CN106498057A - 三结构域蛋白8在治疗非酒精性脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用 - Google Patents

三结构域蛋白8在治疗非酒精性脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种TRIM8基因在脂肪肝糖尿病疾病中的功能和应用。以TRIM8基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，TRIM8基因敲除小鼠体重减轻，空腹血糖水平低于对照组WT小鼠，肝功能障碍明显减轻。通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现TRIM8基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强。从小鼠肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分病理染色结果等均说明高脂饮食的TRIM8‑KO小鼠脂肪肝病变明显减轻，脂质蓄积显著减少。因此，TRIM8可作为筛选治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物靶标，其抑制剂可用于制备治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。

Description

三结构域蛋白8在治疗非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功 能和应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种三结构域蛋白8基因(Thetripartite motif proteins，TRIM8)作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致，以弥散性肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌[1-2]。随着生活水平的提高及饮食结构的改变，NAFLD的发病率逐年提高，在我国已成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病。Ⅱ型糖尿病(T2DM)又称非胰岛素依赖型糖尿病，是一种以高血糖为表现特征的代谢综合征[3]。有研究表明，T2DM患者并发脂肪肝的患病率为55％，严重者可演变为肝硬化[4]。肝脏是调节糖代谢的主要器官，所以肝脏病变也可反过来导致或加重糖尿病，由此形成机体的恶性循环[5]。胰岛素抵抗架起了T2DM和NAFLD间相互联系的病生理桥梁。尽管基础与临床对两者做了大量研究但是具体机制尚未完全阐述，临床上仍然缺乏确切有效的治疗方法。目前针对非酒精性脂肪肝的治疗主要集中在以下几方面：(1)基础治疗：生活方式干预是目前唯一被公认的NAFLD有效防治方法[6]。虽然生活方式的干预在NAFLD患者中取得了明显的疗效，但是患者的依从性不佳的问题是亟待解决的难题；(2)药物治疗：主要包括改善IR类降糖药物、降脂药物、抗氧化剂、GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂及其他保肝抗炎药。GLP-1受体激动剂、DPP-4抑制剂等可安全有效降糖，肝肾毒性小，给T2DM合并NAFLD患者的防治带来了新希望，但是该类药物上市时间尚短，其远期的疗效和安全性以及对脂肪肝组织学的改善等问题尚待更多的询证医学证据加以阐明；(3)外科手术：减重手术成为潜在的治疗NAFLD方法，对于那些病态肥胖的患者，减重手术是有效的，并可减低肥胖相关疾病的发病率和病死率，但手术的长期疗效、术后的慢性并发症等潜在风险尚待进一步的研究加以评价。生活方式的干预同样是T2DM防治的基础，传统抗糖尿病药物为目前T2DM患者的临床治疗主要用药，但是这些药物均存在不同程度的不良反应，如引发低血糖、胃肠道不适、肥胖等。对于糖尿病的治疗药物研究，也从对传统机制的药物研究过渡到对具有新靶点和新作用机制的药物研究。其中基于这些新靶点设计的糖尿病治疗新药有些已上市，且获得良好的降糖效果，如GLP-1受体激动剂、DPP-4抑制剂及SGLT-2抑制剂等，但大部分药物仍处于临床或临床前研究阶段，其疗效和安全性还有待进一步临床验证。
TRIM(The tripartite motif proteins)超家族，属于最突出的E3泛素化连接酶家族一种，存在于所有多细胞的动物体内，是包含了较多蛋白的一个相当大的家族。它们的命名主要来源于N端特征性的三种主体结构：高度保守RING序列的结构域，紧接着的一个或者两个B-BOX结构域和一个coiled-coil(CC)结构域。这种主体结构也经常被称为RBCC结构[7-10]。TRIM蛋白涉及到许多不同的功能，例如泛素连接酶的功能，小泛素样调节功能等等，已被证实在许多生物过程中发挥着不同作用，比如细胞凋亡，细胞分化，肿瘤发生以及免疫反应等[11]。TRIM8是TRIM家族中的一员，RING结构的存在决定了它同样具有E3泛素化连接酶的作用。现阶段对TRIM8的研究主要集中在肿瘤，免疫及炎症方面。研究发现它可对抗细胞增殖，抑制肿瘤的发生发展，促进炎症因子的释放从而调节机体炎症反应等等。Mariano F等发现TRIM8可以调控P53活性促进细胞周期停滞，抑制细胞增殖从而加强P53的肿瘤抑制活性[12]。
参考文献：
[1]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(6)：483-486
[2]Krawczyk M，Bonfrate L，Portincasa P.Nonalcoholic fatty liverdisease[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2010，24(5):695-708.
