WO2018097614A2 - 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법 - Google Patents

유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법 Download PDF

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문영호
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the usefulness of chemotherapy in breast cancer patients, and more particularly, to (a) Ubiquitin-conjugating enzyme E2C (UBE2C), Topoi soraerase 2 alpha (T0P2A), and RR from biological samples obtained from breast cancer patients.
  • UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme
  • T0P2A Topoi soraerase 2 alpha
  • the present invention relates to a method for predicting chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient including the larger and predicting that the immunorelevant gene is overexpressed.
  • Breast cancer is the most common cancer in women and the second most common cancer.
  • the prevalence of breast cancer at 20 years was 90-100 per 100,000 in the United States and 50-70 per 100,000 in Europe. The incidence of this disease is increasing worldwide.
  • Risk factors for breast cancer include race, age, mutations in the cancer suppressor genes BRCA-1, BRCA-2, and p53. Alcohol consumption, high fat diet, lack of exercise, exogenous postmenopausal hormones and ionizing radiation also increase the risk of developing breast cancer.
  • Estrogen receptor and progesterone receptor negative breast cancers ("ER-" and "PR-", respectively), large tumor size, high grade cell diagnostics, and poor prognosis if under 35 (Goldhirsch et al. (2001). J Cl in. Oncol 19: 3817-27).
  • the present inventors have made extensive efforts to develop an algorithm for predicting the prognosis of breast cancer patients using FFPE samples of patients and tissues containing cancer cells.
  • the present inventors have collected and analyzed genetic information and clinical information obtained from breast cancer tissues.
  • We developed a set of genes related to prognostic prediction developed an algorithm for predicting the prognosis of breast cancer patients by selecting and combining genes and sets thereof suitable for FFPE samples among the discovered genes.
  • the present inventors have found that the usefulness of chemotherapy can be predicted in breast cancer patients. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for predicting chemotherapy availability of a breast cancer patient comprising the following steps:
  • Ubiquitin-conjugating enzyme E2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C
  • T0P2A topo isomer ase 2 alpha
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml FOXMK Forkhead box Ml
  • MKI 67 Marker of prol i feration Ki
  • step (b) normalizing the expression level of mRNA measured in step (a);
  • step (c) predicting the chemotherapeutic utility of breast cancer patients by a combination of one or more proliferation-related genes and immune-related genes standardized in step (b), wherein the usefulness of chemotherapeutic treatment is large when the proliferation-related genes are overexpressed. And predicting that the usefulness of chemotherapy is small when the immune-related gene is overexpressed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting chemotherapy availability of a breast cancer patient, comprising the following steps:
  • UBE2C Ubiquit in-conjugating enzyme E2C
  • T0P2A Topoi somerase 2 alpha
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml FOXMK Forkhead box Ml
  • MKI67 Marker of prol i ferat from biological samples obtained from breast cancer patients ion Ki-67
  • BTN3A2 Butyrophil in subfami ly 3 member A2
  • Prognostic gene value is standardized mRNA expression calculated using standard gene, tumor size is length of tumor long axis, pN is value determined by pathological judgment of lymph node metastasis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients comprising an agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient composed of an agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient consisting essentially of an agent for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, VII 2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting chemotherapy usefulness in breast cancer patients comprising an agent for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene. It is still another object of the present invention to provide a use of an agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 genes to prepare agents for predicting chemotherapy availability in breast cancer patients.
  • the present invention provides a method for predicting chemotherapy availability of breast cancer patients comprising the following steps:
  • Ubiquit conjugating enzyme E2C Ubiquit conjugating enzyme E2C (UBE2C), Topoi somerase 2 alpha (T0P2A), ri bonuc 1 eot i de reductase M2, ROX2 (FOXMK Forkhead box Ml) and MKI67 from biological samples obtained from breast cancer patients Measuring mRNA expression levels of one or more proliferation related genes selected from the group consisting of (Marker of prol i ferat ion Ki-67) and immune related genes of BTN3A2 (Butyrophil in subfami ly 3 member A2);
  • step (b) normalizing the expression level of mRNA measured in step (a);
  • step (c) predicting chemotherapeutic utility of a breast cancer patient by a combination of one or more proliferation related genes and an immune related gene standardized in step (b), wherein Predicting that the usefulness of chemotherapy when the proliferation-related gene is overexpressed and that the usefulness of chemotherapy when the immune-related gene is overexpressed is small.
  • the present invention provides a method for predicting chemotherapy availability of breast cancer patients comprising the following steps:
  • UBE2C Ubiquit inconjugating enzyme E2C
  • T0P2A Topoi somerase 2 alpha
  • RRM2 r ibonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml MKI67 (Marker of prol) from biological samples obtained from breast cancer patients i ferat ion Ki-67) and BTN3A2 (Butyrophil in subfami ly 3 member A2) to measure the level of mRNA expression;
  • Prognostic gene value is standardized mRNA expression calculated using standard gene, tumor size is length of tumor long axis, pN is value determined by pathological judgment of lymph node metastasis.
  • the present invention provides a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient comprising an agent for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • the present invention provides a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients consisting of a formulation for measuring the expression level of the UBE2C, TOP2A, ⁇ 2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • the present invention provides a composition for predicting the chemotherapy availability of breast cancer patients consisting essentially of a formulation for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene. do.
  • the present invention provides a kit for predicting the chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient comprising an agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • the present invention provides the use of the agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene for the preparation of a formulation for predicting chemotherapy availability of breast cancer patients do.
  • the present invention provides a method for predicting chemotherapy utility of a breast cancer patient comprising the following steps:
  • a method of predicting chemotherapy usefulness in a breast cancer patient comprising the following steps:
  • UBE2C Ubiquit inconjugating enzyme E2C
  • T0P2A Topoi somerase 2 alpha
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml MKI67 from biological samples obtained from breast cancer patients measuring mRNA expression levels of one or more proliferation related genes selected from the group consisting of ferat ion Ki-67) and BTN3A2 (Butyrophil in subfami ly 3 member A2) immune related genes;
  • step (b) normalizing the expression level of mRNA measured in step (a);
  • step (c) predicting the chemotherapeutic utility of breast cancer patients by a combination of one or more proliferation-related genes and immune-related genes standardized in step (b), wherein the usefulness of chemotherapeutic treatment is large when the proliferation-related genes are overexpressed. And the immune tract Predicting that the usefulness of chemotherapy is small when the related gene is overexpressed.
  • "usefulness of chemotherapy” means that the effective therapeutic effect will be shown when the therapy for administering an anticancer agent such as a chemical to breast cancer patients.
  • the "effective therapeutic effect” is a concept including the cure, recurrence, metastasis or metastatic recurrence of cancer, and most preferably means whether metastatic recurrence, but is not limited thereto.
  • the "metastatic recurrence” in the present invention refers to local metastatic recurrences that have metastasized to the site of development of breast cancer and / or to the area of the ipsilateral breast and / or the contralateral breast and to distant such as lungs, liver, bones, lymph nodes, skin and brain. It is a concept including distant metastatic recurrence that occurs due to metastasis to the site.
  • the metastatic recurrence may be, but is not limited to, distant metastatic recurrence.
  • the term "metastatic recurrence" refers to a modified, i.e.
  • the distant site may be, for example, in one or more lymph nodes, which may be mobile or stationary, ipsilateral or opposite to the tumor, and may be on the clavicle or under the armpit.
  • Prediction of chemotherapy availability in breast cancer patients is mainly based on postoperative disease stage (StageKT ⁇ stage), which assesses tumor size (T), metastatic state to the periphery of lymph nodes (N), and distant metastasis to other organs (di stant metastasi sKM).
  • the usefulness of chemotherapy in breast cancer of the same stage may be determined by expression of estrogen or progesterone receptor (ER or PR) and overexpression of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) or amplification of genes. Even in the same stage of breast cancer, the condition and prognosis are significantly different depending on the expression of estrogen receptor, progesterone receptor, or HER2. Therefore, in recent years, genetic and molecular biological classification of breast cancer characteristics
  • Breast cancer in the present invention is preferably an estrogen receptor and / or progesterone receptor positive and HER2 negative breast cancer, and most preferably may be luminal type A breast cancer, but is not limited thereto.
  • the breast cancer is preferably early breast cancer, more preferably breast cancer corresponding to pNO or pNl phase, and most preferably may be breast cancer classified into stage 0 or stage 1 according to TOM stage, but is not limited thereto. no.
  • each step of the method for predicting chemotherapy availability of breast cancer patients in the present invention will be described in more detail.
  • the biological sample may be breast cancer tissue of a breast cancer patient.
  • the breast cancer tissue may also contain some normal cells, preferably a formal in-fixed paraff in-embedded (FFPE) sample of breast cancer tissue, including cancer cells, fresh tissue (fresh t issue) And into frozen tissue It may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • FFPE formal in-fixed paraff in-embedded
  • UBE2C Ubiqui tin-conjugating enzyme E2 C
  • TOP2A Topoisomerase 2 alpha
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml FOXMK Forkhead box Ml
  • MKI67 Marker of proliferation Ki-67
  • UBE2C Ubiqui tin-conjugating enzyme E2 C
  • TOP2A Topoisomerase 2 alpha
  • RRM2 ribonucleotide reductase M2
  • FOXMK Forkhead box Ml FOXMK Forkhead box Ml
  • MKI67 Marker of proliferation Ki-67
  • Each gene may be a sequence of each gene known in the art or a sequence of synonyms of each gene, preferably a sequence of each gene derived from a human, more preferably UBE2C (Gene ID: 11065), T0P2A (Gene ID: 7153), ⁇ (Gene ID: 6241), FOXMl (Gene ID: 2305), MKI67 (Gene ID: 4288), BTN3A2 (Gene ID: 11118), but are not limited thereto. no. Synonyms and sequences for each gene can be retrieved from GenBank.
  • the method for measuring the mRNA expression level in the present invention can be used in the art any method performed to measure the expression level of the gene, preferably microarray, PCR (polymerase chain reaction), RT-PCR, It may be selected from the group consisting of quantitative RT_PCR (qRT_PCR), real-time PCR, northern blot, DNA chip and RNA chip, but is not limited thereto.
  • the measurement of the expression level of the gene of interest of the present invention is preferably the detection of the amount of expression of the gene of interest, more preferably the quantitative detection of the expression of the gene of interest. MRNA isolation in sample tissue and cDNA synthesis in mRNA for detection of expression level This may be necessary.
  • RNA separation method for the separation of mR A may be used an RNA separation method in a sample known in the art, preferably the sample is an FFPE sample, so may be a method for separating mRNA suitable for FFPE samples.
  • cDNA synthesis process can be used a cDNA synthesis method known in the art consisting of mRNA as a template.
  • the expression level of the chemotherapy usefulness predictor marker of the breast cancer patient of the present invention is a quantitative detection of mRNA expression in FFPE samples, and thus the mRNA separation method and real-time RT-qPCR (real-time reverse transcript ion quant i tat) for FFPE samples. It can be measured by ive polymerase chain react ion method.
  • the measurement of the expression level of the gene of interest in the present invention can be carried out according to a method known in the art, but by an optical quantitative analysis system using a probe labeled with a reporter fluorescent dye and / or quencher fluorescent dye Can be measured.
  • the measurements can be made by commercially available equipment, such as the ABIPRISM 7700 TM Sequence Detect ion System TM, Roche Molecular Biochemical Light Cycler and accompanying software.
  • Such measurement data can be expressed as measured value or threshold cycle (Ct or Cp).
  • the point at which the measured fluorescence value is recorded as statistically significant for the first time is the threshold cycle, which is quantitative when the threshold cycle value is small since it appears inversely proportional to the initial value present as a template of the PCR reaction. Indicates that more detection objects exist.
  • step (c) normalizing the expression level of mRNA measured in step (b);
  • the expression level of the gene to be detected in the present invention may vary in overall gene expression amount or expression level depending on the target patient or sample. Standardization is achieved by the difference between the expression level or expression level of a gene that may indicate a difference in basal expression level or expression level, preferably CTBP1 (C-terminal—binding protein 1), CUL1 (cul l 1). And UBQLNKUb ui Hn-1), by measuring the expression amount of one to three genes (or the average of these expression amounts when a plurality of genes are selected) and calculating the ratio thereof.
  • CTBP1 C-terminal—binding protein 1
  • CUL1 cul l 1
  • UBQLNKUb ui Hn-1 ui Hn-1
  • step (d) predicting the chemotherapeutic utility of breast cancer patients by a combination of one or more proliferation-related genes and immune-related genes standardized in step (c), wherein the usefulness of chemotherapeutic treatment is large when the proliferation-related genes are overexpressed. And the immune tract Predicting the prognosis of breast cancer as the usefulness of chemotherapy is low when the related gene is overexpressed;
  • the usefulness of chemotherapy means that the probability of cancer metastasis, recurrence or metastatic recurrence after chemotherapy is lowered compared to when chemotherapy is not received. That is, since the effect is greater than the side effects of chemotherapy, it can be said that it is more preferable to proceed with chemotherapy.
  • the "usefulness of chemotherapy” is compared to when not receiving chemotherapy. Metastasis, recurrence or metastatic recurrence after chemotherapy. This means that there is no significant change in probability or rather a worse prognosis. In other words, the effect of chemotherapy is not expected and there are side effects, so it can be said that it is more preferable not to proceed with chemotherapy.
  • the greater the usefulness of chemotherapy means that the probability of cancer metastasis, recurrence, or metastatic recurrence is lower within 10 years than when not receiving chemotherapy, and “less usefulness of chemotherapy”. "No change in the probability of metastasis, recurrence or metastatic recurrence within 10 years, or even higher, than when not receiving chemotherapy.
  • the term “10 years” means 10 years from the time point at which the cancer was removed by surgery of a patient with primary breast cancer (ie, the point of surgery).
