CN116377075A - 用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法 - Google Patents

用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于预测乳腺癌患者化疗有效性的方法，更具体地，涉及一种方法，其在从乳腺癌患者获得的生物样品中测量乳腺癌的预后预测基因和标准化基因的表达水平、将测量结果归一化、并将患者分类为预测具有高化疗有效性的人群和预测具有低化疗有效性的人群。本发明的方法允许准确预测乳腺癌患者的化疗有效性，并且可以有效地用于提示针对未来乳腺癌治疗方向的线索的目的。

Description

用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法
相关申请的交叉引用
本申请是申请日为2017年11月23日的中国专利申请201780072701.8的分案申请，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种预测乳腺癌患者化疗有效性的方法，更特别地涉及一种预测乳腺癌患者化疗有效性的方法，该方法包括：步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中测量选自由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的至少一种增殖相关基因、以及BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)免疫相关基因的mRNA表达水平；步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；和步骤c：通过所述步骤b中归一化的所述至少一种增殖相关基因和所述免疫相关基因的组合来预测所述乳腺癌患者的化疗有效性，其中当所述增殖相关基因过表达时预测所述化疗有效性为高以及当所述免疫相关基因过表达时预测所述化疗有效性为低。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症，也是第二大致死癌症。2001年，乳腺癌患病率美国为每100,000人中90-100人，欧洲为每100,000人中50-70人。该病的发病在世界范围内不断增加。乳腺癌的风险因素包括种族、年龄、抑癌基因BRCA-1、BRCA-2和p53中的突变。饮酒、高脂肪饮食、缺乏运动、绝经后的外源性激素和电离辐射也会增加乳腺癌的风险。在雌激素受体和孕激素受体阴性乳腺癌(分别为ER-和PR-)、大肿瘤大小、高级别细胞学诊断结果以及年龄35岁以下的人中乳腺癌预后更差(Goldhirsch等人.(2001).J.Clin.Oncol.19：3817-27)。估计2005年将诊断出约212,000例新的浸润性乳腺癌病例和58,000例新的非浸润性乳腺癌病例，预计2005年有40,000名女性死于乳腺癌。
手术后，目前治疗乳腺癌的方法需要附加的辅助治疗来减少将来的复发，例如化学疗法、抗激素疗法、靶向疗法或放射疗法。其中，化学疗法是抗癌疗法之一。取决于癌症的状况、肿瘤的大小、肿瘤的病理阶段或其他因素，乳腺癌患者的病理状态因患者而异。因此，由于乳腺癌患者的不同病理状况和不同反应，一些患者可能受益于抗癌药物的化疗，但其他患者可能不会。对化疗效果不佳的患者连续施用化疗可能会增加副作用并对患者造成不必要的疼痛。
在这方面，在向乳腺癌患者施用抗癌药物之前，需要方法来准确预测在那些患者中化疗的有效性。
发明内容
技术问题
因此，本发明人在他们发现，通过收集和分析从乳腺癌组织获得的临床信息以鉴定与预后预测相关的基因集、通过在所鉴定的基因中选择和组合适合于FFPE样品的基因和它们的集来开发可预测乳腺癌患者的预后的算法、和通过根据作为使用含有患者癌细胞和基因信息的组织的FFPE样品来开发用于预测乳腺癌患者预后的算法的大量工作的结果的上述算法来区分患者，从而可以预测乳腺癌患者的化疗化学有效性之后，完成了本发明。
因此，本发明的一个方面旨在提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中测量选自由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的至少一种增殖相关基因、以及BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)免疫相关基因的mRNA表达水平；
步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；和
步骤c：通过所述步骤b中归一化的所述至少一种增殖相关基因和所述免疫相关基因的组合来预测所述乳腺癌患者的化疗有效性，其中当所述增殖相关基因过表达时预测所述化疗有效性为高以及当所述免疫相关基因过表达时预测所述化疗有效性为低。
本发明的一个方面要提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中分别测量UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)、MKI67(增殖标志物Ki-67)和BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)的mRNA表达水平；
步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；
步骤c：评估所述乳腺癌患者的肿瘤大小和pN分期；
步骤d：通过将所述步骤b中获得的归一化值以及所述步骤c中的所述肿瘤大小和所述pN分期代入下面的等式1和等式2来计算数值，
[等式1]
未换算的BCT评分(U-BS)＝a*△Ct_UBE2C+b*△Ct_TOP2A+c*△Ct_RRM2+d*△Ct_FOXM1+e*△Ct_MKI67+f*△Ct_BTN3A2+g*肿瘤_大小(cm)+h*pN(0或1)
[等式2]
如果0.8*未换算的BCT评分(U-BS)-13.71<0，则BCT评分＝0
如果0≤0.8*U-BS-13.71≤10，则BCT评分＝0.8*U-BS-13.71
如果0.8*U-BS-13.71>10，则BCT评分＝10
(其中用于预测所述化疗有效性的基因的值是使用标准基因计算的归一化mRNA表达值；所述肿瘤大小是按肿瘤的长轴长度确定的值，并且所述pN是根据淋巴结转移的病理判断确定的值，其中a是0.16至1.09，b是0至0.71，c是0至0.53，d是0至0.57，e是0至0.35，f是-1.02至0，g是0.25至1.52，和h是0.19至2.25)；以及
步骤e：预测在所述步骤d中计算的值越大，所述化疗有效性越高。
