CN105441566B - 用于肝癌术后预后评估的试剂盒和肝癌化疗增敏剂 - Google Patents
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Abstract
本发明“用于肝癌术后预后评估的试剂盒”,涉及生物医药领域,包括用于定量检测待测肝组织中微小RNA分子miR‑653表达水平的试剂;所述miR‑653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。所述肝癌化疗增敏剂,其有效成分包括人工制备的微小RNA分子miR‑653、微小RNA分子miR‑653的前体,或可在肝癌组织中有效表达微小RNA分子miR‑653和/或miR‑653前体的过表达载体;所述微小RNA分子miR‑653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;所述微小RNA分子miR‑653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。实验数据证实了本发明所述的试剂盒在肝癌术后预后评估方面的有效性并验证了基于miR‑653的所述增敏剂能有效增强肝癌细胞对化疗药物sorafenib的敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种肝癌术后预后评估试剂盒和肝癌化疗增敏剂。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是一种严重威胁我国人民生命与健康的恶性肿瘤性疾病。在世界范围内,肝癌已经成为第三大癌症相关死亡原因。近年以来,与肝癌相关的影像学诊断技术和外科手术技术不断提高。以sorafenib为代表的肝癌靶向治疗药物也获得了美国食品与药品管理局的批准。这些成果为肝癌的诊断与治疗提供了更多更有效的选择。但遗憾的是,综观当前肝癌临床治疗的现状,肝癌病人的术后五年生存率并没有显著提高。
目前,外科手术仍然是肝癌的首选疗法。但由于肝癌发病病程长,起病隐匿,一部分病人在确诊时就已经错过了用手术的方法根治肝癌的最佳时机。术后预后不良的病人不得不继续采取化学治疗的办法来巩固疗效。而不幸的是,肝癌细胞容易对化疗药物产生耐药性,抗肿瘤药物化疗药物本身对机体也可能造成较大的毒副作用,故化学治疗的预后至今仍难以令人满意。如能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感程度,就可以减少化疗药物的给药量而尽量地控制药物的毒副作用。故提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性也就成为肝癌临床治疗的关键性难题之一。因此,为了给肝癌的早期预防、术后预后评价和化疗增敏提供新的靶点,深入研究肝癌发生发展过程中涉及到的分子机理具有十分重大的意义。
微小RNA(microRNAs,简称miRNAs)是一种长度约为20~25个核苷酸的非编码小RNA。miRNA可以通过诱导mRNA降解或者抑制mRNA翻译等途径下调靶蛋白的表达水平。这类非编码RNA参与了许多生理与病理过程。一些miRNA的表达异常则在包括肝癌在内的一系列肿瘤性疾病的发生发展过程中扮演了重要角色。miRNA在肝癌的早期诊断、预后评估和靶向性治疗等领域的特殊意义也正吸引着越来越多学者的关注。miR-653在2006年左右就被鉴定到,但目前尚缺乏对其生物学功能的系统研究,对miR-653与肝癌发生和预后的相互关系的认识亦尚不明确。
迄今为止,尚未存在一种以miR-653为生物标志物的肝癌术后预后评估试剂盒,也没有以miR-653为有效成分的肝癌化疗增敏剂。
发明内容
本发明基于本领域存在的上述缺陷和空白,提供了一种以miR-653为主的肝癌术后预后评估标志物,以及一种以miR-653为有效成分的肝癌化疗增敏剂。
本发明的技术方案如下:
用于肝癌术后预后评估的试剂盒,其特征在于,包括用于定量检测待测肝组织中微小RNA分子miR-653表达水平的试剂;所述miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
所述试剂包括实时定量PCR检测所述微小RNA分子miR-653所需的检测引物。
还包括用于对微小RNA分子miR-653进行反转录的反转录引物,其序列如Seq IDNo.3所示。
所述检测引物包括上游引物:5’-GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3’,和
下游引物:5’-GCGTTCGAACAGCTGCCT-3’。
还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂。
采用上述试剂盒的方法中,所述PCR扩增的反应体系推荐为:2×AllinoneTM qPCRMix0.5μL/μL,上游引物0.02μM/μL,下游引物0.02μM/μL,第一链cDNA 0.02μM/μL,其余为双蒸水;
所述PCR扩增的反应程序推荐为:95度10分钟;以95度10秒,57度20秒,72度10秒为一个循环,共30个循环。
一种肝癌化疗增敏剂,其特征在于,其有效成分包括人工制备的微小RNA分子miR-653、微小RNA分子miR-653的前体,或可在肝癌组织中有效表达微小RNA分子miR-653和/或miR-653前体的过表达载体;
