CN106512014A - 肿瘤进展位点2在治疗脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种TPL2基因在脂肪肝糖尿病疾病中的功能和应用。以TPL2基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，TPL2基因敲除小鼠体重减轻，空腹血糖水平低于对照组WT小鼠，肝功能障碍明显减轻。通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现TPL2基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强。从小鼠肝脏组织胆固醇含量变化等结果说明HFD组（High fat diet，高脂饮食）的TPL2‑KO小鼠脂肪肝病变明显减轻，脂质蓄积显著减少。因此，TPL2可作为筛选治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物靶标，其抑制剂可用于制备治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。

Description

肿瘤进展位点2在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种肿瘤进展位点2基因(tumorprogress locus 2，TPL2)作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。

背景技术

随着老龄人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改变，肥胖、非酒精性脂肪肝病、代谢综合征和糖尿病等代谢异常人群剧增，现已经成为全球性的公众健康的重要危害。

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)为非胰岛素依赖型糖尿病。其病因为遗传、肥胖、高热量饮食、体力活动不足等。主要表现为胰岛素敏感性下降。糖尿病目前作为慢性多发性疾病已经成为全球关注的重点公共卫生问题。中国的糖尿病人数已经跃居世界第一。但针对糖尿病的治疗，除胰岛素替代疗法外，还包括双胍类及磺脲类等多种类型不同机制的口服药物。目前无治疗糖尿病的基因调节及治疗制剂等。糖尿病慢性并发症是导致糖尿病患者致死致残的主要原因，不仅累及心脑血管、肾脏、视网膜、神经等重要脏器和组织，肝脏也是其重要的靶器官之一。

脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪肝为一种较为常见的临床不良表现，可由多种疾病诱发，是众多肝脏疾病对肝脏正常功能影响的综合表现。临床表现轻者无症状，重者可危及生命。其病因可分为多种，包括酒精性和非酒精性脂肪肝。其中非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除去酒精和其它明确肝损伤导致的肝细胞内脂肪堆积的临床病理综合征。随着社会经济发展加速及高节奏生活方式的影响，非酒精性脂肪肝正严重威胁我国人群的健康，已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，亦被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。

非酒精性脂肪肝除可直接导致肝硬化肝细胞癌等，还可参与Ⅱ型糖尿病的发病，在有些患者中肝脏脂肪沉积可能是影响其T2DM发展的主要因素。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分发展，不仅促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维变性、肝硬化及肝细胞癌。现阶段，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加，因此未来我们应该制定特异的筛选标准以及治疗方案以期应用于临床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。

TPL2为近年来新发现的丝/苏氨酸激酶，包含467个氨基酸，为IKK分子的下游信号分子，广泛表达与多种类型的机体细胞中，可调节白介素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子表达和激活。蛋白序列研究表明该TPL2与其他激酶同源性很低；TPL2过表达可使SEK1磷酸化，激活JNK信号通路；在人的肿瘤细胞如胃癌、结肠癌、乳腺癌细胞中，TPL2在RNA水平过表达，调节COX-2的表达。本专利主要集中于研究TPL2基因表达与脂肪肝与Ⅱ型糖尿病之间的关系，以期待为脂肪肝与Ⅱ型糖尿病的治疗找出新的作用靶点。

参考文献：

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发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种TPL2基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一种TPL2作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用，进而提供一种TPL2的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明以野生型C57小鼠与TPL2基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究TPL2基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，高脂饲料喂养的TPL2基因敲除小鼠表现出肥胖缓解，其体重低于同种高脂肪饲料饲养的WT小鼠，并且TPL2基因敲除后小鼠的空腹血糖水平低于对照组WT小鼠，TPL2基因敲除小鼠的肝功能障碍较WT小鼠明显减轻。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现TPL2基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强。从小鼠肝脏组织胆固醇含量变化等结果说明HFD组(Highfat diet，高脂饮食)的TPL2-KO小鼠脂肪肝病变明显减轻，脂质蓄积显著减少。这表明TPL2基因敲除会改善脂肪肝并减缓Ⅱ型糖尿病的发生，TPL2基因的表达能够加重脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。

因此，TPL2基因可作为药物靶点，构建TPL2基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物；TPL2基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以TPL2为靶基因，设计可干扰TPL2表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使TPL2基因沉默来治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；还可以设计并构建TPL2的突变体，注射后进入细胞，竞争TPL2原形的作用底物，从而抑制TPL2的功能，起到治疗目的；此外，还可以以TPL2为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用TPL2基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制TPL2的分子，从而为脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治疗提供新的治疗性分子。