  • the overexpression of the proliferation-related genes is closely correlated with the poor prognosis and the usefulness of chemotherapy in breast cancer patients
  • the overexpression of the immune-related genes is closely related to the good prognosis and low usefulness of chemotherapy in breast cancer patients.
  • the gene combination of the present invention can be used to screen patients who do not need additional chemotherapy after surgery for primary breast cancer.
  • the patient group of the gene combination of the present invention is preferably a group of patients who have not received any chemical treatment before and after surgery, and a group of patients who want to decide whether or not to receive chemical treatment in the future.
  • the group of patients with low usefulness of chemotherapy is a group of patients whose breast cancer prognosis is not expected to be poor (ie, a group of patients expected to exhibit a "good prognosis” in the future). Because of the low incidence, additional chemotherapy is not required after surgery, but the chemotherapy group is more likely to have a poor prognosis for breast cancer (ie, a “bad prognosis” in the future).
  • the size of the tumor refers to the length of the long axis of the cancer, and preferably the length of the long axis of the cancer measured by a pathologist, The size of the tumor is expressed in centimeters.
  • pN is a pathological classi f icat ion, which is a method of classifying breast cancer.
  • pN is a classification method based on the degree of metastasis to lymph nodes among pathological classification methods. The higher the pN stage, the more tumor cell metastasis to the lymph nodes, and the poorer the prognosis of breast cancer.
  • the pN step may be preferably a pNO step or a pNl step, but is not limited thereto.
  • the pNO stage refers to the stage at which no metastasis to local lymph nodes is observed
  • the pNl stage refers to the stage where one to three ipsilateral axillary lymph node microtransitions are found. That is, according to the method, the tumor size and the pN stage together with the expression level of the genes measured in step (b) are judged as prognostic predictors or predictors of chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients. The usefulness of chemotherapy can be predicted.
  • the present invention provides a method for predicting chemotherapy availability in a breast cancer patient comprising the following steps:
  • Unsealed BCT score (U-BS) a * ⁇ Ct_UBE2C + b * ⁇ Ct_T0P2A + c * ACt_RRM2 + d * ⁇ Ct_F0XMl + e * ⁇ Ct_MKI67 + f * ⁇ Ct_BTN3A2 + g * Tumor_size (cm) + h * pN (0 or 1)
  • Prognostic gene value is standardized mRNA expression calculated using standard gene, tumor size is length of tumor long axis, pN is value determined by pathological judgment of lymph node metastasis.
  • A is 0.16 to 1.09, b is 0 to 0.71, c is 0 to 0.53, d is 0 to 0.57, e is 0 to 0.35, f is -1.02 to 0, g is 0.25 to 1.52 and h is 0.19 to 2.25);
  • step (f) predicting that the greater the value calculated in step (e), the greater the usefulness of chemotherapy.
  • Unsealed BCT score (U-BS) a * ⁇ Ct_UBE2C + b * ⁇ Ct_T0P2A + c * ⁇ Ct_RRM2 + d * ⁇ Ct_F0XMl + e * ⁇ Ct_MKI67 + f * ⁇ Ct_BTN3A2 + g * Tumor_si ze (cm) + h * pN (0 or 1)
  • the value of the prognostic gene is the normalized mRNA expression value calculated using the standard gene, tumor si ze is the length of the major axis of the tumor, and pN is the value determined by the pathological judgment of lymph node metastasis.
  • A is 0. 16 to 1.09, b is 0 to 0.71, c is 0 to 0.53, d is 0 to 0.57, e is 0 to 0.35, f is -1.02 to 0, g is 0.25 to 1.52 and h is 0. 19 to 2.25)
  • Proliferative genes and tumor si ze, pN have positive coefficients
  • Inverse genes have negative coefficients. Each coefficient is applied within the 95% confidence interval of the coefficient value (point estimate) calculated from the survival analysis, and the point estimate of each coefficient is preferably used.
  • the method of predicting the chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients according to the present invention is related to immune response and cell proliferation, which are two major biological properties that govern the clinical outcome of breast cancer patients, and that expression is stable in FFPE specimen tissue.
  • Genes with a large expression difference according to prognosis are selected, and Cox analysis is performed to calculate coefficients (coeff icient) for the two clinical information (tumor size, pN stage) important for the genes and prognosis. It can be characterized by being able to predict the usefulness of chemotherapeutic treatment by obtaining the BCT score according to Equation 1 by multiplying the normalized gene expression value, tumor size and pN stage.
  • Unsealed BCT score 0.63 * ⁇ Ct_UBE2C + 0.32 * ⁇ Ct_T0P2A + 0.13 * ⁇ Ct_RRM2 + 0.02 * ⁇ Ct_F0XMl + 0.04 * ⁇ Ct_MKI67 -0.42 * ⁇ Ct_BTN3A2 + 0.89 * Tumor_size (cm) + 1.22 * pN
  • prognostic predictors genes, clinical information
  • the Cox proportional hazard model expresses the degree of impact of prognostic factors on survival through proportionate risk ratio (HR), which is the proportionality of risk without prognostic factors and risk with prognostic factors. . If the value of the proportional hazard ratio (HR) is greater than 1, the risk is higher than if there is no prognostic factor, and if it is less than 1, the risk is further reduced if there is a prognostic factor.
  • the proportional risk ratio for each prognostic factor is converted to the log scale, which is called the coeff icient, and is used as the coefficient for calculating the BCT score model (Cox, David R. "Regression"). models and life-tables.
  • the “prognostic predictor genes” are UBE2C (Ubiqui tin-conjugating enzyme E2C), T0P2A (Topoi somerase 2 alp ha), RRM2 (ribonucleotide reductase M2), FOXMK Forkhead box Ml, MKI67 (Marker of proliferation Ki-67) ) And BTN3A2 (Butyrophilin subfamily 3 member A2).
  • Ct refers to the number of cycles when the PCR amplification product is amplified by a certain amount.
  • the change in fluorescence intensity from 1 to 10 times the amplification cycle is generally noise level and equal to 0, so they are considered sample sample tanks of amplification product 0, and their standard
  • the deviation SD is calculated, and the fluorescence value multiplied by 10 is used as the threshold value, and the number of PCR cycles first exceeding the threshold value is set as the Ct (cycle threshold) value. Therefore, when there are many amplification products, the Ct value is small, and when there are few amplification products, the Ct value is large.
  • the expression values of each prognostic gene were standardized using standard genes, and the average Ct values of three standard genes were used to minimize technical errors that may occur in the test.
  • the calculated value of [Equation 1] is converted into a value between 0 and 10 by l inear transformat ion as shown in [Equation 2] below.
  • step (f) Predicting that the numerical value calculated in step (e) is large in availability of the cheksutok chemotherapy:
  • the risk group in the chemotherapy usefulness prediction method of the breast cancer patient of the present invention As a result of calculating the point where the sum of the sensitivity (specificity) and the specificity (speci f icity), which are variables evaluating the accuracy of classification, is maximized, the numerical value calculated according to [Equation 1] exceeds 22.1. In case of less than 22.1, it was judged that the usefulness of chemotherapy was high (mean transition high risk group).
  • Equation 2 (BCT score) that is a linear transformation of the equation KUnscaled BCT score)
  • the usefulness of chemotherapy is high (transitional high risk group). It could be judged as small (mean low risk group).
  • the "sensit ivity” means a high-risk group of test results among patients who have metastasized within 10 years, and the "speci f icity" is low even in test results among patients without metastasis for 10 years. The proportion of risk workers.
  • the present inventors determine the statistical significance of the gene and clinical information (ie cancer size and pN stage) used in the BCT score and BCT score.
  • the results of analysis using the Cox proportional risk model showed that the BCT score according to the present invention was more meaningful than NPI Score, PREDCIT, and SNAP, which are clinical information based on the clinical prognosis and prognostic evaluation models based on the clinical information. Confirmed.
  • the BCT score shows the highest c-index value, the BCT score is different It was confirmed that the model showed higher predictive power of breast cancer than the model.
  • the algorithm of the present invention can be used to screen patients who do not need additional chemotherapy after primary breast cancer surgery.
  • the subject group of the present algorithm of the present invention is preferably a group of patients who have not received any chemical treatment before and after surgery, and a patient group with 'good prognosi s' has a probability of developing metastasis, recurrence or metastatic relapse within 10 years.
  • no additional chemotherapy is required after surgery (smaller usefulness of chemotherapy), but groups with a poor prognos- tion have a higher incidence of metastasis, recurrence, or metastatic relapse within 10 years after surgery. Additional chemotherapy may be recommended after surgery (chemotherapy is useful).
  • the chemotherapeutic usefulness prediction algorithm of breast cancer patients according to Equation 1 or Equations 1 and 2 of the present invention is a proliferation-related gene, an immune-related gene, and clinical information closely related to the prognosis of breast cancer in a wide range of clinical samples. It is calculated by analyzing the size and pN stage of cancer, and the predictive power of prognosis shows higher breast cancer prognostic predictive power than other models such as the conventional clinical information-based prognostic evaluation model. Do.
  • the present invention also provides a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient comprising an agent for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • the present invention provides a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients consisting of a formulation for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene.
  • the present invention provides a composition for predicting the chemotherapeutic usefulness of breast cancer patients consisting essentially of a formulation for measuring the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 gene do.
  • the present invention also provides a composition, characterized in that the composition further comprises an agent for measuring expression levels of CTBPl, CUL1 and UBQLNl genes.
  • the agent for measuring the expression level of the gene may be characterized as a primer pair specifically binding to UBE2C, T0P2A, RRM2, FO XMl, MKI67, BTN3A2, CTBPl, CUL1 and UBQLNl genes.
  • primer refers to an oligonucleotide, the conditions under which the synthesis of a primer extension product complementary to the nucleic acid chain (template) is induced, i.e.
  • the primer is deoxyribonucleotide and single chain.
  • the primers used in the present invention may include natural al ly occurring dNMP (ie dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primer may also include ribonucleotides.
  • the primer of the present invention may be an extension primer annealed to the target nucleic acid to form a sequence complementary to the target nucleic acid by a template-dependent nucleic acid polymerase, which extends to the position where the immobilized probe is annealed to Occupies the annealed area.
  • the extension primer used in the present invention includes a localized nucleotide sequence complementary to the first position of the target nucleic acid.
  • complementary means that the primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to the target nucleic acid sequence under certain annealing or shaking conditions, and is substantially complementary and completely complementary. (perfect ly complementary) has a meaning encompassing all, preferably completely complementary.
  • substantially complementary sequence as used in connection with the reamer sequence means not only a sequence which is completely matched, but also a sequence which is partially mismatched with the sequence to be compared to the extent that it can serve as a primer by annealing a specific sequence. It is meant to be included.
  • the primer should be long enough to prime the synthesis of the face product in the presence of a polymerizer. Suitable lengths of primers are typically dependent on a number of factors, such as temperature, application and source of primer, but are typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures in order to form a more complex stable complex with the template.
  • annealing or “priming” means that a lipoic deoxynucleotide or nucleic acid is juxtaposed to a template nucleic acid, wherein the juxtaposition polymerase polymerizes the nucleotides to complement the template nucleic acid or a portion thereof.
  • the sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range that can be hybridized with the template to perform the primer-specific function.
  • the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the above-described nucleotide sequence as a template, and is sufficient as long as it has sufficient complementarity within a range capable of being primerized by the gene sequence.
  • the design of such a primer can be easily carried out by a sugar bark with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, by using a primer design program (eg, PRIMER 3 program).
  • the primer pair in the present invention may be characterized in that consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 18.
  • the primer and probe sequences of the selected genes for measuring the expression level of the genes in the present invention are shown in Table 3 below. [Table 3]
  • the present invention provides a kit for predicting chemotherapeutic usefulness of a breast cancer patient comprising an agent for measuring the expression level of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 and BTN3A2 genes.
  • the present invention also provides a kit, characterized in that the kit further comprises an agent for measuring the amount of expression of CTBPl, CUL1 and UBQLN1 gene.
  • the kit of the present invention is used for PCR reactions, RNA isolation from samples, and synthesis of cDNA in addition to primer pairs capable of amplification by PCR of UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67, BTN3A2, CTBPl, CUL1 and UBQLN1 genes.
  • the kit of the present invention may further include a tube, a well plate, and instructions describing how to use the same, as necessary, for mixing the respective components.
  • the present invention also provides the use of the agent to measure the expression level of the UBE2C, T0P2A, RRM2, FOXMl, MKI67 and BTN3A2 gene to prepare a formulation for predicting chemotherapy availability of breast cancer patients.
  • the present invention also provides a use of the agent, characterized in that the agent for measuring the expression level further comprises an agent for measuring the expression level of CTBPl, CUL1 and UBQLNl gene.
  • the 'agent for measuring the expression level of the gene' of the present invention is the same as described above, the 'gene that can predict the usefulness of chemotherapy' is the same as described above, UBE2C, T0P2A, RRM2, FOXMl, MKI67 , BTN3A2, CTBPl, CUL1 and UBQLNl.
  • the term 'comprising' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'characteristic' and excludes additional component elements or method steps not mentioned in the composition or method. I never do that.
  • the term 'consisting of' means to exclude additional elements, steps or components, etc., unless otherwise noted.
  • the term 'essent ial ly consist ing of' means to include, in the scope of a composition or method, a component element or step described, as well as a component element or step that does not substantially affect its basic properties, and the like. it means.
  • the present invention relates to a method for predicting the usefulness of chemotherapy for breast cancer patients using gene groups and clinical information that have a significant correlation with the prognosis of breast cancer.
  • the present invention accurately predicts the usefulness of chemotherapy for breast cancer patients. It can be useful for the purpose of presenting clues about the direction of breast cancer treatment in the future.