本发明的另一个方面要提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
本发明的另一个方面要提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
本发明的又一个方面要提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物基本上由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
本发明的又一个方面要提供一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的试剂盒，所述试剂盒包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
本发明的又一个方面要提供用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂在制备用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的试剂中的应用。
技术方案
根据本发明一个方面的一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中测量选自由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的至少一种增殖相关基因、以及BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)免疫相关基因的mRNA表达水平；
步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；和
步骤c：通过所述步骤b中归一化的所述至少一种增殖相关基因和所述免疫相关基因的组合来预测所述乳腺癌患者的化疗有效性，其中当所述增殖相关基因过表达时预测所述化疗有效性为高以及当所述免疫相关基因过表达时预测所述化疗有效性为低。
根据本发明一个方面的另一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中分别测量UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)、MKI67(增殖标志物Ki-67)和BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)的mRNA表达水平；
步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；
步骤c：评估所述乳腺癌患者的肿瘤大小和pN分期；
步骤d：通过将所述步骤b中获得的归一化值以及所述步骤c中的所述肿瘤大小和所述pN分期代入下面的等式1和等式2来计算数值，
[等式1]
未换算的BCT评分(U-BS)＝a*△Ct_UBE2C+b*△Ct_TOP2A+c*△Ct_RRM2+d*△Ct_FOXM1+e*△Ct_MKI67+f*△Ct_BTN3A2+g*肿瘤_大小(cm)+h*pN(0或1)
[等式2]
如果0.8*未换算的BCT评分(U-BS)-13.71<0，则BCT评分＝0
如果0≤0.8*U-BS-13.71≤10，则BCT评分＝0.8*U-BS-13.71
如果0.8*U-BS-13.71>10，则BCT评分＝10
(其中用于预测所述化疗有效性的基因的值是使用标准基因计算的归一化mRNA表达值；所述肿瘤大小是按肿瘤的长轴长度确定的值，并且所述pN是根据淋巴结转移的病理判断确定的值，其中a是0.16至1.09，b是0至0.71，c是0至0.53，d是0至0.57，e是0至0.35，f是-1.02至0，g是0.25至1.52，和h是0.19至2.25)；以及
步骤e：预测在所述步骤d中计算的值越大，所述化疗有效性越高。
根据本发明一个方面的另一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
根据本发明另一个方面的一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
根据本发明又一个方面的一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物基本上由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
根据本发明另一个方面的一个实施方式提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的试剂盒，所述试剂盒包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
根据本发明另一个方面的一个实施方式提供了用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂在制备用于预测乳腺癌患者化疗有效性的试剂中的应用。
以下，将详细描述本发明。
本发明提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：在从所述乳腺癌患者获得的生物样品中测量选自由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的至少一种增殖相关基因、以及BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)免疫相关基因的mRNA表达水平；
步骤b：将所述步骤a中测量的所述mRNA表达水平归一化；和
步骤c：通过所述步骤b中归一化的所述至少一种增殖相关基因和所述免疫相关基因的组合来预测所述乳腺癌患者的化疗有效性，其中当所述增殖相关基因过表达时预测所述化疗有效性为高以及当所述免疫相关基因过表达时预测所述化疗有效性为低。
本发明中的术语“化疗有效性”是指当对乳腺癌患者施用抗癌药物如化学物质进行治疗性治疗时是否会表现出有效的治疗效果。上述“有效的治疗效果”是包括癌症完全恢复、复发、转移或转移性复发的概念，并最优选是指转移性复发，但不限于此。
本发明中的“转移性复发”是包含以下所述的概念：在治疗前的乳腺癌部位和/或同侧乳腺和/或对侧乳腺发生的局部转移性复发，以及在远处区域例如肺、肝、骨、淋巴结、皮肤和脑中发生的远处转移性复发。优选地，在本发明中，转移性复发可以是远处转移性复发，但不限于此。
本发明中的术语“转移”意指在初始治疗后，从至少一个乳腺肿瘤来源和修饰的癌细胞在远离该肿瘤的部位(以下称为“远处区域”)继续生长成癌症。所述远处区域可以是，例如，在一个或多个淋巴结中，其可以是移动的或固定的、肿瘤同侧的或对侧的、以及锁骨或腋下的。