所述微小RNA分子miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;所述微小RNA分子miR-653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。
所述过表达载体指真核表达载体或病毒载体;
所述真核表达载体指pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体或pcDNA3.0系列表达载体;
所述病毒载体指逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
微小RNA分子miR-653在制备肝癌化疗增敏药物中的应用,所述微小RNA分子miR-65指人工制备的微小RNA分子miR-653、微小RNA分子miR-653的前体,或可在肝癌组织中有效表达微小RNA分子miR-653和/或miR-653前体的过表达载体;所述微小RNA分子miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;所述微小RNA分子miR-653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。
所述过表达载体指真核表达载体或病毒载体;
所述真核表达载体指pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体或pcDNA3.0系列表达载体;
所述病毒载体指逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
本发明发明人发现miR-653在正常肝组织中以及肝癌组织中的表达量上存在显著差异,并发现过表达miR-653明显增强肝癌细胞对化疗药物sorafenib诱导凋亡的敏感程度。基于这些发现,本发明供了一种用于肝癌术后预后评估的试剂盒,该试剂盒包括用于定量检测待测肝组织中微小RNA分子miR-653的表达量所需的试剂。对于本领域技术人员而言,定量检测一种已知的微小RNA分子的表达量可以有多种可选方法。比如可选实时定量PCR,其中涉及引物设计,对于本领域技术人员而言,针对一段已知序列设计引物是常规实验技能。
在本发明的优选实施方式中,提供了一些用于实时定量pcr的引物,其中一对如下:
上游引物:5’-GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3’;
下游引物:5’-GCGTTCGAACAGCTGCCT-3’。
本发明提供的试剂盒还可以包括用于检测RNA表达量的其它常规试剂。
还包括用于对微小RNA分子miR-653进行反转录的反转录引物,其序列如Seq IDNo.3所示。
基于发明人的发现,本发明还提供微小RNA分子miR-653在肝癌化疗增敏剂中的制药用途。
肝癌化疗增敏剂/药物中,以miR-653、和/或miR-653前体、和/或miR-653过表达载体为有效成分。在一些具体的实施例中,所述miR-653过表达载体指,miR-653和/或miR-653前体与载体连接的产物。miR-653的序列SEQ ID NO:1由21个核苷酸组成,其末端核苷酸可与靶基因mRNA的3′非翻译区中相对应的靶向序列形成约7个核苷酸的碱基互补匹配,形成种子序列(seed sequence)。
miR-653前体的序列SEQ ID NO:2,经适当的载体(可以选自一般真核表达载体或者病毒相关载体)转染入哺乳动物细胞进行表达后,可被最终加工为成熟的miR-653(即SEQID NO:1所示的RNA)。
所述药物可以直接体内施用(in vivo途径):miR-653或者编码SEQ ID No.2所示的DNA的载体直接导入体内。这种载体可以是一般真核表达载体或者病毒相关表达载体,制成制剂的DNA或RNA甚至是裸DNA或RNA。一般真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体、pcDNA3.0系列表达载体等载体或者在已知的表达载体基础上经改造而成的载体。
所述肝癌术后预后评估试剂盒,还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂、针对miR-653的引物对和使用说明书。
本发明请求保护上述试剂盒的制备方法,任何出于商业目的的制造和/生产所述试剂盒的行为都落入本发明的保护范围。所述行为指,组装所述试剂盒的试剂中包括用于PCR扩增miR-653的cDNA的引物;和/或,在标有肝癌术后预后评估用途的产品包装内放置用于PCR扩增miR-653的cDNA的引物。
需要的时候,本发明的所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述“药学上可接受的载体”包括但不限于包囊剂、混悬剂、缓冲剂、乳剂、稀释剂、颗粒剂、粘合剂、赋形剂、喷雾剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、透皮吸收剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体等。而所述药物可以制成包括但不限于注射液、片剂、胶囊剂、显微注射剂、适于转染的剂型、粉剂、粒剂等剂型。以上提到的各种剂型药物均可依据药剂学领域的常规方法制备。
