CN103459597A - 用于预测胃癌预后的标记和用于预测胃癌预后的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预测胃癌预后的标记、用于预测胃癌预后的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含用于测量该标记表达水平的制剂，和使用所述标记预测胃癌预后的方法。根据本发明，可以精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后有利地建立适宜的治疗计划，以显著减少由胃癌引起的死亡。尤其，根据本发明，可以对Ib/II期胃癌患者中已经预测具有消极预后的患者使用用于III期胃癌患者的治疗方法，借此大幅度提高存活率。

Description

用于预测胃癌预后的标记和用于预测胃癌预后的方法

技术领域

本发明涉及用于预测胃癌预后的标记、用于预测胃癌预后的包含测量该标记表达水平的试剂的组合物和试剂盒和使用所述标记预测胃癌预后的方法。

背景技术

在2005年，总计65,479人死于癌症，占全部死亡的26.7%。造成最多死亡的癌症是肺癌，每100,000人群中有28.4位患者死亡（21.1%），按顺序其次是胃癌，22.6位患者死亡（16.8%）；肝癌，22.5位患者死亡（16.7%）；结直肠癌，12.5位患者死亡（9.3%）。已知胃癌是世界范围内因癌症造成的死亡当中造成第二多死亡的因素。

胃癌的症状显示出多个方面，范围从无症状至严重疼痛。此外，胃癌症状似乎像常见的消化症状，没有任何特异特征。通常，在胃癌早期，大部分病例没有症状，即便有任何症状的话，也很轻微，如轻微消化不良或上腹部不适，这造成大部分人忽视并因此可能增加胃癌死亡率。

大部分用于胃癌的检验方法迄今是物理检验方法。首选是胃X射线法，这包括双重对比方法、压缩X射线法、粘膜图法，并且其次是胃镜检查法，所述胃镜检查法通过找到非常小的病灶并且允许在疑似部位进行胃活组织检查而提高诊断率，其中所述非常小的病灶在X射线检查法中通过用肉眼检查胃部时不显现。然而，这种方法具有以下缺点：存在卫生问题和患者在检查期间感觉疼痛。因此，近年来，已经进行了通过测量胃中特异性表达的标记基因的表达水平而诊断胃癌的研究，但是关于预测胃癌患者预后的遗传标记的研究相对较少。

胃癌患者存活率取决于诊断时的病理学分期。根据三星医学中心的数据，胃癌患者的5年存活率如下（KimS等人,Int J Radiat Oncol Biol Phys2005;63:1279-85）。

II期：76.2%，IIIA期：57.6%，

IIIB期：39.6%，IV期26.3%

结果显示早期检出胃癌能明显有助于提高存活率。然而，由于已经诊断为处于相同阶段的胃癌根据患者的不同而显示出了预后的差异，因此精确预测胃癌预后以及早期检出胃癌是有效治疗胃癌的最重要因素。

在另一方面，为诊断胃癌，医生开始对患者实施必要的、据认为是最适宜的治疗方案的检查。存在用于治疗癌症的方法，如手术、内窥镜疗法、化疗和放射疗法。一般通过考虑胃癌疗法、胃癌尺寸、位置和范围、患者总体健康状态以及许多其他因素确定治疗方法。

在仅用手术治疗ΙB/II期胃癌的情况下，已知大约30%患者在5年内复发。在这种情况下，由于不能预测胃癌在哪些患者中复发，因此不同医生采用不同疗法。因此，如果可以精确预测胃癌患者预后，则可以基于这种预后确定适宜的治疗方法，如手术或化疗，这可能很有助于胃癌患者存活，并且因此需要可以精确预测胃癌患者预后的技术。

常规上，已经使用解剖观察法（癌细胞侵入程度和转移的淋巴结数目）以便预测胃癌患者的预后，但是该方法存在医师主观判断的可能介入和精确预测预后的局限。

发明内容

发明公开

技术问题在这种背景下，作为研究可以通过精确预测胃癌预后并根据预测的预后确定适宜治疗方向而提高胃癌患者存活率的结果，本发明人确定，可以通过鉴定用于预测胃癌预后的标记并且测量所述标记的表达水平来精确预测胃癌预后，以便完成本发明。