预测乳腺癌的化疗有效性主要通过手术评估肿瘤的大小(T)、淋巴结(N)周围的转移和远处转移(M)后疾病的分期(TNM分期)来确定。根据TNM分期分类的患者化疗有效性的预测性即使在同期也是不同的。因此，同期乳腺癌中的化疗有效性可以通过雌激素或孕酮受体(ER或PR)的表达和HER2(人表皮生长因子受体2)的过表达或所述基因的扩增来确定。即使是同期的乳腺癌，病理和预后也会取决于雌激素受体、孕激素受体或HER2的表达而有明显不同，因此有必要将其明确区分并具体设定治疗方法。
因此，最近，通过基因和分子生物学对乳腺癌的特征进行了分类(表1)。根据亚型，治疗的结果和预后不同，并且它被用作选择手术方法或化疗的指标。
[表1]
乳腺癌的分子生物学亚型分类
Figure BDA0004160267920000071
Figure BDA0004160267920000081
本发明中的乳腺癌优选为雌激素受体和/或孕酮受体阳性和HER2阴性乳腺癌，最优选它可以是管腔A型乳腺癌，但不限于此。
在乳腺癌的情况下，分期越高，癌症越晚期，预后也不好。乳腺癌分为0至4期。乳腺癌使用TNM分期系统，需要三个因素确定TNM分期。T期由癌症本身的大小和特征来确定，N期由淋巴结的受累程度来确定，M期由是否向乳腺以外的其它部位转移来确定。各期的病理特征总结在下表2中。
[表2]
根据TNM分期的乳腺癌病理分类
Figure BDA0004160267920000082
在本发明中，乳腺癌优选是早期乳腺癌，更优选对应于pN0或pN1期的乳腺癌，最优选根据TNM分期分类为1或2期的乳腺癌，但不限于此。
以下，详细描述了用于预测乳腺癌患者化疗有效性的方法的每个步骤。
步骤a：从乳腺癌患者获得生物样品；
在本发明中，生物样品可以是乳腺癌患者的乳腺癌组织。乳腺癌组织也可以含有一些正常细胞，优选含有患者癌细胞的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织、新鲜组织和冷冻组织，但不限于此。
步骤b：从步骤a的样品中测量至少一种选自由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的增殖相关基因、以及BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)免疫相关基因的mRNA表达水平。
本发明中乳腺癌患者化疗有效性的预测标志物可以是由UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)和MKI67(增殖标志物Ki-67)组成的组中的增殖相关基因、以及免疫相关基因BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)。这些中的每一个可以独立选择，但可以优选通过两种或更多种基因的组合用于预测乳腺癌患者的化疗有效性。
上述基因中的每一个可以是本领域已知的各基因的序列或各基因的同义词，优选源自于人类的各基因的序列，更优选UBE2C(Gene ID：11065)、TOP2A(Gene ID：7153)、RRM2(Gene ID：6241)、FOXM1(Gene ID：2305)、MKI67(Gene ID：4288)、BTN3A2(Gene ID：11118)，但不限于此。
各基因的同义词和序列可以在GenBank中找到。
在本发明中，mRNA表达水平可以通过本领域中进行的任何方法测量，以测量所述基因的表达水平。优选地，所述方法可以使用微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、RT-PCR(qRT-PCR)、实时PCR、northern印迹、DNA芯片和RNA芯片进行，但不限于此。
本发明的目的基因表达水平的测量优选检测目的基因的表达水平，更优选定量检测目的基因的表达水平。为了检测表达水平，可能需要样品组织的mRNA分离和mRNA的cDNA合成。为了分离mRNA，可以使用本领域已知的分离样品中RNA的方法。优选地，样品是FFPE样品，因此它可以是适合于FFPE样品的mRNA分离方法。作为cDNA合成方法，可以使用本领域已知的使用mRNA作为模板的cDNA合成法。优选地，本发明的乳腺癌患者化疗有效性的预测标志物的表达水平是在FFPE样品中定量检测的mRNA表达。因此，它可以通过用于FFPE样品的mRNA分离方法和实时逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来测量。
另外，本发明中目的基因表达水平的测量可以根据本领域已知的方法进行，但是可以通过使用用荧光报告染料和/或荧光猝灭染料标记的探针的光学定量分析系统来测量。所述测量可以通过可商购的设备、例如诸如ABIPRISM 7700TM Sequence DetectionSystemTM、Roche Molecular Biochemicals Lightcycler这样的系统及其附带的软件进行。这样的测量数据可以表示为测量值或循环阈值(Ct或Cp)。测量的荧光值被记录为第一个统计显著性点的点是循环阈值。这表明检测靶标与作为PCR反应的模板存在的初始值成反比出现，因此当循环阈值的值较小时，要检测的靶标的存在更能定量。
步骤c：将步骤b中测量的mRNA表达水平归一化；
取决于患者或样品，本发明中待检测基因的表达水平在总基因的表达量或者表达水平方面可能不同，因此需要归一化。归一化是通过基因表达量或表达水平的差异来实现的，所述差异可以指示基础表达量或表达水平的差异。优选地，它计算CTBP1(C-末端结合蛋白1)、CUL1(滞蛋白1)和UBQLN1(泛醌蛋白-1)中一至三个基因的平均表达量(或当选择多个基因时这些表达量的平均值)的比率。
步骤d：通过步骤c中归一化的所述至少一种增殖相关基因和所述免疫相关基因的组合预测乳腺癌患者的化疗有效性，其中当所述增殖相关基因过表达时预测化疗有效性为高以及当所述免疫相关基因过表达时预测化疗有效性为低。
在本发明中，术语‘化疗有效性高’是指化疗后癌症的转移、复发或转移性复发的概率低于未给予化疗时。换句话说，可以说因为化疗的效果大于副作用，所以优选进行化疗。
同时，上述‘化疗有效性低’意味着与未给予化疗时相比，接受化疗后转移、复发或转移性复发的概率没有显著改变或甚至预后更差。换句话说，可以说因为不能预期化疗的效果并且存在副作用，所以优选不进行化疗。
优选地，‘化疗有效性高’意味着10年内癌症转移、复发或转移性复发的概率比未给予化疗时低，而‘化疗有效性低’意味着10年内转移、复发或转移性复发的概率与未给予化疗时相比不变或甚至更为增加。
术语‘10年’是指从原发性乳腺癌患者通过手术切除癌症的时间点(即手术的起始点)起10年。
