CN102230014B - 一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，具有结果稳定、分析可靠等优点，包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，如SEQUENCE LISTING所示。本发明还公开了一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA表达量的方法，具有操作简便易行等优点，步骤如下：(1)提取样本血浆的总RNA；(2)RT-PCR扩增；(3)制作标准曲线，计算斜率slope，根据公式E＝10^(-1/slope)-1，计算扩增效率E；(4)计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值和校对样本阈值，根据公式Q＝(E+1)^-ΔCq，得出基因的校正起始拷贝数Q；将样本目的基因的Q值与内参基因的Q值的几何平均数相比，得到目的基因Bmi-1的相对表达量。

Description

一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，以及检测宫颈癌血浆Bmi-1mRNA表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。 

背景技术

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中位居第二位，据统计，全球每年有新增病例49.3万，死亡约27.4万，严重危害妇女的身心健康。早期诊断和早期治疗是预防和控制宫颈癌的关键，宫颈癌如及时发现，并进行恰当的处理，其治愈率几乎达100％。传统的细胞学检查Pap细胞涂片检查，曾经大大降低了宫颈癌的死亡率，但其发展受到多方面的限制，如对细胞检查技术人员的要求高，存在判断主观性，另外取材也容易出现假阴性。阴道镜加上病理检查是早期宫颈癌检查的金标准，但其不适用于筛选检查。因此，寻找敏感性和特异性更强的早期诊断标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学宫颈癌筛查方法是目前关注的焦点。 

近年来，肿瘤相关mRNA陆续在肿瘤患者的血浆/血清中被检测出来，为肿瘤的无创性早期诊断、治疗监测和预后判断提供了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测血浆/血清中微量的肿瘤相关mRNA已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反映体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术具有敏感性高、重复性好、操作简便、检测快速等特点，目前已在临床核苷酸检测领域得到广泛应用。 

Bmi-1(B cell-specific moloney leukemia virus integration site-1)基因为一种属于PcG(Polycomegroup)家族成员的致癌基因，自1991年在鼠淋巴瘤中被发现后即引起生物医学领域的高度关注。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区，含有10个外显子和10个内含子。人类Bmi-1 cDNA长3203bp，共有959个腺嘌呤、591个胞嘧啶、678个鸟嘌呤和975个胸腺嘧啶。Bmi-1开放的阅读框编码一个含326个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为44000-46000。氨基酸序列分析表明，Bmi-1蛋白有几个重要的模序：(1)环指模序(ring finger domain，RF)：位于N-末端的环指结构域，由锌指和C3HC4保守序列组成。Bmi-1通过环指与其他蛋白结合形成多聚复合物。RING结构域则控制着BMI-1蛋白在细胞核内的亚定位，该结构域缺失后BMI-1蛋白不再主要局限在细胞核边缘分布而是散在分布于整个细胞核中。(2)位于中心保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNA banding helix-turn-helix-turn motif，H-T-H-T)介导Bmi-1与DNA结合，可以和c-myc共同作用导致细胞增殖和肿瘤形成。HTHTHT结构域决定了Bmi-1的转录抑制功能，而与Bmi-1蛋白的分布无关。(3)Bmi-1蛋白分子内还有两个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)——NLSI和NLS2，其中NLS2是Bmi-1蛋白定位于细胞核所必需的。(4)Bmi-1的C-末端部分是富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的PEST区域，与Bmi-1蛋白在细胞内快速降解有关。Bmi-1基因作为c-myc癌基因的协同基因，在细胞的中心体扩增调节中起着重要的作用，异常的中心体可以导致染色体的异常分裂，最终使遗传稳定性发生改变，干扰细胞正常活动而发生癌变。目前已发现Bmi-1基因表达异常与人类多种肿瘤的发生、发展相关。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种快速、简便、准确的检测宫颈癌血浆中Bmi-1基因mRNA的专用试剂盒，以及检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA表达量的方法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，引物序列如下所示(如SEQUENCE LISTING所示)： 

Bmi-1-F：5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’； 

Bmi-1-R：5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’； 

GAPDH-F：5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’； 

GAPDH-R：5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’； 

EEF1A1-F：5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’； 

EEF1A1-R：5’-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3’。 

所述专用试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由Syber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾和氯化镁组成。 