  • FIG. 1 is a result showing the distribution of unsealed BCT score in the algorithm calculation test group.
  • Figure 2 is a result showing the distribution of the BCT score in the algorithm calculation test group and verification test group.
  • FIG. 3 is a diagram showing the survival probability of remote survival within 10 years of the high risk group (group of high usefulness of chemotherapy) and the low risk group (group of low usefulness of chemotherapy) classified according to the BCT score.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of evaluating the predictive power of breast cancer prognostic prediction models through C-index.
  • FIG. 5 is a result of calculating the probability of non-remote metastasis for 10 years in a group of patients who received or did not receive chemotherapy after distinguishing between low risk and high risk patients with an algorithm according to the present invention.
  • Figure 6 is a result of confirming the difference in the probability of a remote pandemic within 10 years according to chemotherapy in a patient group classified into a low risk group based on clinical information, among patients classified into a low risk group by the algorithm according to the present invention.
  • NCBI's Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) is a database site where researchers store large-scale experimental data on gene expression and mutations, including microarrays. The data on this site can be freely reanalyzed, and the process of deriving this prognostic gene also uses data from this site.
  • microarray data used in this study was limited to data using a microarray chip called 'Affymetrix Human Genome U133A Array'. There are about 22,000 probes on the chip, and each probe refers to one gene. Through this chip analysis, it is possible to measure the mRNA expression level of most genes in the human body.
  • Lymph node negative based on Affymetrix Human Genome U133A Array, within the NCBI GEO site.
  • the riii croarray dataset was examined.
  • 684 samples were obtained from the following three datasets. Information about the sample data set is shown in Tables 4 and 5 below.
  • DMFS Distant-Metastasis-free survival
  • principal component 1 is concentrated in proliferation and principal component 2 is concentrated in immune response.
  • the genes with the highest expression levels among the prognostic groups were selected for genes belonging to two main components involved in proliferation and immune responses.
  • Each gene set was named p-gene and i-gene representing the expression pattern of immune response in the sense that the gene represents the expression pattern of proliferation.
  • Genes satisfying the following conditions were selected as candidate genes of a gene prognostic diagnosis model in the gene group classified as p-gene or i-gene:
  • the 16 genes selected above were extracted from RNA from FFPE samples, qRT-PCR was performed, and their expression values were calculated.
  • Cox proportional hazards model Changes in the risk of distant metastasis with increasing expression of each gene can be identified using the Cox proportional hazards model.
  • the Cox proportional hazard model the ratio of the risk of occurrence of an event (remote transition) with or without a risk factor (gene) at a certain time interval is defined as a hazard ratio (HR). Increases the risk of an event occurring, and less than 1 means that the risk is reduced.
  • Proliferation-related genes classified as p-genes have an adverse effect on prognosis as the expression value increases with a risk value of 1 or higher, whereas genes classified as i-genes have a higher expression value with a risk value of 1 or less. It was confirmed to show prognostic results. Among the gene groups observed, the genes of prognosis prediction were more important than other genes, and the genes with the same direction as other studies were selected as the genes to be used in the final algorithm.
  • the genes selected were five proliferation-related genes (UBE2C, T0P2A, MKI67, RRM2, F0XM1) and one immune response-related gene (BTN3A2), and three additional standard genes (CTBPl, CUL1, UBQLN1) suitable for FFPE tissue for expression standardization. )
  • T0P2A proliferation-related genes
  • BTN3A2 immune response-related gene
  • CTBPl CUL1, UBQLN1
  • a univariate Cox proportional risk model was used to identify important clinical factors associated with metastatic recurrence in patients with untreated chemotherapy (P-value ⁇ 0.05).
  • Tumor size was an important factor for distant metastatic recurrence in patients without chemotherapy but with chemotherapy It was not significant in the group of breast cancer patients received.
  • pN is significant in both the chemotherapy and chemotherapy groups, but the risk rat io value in the chemotherapy group is more than seven times the risk value in the chemotherapy group. Is gone. In other words, pN was found to be a stronger indicator of distant metastatic recurrence in the chemotherapy group than in the chemotherapy group.
  • the pathologic stage is also a significant factor, but the concept includes tumor size and pN, and the NPI score is calculated based on the size of the cancer and the degree of lymph node metastasis. Overlapping information of size and pN, In the prognostic predictive model for patients who did not receive chemotherapy, the tumor size and pN information were selected as clinical information.
  • P-gene groups (UBE2C, T0P2A, ⁇ 2, F0XM1, and MKI67), which are proliferation-related genes, show worse prognosis as expression of more genes. .
  • the genes were calculated using the Cox proportional hazard analysis.
  • Unsealed BCT score (U-BS) 0.63 * ⁇ Ct_UBE2C + 0.32 * ⁇ Ct_T0P2A + 0.13 * ⁇ Ct_RRM2 + 0.02 * ACt_F0XMl + 0.04 * ACt_MKI67-0.42 * ACt_BTN3A2 + 0.89 * Tumor_size (cm) + 1.22 * pN (0)
  • Sensitivity and specificity are the endpoints for assessing the accuracy of the classification of risk groups, and the sensitivity and specificity are defined as follows in the algorithm of the present invention.
  • Sensit ivity The percentage of patients at high risk of distant metastatic relapse within 10 years.
  • the cut-off point of the risk group classification was calculated by calculating the BCT score classification point so that the sum of the sensitivity and the specificity is maximized in consideration of both sensitivity and specificity.
  • the point where the sum of sensitivity and specificity is maximized according to the above criteria is 22.13767, which divides the high risk group and the low risk group of distant metastasis. Threshold was specified. That is, if the BCT score (BS) is 22.13767 or more, distant metastasis is classified as a high risk group, and if it is less than one, it can be classified into a low risk group.
  • BS BCT score
  • Example ⁇ 5-1> In order to express the calculation formula of Example ⁇ 5-1> in a more intuitive numerical value, it was converted into a BCT score by a linear transformation (l inear transformat ion) ⁇ , and the calculation formula is as follows.
  • the value of the BCT score is less than 0, it is replaced with 0, and if greater than 10, it is converted to 10.
  • the probability of cancer recurrence, metastasis, or metastatic recurrence within 10 years increases.
  • the BCT score was calculated according to the above formula to confirm the distribution thereof, and the results thereof are shown in FIG. 2.
  • the threshold for classifying the high risk group and the low risk group for distant metastasis in the BCT score was set to 4 (a point where the sum of sensitivity and specificity is maximized). That is, if the BCT score is 4 or more, it can be classified as a high risk group for recurrence, metastasis, or metastatic relapse, and a low risk group for less than.
  • the high risk group classified according to the formula of Example 5 means that recurrence, metastasis or metastatic recurrence may occur with a higher probability than the low risk group.
  • 3 shows the results of estimating the probability of distant metastatic recurrence through survival analysis and discovery set of test set (val idat ion set) survival analysis.
  • the probability of 10-year blunting of the BCT score-based low-risk group was 97.82% and 96.47% in the algorithm-calculating test group and the algorithm-detecting test group, respectively. 61, 07%, 76.31%, there was a statistically significant difference in the probability of distant metastatic recurrence within 10 years in both groups (P- values ⁇ 0.001, log-rank test).
  • Cox proportional risk analysis was used to analyze whether the BCT score was more meaningful than the clinical information and clinical information-based prognostic evaluation model.
  • the BCT score was found to be statistically significant in predicting distant metastasis than general clinical information used as a prognostic indicator (p-values ⁇ 0.05). Similarly, the multivariate Cox proportional risk analysis showed that the BCT score was statistically significant than the prognostic model based on clinical information (p-values ⁇ 0.05).
  • the C-index has a value from 0.5 to 1, and the closer it is to 0.5, the lower the prognostic predictive power, and the closer to 1, the higher the prognostic predictive power.
  • the BCT score showed the highest c-index value. This means that the BCT score had a higher prognostic predictive power than other prognostic models (FIG. 4).
  • Example 4 346 patient specimens undergoing surgery at Asan Medical Center were obtained and used in this Example.
  • the samples subjected to chemotherapy and the samples of Example 4 which were not subjected to chemotherapy were analyzed by the algorithm according to the present invention, and then divided into high risk and low risk groups, and the probability of 10-year blunt transition according to the presence or absence of chemotherapy was compared.
  • the probability of armed fighting was 96.0% in the patients who did not receive chemotherapy. 96.4% of patients treated with chemotherapy showed a 0.4% increase in radiological outbreaks. It can be judged that there is no benefit of chemotherapy in the low risk group.
  • the probability of nondisruption of the chemotherapy group was 91.9%, whereas the prognosis of the chemotherapy group was 65.4% in the non-chemistry group.
  • the disease-free survival rate and overall survival probability there was no significant difference in survival probability between the low-risk group and the presence of chemotherapy, and the high-risk group showed significant chemotherapy effects.
  • the benefit of chemotherapy in the low risk group of the present invention is that the modi f ied Adjuvant! Compared with On l ine, it was confirmed more clearly.
  • Modi f ied Adjuvant! Onl ine is classified into high risk or low risk by predicting the patient's risk based on the patient's clinical information.
  • the algorithm of the present invention According to the modif ied Adjuvant! We compared the probability of another 10-year remote attack according to the risk group classification of On in. As shown in FIG. 6, the difference in the probability of non-remote metastasis within 10 years according to chemotherapy in the patient group classified into the low risk group based on clinical information among the patients classified into the low risk group by the algorithm according to the present invention is 0.3 *.
  • the statistically significant AMT was found to be a group of patients without the usefulness of chemotherapy without increasing or decreasing survival probability.
  • the difference in probability of non-remote metastasis within 10 years according to chemotherapy was 2.3%, which was statistically significant due to chemotherapy. It was confirmed that one remote battle had no increase or decrease in survival probability. That is, in the case of a patient diagnosed with breast cancer and determined to be a low risk group according to the algorithm of the present invention, it can be predicted that there is no increase in the probability of a significant non-remote metastasis through chemotherapy. In the case of patients, receiving prophylactic treatment is expected to have a better prognosis because of the high probability of survival for 10 months after surgery.
  • the present invention relates to a method of predicting the usefulness of chemotherapy for breast cancer 3 ⁇ 4 of patients using gene groups and clinical information that correlate well with the prognosis of breast cancer.
  • the method of the present invention accurately predicts the usefulness of chemotherapy for breast cancer patients. It can be used effectively for the purpose of presenting information on the future direction of breast cancer treatment.

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Abstract

본 발명은 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 유방암의 예후 예측 유전 자와 표준화 유전의 발현 정도를 측정하고, 이를 표준화함으로써 화학치료의 유용 성이 큰 환자군과 유용성이 작은 환자군으로 구분하여 예측하는 방법에 관한 것이 다. 본 발명의 방법을 통해 유방암 환자에 대한 화학치료 요법의 유용성을 정확 하게 예측할 수 있는 효과가 있어, 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하 는 목적으로 유용하게 사용할수 있다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
유방암환자의 화학치료유용성 예측 방법
【기술분야】
본 출원은 2016년 11월 23일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0156824 호를우선권으로주장하고, 상기 명세서 전체는본출원의 참고문헌이다. 본 발명은 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubi qui tin- conjugating enzyme E2C) , T0P2A(Topoi soraerase 2 alpha) , RR 2 ( r i bonuc 1 eot i de reductase M2) , FOX KForkhead box Ml) 및 MKI67(Marker of prol iferat ion Ki-67) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 축정된 mRNA의 발현수준을 표준화 하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의 해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서 , 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관련 유전자가 과발현 된 경우 화학치료와 유용성이 작은 것으로 예측하는 단계를 포함하는 유방암 환자 의 화학치료 유용성 예측 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
유방암은 여성에 있어 가장 흔한 암이며, 두 번째로 사망률이 높은 암이다. 20이년 유방암의 유병률은 미국에서 100,000 명당 90-100이었으며, 유럽에서는 100,000 명당 50-70이었다. 이 질환의 발병은 세계적으로 점점 증가하는 추세에 있 다. 유방암의 위험 인자는 인종， 나이, 암 억제 유전자 BRCA-1, BRCA-2 및 p53에서 의 돌연변이 등을 포함한다. 알코을 섭취, 고지방 식이, 운동 부족， 외인성 폐경 후 호르몬 및 이온화 방사선 또한 유방암의 발병 위험을 증가시킨다. 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암 (각각 "ER-" 및 "PR-") , 큰 종양 크기, 높은 등급의 세포진단결과, 및 35세 이하인 경우 그 예후가 나쁘다 (Goldhirsch et al . (2001) . J . Cl in. Oncol . 19： 3817-27) . 2005년 약 212, 000건의 새로운 침습성 유방암 증례 및 58, 000건의 새로운 비침습성 유방암증례가 진단될 것으로 추산되 며 , 40,000명의 여성이 유방암으로사망할 것으로 예상된다. 현재의 유방암에 대한 치료 방법은 수술 이후, 항암 치료， 항호르몬 치료, 표적 치료 혹은 방사선 치료등 향후 재발을 줄이기 위한추가보조적인 치료가 필 요한 경우가 많다. 이 중 화학치료 (chemotherapy)는 항암 치료 요법 중의 하나이 다. 유방암 환자의 병리학적 상태는 암의 상태 , 종양의 크기， 종양의 병리학적 단 계 또는 다른 인자들에 따라서 환자마다 다르기 마련이다. 이처럼 다양한 병리학적 상태와 유방암 환자들에서의 서로 다른 반웅으로 인해, 일부 환자들은 항암제를 이 용한 화학치료가 효과가 있을 수도 있지만， 다른 환자에게서는 효과가 없을 수도 있다. 화학치료의 효과가 크지 않을 환자에게 지속적으로 항암제를 투여하는 것은 부작용만을증가시켜 환자에게 원치 않는 고통을줄수 있다. 이러한 관점에서, 유방암 환자에게 항암제를 투여하기에 앞서, 해당 환자에 서 화학치료의 유용성을 정확하게 예측할수 있는 방법이 필요하다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 환자와 암세포를 포함하는 조직의 FFPE 시료를 이용하 여 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있는 알고리즘을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 유방암 조직으로부터 얻은 유전자 장보 및 임상정보를 수집， 분석하 여 예후 예측과 관련된 유전자 세트를 발굴하고， 발굴된 유전자 중 FFPE 시료에 적 용시키기 적합한 유전자 및 이의 세트를 선별 및 조합하여 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있는 알고리즘을 개발하였고， 상기 알고리즘에 따라 환자를 구분함으로 써 유방암 환자에서 화학치료의 유용성을 예측할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완 성하였다. 따라서， 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측방법을 제공하는 것이다:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubiquitin- conjugating enzyme E2C) , T0P2A(Topo isomer ase 2 alpha) , RRM2( ribonucleotide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI 67 (Marker of prol i feration Ki-67) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 mRNA의 발현수준올 표준화 하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서， 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관 련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 예측하는 단계. 본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법을 제공하는 것이다:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubiquit in- conjugat ing enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2(ribonucleot ide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) , MKI67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단 계;
(b) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 표준화하는 단계 ;
(c) 상기 유방암 환자의 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계;
(d) 상기 (b) 단계에서의 표준화값 및 상기 (c) 단계에서의 종양의 크기 및 pN-단계를 하기 식 1과 2에 대입하여 수치를 계산하는 단계
[식 1]
Unsealed BCT score (U-BS) = a*ᅀ Ct_UBE2C + b*ᅀ Ct_T0P2A + c*ᅀ Ct_RRM2 + d*ᅀ Ct_F0XMl + e*ᅀ Ct_MKI67 + f*ᅀ Ct_BTN3A2 + g*Tumor_size(cm) + h*pN(0 or 1) [식 2]
BCT score = 0 i f 0.8*Unscaled BCT score(U-BS) -13.71 < 0
BCT score = 0.84*U-BS + 26.1 i f 0< 0.8* U-BS -13.71 < 10
BCT score = 10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
(예후 유전자의 값은 표준 유전자를 사용하여 계산된 표준화된 mRNA 발현값 이며， tumor size는 종양의 장축 길이， pN은 림프절 전이의 병리학적 판단에 따라 판정되는 값을 나타냄.