在本发明中，所述增殖相关基因的过表达与乳腺癌患者的不良预后和化疗有效性高密切相关。上述免疫相关基因的过表达与乳腺癌患者的良好预后和化疗有效性低密切相关。因此，通过结合所述增殖相关基因和所述免疫相关基因的表达模式，可以更准确地预测化疗有效性。
也就是说，本发明的基因组合可用于选择在原发性乳腺癌手术后不需要额外化疗的患者。本发明中所述基因组合的目标患者群优选是即使在手术前后也未经历任何化疗的患者群，并且据说是想要决定是接受化疗会有益还是不接受化疗会有益于将来疾病进展的患者群。
在本发明中，化疗有效性低的患者是那些预测没有乳腺癌患者的差预后(即，预计将来有“良好预后”)并且因为10年内转移、复发或转移性复发的概率低所以手术后不需要额外化疗的患者。然而，化疗有效性高的患者是那些预测具有乳腺癌患者的差预后(即，预计将来有“不良预后”)并且因为10年内转移、复发或转移性复发的概率高所以手术后需要额外化疗的患者。换句话说，预测没有乳腺癌不良预后的患者，因为化疗引起的副作用大于治疗效果，可以确定未来不用化疗对乳腺癌进展更有利。然而，预测乳腺癌预后差的患者，因为治疗效果大于化疗引起的副作用，可以确定未来用化疗对乳腺癌进展更有利。
此外，本发明在步骤b后还包括评估肿瘤的大小和pN分期的步骤。在步骤d中，本发明提供了一种预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，其特征在于，如果肿瘤的大小较大且pN分期较高，则确定化疗有效性高。
换句话说，通过组合所述增殖相关基因的表达、所述免疫相关基因的表达、肿瘤的大小和pN分期，可以更准确地预测化疗有效性，并且通过这样的组合来预测乳腺癌患者的乳腺癌化疗有效性的方法在过去尚未见报道。
在本发明中，肿瘤的大小是指癌症的长轴的长度，优选是由病理学者测量的癌症长轴的长度。肿瘤的大小以厘米表示。
在本发明中，pN是指在对乳腺癌阶段进行分类的方法中通过病理分类来确定淋巴结转移的方法。所述病理分类的方法也称为术后组织病理分类。它是通过在乳腺癌患者中收集来自手术或病理检查的信息加之治疗开始之前获得的信息来区分病理阶段的方法。
PN是基于淋巴结转移程度的辨别方法。切除腋窝淋巴结来确定肿瘤是否转移。PN水平越高，发生肿瘤细胞向淋巴结的转移就越多。因此，因为乳腺癌的预后差，可以确定化疗的有效性高。
在本发明中，pN可以优选是pN0或pN1，但不限于此。pN0是指未观察到局部淋巴结转移的阶段。pN1是指在一至三个同侧腋窝淋巴结中发现微转移的阶段。
因此，通过根据上述方法确定肿瘤的大小和pN分期作为乳腺癌患者的预后预测指标和化疗有效性预测指标加之在步骤b中测量的基因的表达水平，可以更准确地预测乳腺癌患者的预后和化疗有效性。
本发明提供了一种预测乳腺癌患者的化疗有效性的方法，所述方法包括：
步骤a：从乳腺癌患者获得生物样品；
步骤b：从乳腺癌患者获得的生物样品中分别测量UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)、MKI67(增殖标志物Ki-67)和BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)的mRNA表达水平；
步骤c：将步骤b中测量的mRNA表达水平归一化；以及
步骤d：评估乳腺癌患者的肿瘤大小和pN分期；
步骤e：通过将步骤c中获得的归一化值以及步骤d中的肿瘤大小和pN分期代入下面的等式1和2来计算数值
[等式1]
未换算的BCT评分(U-BS)＝a*△Ct_UBE2C+b*△Ct_TOP2A+c*△Ct_RRM2+d*△Ct_FOXM1+e*△Ct_MKI67+f*△Ct_BTN3A2+g*肿瘤_大小(cm)+h*pN(0或1)
[等式2]
如果0.8*未换算的BCT评分(U-BS)-13.71<0，则BCT评分＝0
如果0≤0.8*U-BS-13.71≤10，则BCT评分＝0.8*U-BS-13.71
如果0.8*U-BS-13.71>10，则BCT评分＝10
(其中用于预测化疗有效性的基因的值是使用标准基因计算的归一化mRNA表达值；肿瘤大小是按肿瘤的长轴长度确定的值，并且pN是根据淋巴结转移的病理判断确定的值，
其中a是0.16至1.09，b是0至0.71，c是0至0.53，d是0至0.57，e是0至0.35，f是-1.02至0，g是0.25至1.52，和h是0.19至2.25)；以及
步骤f：预测在步骤e中计算的值越大，化疗的有效性越大。
步骤a至步骤d与上述相同。
步骤e：通过将步骤c中获得的归一化值以及步骤d中的肿瘤大小和pN分期代入下面的等式1来计算数值
[等式1]
未换算的BCT评分(U-BS)＝a*△Ct_UBE2C+b*△Ct_TOP2A+c*△Ct_RRM2+d*△Ct_FOXM1+e*△Ct_MKI67+f*△Ct_BTN3A2+g*肿瘤_大小(cm)+h*pN(0或1)
(其中用于预测化疗有效性的基因的值是使用标准基因计算的归一化mRNA表达值；肿瘤大小是按肿瘤的长轴长度确定的值，并且pN是根据淋巴结转移的病理判断确定的值，
其中a是0.16至1.09，b是0至0.71，c是0至0.53，d是0至0.57，e是0至0.35，f是-1.02至0，g是0.25至1.52，和h是0.19至2.25)
通过所述基因和对应于每个肿瘤大小和pN的系数的线性组合来计算预测预后的评分。所述增殖基因、肿瘤大小和pN具有正系数，所述免疫基因具有负系数。每个系数在作为生存分析的结果的计算系数值(点估计)的95％置信区间内应用，并优选使用每个系数的点估计值。
系数 点估计值 95％置信区间
a(UBE2C) 0.63 0.16～1.09
b(top2A) 0.32 0.00～0.71
c(RRM2) 0.13 0.00～0.53
d(FOXM1) 0.02 0.00～0.57
e(MKI67) 0.04 0.00～0.35
f(BTN3A2) -0.42 -1.02～0.00
g(肿瘤大小) 0.89 0.25～1.52
h(pN) 1.22 0.19～2.25
优选地，本发明的用于预测乳腺癌患者化疗有效性的方法涉及管控乳腺癌患者的临床结局的两个主要生物学特征，即免疫应答和细胞增殖。筛选在FFPE组织样本中稳定表达并根据预后显示出大的差异表达的基因。通过Cox分析计算所述基因和两个重要的预后临床信息(肿瘤大小和pN分期)的系数，并且可以通过根据以下等式1乘以归一化基因的表达值、肿瘤大小和pN分期而得到BCT评分以预测化疗有效性。
[等式1]
未换算的BCT评分＝0.63*△Ct_UBE2C+0.32*△Ct_TOP2A+0.13*△Ct_RRM2+0.02*△Ct_FOXM1+0.04*△Ct_MKI67-0.42*△Ct_BTN3A2+0.89*肿瘤_大小(cm)+1.22*pN(0或1)
