CN103409501A - 一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法,包括以下步骤:(1)临床标本收集及组织RNA制备;(2)维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析:(3)宫颈癌特异性差异表达候选基因的半定量RT-PCR分析。本发明通过半定量PCR筛查鉴定,发现绝大部分候选基因编码的mRNA表达水平在CSCC(或CIN)和NC组织之间存在显著差异,同时证明了基因芯片分析数据的可靠性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明专利属于分子生物学或医学诊断技术领域,涉及一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法。
背景技术
宫颈癌是一种妇科恶性肿瘤,而早期发现是肿瘤有效治疗的关键。维吾尔族妇女宫颈癌的发病率和和死亡率很高,列为新疆特高发肿瘤。由于现有肿瘤诊断技术固有的局限性,临床收治的肿瘤患者中,中晚期居多,治疗效果较差。肿瘤特异性差异表达基因可以成为肿瘤发生密切相关的早期预警分子标志物,是建立肿瘤早期分子诊断方法的重要前提。本发明相关的技术包括四个关键步骤:(1)收集病理确诊的肿瘤、癌前病变患者及健康对照组织标本,制备组织RNA(Ribonucleic Acid,核糖核酸),其组织RNA一般含有信使RNA(messenger RNA,mRNA)、核糖体RNA(ribose RNA,rRNA)和转移RNA(transport RNA,tRNA);(2)选择人类全基因组表达谱芯片,通过肿瘤与正常组织mRNA的差异表达谱分析,建立肿瘤及癌前病变组织特异性候选差异表达基因谱(mRNA谱),并进一步在线数据库、专业软件及资源查新分析,鉴别出新的肿瘤特异性差异表达候选基因(mRNA);(3)以组织RNA为模板,在逆转录酶催化下,合成与其mRNA互补的脱氧核糖核苷酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA);(4)设计与合成每一种mRNA序列特异性引物后,利用cDNA模板、Taq DNA聚合酶及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,检测目的基因的mRNA表达水平,筛选出mRNA表达水平上具有显著差异的候选基因,并淘汰无差异基因。在此,“引物”是指以DNA聚合酶催化反应所必需的18-22寡聚核苷酸(碱基)分子,而“逆转录反应”和“PCR”属于同一个检测步骤的连续过程,一般统称为RT-PCR。
据既往文献记载,通过宫颈癌组织的人类全基因组芯片研究,不同研究者发现了一系列宫颈癌组织特异性差异表达基因,并已公开报道。当时,人们所采用的人类全基因组表达谱芯片所含基因条数有限,而且对新疆维吾尔族妇女宫颈癌的相关研究报道几乎空白。近期,随着人类全基因组表达谱芯片技术的优化与完善,芯片所含基因种类不断增加。本发明采用新的人类全基因组表达谱芯片,对维吾尔族妇女宫颈癌组织进行筛查分析及单一基因表达水平的RT-PCR验证,发现一系列尚未报道的宫颈癌组织特异性差异表达基因。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷,利用维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA,通过高密度人类全基因组表达谱芯片及单一候选基因表达水平的RT-PCR鉴定,本发明提供一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法。
其技术方案如下:
一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法,包括以下步骤:
(1)临床标本收集及组织RNA制备
维吾尔族妇女宫颈鳞癌、宫颈内上皮瘤变II-III和正常对照为对象,系统收集患者病例信息和新鲜宫颈组织标本,当场取出标本后,立即液氮冻存与运输,在-80℃超低温冰箱保存,从以上组织标本中,选取病理确诊的组织标本72例,其中宫颈鳞癌25例,宫颈内上皮瘤变II-III22例和正常对照25例。所有入选病例术前均未接受放疗或化疗,平均年龄为45.2岁;
(2)维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析
21)组织RNA样品的制备
从步骤(1)收集的维吾尔族妇女宫颈病变患者组织标本中,选取病理确诊的新鲜宫颈组织共20例,其中宫颈鳞癌7例,宫颈内上皮内瘤变II-III7例,正常对照组织6例,利用RNA提取试剂盒制备组织RNA,保存于超低温冰箱-80℃;