상기 a는 0.16 내지 1.09， b는 0 내지 0.71 , c는 0 내지 0.53， d는 0 내지 0.57， e는 0 내지 0.35， f는 -1.02 내지 0， g는 0.25 내지 1.52 및 h는 0.19 내지 2.25임) ; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 계산된 수치가 클수톡 화학치료의 유용성이 큰 것으로 예측하는 단계. 본 발명의 다른 목적은 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 및 BTN3A2 유전자 의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조 성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제로 구성되는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 용 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 UBE2C, T0P2A, 腿 2, F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제로 필수적으로 구성되는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자 의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 키 트를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 제제를 제 조하기 위한 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량올 측정 하는 제제의 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유방암 환 자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubi qui t in- conjugat ing enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2 ( r i bonuc 1 eot i de reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 mRNA의 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서, 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관 련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 예측하는 단계. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유 방암환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubiqui t in- conjugat ing enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2( r ibonucleot ide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) , MKI67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단 계;
(b) 상기 유전자의 mRNA발현 수준을 표준화하는 단계；
(c) 상기 유방암 환자의 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계;
(d) 상기 (b) 단계에서의 표준화값 및 상기 (c) 단계에서의 종양의 크가 및 pN-단계를 하기 식 1과 2에 대입하여 수치를 계산하는 단계
[식 1]
Unsealed BCT score (U-BS) = a*ᅀ Ct_UBE2C + b*ᅀ Ct_T0P2A + c*ᅀ Ct_RRM2 + d*ᅀ Ct_F0XMl + e*ᅀ Ct_MKI67 + f*ᅀ Ct_BTN3A2 + g*Tumor_size(cm) + h*pN(0 or 1) [식 2]
BCT score = 0 i f 0.8*Unscaled BCT score(U-BS) -13.71 < 0
BCT score = 0.84*U-BS + 26. 1 i f 0 < 0.8* U-BS -13.71 < 10
BCT score = 10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
(예후 유전자의 값은 표준 유전자를 사용하여 계산된 표준화된 mRNA 발현값 이며, tumor size는 종양의 장축 길이， pN은 림프절 전이의 병리학적 판단에 따라 판정되는 값을 나타냄.
상기 a는 0. 16 내지 1.09 , b는 0 내지 0.71 , c는 0 내지 0.53， d는 0 내지 0.57， e는 0 내지 0.35， f는 -1.02 내지 0， g는 0.25 내지 1.52 및 h는 0. 19 내지 2.25임) ; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 계산된 수치가 클수록 화학치료의 유용성이 큰 것으로 예측하는 단계 . 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 UBE2C , T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자 의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 UBE2C, TOP2A, 匪 2， F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량올 측정하는 제제로 구성되는 유방 암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제로 필수적으로 구 성되는 유방암환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자 의 화학치료 유용성 예측용 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 환자의 화학 치료 유용성 예측용 제제를 제조하기 위한 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제의 용도를 제공한다. 이하본 발명에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유 용성 예측 방법을 제공한다:
하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubiqui t in- conjugat ing enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2( ribonucleot ide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 mRNA의 발현수준을 표준화 하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서， 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관 련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 예측하는 단계. 본 발명에서 "화학치료 (chemotherapy)의 유용성" 이란 유방암 환자에게 화 학물질과 같은 항암제를 투여하는 치료요법을 진행했을 때 유효한 치료효과가 나타 날 것인지를 의미하는 것이다. 또한， 상기 "유효한 치료효과" 란 암의 완치， 재 발， 전이 또는 전이성 재발을 포함하는 개념이며， 가장 바람직하게는 전이성 재발 여부를 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 상기 "전이성 재발" 은 치료 전 유방암의 발생 부위 및 /또는 동측 유방 및 /또는 반대 측 유방 내의 부위에 전이된 국소 전이성 재발과 폐， 간， 뼈， 림프절, 피부， 뇌와 같은 원격 부위에 전이되어 발생하는 원격 전이성 재발을 포함하는 개념이다. 바람직하게는， 본 발명에서 상기 전이성 재발은 원격 전이성 재발일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 "전이성 재발" 이란 초기 치료 후， 최소한 하나의 유방 종양에서 유래된 변형된， 즉 암세포가 그 종양에서 분리되어 종양과 떨어진 위치 ( 이하 "원격 부위"라 한다)에서 암으로 계속 성장하는 것을 말한다. 상기 원격 부위 는 예를 들면 하나 이상의 림프절 내일 수 있으며， 이들은 이동성이거나 고정되어 있을 수 있고， 상기 종양에 대해 동측이거나 반대 측일 수 있으며, 쇄골위이거나 겨드랑이 등에 있는 것일 수 있다. 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측은 주로 종양의 크기 (T) , 림프절 주변부 로의 전이 상태 (N) 및 다른 기관으로의 원격 전이 (di stant metastasi sKM)를 평가 하는 수술 후의 질병의 병기 (stageKT匪 병기)에 의해 결정된다. TOM 병기에 따라 분류된 환자의 화학치료 유용성 예측은 동일한 병기에서도 서로 다르다. 즉, 동일 한 병기의 유방암에서도 화학치료의 유용성은 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용 체 (ER 또는 PR)의 발현여부 및 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)의 과발현 여부 또는 유전자의 증폭에 의해 결정될 수 있다. 동일한 병기의 유방암이 라 할지라도 에스트로겐 수용체， 프로게스테론 수용체 또는 HER2의 발현여부에 따 라 병태 및 예후가 현저히 달라지기 때문에， 이를 명확히 구분한후 치료방법을 구 체적으로 설정하는 것이 필요하다. 따라서 , 최근에는 유전자 및 분자생물학적으로 유방암의 특성을 분류하며 (표
1) , 아형에 따라 치료에 따른 결과 및 예후도 다르다고 보고하여， 수술적 방법이나 항암화학요법의 선택에 지표로사용된다.
[표 1】
側鋼; ' 聽 '
Figure imgf000010_0001
본 발명에서의 유방암은 바람직하게는 에스트로겐 수용체 및 /또는 프로게스 테론 수용체 양성이면서 HER2 음성인 유방암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 루미 날 A형 유방암일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 유방암의 경우 병기가 높을수록 암이 더 진행된 것이며 예후 역시 좋 지 않다. 유방암은 0~4기로 구분한다. 유방암은 T應 병기를 사용하는데 TOM 병기를 결정하기 위해서는 3가지 요소가 필요하다. 암 자체의 크기와 특성에 따라 결정되 는 T 병기， 림프절의 침범 정도에 의해 결정되는 N 병기， 그리고 유방 이외의 다른 부위로 전이가 있는지 여부에 의해 결정되는 M 병기가 있다. 각각의 병기에 있어서 의 병리학적 특성을 요약하면 하기 표 2와 같다. 【표 2】 爾 (4 i£¾ 囊 ^
Figure imgf000011_0001
본 발명에서 상기 유방암은 바람직하게는 조기 유방암이며， 보다 바람직하게 는 pNO 또는 pNl기에 해당하는 유방암이며， 가장 바람직하게는 TOM 병기에 따른 0 기 또는 1기로 분류되는 유방암일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 이하에서는 본 발명에서 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법의 각 단 계를 보다상세히 설명한다.
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 유방암 환자의 유방암 조직일 수 있다. 상기 유방암 조직에는 일부 정상 세포도 포함되어 있을 수 있으며， 바람직하게는 암세포를 포함하는 유방암 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매 (formal in-f ixed paraff in -embedded, FFPE) 시료， 신선한 조직 (fresh t issue) 및 동결 조직으로 이 루어진 군에서 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 UBE2C(Ubiqui tin-conjugating enzyme E2 C), T0P2A(Topoisomerase 2 alpha), RRM2(ribonucleotide reductase M2), FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI67 (Marker of proliferation Ki-67)로 이루어진 군 에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Buty rophilin subfamily 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA발현 수준을 측정하는 단계 ; 본 발명에서 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 마커로 기능하는 것은 UBE2C ( Ub i qu i t i n-con j ugat i ng enzyme E2C) , TO P2A ( Topo i s ome rase 2 alpha) , RRM2( ribonucleotide reductase M2), FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI67(Marke r of proliferation Ki-67)로 이루어진 증식 관련 유전자군 및 BTN3A2(Butyrophi 1 in subfamily 3 member A2 ) 면역관련 유전자이다. 이들은 각각 독립적으로 선택될 수 있으나， 바람직하게는 2개 이상의 유전자의 조합에 의해서 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측에 이용될 수 있다. 상기 각 유전자는 당업계에 공지된 각 유전자의 서열 또는 각 유전자의 동의 어 (synonym)의 서열， 바람직하게는 인간에서 유래된 각 유전자의 서열일 수 있으 며， 더 바람직하게는 UBE2C (Gene ID: 11065), T0P2A (Gene ID: 7153), 匿 (Gene ID: 6241 ), FOXMl (Gene ID: 2305) , MKI67 (Gene ID: 4288)， BTN3A2 (Gene ID: 11118)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 각 유전자에 대한 동의어 및 그 서열은 GenBank에서 검색할 수 있다. ' 본 발명에서 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 수행되는 모든 방법을 이용할 수 있으며， 바람직하게는 마이크로어레이， PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR, 정량적 RT_PCR(qRT_ PCR), 실시간 중합효소 연쇄반웅 (real-time PCR), 노던 블롯 (northern blot), DNA 칩 및 RNA 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 대상 유전자의 발현 수준의 측정은 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 검출， 더 바람직하게는 대상 유전자의 발현량의 정량적인 검출이다. 발현 량의 검출을 위해서 시료 조직 내에서의 mRNA 분리 및 mRNA에서의 cDNA 합성과정 이 필요할 수 있다. mR A의 분리를 위해서는 당업계에 공지된 시료에서의 RNA 분리 방법이 이용될 수 있으며， 바람직하게는 시료는 FFPE 시료이므로 FFPE 샘플에 적합 한 mRNA의 분리방법일 수 있다. cDNA 합성과정은 mRNA를 주형으로 하여 이루어지는 당업계에 공지된 cDNA 합성 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 마커의 발현 수준 측정은 FFPE 시료에서의 mRNA 발현 의 정량적 검출이므로 FFPE 시료에 대한 mRNA 분리방법 및 실시간 RT-qPCR (real t ime reverse transcript ion quant i tat ive polymerase chain react ion) 방법에 의 한측정일 수 있다. 또한， 본 발명에서 대상 유전자의 발현 수준의 측정은 당업계에 공지된 방법 에 따라 수행될 수 있으나， 리포터 형광 염료 및 /또는 꿴쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있다. 상기 측정은 상업적으로 판매되는 장비， 예를 들어， ABIPRISM 7700™ Sequence Detect ion System™, Roche Molecular Bioche mi cals Light cycler 및 이에 부속되 는 소프트웨어 등의 시스템에 의해서 이루어질 수 있다. 이와 같은 측정 데이터는 측정값 또는 역치 사이클 (Ct 또는 Cp)로서 표현될 수 있다. 측정된 형광값이 처음 으로 통계학적으로 유의한 것으로 기록될 때의 지점이 역치 사이클이며， 이는 검출 대상이 PCR 반응의 주형으로써 존재하는 초기값에 반비례하여 나타나므로 역치 사 이클 값이 작은 경우 정량적으로 더 많은 검출 대상이 존재하는 것을 나타낸다.