预后因素(基因，临床信息)影响生存率的程度可以通过Cox比例风险分析显示为定量值。Cox比例风险模型通过相对风险比(HR)表示预后因素影响生存率的程度，HR是不存在和存在预后因素时风险的比例。如果相对风险比(HR)的值大于1，则预后因素存在时的风险高于不存在时的风险。如果预后因子小于1，则预后因素存在时风险进一步降低。将各预后因素的相对风险比转换为对数标度称为各因素的系数，该值用作用于计算BCT评分模型的系数(Cox，David R.“回归模型和生命表(Regression models and life-tables)”J.Ournal of the Royal Statistical Society.Series B(Methodological)(1972)：187-220)。所述基因的系数通过交叉验证验证了等式结果的有效性。
在以上等式中，将通过归一化各基因的表达水平获得的值代入各‘ΔCt_预后预测基因’中。归一化是通过基因表达量或表达水平差异来实现的，所述差异可以指示基础表达量或表达水平的差异。优选地，它计算CTBP1(C-末端结合蛋白1)、CUL1(滞蛋白1)和UBQLN1(泛醌蛋白-1)中一至三个基因的平均表达量(或当选择多个基因时这些表达量的平均值)的比率。
具体地，“△Ct-预后预测基因”的值是通过从包括CTBP1(C-末端结合蛋白1)、CUL1(滞蛋白1)和UBQLN1(泛醌蛋白-1)的标准基因的平均表达值中减去各预后基因的表达值后加上30而获得的值。该值成为各预后预测基因的归一化值。也就是说，各预后预测基因的归一化值通过以下等式计算：
[△Ct_预后预测基因＝((Ct_CTBP1+Ct_CUL1+Ct_UBQLN1)/3)-Ct_预后预测基因+30]
(上述“预后预测基因”是指UBE2C(泛素缀合酶E2C)、TOP2A(拓扑异构酶2α)、RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)、FOXM1(叉头框M1)、MKI67(增殖标志物Ki-67)和BTN3A2(嗜乳脂蛋白亚家族3成员A2)之中的任何一种。
“Ct”是指当扩增一定量的PCR扩增产物时的循环数。在使用实时RT-PCR方法中，当扩增循环数是1到10时，由于荧光强度的变化大致等于噪声水平，其等于0，这样的荧光强度被认为是扩增产物样品的空白0。通过计算其标准偏差SD并乘以10获得的荧光值被确定为阈值，并且首次超过阈值的PCR循环数被认为是Ct(循环阈值)值。因此，当扩增产物大时，Ct值变成小值，而当扩增产物小时，Ct值变成大值。
在本发明中，使用标准基因将各个预后基因的表达值归一化，并且使用三个标准基因的平均Ct值来最小化在测试中可能发生的技术误差。
在本发明中，为了将[等式1]的计算值表示为直观数值，将计算值通过如[等式2]所示的线性变换转换为0和10之间的值。
[等式2](BCT评分计算式)
如果0.8*未换算的BCT评分(U-BS)-13.71<0，则BCT评分＝0
如果0≤0.8*U-BS-13.71≤10，则BCT评分＝0.8*U-BS-13.71
如果0.8*U-BS-13.71>10，则BCT评分＝10
步骤f：预测在步骤e中计算的数值越大，化疗的有效性越大。
根据本发明的一个例子，在本发明的估计乳腺癌患者的化疗有效性的方法中，计算作为用于评估风险人群分类准确性的参数的灵敏度和特异性之和最大化时的点。结果，我们确定当根据上述等式1计算的数值超过22.1时，化疗的有效性高(转移风险高)，而当值为22.1或更低时，化疗的有效性(转移风险低)低。
同时，在通过等式1(未换算的BCT评分)的线性变换获得的等式2(BCT评分)的情况下，我们确定如果值为4或更大，则化疗的有效性高(转移高风险人群)而如果值小于4，则化疗的有效性低(转移风险低)。
在本发明中，“灵敏度”是指在10年内转移的患者的测试结果中高风险患者的百分比，以及‘特异性’是指在10年未转移的患者的测试结果中低风险患者的百分比。
根据本发明的一个实施方式，本发明人使用Cox比例风险模型进行分析以确定BCT评分、以及BCT评分中使用的基因和临床信息(即癌症大小和pN分期)的统计显著性。结果，确认了本发明的BCT评分比用作一般预后指标的临床信息以及基于临床信息的预后评估模型例如NPI评分、PREDCIT和SNAP更为显著。
根据本发明的另一个例子，比较了BCT评分的和基于相同患者群的临床信息的其它模型的c-指数。结果，BCT评分显示出最高的c-指数值，并且确认其显示出比其它模型更高的乳腺癌预后预测。
因此，本发明的算法可用于筛选在原发性乳腺癌手术后不需要额外化疗的患者。本发明的本算法的目标人群优选是在手术前后未经历任何化疗的患者群，并且“预后良好”的患者在手术后10年内转移、复发或转移性复发的概率低(化疗有效性低)，但“预后差”的患者在10年内更可能发生转移、复发或转移性复发，并可以建议在手术后进行额外的化疗(化疗的有效性高)。
也就是说，根据本发明的上述等式1或等式1和2预测乳腺癌患者化疗有效性的算法通过从范围广泛的临床样品中分析与乳腺癌预后密切相关的增殖相关基因、免疫相关基因和临床信息(肿瘤大小和pN分期)而获得。预后的预测高于其它模型，例如基于临床信息的常规预后评估模型，并且预测化疗有效性也非常准确。
本发明还提供了用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
根据本发明另一个方面的一个实施方式提供了用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
根据本发明又一个方面的一个实施方式提供了用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的组合物，所述组合物基本上由分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂组成。
本发明还提供了一种组合物，其还包含分别用于测量CTBP1、CUL1和UBQLN1基因的表达水平的试剂。
在本发明中，用于测量所述基因表达水平的试剂可以是与UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67、BTN3A2、CTBP1、CUL1和UBQLN1基因特异性结合的一组引物对。
用于本文中时，术语“引物”是指寡核苷酸，其在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件下作为合成的起始点，所述条件是存在聚合酶例如核苷酸和DNA聚合酶、以及合适的温度和pH。优选地，所述引物是脱氧核糖核苷酸和单链。本发明中使用的引物可包含天然存在的dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、修饰的核苷酸或非天然核苷酸。引物也可包括核糖核苷酸。
