CN111118146B

CN111118146B - LncRNA在乳腺癌化疗相关心肌损伤患者诊断中的应用

Info

Publication number: CN111118146B
Application number: CN202010084421.2A
Authority: CN
Inventors: 王兆平; 王颖翠
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2020-02-10
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-02-10
Also published as: CN111118146A

Abstract

本发明提供了一种用于诊断乳腺癌化疗相关心肌损伤的长链非编码RNA基因标志物，所述长链非编码RNA为LINC01471。本发明利用芯片技术筛选发现，与化疗前乳腺癌患者相比，化疗后患有心肌损伤的患者血液中，LINC01471的表达显著升高，并且该结果在荧光定量PCR中得到了进一步的验证。本发明的有益效果在于，本发明提供了一种诊断乳腺癌化疗相关心肌损伤的分子标志物，通过检测该分子标志物可以在乳腺癌患者化疗早期判断患者是否出现心肌损伤，从而及早的采取相应的治疗措施，减少乳腺癌患者治疗过程中发生心肌损伤的可能性。同时，相较于生化类标志物，本发明所提供的lncRNA标志物具有灵敏度高、特异性强的特点。

Description

LncRNA在乳腺癌化疗相关心肌损伤患者诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种LncRNA在乳腺癌化疗相关心肌损伤患者诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的一种恶性肿瘤，乳腺癌在欧美发达国家以及中国上海等大城市的发病率已经成为女性恶性肿瘤的首位。目前，乳腺癌的综合治疗手段主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗以及免疫治疗等，这其中化疗占有重要的地位。尽管，随着乳腺癌治疗水平的不断提高，患者的生存期不断延长，但是，化疗治疗后，患者的并发症也不断的增加，由化疗所引起的心肌损伤就是其中一种。研究显示，心脑血管疾病已经成为绝经后早期乳腺癌患者的首要死亡原因。肿瘤治疗中潜在的心血管毒性及其所致心血管事件已经成为肿瘤幸存者常见的健康隐患。因此，发现一种检测速度快，检测效果好的乳腺癌化疗相关心肌损伤标志物具有重要的意义。

根据基因组学的研究，大约只有1%的基因可以转录成有蛋白编码功能的RNA，而大部分的基因则转录成无蛋白编码功能的RNA，即非编码RNA。长非编码RNA是一类长度大于200碱基的非编码RNA。长非编码RNA具有多种重要的细胞调控功能，能够参与到细胞发育和代谢等多种生命功能调控途径中，包括基因重组、基因印记、细胞周期调控、染色质修饰、转录、翻译、mRNA降解等。根据长非编码RNA与蛋白编码基因的位置关系，长非编码RNA被分为五类：正义长非编码RNA，反义长非编码RNA,双向长非编码RNA，内含子长非编码RNA，基因间长非编码RNA。长非编码RNA广泛存在于多种组织中，并且长非编码RNA的表达具有特异性和时空特异性。大量的研究表明，长非编码RNA与疾病的发病机制有关。现有的研究表明，长非编码RNA在疾病诊断和治疗领域具有巨大的研究前景。目前，LncRNA在人类疾病中的研究依然处于起步阶段，lncRNA在乳腺癌化疗相关心肌损伤中的机制还有待于进一步的研究和揭示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳腺癌化疗相关心肌损伤诊断用的基因标志物，用于快速准确的诊断乳腺癌化疗相关心肌损伤患者。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案

本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC01471,所述长链非编码RNA LINC01471的编码基因Gene ID：101927149，其转录本为NR_125397.1。

优选地，所述长链非编码RNA LINC01471的序列如SEQ ID NO.1所示。

此外，本发明提供了检测长链非编码RNA LINC01471表达的试剂在诊断乳腺癌化疗治疗相关心肌损伤中的应用。

优选地，所述试剂包括通过实时定量PCR、反转录PCR、原位杂交、芯片检测LINC01471表达水平的试剂。

此外，本发明提供了测定样本中LINC01471含量的产品在制备诊断乳腺癌化疗治疗相关心肌损伤工具中的应用。

优选地，所述产品包括PCR检测试剂盒。

优选地，所述PCR检测试剂盒包括LINC01471的特异性引物和探针。

优选地，所述LINC01471特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述PCR检测试剂盒还包括缓冲剂、助剂、溶剂。