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 mRNA의 발현수준을 표준화 하는 단계;
본 발명에서의 검출 대상 유전자의 발현 수준은 대상 환자 또는 시료에 따라 전체적인 유전자 발현량 또는 발현 수준에 차이가 있올 수 있으므로 표준화가 필요 하다. 표준화는 기본 발현량 또는 발현 수준의 차이를 나타낼 수 있는 유전자의 발 현량 또는 발현 수준과의 차이를 통해 이루어지며， 바람직하게는 CTBP1 (C- terminal— binding protein 1) , CUL1 (cul l in 1) 및 UBQLNKUb ui Hn-1)에서 하나 내지 세 개의 유전자의 발현량 (또는 복수의 유전자가 선별된 경우 이들 발현량의 평균)을 측정하여 이에 대한 비를 산출하는 것에 의해서 수행될 수 있다.
(d) 상기 (c) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서， 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관 련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 유방암 예후를 예측 하는 단계；
본 발명에서 상기 "화학치료의 유용성이 큰 것" 이란 화학치료를 받지 않았 을 때와 비교해 화학치료를 받은 후 암의 전이， 재발 또는 전이성 재발의 확률이 낮아지는 것을 의미하는 것이다. 즉， 화학치료의 부작용보다 그 효과가 크기 때문 에 화학치료를 진행하는 것이 더 바람직한 경우를 의미한다고 할 수 있다.
한편 , 상기 "화학치료의 유용성이 작은 것" 이란 화학치료를 받지 않았을 때 와 비교해. 화학치료를 받은 후 전이， 재발 또는 전이성 재발의. 확률에 큰 변화가 없거나 오히려 더 나쁜 예후를 나타내는 경우를 의미한다. 즉， 화학치료의 효과는 기대할 수 없고 부작용이 존재하기에， 화학치료를 진행하지 않는 것이 더 바람직한 경우를 의미한다고 할 수 있다. 바람직하게는 "화학치료의 유용성이 큰 것" 이란 화학치료를 받지 않았을 때와 비교해 10년 이내에 암의 전이， 재발 또는 전이성 재발의 확률이 더 낮아지는 것을 의미하며， "화학치료의 유용성이 작은 것" 화학치료를 받지 않았을 때와 비 교해 10년 이내에 전이， 재발 또는 전이성 재발의 확률에 별다른 변화가 없거나， 오히려 더 높아진 경우를 의미한다. 상기 "10년" 이란 원발성 유방암 (pr imary breast cancer ) 환자의 수술로 암을 제거한 시점 (즉， 수술일 기점)으로부터 10년을 의미한다. 본 발명에서 상기 증식관련 유전자의 과발현은 유방암 환자의 나쁜 예후 및 화학치료의 유용성이 큰 것과 밀접한 상관성이 있으며， 상기 면역관련 유전자의 과 발현은 유방암 환자의 좋은 예후 및 화학치료의 유용성이 작은 것과 밀접한 상관성 이 있다. 따라서， 상기 증식관련 유전자와 면역관련 유전자의 발현 양상을 조합함 으로써 화학치료의 유용성을 보다 정확하게 예측할 수 있다. 즉， 본 발명의 상기 유전자 조합은 원발성 유방암 (pr imary breast cancer ) 수술 후 추가적인 화학치료가 필요없는 환자를 선별하는데 이용될 수 있다. 본 발 명의 상기 유전자 조합의 대상 환자군은 바람직하게는 수술 전과 후에도 어떠한 화 학치료를 받지 않은 환자군으로, 향후 화학치료를 받는 것이 병의 진행경과에 유리 할지 또는 받지 않는 것이 유리할지 결정하고자하는 환자군이라 할 수 았다.. 본 발명에서 상기 화학치료의 유용성이 작은 환자군은 유방암의 예후가 나쁘 지 않을 것으로 예상되는 환자군으로 (즉, 향후 "좋은 예후" 를 나타낼 것으로 예 상되는 환자군) 10년 내 전이， 재발 또는 전이성 재발의 발생 확률이 낮기에 수술 후 추가적으로 화학치료가 필요하지 않지만， 화학치료의 유용성이 큰 집단은 유방 암의 예후가 좋지 않을 것으로 예상되는 환자군으로 (즉, 향후 "나쁜 예후" 를 나 타낼 것으로 예상되는 환자군) 수술 후 10년 내 전이， 재발 또는 전이성 재발의 발 생 확률이 높아 수술 후 추가적인 화학치료가 권장되는 것이다. 즉， 유방암의 "예후 가 나쁘지 않올 것으로 예상되는 환자는 화학치료에 따른 부작용이 치료효과보다 더 크기 때문에 화학치료를 받지 않는 것이 향후 유방암의 진행경과에 더 유리할 것으로 판단할 수 있으며， 반대로， 유방암의 예후가 나쁠 것으로 예상되는 환자는 화학치료에 따른 효과가 부작용보다 월등하기 때문에 화학치료를 받는 것이 향후 유방암의 진행경과에 더 유리할 것으로 판단할 수 있는 것이다. 본 발명은 또한 상기 (b) 단계 이후에 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계를 추가적으로 포함하며， 상기 (d) 단계에서 종양의 크기가 클수록 및 pN 단계 가 높을수록 화학치료의 유용성이 큰 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법을 제공한다. 즉， 증식관련 유전자의 발현， 면역관련 유전자의 발현， 종양의 크기 및 pN- 단계를 조합함으로써 화학치료의 유용성을 보다 정확하게 예측할 수 있으며， 이러 한 조합을 통해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 방법은 종래에 보고된 바가 없다. 본 발명에서 상기 종양의 크기란 암의 장축의 길이를 뜻하며， 바람직하게는 병리학자의 판단에 의해 측정된 암의 장축의 길이를 말한다. 종양의 크기는 센티미 터 (cent imeter) 단위로 표기된다. 본 발명에서 상기 pN은 유방암의 단계를 구분하는 방법 중 병리학적 구분방 법 (pathological classi f icat ion)에 의해 림프절로의 전이 여부로 판단하는 방법을 의미한다. 병리학적 구분방법은 수술 후 병리조직학적 구분방법 (postsurgi cal hi stopathological classi f icat ion)이라고도 불리며, 유방암 환자에서 치료를 시작 하기 전에 얻었던 정보들과 함께 수술 또는 병리학적 검사들로부터 얻은 정보들을 취합하여 병리 단계를 구분하는 방법이다. pN은 병리학적 구분방법 중 림프절로의 전이정도를 기준으로 판단하는 구분 방법으로 겨드랑이 림프절을 절제하여 종양의 전이 여부를 관단한다. pN 단계가 상 승할수록 림프절로의 종양세포 전이가 많이 이루어진 것으로 유방암 예후가 나쁘기 때문에 화학치료의 유용성이 큰 것으로 판단할 수 있다. 본 발명에서 상기 pN 단계는 바람직하게는 pNO 단계 또는 pNl 단계일 수 있 으나 이에 제한되는 것은 아니다. pNO 단계란 국부 림프절로의 전이가 전혀 관찰되 지 않는 단계를 의미하며， pNl 단계란 1~3개의 동측 (同側) 겨드랑이 림프절 미세전 이가 발견된 단계를 의미한다. 즉， 상기 방법에 따르면 (b) 단계에서 측정한 유전자들의 발현수준과 함께 종양의 크기 및 pN 단계를 예후 예측인자 또는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예 측인자로 판단함으로써， 보다 정확하게 유방암 환자의 예후 및 화학치료의 유용성 을 예측할 수 있다. 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측 방법 을 제공한다:
(a) 유방암 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 UBE2C(Ubi qui t in-conjugat ing enz yme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2(r ibonucleot ide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) , M I67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 및 BTN3A2(Butyrophi l in subfami ly 3 member A2)로 이루어진 예후 예측용 유전자 및 CTBPl (C-terminal binding protein 1) , CULl (cul l in 1) 및 UBQLNl (ubiqui l in 1) 로 이루어진 표준 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계 ;
(c) 상기 표준 유전자를 이용하여 상기 예후 예측용 유전자의 mRNA 발현 수 준을 표준화하는 단계；
(d) 상기 유방암 환자의 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계;
(e) 상기 (c) 단계에서의 표준화값 및 상기 (d) 단계에서의 종양의 크기 및 pN-단계를 하기 식 1과 2에 대입하여 수치를 계산하는 단계 [식 1]
Unsealed BCT score (U-BS) = a*ᅀ Ct_UBE2C + b*ᅀ Ct_T0P2A + c*ACt_RRM2 + d*ᅀ Ct_F0XMl + e*ᅀ Ct_MKI67 + f*ᅀ Ct_BTN3A2 + g*Tumor_size(cm) + h*pN(0 or 1)
[식 2]
BCT score = 0 i f 0.8*Unscaled BCT score(U-BS) -13.71 < 0
BCT score = 0.84*U_BS + 26.1 i f 0< 0.8* U-BS -13.71 < 10
BCT score = 10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
(예후 유전자의 값은 표준 유전자를 사용하여 계산된 표준화된 mRNA 발현값 이며, tumor size는 종양의 장축 길이， pN은 림프절 전이의 병리학적 판단에 따라 판정되는 값을 나타냄.
상기 a는 0.16 내지 1.09， b는 0 내지 0.71， c는 0 내지 0.53， d는 0 내지 0.57 , e는 0 내지 0.35， f는 -1.02 내지 0, g는 0.25 내지 1.52 및 h는 0. 19 내지 2.25임) ;및
( f ) 상기 (e) 단계에서 계산된 수치가 클수록 화학치료의 유용성이 큰 것으 로 예측하는 단계 .
상기 (a) 내지 (d) 단계에 대해서는 전술한 바와 동일하다.
(e) 상기 (c) 단계에서의 표준화값 및 상기 (d) 단계에서의 종양의 크기 및 pN-단계를 하기 식 1에 대입하여 수치를 계산하는 단계
[식 1]
Unsealed BCT score (U-BS) = a*ᅀ Ct_UBE2C + b*ᅀ Ct_T0P2A + c*ᅀ Ct_RRM2 + d*ᅀ Ct_F0XMl + e* ᅀ Ct_MKI67 + f*ᅀ Ct_BTN3A2 + g*Tumor_si ze(cm) + h*pN(0 or 1)
(예후 유전자의 값은 표준 유전자를 사용하여 계산된 표준화된 mRNA 발현값 이며, tumor si ze는 종양의 장축 길이， pN은 림프절 전이의 병리학적 판단에 따라 판정되는 값을 나타냄.
상기 a는 0. 16 내지 1.09 , b는 0 내지 0.71， c는 0 내지 0.53， d는 0 내지 0.57， e는 0 내지 0.35， f는 -1.02 내지 0 , g는 0.25 내지 1.52 및 h는 0. 19 내지 2.25임) 상기 유전자 및 tumor size, pN각각에 해당하는 계수와의 선형 조합을 통해 예후 예측 점수를 계산. 증식 유전자 및 tumor si ze , pN은 양의 계수를 가지며， 면 역 유전자는 음의 계수를 가진다. 각 계수는 생존분석 결과 계산된 계수값 (점추정 값)의 95%의 신뢰구간 범위 내에서 적용되며， 바람직하게는 각 계수의 점 추정값 이 사용된다.
