 240

gccttttttg ctcagtttca actggatgaa gaaacaggag aattcctccc aattcagccg 300

gcccagcaca tccagacaga caccagtgga tccgccagct actcccaggt acactcgtcg 360

tggtgggagc taaggaaaac tctagtgaga aagcagactc tctggagttg agttcttggt 420

ctgccattta ctgtgtcttt tgtgaggagg agaagttctc aaacttcgct tcttgataat 480

caggacacag atcacaggga ggactttgtg agttacagaa acatcctctg tggtgatgaa 540

acagcagcag aaatactgtt gggagtaaaa gaagtaggca ttgctcattg tggtaggcag 600

ggccctgatt gtatgggtaa ctgacttaac tgtgttaagt atgattccca ttttatattc 660

ccatgtctaa acaactaaag cattcgccca gaacactcag aaagaaatga agggaggtta 720

ttgcctagca cagagccctg ggttcagtcc cccagcgctg ttcgttaaag gggagggact 780

aataatttga acacaatctg gtttgaatct atgcaaatcg atttctgaaa tgaaaccata 840

ggttatttta tgaacaagtc ttattgctcg ttgtgaccct gtgcttagaa catttcataa 900

atgatgctct ctgtgccttt ccccttcctc caggttgccc acattcccaa acaagatgcc 960

ttgtactttg aagactgtat gcagcttttg gcagagacat tcccatttgt agatgaccat 1020

gaggtataaa aatgtttgtt taacagcaaa actcccttat ctgatattag ttcctttcat 1080

gtgtctccaa ttaagagaag aaaagaaaat tttagaagga aaaaattgat caaagaaatt 1140

gtcaagtaaa ctgtatgaga gctatacaat gcttaaaaat aagacctgta tgggctggtg 1200

agatggctca gttggtaaga gtacccgact gctcttccga aggtccagag ttcaaatccc 1260

agcaaccaca aggtggctca caacatccat aacaagatct gactccctct tctggagtgt 1320

ctgaagacag ctacagtgta cttacatata ataaataaat aaatctttaa aaaaaaaaaa 1380

ataaggcctg taaactacaa gtccatttta ctgtatagct ggaaacagga atcagaataa 1440

ttttccctgg aaactggata taggtatata aaatattttg actagtaaag aacaactatt 1500

aatcagcatt tggattaaaa aaatcttaat ctgttgtttg aagcattctg ctagatatta 1560

tgggtacaga ttaagtccta atgaatgttt ttatccattt tgaagtctgc ctttaaatac 1620

atggagtgaa ataacctagg agtgtattaa tatggagtca ctgggaggag gaaatgtttc 1680

attttataaa agcagcctga gagctgtagg ccctgctgct gtctgttctt catgccttgg 1740

ttctcactca catgaatcaa tgtcacgtca atcttggctt tcttcacttg catttcagtc 1800

gcttgccctg gatatcccca gccacgctga aagttcagtc ttcactgccc ctcatcaggc 1860

ccagtccctc aatagctctc tggaggcagc catgactgat ttaagcagca tagagcagga 1920

catggagcaa gtttggcagg agctattttc cattcccgaa ttacaggtaa gagagctcta 1980

ggagtgtgct gttttctgcg ggccctttta aattagtcat cctagttatt tattatttac 2040

atgctacctc ctcaaaggaa gaaattgatg gtgcatttaa attactcatg agagcttccc 2100

agactcactt aacacacata gtttttaggt aatcagactg aatatttctg gataaattca 2160

ttcaaagact gaaagctaat ttagagttct gacaaagata aaatacttat ctattgaaaa 2220

atgggagttg aaggaattat tgaaaagaac accttggatt tgggggtagg gaattgatct 2280

aaaatgcact tagcctctgc tcatacaatg tgaccttctt tcctagtgtc ttaataccga 2340

aaacaagcag ctggctgata ctaccgctgt tcccagccca gaagccacac tgacagaaat 2400

ggacagcaat taccattttt actcatcgat ctcctcgctg gaaaaagaag tgggcaactg 2460

tggtccacat ttccttcatg gttttgagga ttctttcagc agcatcctct ccactgatga 2520

tgccagccag ctgacctcct taga 2544

Claims

1.甲基麦冬黄酮A在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病和肝损伤药物中的用途；所述非酒精性脂肪肝病为非酒精性的单纯性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肝损伤是由化学药物引起的肝损伤。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述肝损伤是由服用对乙酰氨基酚引起的。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述肝损伤是由服用正常剂量的对乙酰氨基酚引起的。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够诱导Nrf2、及其下游调控基因与外排转运体的表达。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述Nrf2下游调控基因为NQO1、HO-1、MRP2和MRP4；所述外排转运体为MRP2和MRP4。

7.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够对抗非酒精性脂肪肝病导致的氧化应激反应和炎症反应。

8.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够降低肝脏细胞内的ROS水平；所述药物能够增加肝脏细胞内的GSH水平。

9.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够促进有毒物质外排以及中和N-乙酰对苯醌亚胺，减少肝脏细胞内的氧化应激损伤，保护肝细胞。

10.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物为Nrf2激动剂。