本发明的引物可以是延伸引物，其退火到靶核酸并通过模板依赖性核酸聚合酶形成与靶核酸互补的序列。它延伸到固定化探针退火的位置并占据它退火的区域。
本发明使用的延伸引物包含与靶核酸的第一位置互补的杂交核苷酸序列。术语“互补”是指引物或探针充分互补以在某些退火或杂交条件下选择性地与靶核酸序列杂交，并且是基本互补和完全互补，并优选意指完全互补。用于本文中时，关于引物序列使用的术语“基本互补序列”意味着不仅包括完全匹配的序列，而且还包括在可退火到特定序列并充当引物的范围内与待比较的序列部分不一致的序列。
引物应足够长以在聚合酶存在下引发延伸产物的合成。引物的合适长度由许多因素例如温度、应用和引物来源决定，但通常为15-30个核苷酸。短引物分子一般需要较低的温度就能与模板形成足够稳定的杂交复合物。术语“退火”或“引发”是指寡脱氧核苷酸或己烷与模板核酸并置(apposition)，并且所述并置允许聚合酶使核苷酸聚合以在模板核酸或其部分中形成互补核酸分子。
引物的序列不需要具有与模板的部分序列完全互补的序列，并且如果引物具有在与模板杂交并且可以执行引物特异性作用的范围内的充分互补性就足够了。因此，本发明的引物不需要具有与作为模板的核苷酸序列完全互补的序列，并且如果引物具有在能够与基因序列杂交并充当引物的范围内的充分互补性就足够了。本领域技术人员参考上述核苷酸序列，例如，通过使用引物设计程序(例如，PRIMER 3程序)，可以容易地进行这样的引物的设计。
优选地，本发明中的引物对特征在于由序列号1至序列号18中所示的序列构成。用于测量本发明中基因表达水平的所选基因的引物和探针序列示于下表3中。
[表3]
用于预测乳腺癌预后的基因引物和探针序列
Figure BDA0004160267920000191
本发明提供了一种用于预测乳腺癌患者的化疗有效性的试剂盒，所述试剂盒包含分别用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂。
本发明还提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒还包含分别用于测量CTBP1、CUL1和UBQLN1基因的表达水平的试剂。
除了能够通过PCR扩增UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67、BTN3A2、CTBP1、CUL1和UBQLN1基因的一组引物对之外，本发明的试剂盒还可以在PCR反应试剂中包含本领域已知的用于RNA分离和cDNA合成的工具和/或试剂。如果需要，本发明的试剂盒还可以包含用于混合各个组分的试管、孔板，以及描述使用方法的说明材料。
另外，本发明提供了用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因表达水平的试剂在制备预测乳腺癌患者化疗有效性的试剂中的应用。
本发明还提供了试剂的应用，其中用于测量表达水平的试剂还包含分别用于测量CTBP1、CUL1和UBQLN1基因的表达水平的试剂。
本发明的“用于测量基因表达水平的试剂”与上述相同，“用于制备预测化疗有效性的试剂的基因”与上述相同，并且是选自由UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67、BTN3A2、CTBP1、CUL1和UBQLN1组成的组中的一种或多种。
本发明的术语“包含”与“含有”或“表征的”同义使用，并且不排除在组成或方法中未提及的其它组分元素或方法步骤。术语“由...组成”意味着排除未另外提及的其它元素、步骤或组分。术语“基本上由......组成”是指包含在组成或方法的范围内描述的并且基本上不影响其根本的组分元素或步骤。
有益效果
本发明涉及显示出与乳腺癌的预后显著相关的基因群，以及使用临床信息预测乳腺癌患者化疗有效性的方法。因此，本发明的方法可以准确地预测乳腺癌患者的化疗有效性，并且可以用于提供关于未来乳腺癌治疗方向的线索的目的。
附图说明
图1显示了算法测试组中未换算的BCT评分的分布。
图2显示了算法计算测试组和验证测试组中BCT评分的分布。
图3是显示根据BCT评分分类的高风险人群(化疗有效性高的人群)和低风险人群(化疗有效性低的人群)中10年无远处转移生存的图。
图4是显示通过C-指数评估乳腺癌预后预测模型的预测性能的结果的图。
图5是显示在通过本发明的算法将患者分类为低风险人群和高风险人群之后，计算有或没有化疗治疗的患者中10年无远处转移概率的结果的图。
图6是显示在通过本发明的算法分类为低风险人群的患者之中，基于临床信息分类为低风险的患者在10年内无远处转移生存概率的差异的确认结果图。
具体实施方式
以下，将详细地描述本发明。
然而，以下实施例是对本发明的说明，并且本发明不限于以下实施例。
<实施例1>
早期乳腺癌组织表达谱的收集
NCBI的Gene Expression Omnibus(GEO，www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是一个数据库站点，在此研究人员汇集了有关基因表达和突变的大规模实验数据，例如微阵列。该站点上的数据可以自由地重新分析，并且导出此预后基因的过程也使用了来自该站点的数据。
本研究中使用的微阵列数据限于使用了被称为‘Affymetrix人类基因组U133A阵列(Affymetrix Human Genome U133A Array)’的微阵列芯片的数据。所述芯片上有大约22,000个探针，每个探针都是单个基因。通过芯片分析可以测量人体中大多数基因的mRNA表达程度。
在NCBI GEO站点，我们调查了作为淋巴结阴性患者且手术后没有用任何化疗进行治疗的患者的微阵列数据集。结果，获得来自以下三个数据集的684个样本数据。样本数据集的信息显示在下面的表4和表5中。
[表4]
样本数据集
Figure BDA0004160267920000221
[表5]
临床样品的病理信息
Figure BDA0004160267920000231
<实施例2>
根据无远处转移生存(DMFS)的分布，超过10年无远处转移性复发的患者被分类为‘预后良好组’，5年内远处转移性复发的患者被分类为‘预后不良组’。作为根据这些分类标准对样品组进行分类的结果，分类为预后良好组212例，预后不良组159例。平均DMFS在预后良好组中为13年，在预后不良组中为2.2年。
<实施例3>
预测预后的基因的选择
我们通过对212个具有良好预后的样品和159个差预后的样品进行SAM(微阵列显著性分析)分析，调查了在预后组之间表达水平不同的基因。使用SAM分析结果的q值，我们选择了良好预后组中的过表达基因和差预后组中过表达的基因。将所选基因组合成一个集。结果，产生了总共302个无冗余的基因集，并通过主成分分析(PCA)进行聚类分析以确定这些基因的表达模式。对每个聚类进行基因本体(Gene Ontology)(GO)功能分析，以选择两个主要成分并探索每个主要成分的相关生物学功能。