Figure imgf000018_0001
바람직하게， 본 발명에 따른 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 방 법은 유방암 환자들의 임상 결과를 지배하는 2가지 주요 생물학적 특성인 면역 반 웅과 세포 증식에 관련되어 있으며 FFPE 검체 조직에서 발현이 안정적이며， 예후에 따른 발현차이가 큰 유전자를 대상으로 선별하고, Cox 분석을 통해 상기 유전자들 및 예후에 중요한 2개의 임상정보 (종양의 크기， pN 단계)에 대한 계수 (coeff icient )를 계산하고， 표준화된 유전자의 발현값， 종양의 크기 및 pN 단계에 곱하여 하기 식 1에 따라 BCT score를 구하여 화학치료의 유용성을 예측할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
[식 1]
Unsealed BCT score = 0.63*ᅀ Ct_UBE2C + 0.32*ᅀ Ct_T0P2A + 0.13*ᅀ Ct_RRM2 + 0.02*ᅀ Ct_F0XMl + 0.04*ᅀ Ct_MKI67 -0.42*ᅀ Ct_BTN3A2 + 0.89*Tumor_size(cm) + 1.22*pN(0 or 1) 상기 예후 예측 인자 (유전자， 임상정보)가 생존율에 영향을 미치는 정도는 Cox 비례 위험 분석 (Cox proport ional hazard analysis)을 통해 정량적인 값으로 나타낼 수 있다. Cox 비례 위험 모형은 예후 인자가 없는 경우의 위험도와 예후인 자가 있는 경우의 위험도의 비례값인 비례위험비 (relat ive hazard rat io, HR)값을 통해 예후 인자가 생존율에 미치는 영향 정도를 표현한다. 비례위험비 (HR)의 값이 1보다 크면 예후 인자가 있는 경우에 없는 경우보다 위험도가 올라가며， 1보다 작 을 경우 예후 인자가 있을 경우 위험도가 더 감소한다. 각 예후 인자에 대한 비례 위험비를 log scale로 전환한 값을 각 인자어† 대한 계수 (coeff icient )라 하며, 이 값을 BCT score 모델의 산출식 계수로 사용한다 (Cox, David R. "Regression models and life-tables. " J ournal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological) (1972)： 187-220.). 유전자의 계수는 교차검증 (cross validation)을 통해 산출식의 결과의 타당성을 검증 판단하였다. 상기 식에서 각각의 "ACt_예후예측용유전자" 에는 각 유전자의 발현량을 표준화한 값이 대입된다. 상기 표준화는 기본 발현량 또는 발현 수준의 차이를 나 타낼 수 있는 유전자의 발현량 또는 발현 수준과의 차이를 통해 이루어지며, 바람 직하게는 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1)， CULl (cullin 1) 및 UBQLNl(Ubiquilin-l)에서 하나 내지 세 개의 유전자의 발현량 (또는 복수의 유전자 가 선별된 경우 이들 발현량의 평균)을 측정하여 이에 대한 비를 산출하는 것에 의 해서 수행될 수 있다. 구체적으로， CTBP1 (C-terminal-binding protein 1 )， CULl (cullin 1) 및 UBQLNKUbiquilin-l)로 이루어진 표준화용 유전자의 발현 평균값에 각 예후예측용 유 전자의 발현값을 빼준 뒤 30을 더한 값을 "ACt_예후예측용유전자" 값으로 하 며， 이 값을 상기 예후 예측용 각 유전자의 표준화값이 된다. 즉, 각각의 예후 예 측용 유전자의 표준화값은 하기 식에 대입하여 계산된다:
[ACt_예후예측유전자=(( _ ^?1+(:1_(:1 1+(:;_1]8(31 1)/3) - Ctᅳ예후예측유전 자 +30]
(상기 "예후 예측유전자" 란 표준화 하고자 하는 UBE2C(Ubiqui tin- conjugating enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alp ha) , RRM2( ribonucleotide reductase M2), FOXMKForkhead box Ml), MKI67(Marker of proliferation Ki-67) 및 BTN3A2(Butyrophilin subfamily 3 member A2) 중 어느 하나를 의미한다. 상기 "Ct" 란 PCR증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 cycle 수를 의미한 다. real-time RT-PCR법을 채용하는 경우, 일반적으로 증폭 사이클수 1 내지 10까 지는 형광 강도의 변화는 노이즈 수준이고 0과 같기 때문에， 이들을 증폭산물 0의 샘플 블탱크라고 간주하고， 이들의 표준편차 SD를 산출하고 10을 곱한 형광값올 임 계값으로 하고， 그 임계값에 최초로 상회하는 PCR 사이클 수를 Ct (cycle threshold) 값으로 한다. 따라서 증폭 산물이 많은 경우， Ct 값은 작은 값이 되고， 증폭 산물이 적을 경우， Ct값은 큰 값이 된다. 본 발명에서는 표준 유전자를 사용하여 각 예후 유전자의 발현값을 표준화하 였으며, 3개의 표준 유전자의 평균 Ct값을 사용하여, 시험상 발생할 수 있는 기술 적인 오류를 최소화하였다. 본 발명에서 상기 [식 1]의 계산값을 직관적인 수치로 표현하기 위하여 하기 [식 2]와 같은 선형변환 ( l inear transformat ion)에 의해 0과 10 사이의 값으로 변 환한다ᅳ
[식 2] (BCT score 계산식)
BCT score =0 i f 0.8*Unscaled BCT score(U-BS) -13.71 < 0
BCT score=0.84*U-BS + 26.1 i f 0< 0.8* U-BS - 13.71 < 10
BCT score=10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
(f ) 상기 (e) 단계에서 계산된 수치가클수톡 화학치료의 유용성이 큰 것으 로 예측하는 단계 : 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명의 유방암 환자의 화학치료 유용성 예 측방법에서 위험군 분류의 정확도를 평가하는 변수인 민감도 (sensit ivity)와 특이 도 (speci f icity)의 합이 최대가 되는 지점을 산출한 결과， 상기 [식 1]에 따라 계 산된 수치값이 22.1을 초과하는 경우에는 화학치료의 유용성이 큰 것으로 (전이 고 위험군)， 22.1 이하인 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 (전이 저위험군.) 판단 할 수 있었다. 한편， 상기 식 KUnscaled BCT score)을 선형 변환한 식 2(BCT score)의 경 우 그 값이 4 이상인 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 (전이 고위험군)인 것으 로， 4 미만인 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 (전이 저위험군) 판단할 수 있 었다. 본 발명에서 상기 "민감도 (sensit ivity)" 란 10년 내 전이된 환자 중 검사 결과에서 고위험군인 비율을 의미하며， 상기 "특이도 (speci f icity)" 는 10년간 무 전이 환자 중 검사 결과에서도 저위험군인 비율을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 BCT score 및 BCT score에 사 용되는 유전자와 임상정보 (즉， 암의 크기 및 pN 단계)의 통계적 유의성을 판단하기 위해， Cox 비례위험 모델을 사용해 분석하여 본 결과， 본 발명에 따른 BCT score가 일반적인 예후의 지표로 사용되는 임상정보 및 이들을 사용한 임상정보 기반 예후 평가모델인 NPI Score , PREDCIT, SNAP보다유의성을 띄는 것으로 확인되었다. 또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 같은 환자군을 대상으로 BCT score 및 타 임상정보 기반 모델들의 c-index를 비교한 결과 BCT score가 가장 높 은 c-index 값을 보이는 것으로 나타나, BCT score가 타 모델보다 더 높은 유방암 예후 예측력을 나타낸다는 것을 확인하였다.
따라서， 본 발명의 상기 알고리즘은 원발성 유방암 (primary breast cancer) 수술 후 추가적인 화학치료가 필요없는 환자를 선별하는데 이용될 수 있다. 본 발 명의 상기 본 알고리즘의 대상 환자군은 바람직하게는 수술 전과 후에도 어떠한 화 학치료를 받지 않은 환자군으로 '좋은 예후 (good prognosi s)' 를 가진 환자군은 10년 내 전이, 재발 또는 전이성 재발의 발생 확률이 낮기에 수술 후 추가적으로 화학치료가 필요하지 않지만 (화학치료의 유용성이 작음)， '나쁜 예후 (poor prognosi s)' 를 가진 집단은 수술 후 10년 내 전이， 재발 또는 전이성 재발의 발생 확률이 높아 수술 후 추가적인 화학치료가 권장될 수 있다 (화학치료의 유용성이 큼 ) . 즉, 본 발명의 상기 식 1 또는 식 1 및 2에 의한 유방암환자의 화학치료 유 용성 예측 알고리즘은 광범위한 임상시료를 대상으로 유방암의 예후와 밀접하게 관 련된 증식관련 유전자， 면역관련 유전자 및 임상정보 (암의 크기 및 pN 단계)를 분 석하여 산출된 것으로 그 예후 예측력이 종래 임상정보 기반 예후 평가모델 등 타 모델보다 더 높은 유방암 예후 예측력을 나타내어， 이를 기초로 한 화학치료의 유 용성 예측 또한 매우 정확하다. 본 발명은 또한 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현 량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제로 구성되는 유방 암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 UBE2C, T0P2A, RRM2, F0XM1, MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제로 필수적으로 구 성되는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물은 CTBPl , CUL1 및 UBQLNl유전자의 발현량올 측 정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현량올 측정하는 제제는 UBE2C, T0P2A, RRM2, FO XMl, MKI67, BTN3A2, CTBPl , CUL1 및 UBQLNl 유전자에 특이적으로 결합하는 프 라이머쌍인 것을 특징으로 할수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머" 는 올리고뉴클레오타이드를 의미 하는 것으로， 핵산쇄 (주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조 건, 즉， 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재， 그리고 적합한 온 도와 PH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는， 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 (natur al ly occurring) dNMP (즉， dAMP,dGMP, dCMP 및 dTMP) , 변형 뉴클레오타이드 또는 비 -자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한， 프라이머는 리보뉴클레오타 이드도 포함할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머 (extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링되어 있는 부위를 차지한다. 본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제 1위치에 상보적인 흔 성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 "상보적" 은 소정의 어닐링 또는 흔 성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 흔성화할 정도로 층분히 상보적인 것을 의미하며， 실질적으로 상보적 (substant ial ly complementary) 및 완전히 상보적 (perfect ly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며， 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서， 프 라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어， "실질적으로 상보적인 서열" 은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라， 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서， 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이 다. 프라이머는， 중합제의 존재하에서 면장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 층분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소， 예컨대， 온 도， 웅용분야 및 프라이머의 소스 (source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴 클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 층분히 안정된 흔성 복합체를 형 성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 "어닐링" 또는 "프 라이밍" 은 주형 핵산에 을리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치 (apposit ion)되는 것을 의미하며， 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합 시켜 주형 핵산또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요 는 없으며, 주형과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 층분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술 한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 이 유전자 서열에 흔성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지 면 층분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당껍자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대， 프라이머 디자인용 프로그램( 예 : PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다. 바람직하게는， 본 발명에서 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 18로 표시되 는 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 유전자의 발현량을 측 정하기 위해 선별된 유전자의 프라이머 및 프로브 서열을 하기 표 3에 나타내었다. 【표 3]
Figure imgf000024_0001
본 발명은 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 키트를 제공한 다. 본 발명은 또한 상기 키트는 CTBPl , CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측정 하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 , BTN3A2 , CTBPl , CUL1 및 UBQLN1 유전자의 PCR에 의한 증폭이 가능한 프라이머쌍 이외에 PCR 반응， 시료 에서의 RNA 분리 및 cDNA의 합성에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및 /또는 시약 을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 흔합하는데 사용될 튜브， 웰 플레이트 및 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 제제를 제조하기 위 한 UBE2C, T0P2A, RRM2, FOXMl , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제 의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 발현량을 측정하는 제제는 CTBPl, CUL1 및 UBQLNl 유전 자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 상기 '유전자의 발현량을 측정하는 제제' 는 앞서 서술한 바와 동일하고， 상기 '화학치료 유용성을 예측할 수 있는 유전자' 는 앞서 서술한 바와 동일하며， UBE2C, T0P2A, RRM2, FOXMl, MKI67, BTN3A2, CTBPl , CUL1 및 UBQLNl로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것이다. 본 발명의 용어 '~을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '~로 구성되는 (consist ing of )' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent ial ly consist ing of ) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
【발명의 효과】
본 발명은 유방암의 예후와 유의한 상관성을 나타내는 유전자군 및 임상정보 를 이용한 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측방법에 관한 것으로， 본 발명의 방 법을 통해 유방암 환자에 대한 화학치료 요법의 유용성을 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있어， 향후 유방암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 알고리즘산출 시험군에서 unsealed BCT score의 분포를 나타낸 결과 이다. 도 2는 알고리즘 산출 시험군 및 검증 시험군에서 BCT score의 분포를 나타 낸 결과이다.
도 3은 BCT score에 따라구분된 고위험군 (화학치료의 유용성이 큰그룹) 및 저위험군 (화학치료의 유용성이 작은 그룹)의 10년 내 무원격전이 생존확률을 나타 낸도면이다.
도 4는 C-index를통한유방암 예후 예측모델들의 예측력 평가 결과를 나타 낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 알고리즘으로 저위험군 환자 및 고위험군 환자를 구 분한후, 화학치료를 받거나 받지 않은 환자집단에서의 10년 간 무원격전이 확률을 계산한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 알고리즘으로 저위험군에 분류된 환자 중, 임상정보 기반 저위험군으로 분류된 환자군에서 화학치료에 따른 10년 내 무원격전이 확률의 차이를 확인한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명을상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
초기 유방암조직의 발현 프로파일의 수집
NCBI의 Gene Expression Omnibus (GEO, www. ncbi .nlm.nih.gov/geo)는 연구자 들이 microarray를 비롯한 유전자 발현 및 돌연변이에 대한 대규모 실험 데이터들 을 저장하는 데이터베이스 사이트이다. 이 사이트의 테이터들은 자유롭게 재분석을 할수 있으며， 본 예후유전자의 도출과정 역시 이 사이트의 자료를 사용하였다.
본 연구에 사용된 microarray 데이터는 'Affymetrix Human Genome U133A Array' 라는 microarray chip을 사용한 데이터로 한정지었다. 이 chip에는 약 2만 2천개의 탐침 (probe)이 존재하며， 각 탐침은 하나의 유전자를 지칭한다. 이러한 chip 분석을 통해 인체 내 대부분의 유전자에 대한 mRNA 발현 정도를 측정할수 있 다.
NCBI GEO 사이트 내에서 'Affymetrix Human Genome U133A Array' 기반의 림프절 음성이며, 수술 후 어떠한 화학치료를 받지 않은 환자군이 대상인 riii croarray 데이터셋을 조사하였으며， 그 결과 다음과 같은 3개의 데이터셋으로부 터 684개의 검체 데이터를 확보하였다. 검체 데이터셋에 대한 정보를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
【표 4】
Figure imgf000027_0001
【표 5]
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Not anrailable
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<실시예 2>
원격 전이성 재발이 없는 생존 (Distant -Metastasis-free survival , DMFS)의 분포에 따라서， 10년 이상 원격 전이성 재발이 없는 집단을 "예후가 좋은 집단" 으로 분류하였으며， 5년 이내에 원격 전이성 재발이 발생한 집단을 "예후가 나쁜 집단" 으로 분류하였다. 이러한 분류기준에 따라 검체 집단을 분류한 결과 212개의 예후가 좋은 집단과 159개의 예후가 나쁜 집단으로 분류가 되었다. 예후가 좋은 집 단에서 평균 DMFS는 13년 이었으며， 예후가 나쁜 집단에서 평균 DMFS는 2.2년이었 다.
<실시예 3>
예후 예측 유전자의 선택
상기 예후가 좋은 집단인 212개의 샘플과 예후가 나쁜 집단인 159개의 샘플 에서 SAM(Signi f icant Analysis of Microarray) 분석을 통해 예후집단 간 발현량이 차이가 나는 유전자를 알아보았다. SAM 분석결과의 q-값을 이용하여 예후가 좋은집 단에서 과발현된 유전자， 예후가 나쁜 집단에서 과발현된 유전자를 선택하였다. 선 택된 유전자를 하나로 합친 결과 총 302개의 중복되지 않는 유전자세트가 만들어졌 고， 이 유전자들의 발현패턴을 알아보기 위한 군집분석을 주성분 분석 (Principal Component Analysis , PCA) 방법을 이용하여 수행하였다. 2개의 주성분을 선택하여 각 주성분에 대해， 관련된 생물학적 기능을 알아보기 위하여， 군집별로 Gene Ontology (GO) 기능분석을 수행하였다.