针对TPL2的上述功能，提供TPL2作为药物靶标在筛选保护神肝脏及糖代谢的药物中的应用。

针对TPL2的上述功能，提供TPL2作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

针对TPL2的上述功能，提供TPL2的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，包含TPL2的抑制剂。

所述的TPL2的抑制剂优选为TPL2基因的siRNA、TPL2基因的RNA干扰载体，TPL2的抗体及其他能够抑制TPL2表达的抑制剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现TPL2的新功能，即TPL2具有恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。

(2)基于TPL2在恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物提供靶标。

(3)TPL2的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是构建肝脏特异性TPL2基因敲除小鼠的打靶策略图。

图2是WT和TPL2-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；

A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(***：p＜0.01vs WT NC组，###：p＜0.01vs WT HFD组)。

图3是WT和TPL2-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；

A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组胰岛素耐受实验(***：p＜0.01vs WT NC组，##：p＜0.05vs WT HFD组，###：p＜0.01vs WT HFD组)。

图4是TPL2-KO和WT小鼠的肝脏重量结果图；

A为肝脏重量统计柱状图，B为肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(***：p＜0.01vs WT NC组，###：p＜0.01vs WT HFD组)。

图5是TPL2-KO和WT小鼠肝脏脂质测定结果，

分别检测肝脏总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸含量(***：p＜0.01vs WTNC组，###：p＜0.01vs WT HFD组)。

图6是WT和TPL2-KO小鼠的肝功测量结果图，

分别采取AST、ALT和ALP对小鼠肝功进行检测(***：p＜0.01vs WT NC组，###：p＜0.01vs WT HFD组)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和肝脏特异性TPL2基因敲除(TPL2-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；TPL2基因敲除(转基因)小鼠由TPL2-floxed小鼠与受蛋白启动子控制、肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre(购自The Jackson Laboratory，货号003574)杂交得到，构建策略见图1。

肝脏特异性TPL2基因敲除小鼠的构建：

根据基因信息，利用CRISPR Design(网址：http://crispr.mit.edu/)分别在内含子3和4中各设计一个CRISPR的打靶位点。靶序列分别为：

TPL2-sRNA1：AGAGTTTAGGAATCCGAACA AGG

TPL2-sRNA2：CAGTACTGAGTGGGTAGCTC AGG

此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。

①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的

pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

②条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp的构建：

分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：

loxp1-F：

AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：

ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：

GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：

CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescript IISK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescript SK(+)-2loxp。

③供体载体(Donor Vector)的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

引物名称	引物序列	酶切位点
			TPL2LA-F	GGGGTACCTCATAGGTGCCAGACAGGTG	KpnI
TPL2LA-R	ATGGACGTCACAAGGTTTCAAAATACTGACTGAG	AatII
			TPL2M-F	TCTACCGGTTCGGATTCCTAAACTCTAAATGAAG	AgeI
TPL2M-R	ACGCTTAAGCTACCCACTCAGTACTGATTGTT	Afl II
			TPL2RA-F	CGACGCGTCTCAGGGATAGAACTCCTGTTTAGC	MluI
TPL2RA-R	ATAAGAATGCGGCCGCTACTCTCCTGTGAGCGTTGG	NotI

④打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体(pST1374-Cas9)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGEmMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

⑤TPL2-floxed条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得TPL2-floxed纯合小鼠。

⑥肝脏特异性TPL2基因敲除小鼠的制作

将上述TPL2-floxed小鼠与肝脏特异性Albumin-Cre(购自TheJacksonLaboratory，货号003574)转基因小鼠交配，筛选得到TPL2^{floxed/floxed}/Albumin-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性TPL2基因敲除小鼠。

实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

【实施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得

(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和TPL2-KO(TG)小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。

(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：

采用WT和KO(TG)小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确TPL2基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和TPL2-KO(TG)小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WTHFD组，KO HFD组共4个组别。小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第12周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作为病理分析用。