技术方案

本发明的目的是提供一种用于预测胃癌预后的标记，所述标记包括选自以下的一个或多种基因：C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1、THBS4、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、NOX4、TFDP1、ADRA2C、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MRGPRX3、ALAS1、CASP8、CLYBL、CST2、HSPC159、MADCAM1、MAF、REG3A、RNF152、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的组合物，所述组合物包含用于测量用于预测胃癌预后标记的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量用于预测胃癌预后标记的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）获得从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式；和b）比较从步骤a）所获得的表达水平或表达模式与预后已知的胃癌患者中相应基因的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式。

本发明的另一个目的是提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）测量从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式，以获得定量的表达值；b）将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分；和c）将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者的预后。

有益效果

根据本发明，可以迅速和精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后确定适宜的治疗，这具有有助于显著减少由胃癌引起的死亡的优点。尤其是，根据本发明，可以通过使用针对III期胃癌所开发的靶向疗法大幅度提高存活率，因为Ib/II期胃癌患者当中已经预测具有消极预后的患者显示与III期胃癌患者相似的预后并且耐受现有的标准化疗。

附图简述

图1是显示在使用参比基因基于分位数归一化和自我标准化的多种风险之间关系的图。

图2代表根据C20orf103、COL10A1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图3代表根据MATN3、FMO2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图4代表根据FOXS1、COL8A1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图5代表根据THBS4、ALAS1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图6代表根据CASP8、CLYBL基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图7代表根据CST2、HSPC159基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图8代表根据MADCAM1、MAF基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图9代表根据REG3A、RNF152基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图10代表根据UCHL1、ZBED5基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图11代表根据GPNMB、HIST1H2AJ基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图12代表根据RPL9、DPP6基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图13代表根据ARL10、ISLR2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图14代表根据GPBAR1、CPS1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图15代表根据BCL11B、PCDHGA8基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图2至图15的p-值是借助高表达或低表达和基因表达水平划分基因的表达水平并进行对数秩检验的结果值。

图16是显示积极预后组（低风险）或消极预后组（高风险）的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲线，所述组根据使用表5中所列出基因的预后预测模型划分。

图17是显示Ib/II期胃癌患者的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲线，所述Ib/II期胃癌患者使用表5中所列出基因的预后预测模型划分成积极预后组或消极预后组。

图18是显示积极预后组（低风险）或消极预后组（高风险）的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲线，所述组根据使用表7中所列出基因的预后预测模型划分。图18中的HR是累积性风险函数比，并且使用100个排列计算p-值。

图19是通过划分患者（高对低）后患者组的Kaplan-Meier曲线，其中根据使用表7中列出的基因并根据病理学分期（IB+II对III+IV）的预后预测模型将所述患者分类。通过双侧对数秩检验计算p-值。

图20代表根据CDC25B、CDK1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图21代表根据CLIP4、LTB4R2基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图22代表根据NOX4、TFDP1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图23代表根据ADRA2C、CSK基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图24代表根据FZD9、GALR1基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图25代表根据GRM6、INSR基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图26代表根据LPHN1、LYN基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图27代表根据MRGPRX3基因的表达水平的Kaplan-Meier曲线。

图20至图27的p-值是借助高表达或低表达和基因表达水平划分基因的表达水平并进行对数秩检验的结果值。

图28代表在表10中列出的基因的GCPS的临界值分析。最佳区分是将患者划分为高风险组75%和低风险组25%的情况。

图29代表基于表10中列出的基因的GCPS的优化临界值，在发现集合中的II期胃癌患者的无疾病存活率。

图30代表发现集合对验证集合中表10中列出的基因的GCPS的分布，并且显示发现集合中GCPS的分布与发现集合中GCPS的分布重合。这代表这种测定法的分析稳健性。

图31代表根据预定义算法GCPS和临界值（红色=高风险）的验证队列的无疾病存活率。

图32代表II期胃癌患者的无疾病存活率，其中所述II期胃癌患者基于表11中列出的基因的GCPS接受手术和放射疗法。蓝颜色代表由GCPS定义的高风险。

图33代表II期胃癌患者的无疾病存活率，其中所述II期胃癌患者仅基于表11中列出的基因的GCPS接受手术。蓝颜色代表由GCPS定义的高风险。

具体实施方式

优选发明模式

作为实现目标的一个方面，本发明提供用于预测胃癌预后的标记，所述标记包括选自以下基因的一个或多种：C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1、THBS4、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、NOX4、TFDP1、ADRA2C、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MRGPRX3、ALAS1、CASP8、CLYBL、CST2、HSPC159、MADCAM1、MAF、REG3A、RNF152、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的组合物，所述组合物包含用于测量用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