GO 분석결과 주성분 1은 증식에 집중되어 있고 주성분 2는 면역반응에 집중 되어 있는 것으로 나타났다. 증식과 면역반응에 관여하는 2개의 주성분에 속하는 유전자를 대상으로 예후 집단 간 발현량이 가장 큰 유전자를 각각 선택하였다. 각 유전자세트는 유전자는 증식의 발현패턴을 대표하는 의미에서 p-gene, 면역반웅의 발현패턴을 나타내는 i-gene으로 명명하였다.
상기 p-gene 또는 i-gene으로 분류된 유전자군에서 하기 조건에 맞는 유전자 를 유전자 예후 진단 모델의 후보 유전자로 선별하였다:
( i ) 면역 또는 면역 반응에 높은 연관성이 있음.
( i i ) 검체 간 발현의 차이가큼.
( i i i ) 평균적으로 높은 발현값을 가짐.
( iv) qRT-PCR 실험 결과， FFPE 검체와 frozen 검체에서 발현의 높은 연관성 을 보임.
상기 기준에 따라 선별된 유전자군은 다음과 같다.
(1) 10종의 증식관련 유전자군 (p-genes) ： AURKA, CCNB2, F0XM1 , MKI67, MMP11, FITG1, ACGAP1, 匪 2， T0P2A 및 UBE2C ,
(2) 6종의 면역반응 관련 유전자군 ( i-genes) ： BTN3A2, CCL19, CD2 , CD52 , HLA. DPA1 및 TRBC1 <실시예 4>
유방암 예후 예측 암고리즘 구현을 위하 변수의 서범
<4-1> 알고리즘 구현을 위한 샘플 수득
삼성병원과 아산병원에서 화학치료를 받지 않은 유방암 환자의 샘플을 174개 입수하여 알고리즘의 구현에 사용하였으며, 227개의 샘플을 알고리즘 검증에 사용 하였다.
聊 l 0簾纖 a 0 φ:
수득한환자 샘플의 임상 5정보는 하기 표 6에 나타내었다.
【표 6】 藝 ¾一 1리奢 앞고라즘
fib. of ¾ No. of M
patients * Pat廳纖雄緩膽，: ¾i .:ents *
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¾赫 <4-2> 예후 예측에 사용될 유전자의 선별
앞서 선별된 16유전자는 FFPE 검체에서부터 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행 하여 그 발현값을 계산하였다.
각 유전자의 발현 증가에 따른 원격전이의 위험성의 변화는 Cox 비례 위험 모형을 사용해 파악할 수 있다. Cox 비례 위험 모형에서 일정 시간 간격에서 위험 인자 (유전자)의 유무에 따른 사건 (원격전이)의 발생의 위험 정도의 비를 위험도 (hazard ratio, HR)이라 정의하며， 이러한 위험도가 1보다 크면 위험인자가 사건 발생의 위험을 증가시키는 것이고， 1보다 작으면 위험이 감소됨을 의미한다.
p-genes으로 분류된 증식 관련 유전자는 위험도의 값이 1 이상으로 발현값이 커질수톡 예후에 악영향을 주었으며, 반대로 i-genes로 분류된 유전자는 위험도의 값이 1 이하로 발현값이 커질수록 좋은 예후 결과를 나타내는 것으로 확인되었다. 관찰된 유전자 군 중 예후 예측의 중요도가 다른 유전자보다 높으며， 타 연 구와 예후의 방향성이 일치하는 유전자를 최종 알고리듬에 사용될 유전자로 선택하 였다.
선택된 유전자는 증식 관련 유전자 5개 (UBE2C, T0P2A, MKI67, RRM2, F0XM1) 와 면역반웅 관련 유전자 1개 (BTN3A2)이며， 추가적으로 발현 표준화를 위해 FFPE 조직에 적합한 표준 유전자 3개 (CTBPl, CUL1, UBQLN1)를 기존 논문을 통해 선별해 그 발현값을 분석에 Λ1 "용하였다 (" Identification of novel reference genes using multiplatform expression data and their validation for quantitative gene expression analysis." PLoS One 4(7)： e6162.2009). ,
<4-3> 알고리즘에 사용할 임상정도의 선별
단변량 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 화학치료를 받지 않은 유방암 환자 대상으로 전이성 재발과 연관된 중요한 임상 인자가 무엇인지 확인하였다 (P- value<0.05).
이에 대한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
하기 표 7에 나타낸 바와 같이， pN, 병리학적 병기 (pathologic stage), 암 의 크기 (Tumor size) 및 NPI score가 원격전이에 유의한 인자로 확인되었다. 【표 7] , cox; sia^f Mi ¾' 纖
All Chento KoQ-cheaid
.s>
HR ?5% a ^tue HR 95% a p-value HR 55% 3 p- alue
1.000 1.Q00
1 3.7322:418 5.761 0.000 2.602 1 624 4.KS8 0細 14.832 4.819 45.650 0.000 i 1.000 LOGO 1.000
ρτ Ϊ 1J888L21? 2M ^ L302 Oj()6 2 102 0J81 4.66 & 1.5SS n.906 0100έ
3 1.9990-61? 6,4?1 0.248 1.360 0.416 4441 0.«11 - - - -
IA 1.000 1.000 1.000
ΠΑ 2.4731.479 I¾ 0.901 1.5^2 0,902 1810 0408 5.750 im i9M 0006
ΠΒ M 8.514 Φ.0Φ(ϋ 2J8Q 1.442 5.357 0.002 19.ίί2 4.«39 82,070 Q I0O
ΙΠΑ S 93 1.39925.170 0.016 3.738 0.368 16.091 0.077 - - -: -
1 1.000 1.000 1.000 1
Ifistolo^c Grade 2 1.9821.029 818 0.041 1.771 0.830 3.778 (ϊ.140 1.07 0.416 6.214 0.492
Ϊ 2.79S L368 5.711 Φ.005 2.061 912 4.660 0.082 3,983 080 19J39 0.091
Tumor Si2e - T1 1.121 1.441 繊 0 1.131 0.969 1.321 0 ί19 "79 2275 0 Μ
I 1.000 1.000 1 000
' — 18941.679 4.986 0.0p¾ 1.828 0.996 1355. O OSl 7.652 2240 26.140 0Μ1
t
3 «572.415 7.50? 0M0 2.650 1.436 4.893 0^02 12133 2236 66.930 0.004
4 ᅳ -
NH Score -. 1.9301,546 2.411 Ο,ΘΘΟ 1.6¾4 Ϊ246 2.066 0Λ0Φ 428! ϊ,οη 8i829 0.000
PaAolo^c Std 1 1.000； 1,000 1.000
2 2；9631,837 4.777 0扁 1.86S 1.099 3.174 0.C21 7,80 2.552 23.900 0.000
3 5.9201.39625.112 0,016 3 J29 0.366 16057 0.077 - - - -
- 2.8021.836 Ψ,275 β細. L88S61.165 3 051 0J)lO 7:809 2' 'S2 23.9 OjOOiS
- 1.6131.164 2236'膽 4 1.36Q (S.94 1.949 tf <39 1,996 0.8522 4.673 0,111 이들 중 암의 크기 (Tumor size)는 화학 치료를 받지 않은 유방암 환자군에서 원격 전이성 재발에 중요한 인자이었지만 화학 치료를 받은 유방암 환자군에서는 유의하지 않았다.
pN은 화학 치료를 받지 않은 환자군과 화학치료를 받은 환자군 모두에서 유 의하지만, 화학 치료를 받지 않은 환자군에서의 위험도 (hazard rat io) 값이 화학 치료를 받은 환자군에서의 위험도 값보다 7배 이상 차이가 났다. 즉， pN은 화학치 료를 받은 환자군보다 화학 치료를 받지 않은 환자군에서 더 강력한 원격 전이성 재발에 대한 지표라는 것을 알수 있었다.
병리학적 병기 (Pathologic stage)도 유의한 인자이지만 암의 크기 (tumor size) , pN이 포함된 개념이며， NPI score는 암의 크기， 림프절 전이 정도 등을 바 탕으로 계산되기에 이 지표 역시도 암의 크기와 pN의 정보와 중첩되는 것이어서， 최종적으로 화학 치료를 받지 않은 환자군을 대상으로 한 예후 예측 모델에서 임상 정보는 암의 크기 (tumor size) 및 pN 정보를 선택하였다. <실시예 5>
Cox 비례 위험 모델 기반 BCT score 계산식의 도출 <5-1> 계산식의 도출
증식관련 유전자인 p-gene 그룹 (UBE2C, T0P2A, 腿2， F0XM1 및 MKI67)은 많 이 발현할수록 예후에 나쁜 결과를 나타내며， 면역관련 유전자엔 i_gene(BTN3A2)은 많이 발현할수록 예후에 좋은 결과를 나타낸다. 상기 유전자들을 Cox 비례 위험 분 석을통해 다음과 같은 식을산출하였다.
[Unsealed BCT score 계산식]
Unsealed BCT score (U-BS) = 0.63*ᅀ Ct_UBE2C+0.32*ᅀ Ct_T0P2A + 0.13*ᅀ Ct_RRM2+0.02*ACt_F0XMl+0.04*ACt_MKI67-0.42*ACt_BTN3A2+0.89*Tumor_size(cm) + 1.22*pN(0 orl)
상기 계산식에 따라 Unsealed BCT score(U-BS)를 산출하여 분포를 확인하였 고, 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
BCT Score의 cut-off는 환자를 10년 내 원격 전이성 재발 발생에 대한 저위 험군 또는 고위험군을 분류한다. 위험군 분류의 정확도 (accuracy)의 평가변수가 바 로 민감도 (sensit ivity)와 특이도 (speci f ici ty)이며， 본 발명의 알고리즘에서는 민 감도와 특이도는 다음과 같이 정의된다.
* 민감도 (sensit ivity) : 10년 내 원격 전이성 재발된 환자 중 검사 결과에서 고위험군인 비율.
* 특이도 (speci f icity) : 10년 내 원격 전이성 재발이 없는 환자 중 검사 결 과에서도 저위험군인 비율. '
상기 민감도와 특이도의 값이 클수록 분류가 잘 되었다고 할 수 있지만， 민 감도를 높이면 특이도가 떨어지며， 반대로 특이도를 높이면 민감도가 떨어진다. 본 발명의 알고리즘에서는 민감도와 특이도 모두를 고려하여， 위험군 분류의 cut-off 지점을 민감도와 특이도의 합이 최대가 되도록 하는 BCT score 분류 지점을 계산을 - 통해 산출하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이， 상기한 기준에 따라 민감도와 특이도의 합이 최대 가 되는 지점은 22.13767로 이 지점을 원격전이의 고위험군과 저위험군을 나누는 threshold로 지정하였다. 즉, BCT score(BS)가 22.13767 이상일 경우 원격전이 고 위험군, 미만일 경우 원격전이 저위험군으로 분류할 수 있는 것이다.
<5-2> Scaled 계산식의 도출
상기 실시예 <5-1〉의 계산식을 보다 직관적인 수치로 표현하기 위하여 선형 변환 ( l inear transformat ion)^ 의해 BCT score로 변환하였고, 계산식은 다음과 같 다.
[BCT score(BS) 계산식]
BCT score =0 i f 0.8*U-BS -13.71 < 0
BCT score =0.84*U_BS + 26.1 i f 0< 0.8* U-BS -13.71 < 10
BCT score =10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
상기 계산식에서 BCT score의 값이 0보다 적으면 0으로 치환되며， 10보다 클 경우 10으로 변환된다. BCT score가 커짐에 따라 10년 내 암의 재발， 전이 또는 전 이성 재발의 확률은 커지게 된다.
상기 계산식에 따라 BCT score를 산출하여 그 분포를 확인하였고， 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 BCT score에서 환자를 원격전 이 발생에 대한 고위험군과 저위험군을 분류하는 threshold는 4로 설정 (민감도와 특이도의 합이 최대가 되는 지점) 하였다. 즉， BCT score가 4 이상인 경우에는 재 발， 전이 또는 전이성 재발 고위험군으로， 미만이면 저위험군으로 분류할 수 있다.
<실시예 6>
예후 예측 성능 평가
<6-1> 알고리즘 산출 시험군과 검증 시험군을 통한 성능평가
상기 실시예 5의 계산식에 따라 분류한 고위험군은 저위험군보다 높은 확률 로 재발， 전이 또는 전이성 재발이 발생할 수 있음을 의미한다. 알고리즘 산출 시 험군 (discovery set )과 알고리즘 검증 시험군 (val idat ion set ) 생존분석을 통한 원격 전이성 재발 확률을 추정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이， 알고리즘 산출 시험군과 알고리즘 검출 시험군에 서 BCT score 기반 저위험군의 10년 무원격전이 확률은 각각 97.82%, 96.47%이었으 며, 고위험군의 10년 내 무원격전이 확률은 61, 07%， 76.31%로 두 시험군 모두에서 통계적으로 유의한 10년 내 원격 전이성 재발 확률의 차이가 있음을 확인하였다 (P- values<0.001 , log-rank test ) .
<6-2> 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 모델을 사용한 BCT score의 예후 예 측에 대한 통계적 유의성 검증
BCT score의 원격전이 예측에 대한 통계적 유의성을 검증하기 위해 Cox 비례 위험 분석을 사용해 임상정보 및 임상정보 기반 예후 평가 모델보다 유의성을 가지 는지 분석하였다.
알고리즘 산출 시험군 및 검증 시험군에서 다변량 Cox 비례위험 분석 결과， BCT Score는 예후의 지표로 사용되는 일반적인 임상정보보다 원격전이의 예측에 통 계적으로 유의한 지표로 확인되었다 (p-values<0.05) . 이와 유사하게 BCT Score는 임상정보를 기반으로 하는 예후 모델보다 통계적으로 유의한 지표임이 다변량 Cox 비례위험 분석을 통해 확인할 수 있었다 (p-values<0.05) .