GO分析结果显示，主要成分1在增殖中集中，主要成分2在免疫应答中集中。在属于参与增殖和免疫应答的两种主要成分的基因中，选择在预后组之间具有最高表达水平的基因。对于每个基因集，将基因命名为p基因表示增殖的表达模式，i基因表示免疫应答的表达模式。
在分类为p基因或i基因的基因群中，选择满足以下条件的基因作为基因预后诊断模型的候选基因：
(i)与免疫力或免疫应答高度相关。
(ii)样本之间的表达差异大。
(iii)平均表达值高。
(iv)在qRT-PCR结果中FFPE和冷冻样本之间的表达高度相关。
根据上述标准选择的基因群如下。
(1)10种增殖相关群(p基因)：AURKA，CCNB2，FOXM1，MKI67，MMP11，PTTG1，RACGAP1，RRM2，TOP2A，和UBE2C
(2)六种免疫应答相关基因(i基因)：BTN3A2，CCL19，CD2，CD52，HLA.DPA1，和TRBC1
<实施例4>
用于实施预测乳腺癌预后的算法的变量选择
<4-1>获得用于算法实施的样品
我们在Samsung医院和Asan医院获得了174例未接受化疗的乳腺癌患者样品，用它们实施该算法，并使用227个样品用于算法验证。
获得的患者样品的临床信息显示在下表6中。
[表6]
Samsung和Asan医院的临床样本的临床信息
Figure BDA0004160267920000261
<4-2>选择用于预后预测的基因
从FFPE样本中提取先前选择的16个基因的RNA，并进行qRT-PCR以计算它们的表达值。
可以使用Cox比例风险模型验证由于每个基因的表达增加而导致的远处转移风险的变化。风险比(HR)定义为在Cox比例风险模型中在特定时间间隔内根据风险因素(基因)的存在与否事件(远处转移)发生风险的比率。如果该风险大于1，则该风险因素将增加事件的风险，但如果小于1则意味着风险将降低。
分类为p基因的增殖相关基因的风险值为1或更高，并且如果表达值越大，则预后越差。然而，分类为i基因的风险值小于1，并且证实表达值越大，预后的结果越好。
在所观察的基因中预测预后的重要性高于其它基因，并选择与其它研究和预后的方向一致的基因作为最终算法中使用的基因。
选择的基因是五个增殖相关基因(UBE2C，TOP2A，MKI67，RRM2，和FOXM1)和一个免疫应答相关基因(BTN3A2)。从现有论文中选择三个另外的适用于FFPE组织的标准基因(CTBP1，CUL1，和UBQLN1)，并将它们的表达值用于分析(“使用多平台表达数据鉴定新的参考基因以及它们用于定量基因表达分析的验证(Identification of novel referencegenes using multiplatform expression data and their validation forquantitative gene expression analysis).”PLoS One 4(7)：e6162.2009)。
<4-3>选择算法中的临床应用程度
使用单变量Cox比例风险模型，我们鉴定了在未用化疗治疗的乳腺癌患者中与转移性复发相关的重要临床因素(p值<0.05)。
结果示于下表7中。
如下表7所示，发现pN、病理学分期、肿瘤大小和NPI评分是远处转移的显著因素。
[表7]
通过单变量Cox比例风险模型得到的远处转移的显著临床信息
Figure BDA0004160267920000281
在这些之中，肿瘤大小在未化疗的乳腺癌患者中是远处转移性复发的重要因素，但在接受化疗的乳腺癌患者中则不是。
PN在没有化疗和化疗的患者组中均显著，但在没有化疗的患者中的风险比值比受过化学治疗的患者大7倍。换句话说，发现pN在未接受化疗的患者中是比接受化疗的患者更显著的远处转移性复发指标。
病理学分期也是一个显著因素，但它是一个包括肿瘤大小和pN的概念。因为NPI评分是基于癌症的大小和淋巴结转移的程度来计算的，所以该指标也与癌症的大小和有关pN的信息重叠。最后，我们在未用化疗治疗的患者的预后预测模型中选择肿瘤大小和pN信息用于临床信息。
<实施例5>
基于Cox比例风险模型的BCT评分等式的推导
<5-1>等式的推导
增殖相关基因的p基因群(UBE2C，TOP2A，RRM2，FOXM1，和MKI67)随着表达水平的增加显示出预后差，而免疫相关基因的i基因(BTN3A2)随着表达水平增加显示出预后良好。这些基因通过Cox比例风险分析如下计算。
[未换算的BCT评分的等式]
未换算的BCT评分(U-BS)＝0.63*△Ct_UBE2C+0.32*△Ct_TOP2A+0.13*△Ct_RRM2+0.02*△Ct_FOXM1+0.04*△Ct_MKI67-0.42*△Ct_BTN3A2+0.89*肿瘤_大小(cm)+1.22*pN(0或1)
未换算的BCT评分(U-BS)根据以上等式计算，并确认分布。结果在图1中显示。
BCT评分的截止值将患者归类为10年内发生远处转移性复发的低风险或高风险。风险人群分类准确性的评估变量是灵敏度和特异性。在本发明的算法中，灵敏度和特异性定义如下。
*灵敏度：10年内有远处转移性复发的高风险患者的百分比。
*特异性：10年内没有远处转移性复发的低风险患者的百分比。
灵敏度和特异性的值越大，分类越好。然而，增加灵敏度会降低特异性，而增加特异性会降低灵敏度。在本发明的算法中，通过计算风险人群分类的截止点来计算BCT评分分类点，使得考虑灵敏度和特异性双方，灵敏度和特异性之和最大化。
如图2所示，根据上述标准，灵敏度和特异性之和达到最大值的点是22.13767，其被指定为区分高风险人群和低风险人群的阈值。换句话说，如果BCT评分(BS)为22.13767或更高，则可将其分类为远处转移的高风险人群。
<5-2>换算的等式的推导
为了更直观地表达实施例<5-1>的等式，通过线性变换将其转换为BCT评分。等式如下。
[BCT评分(BS)的等式]
如果0.8*U-BS-13.71<0，则BCT评分＝0
如果0≤0.8*U-BS-13.71≤10，则BCT评分＝0.8*U-BS-13.71
如果0.8*U-BS-13.71>10，则BCT评分＝10
如果BCT评分的值小于0，则将其替换为0，如果它大于10，则将其转换为10。随着BCT评分增加，10年内癌症复发、转移或转移性复发的可能性增加。
根据以上等式计算BCT评分并确认分布。结果在图2中显示。如图3所示，BCT评分中将患者分类为远处转移高风险人群和低风险人群的阈值设置为4(灵敏度和特异性之和达到最大值的点)。如果BCT评分为4分或以上，则可分类为复发、转移或转移性复发的高风险人群，而低于4，可分类为低风险人群。
<实施例6>
预测预后的性能评估