[3]Katsikin，Athyrosv，Gkaragiannisa，etal.Metabolic syndrome and non-cardiac vasculardiseases:an update from human studies[J].CurrPharmDes，2014,20(31)：4944-52
[4]何兰杰，宋艾云.Ⅱ型糖尿病合并脂肪肝临床和生化特征及肝功能评价分析[J].宁夏医学杂志，2008，30(1):16-18
[5]刘子砚.糖尿病及糖尿病前期与肝功能转氨酶相关性研究进展[J].贵州医药，2014，38(3):278-280
[6].Tai FW,Syn WK,Alazawi W.Practical approach to non-alcoholic fattyliver disease in patients with diabetes.Diabet Med 2015；32:1121-1133
[7]Reddy BA,Etkin LD.A unique bipartite cysteine-histidine motifdefines a subfamily of potential zinc-finger proteins.Nucleic Acids Res 1991；19:6330.
[8]Reddy BA,Etkin LD,Freemont PS.A novel zinc finger coiled-coildomain in a family of nuclear proteins.Trends Biochem Sci 1992；17:344–5.
[9]Saurin AJ,Borden KL,Boddy MN,Freemont PS.Does this have a familiarRING？Trends BiochemSci 1996；21:208–14.
[10]Freemont PS.The RING finger.A novel protein sequencemotif relatedto the zinc finger.Ann N Y Acad Sci 1993；684:174–92.
[11]Meroni G,Diez-Roux G.TRIM/RBCC,a novel class of“single proteinRING finger”E3 ubiquitin ligases.BioEssays2005；27:1147–57.
[12]Caratozzolo MF1,Micale L,Turturo MG et al.TRIM8 modulates p53activity to dictate cell cycle arrest.Cell Cycle.2012Feb 1；11(3):511-23。
发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供TRIM8基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因TRIM8的新用途，进而把TRIM8基因应用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治疗。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明以野生型C57小鼠(WT)与TRIM8基因敲除小鼠(TRIM8-KO)为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究TRIM8基因的功能，结果发现与WT小鼠对比，TRIM8-KO小鼠其体重于第4、6、8周明显低于同种饲料饲养的WT小鼠，并且TRIM8-KO小鼠的空腹血糖水平低于对照组WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现TRIM8-KO小鼠对葡萄糖的耐受能力明显加强。从小鼠肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分病理染色结果等均说明HFD组(High fat diet，高脂饮食)的TRIM8-KO小鼠脂肪肝病变明显得到改善，脂质蓄积显著减少。这表明TRIM8基因敲除可以降低脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。
因此，TRIM8基因可作为药物靶点，构建TRIM8基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物；TRIM8基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以TRIM8为靶基因，设计可干扰TRIM8表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使TRIM8基因沉默来治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；还可以设计并构建TRIM8的突变体，注射后进入细胞，竞争TRIM8原形的作用底物，从而抑制TRIM8的功能，起到治疗目的；此外，还可以以TRIM8为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用TRIM8基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制TRIM8的分子，从而为脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治疗提供新的治疗性分子。
针对TRIM8的上述功能，提供TRIM8作为药物靶标在筛选保护神肝脏及糖代谢的药物中的应用。
针对TRIM8的上述功能，提供TRIM8作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
针对TRIM8的上述功能，提供TRIM8的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，包含TRIM8的抑制剂。
所述的TRIM8的抑制剂优选为TRIM8基因的siRNA、TRIM8基因的RNA干扰载体，TRIM8的抗体及其他能够抑制TRIM8表达的抑制剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现TRIM8的新功能，即TRIM8具有恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。
(2)基于TRIM8在恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物提供靶标。
(3)TRIM8的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。
附图说明
图1是WT和TRIM8-KO小鼠的体重和空腹血糖结果图；
A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图，C为空腹血清胰岛素水平图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。
图2是WT和TRIM8-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；
A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve，AUC)比较图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vsWT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。
图3是TRIM8-KO和WT小鼠的肝脏重量结果图；
A为肝脏重量统计柱状图，B为肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。
图4是TRIM8-KO和WT小鼠的肝脏脂质结果图；
分别为肝脏胆固醇，肝脏甘油三酯及肝脏游离脂肪酸统计柱状图(*：p＜0.05vsWT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实验用动物及饲养：