【표 8】
m w ¾예享꿰촉 st« ¾f; CQ* m위零 알： aei춤산출시¾군 ¾i리즘 ¾중시월?
HR 95% CL P value H 9S% C.I. P value
BCT Score 2.2 (1,08:- .S8) 0.030 L88 (1.1(^3.21) 0.022
Ageat surgeiy 1.02 0:364 L«4 (0.98-i.lO) 0.184
Tumor Size 1,50 ((J.47- 74 6.494 0.79 (6.13^1.89) 0.597
No: of LN metastasis 1.53 (ϋ:77-^04) 0.220 0.17 (0Λ2-1.42) 0.103
Histologic Grade 1.36 (0.50-3,69) 0.543 1.51 (0.5*4.27) 0.435 일^리줄산 #시험군 알고리춤 ¾시¾*
H 95% G.L P value HR 95%e.I. value
BCT Score 2.54 0,004 2.02 ami
ΡΪ Score- 1.76 (0:42-7.36) 0.437 1.43 (0,37-5,48)' ϋΜό
PREDICT 1.05 (0;99-1.12) 0.090 0.98 (0i8-1.10) 0.763
SNAP 0.93 (0,74-1.18) .0:545 0,91 (0；71-1.16) 0.438
<6-3> C-index를사용한 BCT score의 예후 예측력 평가
C- index는 0.5에서 1까지의 값을 가지며 0.5에 가까울수록 예후 예측력은 떨 어지며 1에 가까울수톡 높은 예후 예측력을 가진다. BCT score의 예후예측력을 평 가하기 위하여 임상정보 기반 모델과 C-index 비교 평가를 수행하였다.
같은 환자군을 대상으로 BCT score 및 타 임상정보 기반 모델들의 c-index를 비교한 결과 BCT score가 가장 높은 c-index 값을 보이는 것으로 나타났다. 이는 타 예후예측 모델보다 BCT score가 더 높은 예후 예측력을 가졌다는 것을 의미한다 (도 4) .
<실시예 7>
화학치료의 유용성 예측력
상기 실시예 1 내지 6을 통해 확립한 알고리즘을 이용하여 유방암 환자의 화 학치료 유용성을 예측할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
아산병원에서 수술을 받은 환자 검체 346개를 수득하여 본 실시예에 사용하 였다. 화학치료를 받은 검체와 화학치료를 받지 않은 상기 실시예 4의 검체를 본 발명에 따른 알고리즘으로 분석하여 고위험군과 저위험군으로 구분하고， 화학치료 유무에 따른 10년 무원격전이 확률을 비교하였다.
상기 환자의 구체적인 임상 정보를 하기 표 9에 나타내었으며， 무원격전이 확률에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
【표 9】
환자총수 =346 환자수 %
나이 (년)
<50 209 60.4%
>50 137 39.6%
암의크기 (cm)
<2 231 66.8%
2-5 113 32.7%
>5 2 0.6%
AJCC stage (7th ed.)
1 231 66.8%
II 115 33.2%
Histologic grade
1 46 13.3%
2 243 70.2%
3 57 16.5%
NPI정수
1 204 59.0%
2 118 34.1%
3 24 6.9%
보조항암치료
화학지료받지않은겨우 203 58.7%
화학지료받은경우 143 41.3% 도 5에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 알고리즘에 따라 구분된 저위험군에서 는 화학치료를 받지 않는 환자군에서 무원 격전이 확률이 96.0%인데 반해서, 화학 치료를 받은 환자군에서 96.4%로 화학치료를 받은 환자군에서 무원격전이 확를이 0.4% 증가하였다. 이는 저위험군 환자군에서는 화학치료의 이익이 없다고 판단할 수 있다. 한편， 본 발명의 알고리즘에 따라 구분된 고위험군에서는 화학치료를 받 은 환자군의 무원격전이 확률이 91.9%인데 반해, 화학치료를 받지 않은 환자군은 65.4%로 통계적으로 유의하게 화학치료를 받은 환자군의 예후가 더 좋았던 것을 확 인할 수 있었다. 더 나아가 무질병 생존확률 및 전체 생존확률에서도 저위험군은 화학치료 유무에 따른 유의한 생존확률의 차이는 없었으며, 고위험군에서는 유의한 화학치료의 효과를 볼 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 알고리즘에 따라 구분된 각 위험군에서 환자의 무원격전이 생존율 에 영향을 줄 수 있는 인자들에 대한 Cox 비례 위험 모형 기반 단변량 및 다변량 분석 결과 표 10과 같이 저위험군에서는 화학치료가 무원격전이 생존율에 영향을 미치지 않으며， 고위험군에서는 화학치료의 유무가 환자의 무원격전이 생존율에 영 향을 주는 인자로 확인되었다.
【표 10】
단변량분석 다변량분석
H 95% CI. p^value HR 95% C.I. p-value 고위 ¾군(11=80>
수술당시나이 1.08 1.01 1.15 0.020 1.05 0.07 0.97 0.138 암의크기 (≤2cm vs. >2cm) 0.55 0.16 1.88 0.342 - - - -
Histologic grade (Grade 1/2 vs. Grade 3) 0.67 0.18 2.54 0.557 - - - -
ER (IHC) 1.14 0.76 1.71 0.514 - - - -
PR (IHC) 1.04 0.81 1.34 0.760 - - - - 화학치료유무 (HTx vs. HTx+CTx) 0.18 0.05 0.64 0.007 0.26 0.07 0.97 0.045 저위험군 (η=26β>
수술당시나이 0.97 0.90 1.05 0.506 - 암의크기 (≤2cm vs. >2cm) 0.52 0.06 4.23 0.542 -
Histologic grade (Grade 1/2 vs. Grade 3) <0.01 0.00 Inf 0.998 -
ER (IHC) 0.99 0.60 1.62 0.969 · ᅳ - -
PR (IHC) 0.84 0.66 1.07 0.158 · - - - 화학치료유무 (HTx vs. HTx+CTx) 1.11 0.26 4.66 0.889 -
<실시예 8>
화학치료의 유용성 예측력 비교
본 발명의 저위험군 환자군에서 화학치료의 이익이 없다는 점은 임상정보 기 반 위험군 분류 모델인 modi f ied Adjuvant ! On l ine와 비교하였을 때 보다 명확하게 확인되었다. Modi f ied Adjuvant ! Onl ine은 환자의 임상정보를 기반으로 환자의 위 험정도를 예측하여 고위험군 또는 저위험군으로 분류한다. 본 발명의 알고리즘에 따라 저위험군으로 분류된 총 266명의 환자 중 환자의 임상정보 기반 모델인 modif ied Adjuvant ! Onl ine의 위험군 분류에 따라다른 10년 무원격전이 확률을보 이는지 비교하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 알고리즘으로 저위험군에 분류된 환자 중 임상정보 기반 저위험군으로 분류된 환자군에서 화학치료에 따른 10년 내 무원격전이 확률의 차이는 0.3*로， 화학치료로 인해 통계적으로 유의한 무원격전이 생존확률의 증감이 없는 화학치료의 유용성이 없는 환자군임을 확인하였다. 이와 유사하게 본 발명에 따른 알고리즘으로 저위험군에 분류된 환자 중 임상정보 기반 고위험군으로 분류된 환자군에서 화학치료에 따른 10년 내 무원격전이 확률의 차이 는 2.3%로, 화학치료로 인해 통계적으로 유의한 무원격전이 생존확률의 증감이 없 는 것을 확인할수 있었다. 즉, 유방암 진단을 받은 환자로서 본 발명의 알고리즘에 따라 저위험군으로 판단된 특정 환자의 경우에는， 화학치료를 통한 유의한 무원격전이 확률의 증가가 없을 것이라 예측해 볼 수 있으며, 고위험군으로 판단된 특정 환자의 경우에는 화 학치료를 받는 것이 수술 후 10년 내 무원격전이 생존확률이 높아 예후가 더 좋을 것으로 예측해 볼 수 있는 것이다.
【산업상 이용가능성】
본 발명은 유방암의 예후와유의한상관성을 나타내는 유전자군 및 임상정보 를 이용한 유방암 ¾자의 화학치료 유용성 예측방법에 관한 것으로, 본 발명의 방 법을 통해 유방암 환자에 대한 화학치료 요법의 유용성을 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있어, 향후 유방암 치료의 방향에 대한 정보를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할수 있어 산,업상 이용가능성이 매우우수하다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법：
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubi qui t in- conjugat ing enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2( ribonucleot ide reductase M2) , FOXMKForkhead box Ml) 및 MKI67(Marker of prol i ferat ion Ki-67) 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 BTN3A2(Butyrophi 1 in subfami ly 3 member A2) 면역관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 mRNA의 발현수준올 표준화 하는 단계 ; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 표준화된 하나 이상의 증식 관련 유전자 및 면역관련 유전자의 조합에 의해 유방암 환자의 화학치료 유용성을 예측하는 단계로서， 상기 증식관련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 큰 것으로 및 상기 면역관 련 유전자가 과발현된 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 예측하는 단계.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 화학치료의 유용성 예측은 화학치료 후 재발， 전이 및 전이성 재발로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 발생할 것인지 여부를 예 측하는 것을 특징으로 하는 방법 . , '
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 유방암은 에스트로겐 수용체， 프로게스테론 수용체 또 는 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 양성이면서 HER2 음성인 유방암인 것을 특징으로 하는 방법 .
[청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 유방암은 암전이분류 (Tumor Node Metastasis :T匿) 시 스템에 따라 0기 또는 1기로 분류되는 초기 유방암인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5]
제 1항에 있어서， 상기 (a) 단계 이후에 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 (c) 단계에서 종양의 크기가 클수록 및 pN—단계 가 높을수록 화학치료의 유용성이 큰 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6]
제 1항에 있어서， 상기 표준화는 CTBP1 (C-terminal-binding protein 1)， CUL1 (cull in 1) 및 UBQLN1 (Ubiqui 1 in-1)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 표 준유전자의 평균 발현량에 대한 비를 산출하는 것에 의해서 수행되는 것을 특징으 로 하는 방법 .
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 시료는 환자의 암세포를 포함하는 조직의 포르말린 고 정 파라핀 포매 (formal in-fixed paraffin-embedded, FFPE) 시료， 신선한 조직 (fresh tissue) 및 동결 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것올 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 유전자의 발현량을 측정하기 위한 방법은 마이크로어 레이， PCRCpolymerase chain reaction), RT-PCR, 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) , 실시간 중합효소 연쇄반응 (real— time PCR), 노던 블롯 (northern blot), DNA 칩 및 RNA 칩 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
하기 단계를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 (chemotherapy) 유용성 예측 방법:
(a) 유방암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 UBE2C(Ubiqui tin- conjugating enzyme E2C) , T0P2A(Topoi somerase 2 alpha) , RRM2 ( r i bonuc 1 eot i de reductase M2), FOXMKForkhead box Ml), MKI67(Marker of proliferation Ki-67) 및 BTN3A2(Butyrophilin subfamily 3 member A2)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단 계;
(b) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 표준화하는 단계；
(c) 상기 유방암 환자의 종양의 크기 및 pN-단계를 평가하는 단계;
(d) 상기 (b) 단계에서의 표준화값 및 상기 (c) 단계에서의 종양의 크기 및 pN-단계를 하기 식 1과 2에 대입하여 수치를 계산하는 단계 [식 1]
Unsealed BCT score (U-BS) = a*ᅀ Ct_UBE2C + b*-ACt_T0P2A + c*ᅀ Ct_RRM2 + d*ᅀ Ct_F0XMl + e*ᅀ Ct_MKI67 + f*ᅀ Ct— BTN3A2 + g*Tumor_si ze(cm) + h*pN(0 or 1) [식 2] ᅳ
BCT score = 0 i f 0.8*Unscaled BCT score(U-BS) -13.71 < 0
BCT score = 0.84*U-BS + 26. 1 i f 0 < 0.8* U-BS - 13.71 < 10
BCT score = 10 i f 0.8*U-BS -13.71>10
(예후 유전자의 값은 표준 유전자를 사용하여 계산된 표준화된 mRNA 발현값 이며， tumor size는 종양의 장축 길이， pN은 림프절 전이의 병리학적 판단에 따라 판정되는 값을 나타냄.
상기 a는 0. 16 내지 1.09， b는 0 내지 0.71， c는 0 내지 0.53， d는 0 내지 0.57, e는 0 내지 0.35， f는 -1.02 내지 0 , g는 0.25 내지 1.52 및 h는 0. 19 내지 2.25임) ; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 계산된 수치가 클수록 화학치료의 유용성이 큰 것으로 예측하는 단계 .
【청구항 10]
제 9항에 있어서， 상기 (d) 단계에서의 수치가 4 이상인 경우 화학치료의 유 용성이 큰 것으로， 4 미만인 경우 화학치료의 유용성이 작은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 111
UBE2C , T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 조성물.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 조성물은 CTBPl , CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 발현량을 측정하는 제제는 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍인 것을 특징으 로 하는 조성물.
【청구항 14]
제 13항에 있어서， 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 12의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 15】
UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 키트.
【청구항 16】
제 15항에 있어서， 상기 키트는 CTBPl , CUL1 및 UBQLN1 유전자의 발현량을 측 정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 17]
유방암 환자의 화학치료 유용성 예측용 제제를 제조하기 위한 UBE2C, T0P2A, RRM2 , F0XM1 , MKI67 및 BTN3A2 유전자의 발현량을 측정하는 제제의 용도.
【청구항 18】
제 17항에 있어서， 상기 발현량을 측정하는 제제는 CTBPl , CULr및 UBQLN1 유 전자의 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제제의 용도.
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