本发明中所述的“受试者”可以选自人类和小鼠;优选人类。在一些具体的实施方式中,受试者是人类;更具体地,是人类的器官、组织、细胞;优选人类肝癌细胞。
需要注意的是,向受试者施用的miR-653或者含SEQ ID No.2所示的DNA载体的量,是一种经过计算而得到的产生所需治疗作用的活性物质预先确定的量。针对本发明而言,向受试者施用的miR-653或者含SEQ ID No.2所示的DNA的载体的量,是指能够统计学上显著增强化疗药物诱导的肝癌细胞增殖抑制或凋亡而预先确定的量。基于受试者特征(比如本领域熟知的年龄、性别、病史、并发症、遗传因素、其它疾病等)、疾病严重程度、载体性质与施用途径等因素,普通医疗人员可以进一步调整向受试者施用miR-653或者编码SEQ IDNo.2所示的DNA的载体的量。
本发明采集了经肝肿块切除手术获得的肝癌组织及非癌变肝脏组织进行了临床验证,采用实时荧光定量PCR对miR-653的表达水平进行定量,结果表明miR-653的表达量在非癌变组织中的水平显著高于癌变组织;此外,对188个肝癌病例中miR-653高表达组与低表达组的患者的总体生存情况和肝癌无复发生存情况进行了分析比较,发现miR-653高表达组的总体生存率和无复发生存率均显著优于miR-653低表达组。由此可见,miR-653可以作为肝癌术后预后评估的一项有效的生物标志物,也进一步证实了本发明所述的试剂盒在肝癌术后预后评估方面的有效性。
在肝癌化疗增敏方面,本发明验证了基于miR-653的所述增敏剂能有效增强肝癌细胞对化疗药物sorafenib的敏感性,说明本发明提供的增敏剂具有显著的化疗增敏效果。
附图说明
图1是real time-PCR技术检测肝癌组织与对应癌旁组织中的miR-653的表达水平的结果,其中:
A:miR-653在绝大多数肝癌组织中表达水平下调;
B:miR-653表达水平在未癌变肝脏组织和肝癌组织中的差异;
C和D:miR-653表达水平在未癌变肝脏组织和肝癌组织中的差异;
E:miR-653在非癌变肝脏组织、HL-7702非转化肝癌细胞和肝癌细胞中的表达差异;
F和G:分别示意miR-653高低表达组中总体生存率和无复发生存率。从图中可以看出,miR-653高表达组中患者具有较好的术后总体生存率与无复发生存率,即预后良好;而miR-653低表达组中患者预后不及高表达组。
图2、miR-653作为肝癌化疗增敏剂的检测结果
结果显示,miR-653可增强肝癌细胞对肝癌化疗药物sorafenib的敏感程度。A和B:分别用流式细胞分析技术(A)和caspase-3蛋白酶活性测试技术(B)在HepG2、Huh-7和SMMC-7721三种不同的肝癌细胞中检测增强miR-653的表达对低浓度的sorafenib(3μM)诱导肝癌细胞凋亡程度的影响;C和D:在裸鼠的皮下分别移植对照HepG2肝癌细胞和miR-653过表达HepG2细胞,构建肝癌细胞体内生长模型。不同组模型小鼠口服sorafenib(30mg/kg),观察移植肿瘤的生长情况(C);观察结束后,处死小鼠,解剖取肿瘤组织进行caspase-3活性测试分析,检测在动物体内增强miR-653的表达对低剂量sorafenib诱导肝癌细胞凋亡程度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明,但并不以此限制本发明的范围。如无特殊说明,下述所采用的试剂与材料均可商购获得,所采用的方法均为常规操作。
生物材料
实施例2中所使用的212例肝肿块切除手术的手术标本是经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准,搜集自武汉大学人民医院自2005年1月至2013年12月间收治的病例。
实施例4中使用的裸鼠/小鼠来自购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
试剂与耗材
肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、Huh-7、Bel7402和SMMC7721)、非转化肝细胞系(HL-7702)
pSicoR载体,购自优宝生物;
miRNA mimic和转染试剂riboFECTYTM CP购自广州市锐博生物科技有限公司;
反转录荧光定量PCR方法检测miRNA的试剂盒为All-in-OneTMqPCR Mix,购自GeneCopoeia,Inc.公司。
实施例1、本发明所述肝癌术后预后评估试剂盒及其制备方法
本实施例提供了用于肝癌术后预后评估的试剂盒。所述试剂盒具体包括用于PCR扩增miR-653的cDNA的引物,其上下游序列如下:
上游引物:5’-GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3’;
下游引物:5’-GCGTTCGAACAGCTGCCT-3’。
进一步地,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂。
进一步地,本发明的试剂盒还包括miR-653的反转录引物,如Seq ID No.3所示。
本实施例还提供上述试剂盒的制备方法,步骤为:组装所述试剂盒的试剂中包括用于PCR扩增miR-653的cDNA的引物;和/或,在标有肝癌术后预后评估用途的商品包装内放置用于PCR扩增miR-653的cDNA的引物;所述步骤还包括:组装所述试剂盒的试剂中还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂;和/或,所述商品包装内还放置有RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂。