22)取以上人类基因组表达谱芯片共20张,分别与20例宫颈组织RNA进行杂交实验,并重复三次;
23)利用LuxScan10KA双通道激光扫描仪,对杂交后的基因芯片进行扫描分析;
24)利用SAM软件,并以NC为对照,对CSCC和CIN II-III的芯片扫描数据进行处理与统计分析,其聚类分析;
25)以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限,获得CSCC或CIN II-III与NC之间差异表达候选基因;
(3)宫颈癌特异性差异表达候选基因的半定量RT-PCR分析
31)候选基因的选择及编码的mRNA特异性引物设计
32)候选基因表达水平的半定量RT-PCR分析。
主要是提取组织RNA,合成cDNA,利用特异性引物和半定量RT-PCR方法对72例组织RNA样品进行mRNA表达水平鉴定,通过定量及统计学差异分析,筛选出具有显著差异的CSCC或CIN II-III特异性差异表达基因。
本发明的有益效果为:
首先,设计候选基因编码的mRNA序列特异性PCR引物,利用CSCC、CIN和NC组织RNA,通过半定量PCR筛查鉴定,发现绝大部分候选基因编码的mRNA表达水平在CSCC(或CIN)和NC组织之间存在显著差异,同时证明了基因芯片分析数据的可靠性和灵敏度。其次,依据半定量RT-PCR分析结果,选取了其中一些关键基因,通过定量RT-PCR分析,进一步证明了半定量RT-PCR分析所得结论的可行性和准确度,确定了新一类宫颈癌及癌前病变特异性差异表达基因,包括上调或下调表达基因。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步详细描述。
一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法,包括以下步骤:
(1)临床标本收集及组织RNA制备
2010-2011年期间,以新疆医科大学第三附属肿瘤医院住院门诊或妇科临床为基地,维吾尔族妇女宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)、宫颈内上皮瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia,CIN)II-III和正常对照(normal control,NC)为对象,系统收集患者病例信息和新鲜宫颈组织标本,当场取出标本后,立即液氮冻存与运输,在-80℃超低温冰箱保存。从以上组织标本中,选取病理确诊的组织标本72例,其中宫颈鳞癌(cervical squamouscell carcinoma,CSCC)25例,宫颈内上皮瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)II-III22例和正常对照(normal control,NC)25例。所有入选病例术前均未接受放疗或化疗,平均年龄为45.2岁(25~69岁)。
(2)维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析
依托博奥生物公司提供的基因芯片分析平台的技术服务,选择AFFX人类基因组表达谱芯片(AFFX Human Genome U133Plus2.0Array,Affimetrix公司),完成了CSCC(7例)、CIN II-III(6例)和NC(7例)组织RNA标本的基因芯片筛查分析,其工作原理及全部操作流程参照该公司常规的基因芯片分析方法,主要细节如下:
21)组织RNA样品的制备
从步骤(1)收集的维吾尔族妇女宫颈病变患者组织标本中,选取病理确诊的新鲜宫颈组织共20例,其中宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma)7例,宫颈内上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)II-III7例,正常对照(normal control,NC)组织6例),利用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit,Qiagen公司)制备组织RNA,保存于超低温冰箱-80℃;
22)取以上人类基因组表达谱芯片共20张,分别与20例宫颈组织RNA进行杂交实验,并重复三次;
23)利用LuxScan10KA双通道激光扫描仪,对杂交后的基因芯片进行扫描分析;
24)利用SAM软件,并以NC为对照,对CSCC和CIN II-III的芯片扫描数据进行处理与统计分析,其聚类分析(gene cluster analysis);
25)以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限,获得CSCC或CIN II-III与NC之间差异表达候选基因;