本发明所提供的试剂盒的引物序列是根据GeneBank序列号为NM 005180、NM 002046和NM 001402的基因序列为模板所设计的，其序列、Tm值及扩增产物长度见表1，该引物序列均跨越了原基因序列中的两个外显子，省去了DNA酶对样本的处理，避免了基因组DNA对实验结果的影响。 

一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA表达量的方法，步骤如下： 

(1)提取样本血浆的总RNA； 

(2)RT-PCR扩增：将上述提取的mRNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq(test sample)；同时以宫颈癌细胞株 Hela细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测； 

(3)制作标准曲线：从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，梯度稀释后，作为标准品，同步骤(2)进行RT-PCR扩增，检测Cq值；然后拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，给出数据点的趋势线，制作标准曲线，计算斜率slope，然后根据公式E＝10^(-1/slope)-1，计算扩增效率E； 

(4)计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq(test sample)和校对样本阈值Cq(calibrator sample)，根据公式Q＝(E +1)^-ΔCq，ΔCq＝[Cq(test sample)-Cq(calibrator sample)]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将样本目的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何平均数相比，得到目的基因Bmi-1的相对表达量。 

本发明建立的宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA检测方法，为宫颈癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。 

本发明使用了在宫颈癌中表达相对稳定的GAPDH基因和EEF1A1基因作为内参基因，对标本中的Bmi-1基因mRNA进行相对定量分析，避免了单一内参基因表达不稳定对结果产生的影响。 

本发明任意选取一个已知目标检测基因表达的样品的总RNA(或cDNA)，按10进行系列稀释，提供5个浓度的标准品，制作标准曲线，得出斜率(slope)，避免了传统方法构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得，实验过程繁琐。然后根据公式E＝10^(-1/slope)-1，计算扩增效率(E)，根据公式Q＝(E+1)^-ΔCq计算Bmi-1基因相对GAPDH基因和EEF1A1基因的表达量，避免了传统2^-ΔΔCq法必须要求PCR扩增效率为100％的限制，使结果分析更加可靠。 

附图说明

图1为EEF1A1基因、GAPDH基因和Bmi-1基因的标准曲线，其中，A：EEF1A1基因；B：GAPDH基因；C：Bmi-1基因。 

图2为血浆Bmi-1 mRNA在80例健康对照者(healthy)、42例CIN1级患者(CIN1)，45例CIN2级患者(CIN2)，51例CIN3级(CIN3)和138例宫颈癌患者(UCC)中的相对表达水平。 

图3为血浆Bmi-1 mRNA检测对宫颈癌诊断的ROC曲线。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实施例一 

1、试剂盒的组成及配制： 

根据GeneBank序列号为NM_005180、NM_002046和NM_001402的基因序列为模板，设计的检测目标基因(Bmi-1)和内参基因(GAPDH和EEF1A1)mRNA的引物，其引物序列、Tm值及扩增产物长度见表1。该引物序列均跨越了原基因序列中的两个外显子，省去了DNA酶对样本的处理，避免了基因组DNA对实验结果的影响。 

表1引物序列、Tm值及扩增产物长度 

所述试剂盒进一步包括PCR反应液：由Syber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁组成。 

所述DNA聚合酶在PCR反应液中的终浓度为100U/ml。 

所述dNTPs在PCR反应液中的终浓度为0.2mM。 

所述氯化镁在PCR反应液中的终浓度为6mM。 

所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在PCR反应液中的终浓度为16.5mM。 

所述氯化钾在PCR反应液中的终浓度为89.3mM。 

2、标本采集 

采集109例宫颈癌患者，138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(其中CIN1级42例，CIN2级45例，CIN3级51例)，80例健康对照者空腹静脉血3ml，1600g离心5分钟，分离血浆，保存于-80℃待测。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。 

3、血浆RNA提取 

1)、将样本浓缩到500μl，向每250μl样品中加入750μl Trizol LS(Invitrogen公司)，混匀，在15～30℃下孵育5min，让核蛋白质复合物充分溶解。