上述miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
实施例2、肝癌术后预后评估试剂盒的临床验证
经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准,发明人对武汉大学人民医院自2005年1月至2013年12月间收治的212例肝肿块切除手术的手术标本进行了研究。其中188例被诊断为肝癌,获取的手术组织为肝癌组织(部分含对应的癌旁组织)。24例被诊断为肝血管瘤,获取的组织(距血管瘤前缘2厘米以上)可以作为非癌变肝脏组织而作为研究对照。
利用实施例1所述的试剂盒,首先采用real time-PCR技术检测40例肝癌组织与对应癌旁组织中的miR-653的表达水平。
步骤如下:
(1)获取用于real time-PCR的模板:
1)用Trizol提取总RNA
2)依如下反应体系添加poly(A)尾巴,混匀后于37摄氏度反应20分钟
反应体系:总体积为20μL。其中总RNA 2μg,poly(A)聚合酶1μL(2.5个单位),10×poly(A)聚合酶缓冲液2μL,10×rATP溶液2μL,其余为不含DNA酶和RNA酶的双蒸水。
3)依如下方法完成反转录,得到扩增模板
第一步:依如下反应体系配制RNA-反转录引物混合物,混匀并短暂离心后,置65摄氏度孵育变性10分钟后,立即放冰上至少2分钟。
混合物总体积为13μL。其中poly(A)添加反应的反应产物2μL,反转录引物1μL(终浓度0.02μM/L),不含DNA酶和RNA酶的双蒸水10μL。
其中miR-653的反转录引物序列如下:
5`-GCGTT CGAACA GCTGC CTCGA GCTTA AGCCT AGGTT TTTTT TTTTT TTTTTTTTTTTT-3,如Seq ID No.3所示。
第二步:依如下说明配置反转录反应体系,充分混匀并短暂离心后于42摄氏度孵育反应60分钟,然后将反应体系至于85摄氏度孵育5分钟将反应体系灭活。所得单链的反转录产物cDNA可以放置于-20摄氏度保存。
反转录反应体系共25μL。其中RNA-反转录引物混合物共13μL,5×反转录缓冲溶液5μL,25mM dNTP 1μL,RNA酶抑制剂(25单位/μL)1μL,反转录酶(200单位/μL)1μL,不含DNA酶和RNA酶的双蒸水4μL。
(2)real time-PCR的引物序列如下:
上游引物:5’-GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3’(Seq ID No.5);
下游引物:5’-GCGTTCGAACAGCTGCCT-3’(Seq ID No.6)
扩增的目的片段序列为:
5`-GTGTTGAAACAATCTCTACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCTAGGCTT
AAGCTCGAGGCAGCTGTTCGAACGC-3`(Seq ID No.4)
(3)所述PCR扩增的反应体系如下
PCR扩增反应体系为20μL。其中2×AllinOneTM qPCR Mix 10μL,上游引物2μL(终浓度0.02μM/L),下游引物2μL(终浓度亦为0.02μM/L),第一链cDNA 2μL,其余为双蒸水;
所述PCR扩增的反应程序为:
95度10分钟;以95度10秒,57度20秒,72度10秒为一个循环,共30个循环
检测结果采用log2(癌组织表达水平/癌旁组织表达水平)表示。图1A显示在绝大多数的肝癌组织样本里(34/40),miR-653在癌症组织中的表达水平低于癌旁组织,差异有统计学意义(p<0.01)。进一步研究表明,正常肝脏组织中miR-653的表达水平明显高于肝癌组织,且随着临床病情的严重程度增加,miR-653的表达水平呈现逐渐降低的趋势(图1B、C和D)。此外,发明人还选取了5株肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、Huh-7、Bel7402和SMMC7721),1株非转化肝细胞系(HL-7702)和3例非癌变肝脏组织,采用real time-PCR检测其中miR-653的表达水平,结果如图1E所示,同样发现肝癌细胞中miR-653表达水平均低于非转化肝细胞系和非癌变肝脏组织。这一发现与临床样本中的发现是一致的。
为了更为直观地分析与观察miR-653低表达与miR-653表达患者的术后远期预后,发明人利用Kaplan-meier曲线对188个肝癌病例中miR-653高表达组与低表达组的患者的总体生存情况和肝癌无复发生存情况进行了分析比较。如图1F和1G所示,miR-653高表达组的总体生存率和无复发生存率均显著优于miR-653低表达组(差异有统计学意义)。由此可见,肝癌组织中高表达miR-653的患者往往有着一个相对较好的远期生存预后。
实施例3、本发明所述的肝癌化疗增敏剂及其制备方法