通过以上杂交、扫描和数据分析,发现CSCC与NC(正常对照)比较,有(2倍及以上)差异表达基因480种,其上调表达基因有394种,下调表达基因为86种;CIN II-III与NC比较,只有下调表达基因3种;CSCC与CIN II-III比较,差异表达基因538种,其上调表达基因516种,下调表达基因)。
采用高密度人类全基因组表达谱芯片(AFFX Human Genome U133Plus2.0Array,Affimetrix公司)分析,发现尚未报道的维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织特异性差异表达基因谱。
(3)宫颈癌特异性差异表达候选基因的半定量RT-PCR分析
首先,根据本研究前提条件及上述基因表达谱芯片数据,确定了候选差异表达基因,设计出每一个候选基因的mRNA序列特异性PCR引物。其次,制备上述72例宫颈病变组织RNA,以此为模板而合成cDNA。最后,以cDNA为模板,利用特异性引物进行半定量RT-PCR筛查鉴定,筛选出具有显著差异的差异表达基因。其具体操作过程如下:
31)候选基因的选择及编码的mRNA特异性引物设计
在基因表达谱芯片分析的基础上,设定一系列优先选择标准,对差异表达候选基因进行了进一步分析与选择,其优选条件或标准如下:①CSCC与NC比较,该基因差异表达的倍数高;②SAM软件分析提供的Q-value较低或接近零值;③当CSCC与CIN II-III比较时,该基因无差异;④该基因与其他肿瘤的关系有文献依据,但是与宫颈癌发生的关系研究尚未见报道;⑤根据该基因的mRNA序列,可以设计出高度特异性PCR引物。
按照以上我们对候选基因的选择标准,我们选取CSCC特异性差异表达候选基因23种,其中上调表达基因为9种,下调表达基因12种,其相关基因上调表达及下调表达基因信息列于表1和表2。在表2中,为了便于理解,按照NC/CSCC比例提供了下调表达基因的差异倍数,反之,按照CSCC/NC比例计算,该基因的差异表达倍数小于0.500。
表1 9种CSCC特异性候选上调表达基因信息
a Genebank数据库提供的mRNA代码;b CSCC/NC差异倍数;c SAM软件提供的统计学分析结果
表2 12种CSCC特异性下调表达候选基因信息
a Genebank数据库提供的mRNA代码;b CSCC/NC差异倍数;c SAM软件提供的统计学分析结果
为了对以上单一候选基因表达水平的半定量RT-PCR鉴定,根据Genebank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)信息,获得候选基因编码的mRNA序列信息,利用该数据库提供的引物设计共享软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)或依托专业化的引物设计技术服务(TaKaRa公司提供),设计出候选基因编码的mRNA序列特异性PCR引物,列于表3,其中上调表达候选基因相应的引物为半定量或实时荧光定量RT-PCR可共用。
32)候选基因表达水平的半定量RT-PCR分析。
主要是提取组织RNA,合成cDNA,利用特异性引物和半定量RT-PCR方法对72例组织RNA样品进行mRNA表达水平鉴定,通过定量及统计学差异分析,筛选出具有显著差异的CSCC或CIN II-III特异性差异表达基因,其主要细节如下:
①选择上述72例新鲜宫颈病变及正常宫颈组织标本(CSCC25例,CIN II-III22例和NC25例),利用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit,Qiagen公司)制备组织RNA;②采用10μL-反应体系,以1.0μg组织RNA为模板,选择专用逆转录试剂(Revert Aid First StrandcDNA Synthesis Kit,Fermentas公司)合成cDNA;③采用25μL-PCR反应体系,以cDNA为模板,采用常规半定量RT-PCR方法及特异性引物,扩增出每一份组织样品和候选基因相应的PCR产物,其PCR扩增条件的选择参照常规PCR程序设计方法及
表3 候选差异表达基因特异性PCR引物信息
a PCR扩增产物的预期大小;b 管家基因,视为RT-PCR鉴定所需的内部参照基因。
预实验确定;④经2%琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭(替代品)显色和紫外成像,获得每一份PCR产物的电泳图;⑤为了量化分析PCR产物,利用Quantity One分析软件(V4.6.2,Biorad公司),按照凝胶电泳图,计算每一个PCR产物相应的灰度值,并按照该软件操作规程,依次获得每一个候选基因相应的半定量PCR产物的灰度值。