除此之外，本发明提供了长链非编码RNA LINC01471在用于筛选乳腺癌化疗治疗相关心肌损伤候选药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种诊断乳腺癌化疗相关心肌损伤的分子标志物，通过检测该分子标志物能够在乳腺癌患者化疗治疗早期判断患者是否出现心肌损伤，从而及早的采取相应的治疗措施，减少乳腺癌患者治疗过程中发生心肌损伤的可能性。同时，相较于生化类标志物，本发明所提供的lncRNA标志物具有灵敏度高、特异性强的特点。

附图说明

图1利用芯片筛选出的乳腺癌化疗相关心肌损伤患者的差异表达基因LINC01471的表达情况。

A:化疗前乳腺癌患者血清 B:相应化疗后患有心肌损伤患者的血清

图2化疗后未患有心肌损伤患者化疗前后血清中LINC01471的表达情况。

C:化疗前乳腺癌患者血清 D:相应化疗后未患有心肌损伤患者的血清

图3 利用荧光定量PCR检测LINC01471在乳腺癌化疗相关心肌损伤患者中的表达情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的详细说明。需要说明的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1筛选乳腺癌化疗相关心肌损伤差异表达长链非编码RNA

1.研究对象

选取5例化疗后出现心肌损伤乳腺癌患者的血液（B组），以及相应乳腺癌患者未化疗前的血液（A组）（患者化疗前未患有心肌损伤），同时，选择5例化疗后未出现心肌损伤患者的血液（D组）以及相应乳腺癌患者未化疗前的血液（C组），本研究通过医院伦理委员会审查和批准，所有患者入组前均签署书面知情通知书。

2.RNA提取

（1）临床血清样本收集后置于离心机中，12000r/min 离心10min，重复2次，将所得血清样本置于-80℃冰箱中保存；

（2）将冻存的血清样本置于4℃冰箱中解冻；

（3）取250ul血清样本置于离心管中，加入750ul Trizol，吹打混匀后，室温静置5min

（4）加入250ul氯仿，震荡混匀后，室温放置15min；

（5）4℃ 12000rpm离心 15min；

（6）取上清（需要注意不能吸到中间层），转移至另一个离心管中，加入1.5ml预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置8分钟；

（7）4℃ 12000rpm离心10分钟，去除上清，留沉淀；

（8）加入1ml 75%乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；

（9）4℃ 8000rpm离心5分钟，使用移液器小心的去除上清；

（10）室温静置10分钟干燥RNA，之后使用50ulDEPC水溶解沉淀。

（11）使用Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定组织总RNA的纯度和浓度。

3.逆转录

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记A-D组。

4.LncRNA表达芯片分析

使用Arraystar公司的Arraystar Human 1ncRNA Array检测乳腺癌化疗相关心肌损伤患者血清和相应患者未化疗前的血清中LncRNA表达谱的差异，并使用利用AgilentGeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(Fold chang≥2.0，P值≤0 .05)的lncRNA。

5.实验结果

结果如图1所示，同未化疗前患者血清相比，患有乳腺癌化疗相关心肌损伤患者的血清中LINC01471基因的表达量显著提高（P值≤0 .05），而化疗后未患有心肌损伤的患者血清中LINC01471基因的表达量无显著变化（图2）。

实施例2 荧光定量PCR验证LINC01471基因的表达差异

1.样本选取

选取20例化疗后出现心肌损伤乳腺癌患者的血液（B组），以及相应乳腺癌患者未化疗前的血液（A组）（患者化疗前未患有心肌损伤），本研究通过医院伦理委员会审查和批准，所有患者入组前均签署书面知情通知书。

2.荧光定量PCR检测

（1）血清RNA的提取步骤同实施例1

（2）逆转录反应

去除基因组DNA

反应试剂

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0 μl
gDNA Eraser	1μl
		Total RNA	1μg
RNase Free dH2O	up to 10 μl

反应条件

42℃ 2分钟，4℃。

逆转录反应试剂

试剂	使用量
		步骤1的反应液	10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μl
		RT Primer Mix	1.0 μl
5×PrimeScript Buffer 2	4.0 μl
		RNase Free dH2O	4.0 μl
Total	20 μl