本实施例具体提供一种肝癌化疗增敏剂,其有效成分包括miR-653、和/或miR-653前体、和/或miR-653过表达载体;基于上述肝癌化疗增敏剂,本实施例还提供其制作方法,包括如下步骤:标有肝癌化疗增敏用途的产品包装内含有miR-653和/或miR-653前体,和/或miR-653过表达载体;进一步地,所述miR-653过表达载体指,miR-653和/或miR-653前体与载体连接的产物。具体地,所述载体可选真核表达载体或病毒载体;所述真核表达载体可选pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体、pcDNA3.0系列表达载体;所述病毒载体可选逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体。具体地,所述miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;所述miR-653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。
实施例4、miR-653作为肝癌化疗增敏剂的检测。
基于实施例3所述的肝癌化疗增敏剂,本实施例利用病毒相关表达载体在HepG2、Huh-7和SMMC-7721细胞中稳定高表达miR-653。具体如下:
(1)构建过表达miR-653的慢病毒载体:步骤如下:
采用pSicoR载体,将Seq ID No.2所示序列插入该载体中。将pSicoR、p-CMV-VEVG和p-CMV-dr8.91共转染293T细胞,转染24小时、48小时后收获细胞培养液。用收获的培养液感染肝癌细胞即得。
(2)在HepG2、Huh-7和SMMC-7721细胞中表达miR-653,步骤如下:
采用miR-653的miRNA mimic和转染试剂riboFECTYTM CP,按照转染试剂的说明书记载的步骤将miRNA mimic转染到上述肝癌细胞中去。
(3)用3μM的sorafenib处理对照肝癌细胞和miR-653过表达的肝癌细胞,48小时后用流式细胞分析技术和caspase-3活性测试技术检测细胞凋亡的情况。
如图2A和2B所示,在三种肝癌细胞里,单独用3μM的sorafenib处理细胞或者单独过表达miR-653并不能诱导显著的肝癌细胞凋亡,但过表达miR-653则明显增强了肝癌细胞对sorafenib诱导凋亡的敏感程度。
(4)将对照与过表达miR-653的肝癌细胞移植在裸鼠的皮下。具体操作步骤为:将细胞悬浮在含有50%MatriGel的DMEM培养基中,皮下注射。
移植48小时后各肝癌细胞系注射到不同裸鼠皮下,3日后口服给予30mg/kg的sorafenib(对照组给予相同体积的生理盐水)。
从第二周开始,每周用游标卡尺测量瘤体的长和宽,计算瘤体的体积,持续到第5周。绘制肿瘤生长曲线如图2C所示,结果表明,单独使用30mg/kg的sorafenib或单独在肝癌细胞内过表达miR-653仅仅能够在一个较低的程度上迟滞肝癌移植组织的生长,而miR-653过表达则大大增强了sorafenib诱导的肿瘤组织生长抑制。
实验结束后,处死小鼠,解剖收集肝癌组织,用caspase-3活性分析法检测肿瘤组织中细胞凋亡的情况(图2D)。与体外实验的结果类似,单独口服sorafenib或者单独过表达miR-653并不能在移植肿瘤组织中显著诱导肝癌细胞凋亡,但过表达miR-653则明显增强了肝癌细胞对sorafenib诱导凋亡的敏感程度。
以上结果说明无论是在体外还是在动物体内,miR-653都可以增强肝癌细胞对化疗药物sorafenib的敏感性,即具有显著的化疗增敏效果。
Claims (7)
1.微小RNA分子miR-653在制备用于肝癌术后预后评估的试剂方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,所述试剂包括采用实时定量PCR检测肝脏组织中所述微小RNA分子miR-653的表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述实时定量PCR检测的检测引物包括:
上游引物: 5’-GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3’,
下游引物: 5’-GCGTTCGAACAGCTGCCT-3’。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述实时定量PCR检测的检测引物还包括用于对微小RNA分子miR-653进行反转录的反转录引物, 其序列如Seq ID No. 3 所示。
5.微小RNA分子miR-653在制备肝癌化疗增敏药物中的应用,
所述微小RNA分子miR-653指人工制备的微小RNA分子miR-653 、微小RNA分子miR-653的前体,或可在肝癌组织中有效表达微小RNA分子miR-653和/或miR-653前体的过表达载体;
所述微小RNA分子miR-653的核苷酸序列如Seq ID No.1所示;
所述微小RNA分子miR-653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述过表达载体指真核表达载体或病毒载体;
所述真核表达载体指pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体或pcDNA3.0系列表达载体;
所述病毒载体指逆转录病毒载体或腺病毒载体。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述逆转录病毒载体为慢病毒载体。
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