将半定量PCR产物的灰度值视为每一个候选基因表达水平(mRNA),对每一个基因在CSCC、CIN II-III和NC组织之间表达水平差异进行量化比较,并计算统计学差异,以NC或CIN II-III为对照,发现在宫颈癌组织中,绝大部分基因的表达水平有量化差异,而且这些差异具有统计学意义如表4和表5所示。
如表4所示,关注上调表达候选基因的mRNA表达水平,大部分情况下,在CSCC组织中升高,在CIN下降,在NC最低,其主要分析结果如下:
(1)CSCC与NC比较,经统计学t-检验,发现RARRES1、SHISA2、SYCP2、SIX1、DTL、APOBEC3B、DSG2、NUP62CL和KIF4A等9种基因表达水平存在显著差异(P<0.05),是宫颈癌特异性差异表达基因,其中SHISA2、SIX1、DTL、DSG2和NUP62CL等5种基因表达水平差异更为显著(P<0.01),可能更具有代表性。
(2)CSCC与CIN(II-III)比较,经统计学t-检验,发现RARRES1、SHISA2、SYCP2、SIX1、APOBEC3B、DSG2和KIF4A等7种基因表达水平存在显著差异(P<0.05),其检测可能有助于鉴别肿瘤与癌前病变。
(3)CIN与NC比较,经统计学t-检验,发现只有SHISA2基因的表达水平差异显著(P<0.05),但是在CIN组织中的表达水平反而低于NC,尚无合理的解释,待进一步探讨。
表4 9种宫颈病变组织特异性上调表达基因表达水平的半定量RT-PCR分析
a 按2%琼脂糖凝胶电泳条带的灰度值计算;b 指CIN II-III
如表5所示,观察下调表达候选基因的mRNA表达水平,在NC组织为最高,在CIN组织下降,在CSCC组织为最低,其主要分析结果如下:
(4)CSCC与NC比较,经统计学t-检验,发现FOSB、DNASE1L3、SCARA5、EGR1、ABI3BP、FOS、ISL1、CFD、KLF4、ID4、IER2和RHOB等12种基因表达水平存在显著差异(P<0.05),是宫颈癌特异性下调(低)基因,其中FOSB、EGR1、FOS、CFD、KLF4、ID4、IER2和RHOB等8种基因表达水平差异更为显著(P<0.01),可能更具有代表性。
(5)CSCC与CIN比较,经统计学t-检验,发现FOSB、SCARA5、ABI3BP、FOS、ID4和RHOB等6种基因存在统计学差异(P<0.05),其检测可能有助于鉴别肿瘤与癌前病变。
(6)CIN与NC比较,经统计学t-检验,发现DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF4和IER2等5种基因存在统计学差异(P<0.05),其中DNASE1L3、EGR1、KLF4和IER2等4种基因在CSCC与CIN之间无任何统计学差异(P>0.05),因而这4种基因可能是癌前病变特异性下调表达基因。
表5 12种宫颈病变组织特异性下调表达基因表达水平的半定量RT-PCR分析
a 按2%琼脂糖凝胶电泳条带的灰度值计算;b 指CIN II-III
宫颈癌特异性差异表达候选基因的实时荧光定量RT-PCR分析
在半定量RT-PCR筛选的基础上,选取具有显著差异的基因指标,依托实时荧光定量PCR技术平台,定量筛查分析,验证半定量RT-PCR分析结果的可靠性和准确度,是实时荧光定量RT-PCR分析的预期目标
候选差异表达基因的选择及实时荧光定量RT-PCR专用引物的设计
依据以上半定量RT-PCR分析,选择候选基因指标如下:
(1)6种宫颈癌特异性上调表达基因,SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL和APOBEC3B。
(2)5种宫颈癌特异性下调表达基因,FOSB、DNASE1L3、EGR1、ABI3BP和FOS。
依据Genebank数据库信息,获得候选基因编码的mRNA序列信息,依托专业化的引物设计技术服务(TaKaRa公司提供),设计出实时荧光定量RT-PCR引物,列于附表5,其中上调表达候选基因相关的引物序列同表3。
实时荧光定量RT-PCR分析结果
首先,以组织RNA为模板,合成cDNA,选用Real Time RT-PCR SYBR Green1试剂盒(DRR041A,TAKARA),依托实时荧光定量PCR仪(IQTM5,BIORAD公司)技术平台,分析CSCC、CIN(II-III)和NC组织RNA72例,其试验设计和数据分析采用双标准曲线法,均参照该仪器的常规工作流程和说明书。利用专业配套软件处理数据与比较分析,其中关键步骤是绘制内参基因GADPH或β-actin和每一个候选基因相应的PCR标准曲线,以此分别计算出每一种样品中GADPH或β-actin及候选基因相应的PCR扩增相对起始拷贝数。然后,以每一种候选基因相应的相对起始拷贝数除以同一样品的GADPH或β-actin起始拷贝数,获得每一种样品中该基因的mRNA相对表达量。