反应条件37℃ 15min；85℃ 5s；4℃。

（3）荧光定量PCR检测

反应试剂

试剂	使用量
		SYBR Green Premix Ex Taq（2×）	10μl
引物1	0.4μl
		引物2	0.4μl
cDNA模板	2μl
		无菌水	7.2μl
Total	20μl

反应条件

95℃ 30s；95℃ 10s，60℃ 20s 35个循环；95℃ 15s；60℃。

采用2^-△△Ct方法处理实时荧光定量PCR数据，计算LINC01471的表达变化。

（4）引物序列

LINC01471引物为

Forward 5’‐ GTGCTCCTCATCACACCACA‐3’（ SEQ ID NO.2）

Reverse 5’‐ CGTGCACCTTCTAAGCCTCA‐3’ （SEQ ID NO.3）

β-actin引物为

Forward 5’‐ CCCATCTATGAGGGTTACGC‐3’ （SEQ ID NO.4）

Reverse 5’‐ TTTAATGTCACGCACGATTTC‐3’（ SEQ ID NO.5）

（5）结果

荧光定量PCR的结果表明（图2），与未化疗前患者血清相比，患有乳腺癌化疗相关心肌损伤患者的血清中LINC01471基因的表达量显著提高,且差异具有统计学意义（P<0.05），说明LINC01471能够作为乳腺癌化疗相关心肌损伤的基因标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 山东大学齐鲁医院（青岛）

<120> LncRNA在乳腺癌化疗相关心肌损伤患者诊断中的应用

<130> 2020.2.10

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人源(PatentIn version 3.5)

<400> 1

ataatgcaga ggtgggggac agagtgggtg gggaggggag ccgccataca gtggccagga 60

ccagctttgc ccaagtggtg gcaaccgcat gaccacagga acgatggcgc caagccactg 120

gtgaatatgc tgcaaaaaat atgctggaac ttctatgaat accacagggt gtgagaagaa 180

aacattagaa cttctatttt gtacctgtgt tactccacaa caagaaagca atcagcttga 240

tcaatgccta ctgtaaagac ggcaccgccc tccggaggtc ctttctcagc cctggtgttc 300

ggacagccac atcccctcgc agcaggggga ggcctgaagc atagaggggc ccatgcaggt 360

ctattctgtt tcagcgaatt gcctgggaaa taatccagga tccatttcgt gtggtcatct 420

tgtctccctg gtcccctcca gcctttcctc atcttttgtg acctggtcac tctggaaggg 480

cgctggccag ttagtccaca ggatgggcct cccctggggc ttttctgatg cttccttatg 540

atggcactgg catcctgagg gggaggacca cagagaggag gtgctcctca tcacaccaca 600

tgggggtcca tgcaccagtg ccactgcttt ccagggctct tcaccttcat cactggtgga 660

ggtggcgtct gccaagaagc agaaagttga ggcttagaag gtgcacggcc ctacctcttc 720

cgaggtgccc ctgcgggctg tctacagacc aggcagcaca tgcctgatag cagctgcata 780

aggaaaagca ggagccagct cgtgcacagt gccctcaaca gaagccaagg ccaagtcctc 840

gaacttccta gtctgcacaa tgtctgtctt tcagacactt ctgatgaaac tgaaaatgcc 900

accagggaga agcagctgaa ataacacttg tgctgaggtc gctgagccac tgtggaagac 960

atccaagctc cataaagaca ggtcaagtgc acatgctcca gtcaacagcc cagctgagcc 1020

ctcagcatac agccaacacc aactgcaagc tgagggtgaa acaacttgga tgtccatttg 1080

gatgtcaagc tggacttcag atgcctgtgg ttgcagctct gtctgcaact acatggaaga 1140

cgccatgtga accacctagt agagcccttc ctagaattgt tggccctcag actctacatg 1200

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgctcctca tcacaccaca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgcacctt ctaagcctca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccatctatg agggttacgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttaatgtca cgcacgattt c 21

Claims

1.测定样本中LINC01471含量的产品在制备诊断乳腺癌化疗相关心肌损伤工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括LINC01471的特异性引物和探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LINC01471特异性引物序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括缓冲剂、助剂、溶剂。