【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定

(1)小鼠空腹体重，食量检测

1)体重检测。

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。

(2)空腹血糖水平检测实验

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图2所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重低于其NC饲料组，其中第6周、第12周显著低于其NC饲料组(见图2A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第6周、10周、12周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组增高，HFD组的TPL2-KO小鼠空腹血糖水平也明显低于WT组小鼠空腹血糖水平(见图2B)。表明TPL2基因特异性敲除显著改善了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，TPL2基因特异性敲除能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明TPL2基因在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第11周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和TPL2-TG小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且TPL2-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于低于WT小鼠的血糖水平(图3A)。上述结果表明TPL2不利于维持糖代谢稳态。

【实施例4】胰岛素耐受实验

详细操作步骤参考实例3葡萄糖耐受试验。胰岛素用量根据小鼠的年龄和性别来决定，一般理想用量是使葡萄糖水平在注射30min后下降至注射前的40％左右。小鼠胰岛素耐受实验的胰岛素用量一般为0.5-1.2U/kg，胰岛素用生理盐水稀释，如用量0.5U/kg，配制浓度0.5U/ml。0.75U/kg，0、15、30、60min测血糖；0.027U/10g＝2.7U/kg

上午禁食4小时，正常饮水。下午试验，称体重，标记序号，注射胰岛素前测血糖，胰岛素按体重计算注射量，在15min、30min、45min、60min分别测血糖，实验完毕，每笼补充上饲料。

胰岛素耐受实验结果如图3B所示。HFD组的WT小鼠和TPL2-TG小鼠血糖水平下降并在30分钟时间点达到最低值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微上升，但仍处于低于空腹血糖水平(0分钟时血糖)。且TPL2-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于低于WT小鼠的血糖水平(图3B)。结果表明TPL2-KO小鼠的胰岛素抵抗得到改善。

【实施例5】肝脏组织脂质评估

(1)终末肝脏组织取材

①小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

②用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

③迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。

(2)小鼠肝组织脂质检测

①从-80℃冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于1mLPBS中，混匀后再与1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育过夜。

②以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。

③将分离出的脂质层物质溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。

④开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；

⑤选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；

⑥在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。

⑦将制得的混匀液上机检测，分析。

(3)肝功能测定

①开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；

②选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；

③将待检测的血清标本从-80℃冰箱中找出；将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；

④在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等；

⑤加入待检血清样品50μl，开始检测；

⑥待检测完毕后记录检测数值。

在HFD组的TPL2-KO小鼠肝脏重量较WT小鼠低(如图4A)，同时，肝脏重量与小鼠本身体重比值较HFD组的WT小鼠低(如图4B)。

肝脏组织的总胆固醇含量变化如图5所示。TPL2基因敲除后，肝脏组织总胆固醇、甘油三酯以及有利脂肪酸含量均下降(如图5A-C)。这些结果说明TPL2基因敲除小鼠的脂肪肝明显减轻。

进一步肝功能检测表明，HFD组小鼠肝功明显较NC组差，而TPL2-KO小鼠的三种肝酶(AST(谷草转氨酶)、ASLT(谷丙转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶))均较HFD组的WT小鼠低(如图6)。这些结果说明TPL2基因敲除小鼠的脂肪肝明显被抑制。

上述结果显示TPL2-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著减轻。这些结果表明TPL2基因敲除对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明TPL2基因可促进脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，TPL2基因抑制剂在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着潜在的重要保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 肿瘤进展位点2在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> TPL2-sRNA 1

<400> 1

agagtttagg aatccgaaca agg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> TPL2-sRNA 2

<400> 2

cagtactgag tgggtagctc agg 23

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> TPL2 LA-F

<400> 7

ggggtacctc ataggtgcca gacaggtg 28

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> TPL2 LA-R

<400> 8

atggacgtca caaggtttca aaatactgac tgag 34

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> TPL2 M-F

<400> 9

tctaccggtt cggattccta aactctaaat gaag 34

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> TPL2 M-R

<400> 10

acgcttaagc tacccactca gtactgattg tt 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> TPL2 RA-F

<400> 11

cgacgcgtct cagggataga actcctgttt agc 33

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> TPL2 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgctact ctcctgtgag cgttgg 36

Claims (6)

1.TPL2基因作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制TPL2基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。

3.TPL2基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制TPL2基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。

5.一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，期特征在于，包含TPL2的抑制剂。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述的TPL2的抑制剂优选为TPL2基因的siRNA、TPL2基因的RNA干扰载体，TPL2的抗体及其他能够抑制TPL2表达的抑制剂。