表6候选差异表达基因特异性PCR引物信息
a PCR扩增产物的预期大小;b 管家基因,视为RT-PCR鉴定所需的内部参照基因。
如表7所示,发现上调表达候选基因的表达水平在CSCC组织RNA较高,在CIN下降,在NC较低,其主要分析结果如下:
(1)CSCC与NC比较,SHISA2、SIX1、DTL、DSG2和NUP62CL等5种基因表达水平存在显著差异(P<0.05),其中DTL和NUP62CL等2种基因表达水平差异更为显著(P<0.01)。
(2)CSCC与CIN(II-III)比较,SIX1和NUP62CL等2种基因表达水平存在显著差异(P<0.05)。
(3)CIN与NC比较,仅有DTL基因的表达水平差异显著(P<0.05)。
(4)DTL基因的表达水平在CSCC与CIN之间无差异(P>0.05),而在CIN与NC之间又有差异(P<0.05),即该基因表达水平接近于CSCC,而有别于NC,对于在CIN阶段预测宫颈癌的发生具有一定的应用价值。
表7 6种上调表达基因表达水平的实时荧光定量RT-PCR分析
如表8所示,发现下调表达候选基因的表达水平在CSCC组织RNA较低,在CIN下降,在NC较高,其主要分析结果如下:
(1)CSCC与NC比较,DNASE1L3、FOSB、EGR1、ABI3BP和FOS等5种基因表达水平存在显著差异(P<0.05),其中DNASE1L3、FOSB、EGR1和FOS等4种基因表达水平差异更为显著(P<0.01)。
(2)CSCC与CIN(II-III)比较,EGR1、ABI3BP和FOS等3种基因表达水平存在显著差异(P<0.05)。
(3)CIN与NC比较,DNASE1L3、FOSB、EGR1和FOS等4种基因的表达水平差异显著(P<0.05)。
表8 5种下调表达基因表达水平的实时荧光定量RT-PCR分析
本发明通过不同定量分析数据的互补性和重复性,在半定量RT-PCR筛查鉴定中,获得了以上分析结果,而通过实时荧光定量RT-PCR鉴定,部分基因相关的结论得以进一步验证,其中有SHISA2、SIX1、DTL、APOBEC3B、DSG2和NUP62CL等6种上调表达基因,以及DNASE1L3、FOSB、EGR1、ABI3BP和FOS等5种下调表达基因。由于实时荧光定量RT-PCR是基因表达水平鉴定的首选方法,其准确度和灵敏度高,一般优于半定量RT-PCR,因而以两种方法分析同一种基因的表达水平时,将实时荧光定量RT-PCR分析结果视为最终定论。
以上所述,仅为本发明较佳的实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)临床标本收集及组织RNA制备
维吾尔族妇女宫颈鳞癌、宫颈内上皮瘤变II-III和正常对照为对象,系统收集患者病例信息和新鲜宫颈组织标本,当场取出标本后,立即液氮冻存与运输,在-80℃超低温冰箱保存,从以上组织标本中,选取病理确诊的组织标本72例,其中宫颈鳞癌25例,宫颈内上皮瘤变II-III22例和正常对照25例。所有入选病例术前均未接受放疗或化疗,平均年龄为45.2岁;
(2)维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析
21)组织RNA样品的制备
从步骤(1)收集的维吾尔族妇女宫颈病变患者组织标本中,选取病理确诊的新鲜宫颈组织共20例,其中宫颈鳞癌7例,宫颈内上皮内瘤变II-III7例,正常对照组织6例,利用RNA提取试剂盒制备组织RNA,保存于超低温冰箱-80℃;
22)取以上人类基因组表达谱芯片共20张,分别与20例宫颈组织RNA进行杂交实验,并重复三次;
23)利用LuxScan10KA双通道激光扫描仪,对杂交后的基因芯片进行扫描分析;
24)利用SAM软件,并以NC为对照,对CSCC和CIN II-III的芯片扫描数据进行处理与统计分析,其聚类分析;
25)以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限,获得CSCC或CIN II-III与NC之间差异表达候选基因;
(3)宫颈癌特异性差异表达候选基因的半定量RT-PCR分析
31)候选基因的选择及编码的mRNA特异性引物设计
32)候选基因表达水平的半定量RT-PCR分析。
主要是提取组织RNA,合成cDNA,利用特异性引物和半定量RT-PCR方法对72例组织RNA样品进行mRNA表达水平鉴定,通过定量及统计学差异分析,筛选出具有显著差异的CSCC或CIN II-III特异性差异表达基因。
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