<6-1>通过算法计算测试组和验证测试组进行性能评估
根据实施例5的等式分类的高风险人群意味着可能发生复发、转移或转移性复发的概率高于低风险人群。图3显示了通过算法计算测试组(发现集)和算法验证测试组(验证集)的生存分析估算远处转移复发概率的结果。
如图3所示，基于BCT评分的低风险人群10年内无远处转移生存率在算法计算测试组和算法验证测试组中分别为97.82％和96.47％。高风险人群10年内无远处转移生存率分别为61.07％和76.31％(p值<0.001，对数秩检验)，表明两个测试组10年内的无远处转移生存率均存在统计显著性差异。
<6-2>使用单变量和多变量Cox比例风险模型对BCT评分预测预后的统计显著性验证
为了验证BCT评分预测远处转移的统计显著性，我们使用Cox比例风险分析来确定它是否比临床信息和基于临床信息的预后评估模型更显著。
作为算法的计算测试组和验证测试组的多变量Cox比例风险分析的结果，BCT评分被证实与用作预后指标的一般临床信息相比，在预测远处转移方面是统计显著性指标(p值<0.05)。类似地，与基于临床信息的预后模型相比，BCT评分是统计显著性指标，并且可以通过多变量Cox比例风险分析来证实(p值<0.05)。
[表8]
临床信息和预后预测模型的多变量Cox比例风险分析
Figure BDA0004160267920000311
<6-3>使用C-指数评估BCT评分的预后预测性能
C-指数的值为0.5至1。当C指数接近0.5的值时，预后的预测可能性降低，而当其接近1时，预后的预测可能性增加。为了评估BCT评分的预后预测可能性，进行了基于临床信息的模型和C-指数比较评估。
在同一患者组中比较了BCT评分和其他基于临床信息的模型的c-指数。结果，BCT评分显示出最高的c-指数值。这意味着BCT评分比其它预测预后的模型具有更高的预后预测性能(图4)。
<实施例7>
化疗有效性的预测
使用上述实施例1至6中建立的算法来确认是否可以预测乳腺癌患者的化疗有效性。
在本实施例中使用了在Asan医院经历手术的346名患者。通过本发明的算法分析实施例4中接受化疗的样本和未接受化疗的样本。他们被分为高风险和低风险人群，并比较有或没有化疗治疗的患者的10年内无远处转移生存率。
患者的具体临床信息在表9中显示，无远处转移生存概率的结果示于图5。
[表9]
Figure BDA0004160267920000321
如图5所示，在根据本发明的算法分类的低风险人群中，未化疗患者组的概率为96.0％，而用化疗治疗的患者的概率为96.4％。因此，接受化疗的患者的无远处转移生存率增加了0.4％。可以得出结论，在低风险患者中化疗没有益处。另一方面，在根据本发明的算法分类的高风险人群中，用化疗治疗的患者的无远处转移生存的概率有91.9％，而未化疗患者组的概率有65.4％。因此，我们可以确认，接受化疗的患者预后更好是统计显著性的。此外，根据用化疗治疗或未治疗，确认在低风险人群中的生存概率没有显著差异，但高风险人群在无病生存概率和总生存概率上显示了显著的化疗效果。
对于在根据本发明算法的每个判别的风险人群的患者中可以影响无远处无转移生存的因素，基于Cox比例风险模型的单变量和多变量分析的结果显示在表10中。化疗治疗对低风险人群的无远处转移生存没有影响，在高风险人群中用化疗治疗或未治疗是影响患者无远处转移生存的因素。
[表10]
Figure BDA0004160267920000331
Figure BDA0004160267920000341
<实施例8>
化疗有效性的预测性比较
在本发明的低风险人群中化疗没有益处。当与作为基于临床信息的风险人群分类模型的Modified Adjuvant！Online相比，它得到了更明确的证实。Modified Adjuvant！Online基于患者的临床信息预测患者的风险程度，并将患者分类为高风险或低风险人群。根据本发明的算法，我们在被分类为低风险患者的266名患者之中比较了作为基于患者临床信息的模型的Modified Adjuvant！Online是否显示患者在10年内的不同无远处转移生存。
如图6所示，在根据本发明的算法分类为低风险人群的患者之中，基于临床信息分类为低风险人群的患者根据化疗在10年内无远处转移生存概率的差异为0.3％。证实了没有化疗有效性的患者通过化疗没有统计显著的无远处转移生存变化。类似地，在根据本发明算法分类为低风险人群的患者之中，基于临床信息分类为高风险人群的患者中患者在10年内的无远处转移生存率的差异为2.3％。证实了通过化疗的无远处转移生存方面没有统计显著变化。
因此，在根据本发明的算法确定为低风险人群的特定患者作为诊断患有乳腺癌的患者的情况下，可以预测通过化疗的远处无转移存活不会显著增加。在确定为高风险人群的特定患者的情况下，预测化疗治疗由于手术后10年内的无远处转移生存高，将有更好的预后。
工业适用性
本发明涉及与乳腺癌的预后显著相关的基因群，以及使用临床信息预测乳腺癌化疗有效性的方法。本发明的方法可以准确地预测乳腺癌患者的化疗有效性。因此，它可以用于提供未来乳腺癌治疗方向的信息的目的，并且在产业中高度有用。

Claims (7)

1.用于测量UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因的表达水平的试剂在制备用于预测早期乳腺癌患者的化疗有效性的试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒还包括分别用于测量CTBP1、CUL1和UBQLN1基因的表达水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中用于测量所述水平的所述试剂是分别与UBE2C、TOP2A、RRM2、FOXM1、MKI67和BTN3A2基因特异性结合的一组引物对。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述一组引物对由SEQ ID NO：1至12的序列组成。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述预测化疗有效性包括预测在化疗后是否会发生选自由复发、转移和转移性复发组成的组中的任一者或多者。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述乳腺癌是为雌激素受体阳性、孕激素受体阳性或雌激素受体和孕激素受体阳性的同时为HER2阴性的乳腺癌。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述乳腺癌是根据肿瘤淋巴结转移(TNM)系统分类为1期或2期的早期乳腺癌。
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