实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和TRIM8-KO小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；TRIM8基因敲除小鼠的构建过程如下：
1、全身性TRIM8基因敲除小鼠的构建：
利用CRISPR-Cas9技术构建全身性TRIM8基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)预测小鼠TRIM8的引导序列，设计2条单链oligo：
oligo1：TAGGCCGGTTCCACGAAAACGTGC，
oligo2：AAACGCACGTTTTCGTGGAACCGG。
oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI限制性内切酶酶切的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)构建sgRNA表达载体。
以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段：
Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，
Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。
以所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)进行体外转录；Cas9质粒(Addgene 44758)通过T7Ultra kit(Ambion，Am1345)进行转录。将转录得到的Cas9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiaen，217084)纯化后，通过FemtoJet 5247显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过19天妊娠之后得到F0代小鼠。
F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长295bp的DNA序列，而突变小鼠(TRIM8基因敲除小鼠)含有287bp的DNA序列，最终蛋白产物通过western blot进行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下：
TRIM8-F：5’-TGTACCAGACGGATCCCCA-3’，
TRIM8-R：5’-TCCACGATGTTGGTGAGCTT-3’。
实验所用小鼠为突变体纯合子。
实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。
动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级动物房。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。
【实施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得
(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和TRIM8-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。
(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：
采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确XX基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和XX-KO(TG)小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第16周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作为病理分析用。
【实施例2】小鼠空腹体重、血糖水平及血清胰岛素水平的测定
(1)小鼠空腹体重检测
①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。
②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。
(2)空腹血糖水平检测实验
将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。
①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。
②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。
③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。
④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。
(3)空腹血清胰岛素水平检测
①试剂及耗材准备：
样品(冰冻血清)，去离子水一瓶(1000mL)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore，货号EZRMI-13K)含胰岛素ELISA酶标板(1块，储存于2-8℃)、酶标板封口膜(1片)、10×HRP洗脱缓冲液(2瓶，每瓶50mL,使用前使用去离子水稀释10倍)、胰岛素标准品(浓度为：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每种量为0.25mL)、胰岛素质量对照buffer(0.25mL)、基质溶液(0.5mL)、分析缓冲液(20mL)、胰岛素检测抗体(10mL)、酶溶液(12mL)、底物(12mL)、终止溶液(12mL)。
②实验步骤：
A.确认温箱开启，熟悉酶标仪操作，将待检测的血清标本从-80℃冰箱中找出；
B.将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；
C.稀释10×HRP洗脱缓冲液，每瓶用450mL去离子水稀释；
D.将取下来的酶标板条安装到一个空的酶标板架上300μL TBS洗脱缓冲液洗涤3次。洗涤完毕将酶标板倒扣在吸水纸上，轻轻拍几次，将残液吸净(注意：在进行下一步之前避免酶标板干燥，将未使用的酶标板条密封在装酶标板的袋子里，2-8℃保存)；
E.将10μL分析缓冲液加入非特异性孔(NSB)和所有的样品孔；
F.在NSB孔，标准孔和对照孔加入10μL基质溶液；
G.在预设的标准孔里加入10μL胰岛素标准品；
H.在预设的质量对照孔里加入胰岛素质量对照buffer1和2各10μL；
I.在每个样品孔里加入10μL样品；
J.每孔中加入80μL胰岛素检测抗体(以上所有加样步骤在1个小时之内完成，室温孵育2小时，在此期间将酶标板至于酶标板振荡器上，调整转速为400-500rpm震荡)；
K.取下封口膜，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍打，吸净残液；
L.使用洗脱缓冲液洗板3次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液；
M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室温下酶标板振荡器震荡30分钟，取下封口膜，弃去溶液，拍打吸干；
N.使用洗脱缓冲液洗板6次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液加入100μL底物溶液，酶标板震荡器上震荡15分钟左右。此时可以看到标准孔出现深浅渐变的蓝色。(注意：在这一步，蓝色的出现和进展可能明显快于15分钟，也可能明显慢于15分钟，取决于室温温度。请通过视觉来判断孵育的时间。或者使用酶标仪370nm波长检测，读数在1.2到1.8之间，则为合适的孵育时间)
O.加入100μL终止溶液，震荡酶标板确保充分的混匀，此时蓝色变为黄色。5分钟内在450nm和590nm处分别读取吸光值。根据测定的标准曲线，通过吸光值换算出浓度。、
Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，这些指标均与糖尿病严重程度正相关。体重、血糖、血清胰岛素水平变化结果如图1所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与TRIM8-KO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第4周开始HFD组的TRIM8-KO小鼠体重明显低于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第8周(见图1A)；经空腹血糖及血清胰岛素水平检测发现在HFD组的小鼠从第2周开始，空腹血糖及血清胰岛素水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的TRIM8-KO小鼠空腹血糖及血清胰岛素水平明显低于WT组小鼠空腹血糖水平(见图1B、C)。表明TRIM8基因敲除后显著改善了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，TRIM8基因敲出能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明TRIM8基因可促进高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病的发生发展。
【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)
实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。
(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。
(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。
(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。
进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第12周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和TRIM8-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后30分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且TRIM8-KO小鼠血糖水平从15分钟至2小时一直处于低于WT小鼠的血糖水平(图2A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(areaunder the curve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，而TRIM8-KO HFD组的AUC显著低于WT HFD组的AUC(图2B)，表明TRIM8基因不利于维持糖代谢的稳态。
【实施例4】肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分测定
(1)终末肝脏组织取材
1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。
2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。
3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。
(2)小鼠肝组织脂质检测
①从-80℃冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于1mLPBS中，混匀后再与1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育过夜。
②以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。
③将分离出的脂质层物质溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。
④开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；
⑤选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；
⑥在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。
⑦将制得的混匀液上机检测，分析。
图3结果表明，在HFD组的TRIM8-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠低。进一步通过肝脏脂质对比后发现无论是肝脏胆固醇，肝脏甘油三酯还是肝脏游离脂肪酸，HFD组的TRIM8-KO小鼠均较HFD组的WT小鼠降低(如图4A-C)。这些结果说明TRIM8基因敲除小鼠的脂肪肝明显改善。
上述结果显示TRIM8-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著减低。这些结果表明TRIM8基因敲出对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明TRIM8基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的恶化作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 三结构域蛋白8在治疗非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> oligo1
<400> 1
taggccggtt ccacgaaaac gtgc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> oligo2
<400> 2
aaacgcacgt tttcgtggaa ccgg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段上游引物
<400> 3
gatccctaat acgactcact atag 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段下游引物
<400> 4
aaaaaaagca ccgactcggt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> TRIM8-F
<400> 5
tgtaccagac ggatcccca 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> TRIM8-R
<400> 6
tccacgatgt tggtgagctt 20

Claims (6)

1.TRIM8基因作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制TRIM8基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。
3.TRIM8基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制TRIM8基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。
5.一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，期特征在于，包含TRIM8的抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述的TRIM8的抑制剂优选为TRIM8基因的siRNA、TRIM8基因的RNA干扰载体，TRIM8的抗体及其他能够抑制TRIM8表达的抑制剂。
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