2)、加200μl氯仿，小心盖上盖子，剧烈震荡15s，然后15～30℃下15min。 

3)、4℃下12000g离心15min。 

4)、取上层水相，加入一个新的EP管内，同时加入500μl异丙醇，15～30℃下10min。 

5)、4℃下12000g离心10min。 

6)、弃上清，加入1ml 75％乙醇，漩涡震荡，4℃下7500g心里5min。 

7)、弃上清，将RNA沉淀空气中干燥5-10min，加10μl DEPC水溶解，如果A260/A280＜1.6，则在55-60℃下溶解10min，立即使用或-80℃保存。 

4、RT-PCR 

采用Applied Biosystems公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒对上述mRNA进行反转录成cDNA，取5μl cDNA为模板，进行PCR反应。 

PCR反应体系： 

模板DNA.5ul 

PCR反应液：12.5μl 

上游引物(10μM)：1μl 

下游引物(10μM)：1μl 

无菌水：5.5μl 

反应条件为：37℃→20分钟，95℃→10分钟；(95℃15秒，  55℃1分钟)→40个循环。 

同时以宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测。 

5、标准曲线制作 

将从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取的mRNA，逆转录成cDNA，然后10倍梯度稀释成5个浓度，作为标准品，同待测样本一同进行RT-PCR扩增，制作标准曲线。 

6、结果判断 

1)、使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行阈值测定，对不同浓度标准品进行分析，对拷贝数以10为底取对数，作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，给出数据点的趋势线，获得相对定量的标准曲线和斜率，根据公式E＝10^(-1/slope)-1，计算扩增效率(E)； 

2)、选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq(test sample)和校对样本阈值Cq(calibrator sample)，根据公式Q＝(E+1)^-ΔCq，ΔCq＝[Cq (test sample)-Cq(calibrator sample)]，得出基因的校正起始拷贝数Q； 

3)、将样本目的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何平均数相比，得到目的基因Bmi-1的相对表达量(R)。 

7、检测结果 

1)、标准曲线见图1。 

2)、109例宫颈癌患者，138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(其中CIN1级42例，CIN2级45例，CIN3级51例)，80例健康对照者血浆Bmi-1检测结果见图2。宫颈癌患者血浆Bmi-1mRNA中位水平为0.129(0.030～0.2705)，CIN3、CIN2、CIN1血浆Bmi-1 mRNA中位水平分别为0.037(0～0.051)、0.023(0～0.044)和0.004(0～0.004)，健康对照组血浆Bmi-1 mRNA中位水平为0.003(0～0.017)(各数据是根据“结果判断”中说明的过程得到的，对应于“结果判断”中的R值)。宫颈癌患者血浆Bmi-1 mRNA水平明显高于CIN各组和健康对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 

3)、宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA检测方法对宫颈癌的诊断价值分析 

以109例宫颈癌患者作为宫颈癌组，138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者和80例健康对照者作为非宫颈癌组(218例)，采用SPSS13.0统计学软件中的受试者工作曲线分析，得出血浆Bmi-1 mRNA检测宫颈癌的临界值为0.057，敏感性为69.7％，特异性为95.9％，诊断效能为0.801(见图3)，说明血浆Bmi-1 mRNA对宫颈癌具有较大的诊断价值。 

Claims (3)

1.一种检测宫颈癌血浆Bmi-1mRNA的专用试剂盒，其特征在于：包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，引物序列如下所示：

Bmi-1-F：5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’；

Bmi-1-R：5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’；

GAPDH-F：5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’；

GAPDH-R：5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’；

EEF1A1-F：5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’；

EEF1A1-R：5’-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3’。

2.根据权利要求1所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1mRNA的专用试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液，PCR反应液由Syber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾和氯化镁组成。

3.根据权利要求2所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1mRNA的专用试剂盒，其特征在于：所述上游引物和下游引物的体积均为1μl，其中，Bmi-1-F、Bmi-1-R、GAPDH-F、GAPDH-R、EEF1A1-F和EEF1A1-R的浓度均为10μM；所述PCR反应液中，各组分的浓度为：DNA聚合酶的浓度为100U/ml，dNTPs的浓度为0.2mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为16.5mM，氯化镁的浓度为6mM，氯化钾的浓度为89.3mM和1×Syber Green I荧光染料。

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