虽然处于相同病理学分期，但是每种胃癌的临床预后是不同的，并且必须根据这种预后使用适宜的治疗方法以便增加胃癌患者的存活率。因而，本发明提供一种用于预测胃癌预后的组合物，所述组合物包含用于预测胃癌预后的标记和用于测量其表达水平的试剂，以便精确预测被诊断患有胃癌的患者的预后并且基于预测的预后确定适宜治疗方向，以增加胃癌患者的存活率。

如本文所用，术语“标记”指与生物学现象的存在定量或定性相关的分子，并且本发明的标记指作为预测胃癌患者存在良好或不良预后的基础的基因。

本发明的标记具有用于预测胃癌预后的显著低的p-值和高度可靠性，并且尤其，表5、7、10和11中列出的标记可以根据所述标记的表达水平，将患者组划分成积极预后组或消极预后组，并且可以通过测量标记的表达水平精确地预测胃癌患者的预后，因为根据显示这些组的存活率的Kaplan-Meier曲线，积极预后组的存活率高于消极预后组的存活率。

如本文所用，术语“预后”指关于医学发展（例如，长期存活可能性、无疾病存活率等）的预期，包括积极预后或消极预后，所述消极预后包括疾病进展如复发，肿瘤生长、转移和耐药死亡率（mortality），并且积极预后包括疾病缓解如无疾病状态，疾病改善如肿瘤消退或稳定（stabilization）。

如本文所用，术语“预测”指关于医学发展的猜测，并且出于本发明的目的，指猜测诊断为胃癌的患者的疾病发展（疾病进展、改善、胃癌复发、肿瘤生长、耐药）。

在本发明的例子中，通过将诊断患有胃癌的患者划分成积极预后组或消极预后组来预测胃癌患者的预后，并且另外，通过根据所述预后划分诊断存在胃癌病理学分期的患者来预测胃癌患者的预后（实施例7至9）。

用于预测胃癌预后的标记可以优选地是以下基因的组合：C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1和THBS4基因；以下基因的组合：ALAS1、C20orf103、CASP8、CLYBL、COL10A1、CST2、FMO2、FOXS1、HSPC159、MADCAM1、MAF、REG3A、RNF152、THBS4、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因；以下基因的组合：C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因；或以下基因的组合：ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因；并且更优选地是以下基因的组合：C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因，或以下基因的组合：ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因。

本发明人确定通过以下方法，以上基因可以精确地预测胃癌预后。本发明人从福尔马林固定的石蜡包埋的胃癌肿瘤组织中提取RNA，使用提取的RNA和全基因组DASL测定试剂盒（Whole-Genome DASL assay kit）测量基因表达水平，并且随后使用其中将基因表达水平作为连续变量处理的Cox比例风险模型（Cox proportional hazard model）进行标准统计分析（standard statistical analysis）。作为结果，鉴定到与无疾病存活率存在巨大相关性的、用于通过单变量分析（Univariate analysis）预测胃癌预后的369种基因（表2），和用于预测病理学分期Ib/II胃癌预后的基因（表3）。随后，通过对鉴定的基因的表达水平应用superPC算法，产生包含表5中基因的预后预测模型，并且根据这个预测模型，将胃癌患者划分成积极预后组或消极预后组。通过显示积极预后组的存活率高于消极预后组（实施例7和图16、图17），Kaplan-Meier曲线针对划分组的结果验证了使用本发明标记的预后预测模型的有效性和可靠性。此外，通过对鉴定的基因的表达水平应用梯度套索算法（gradient lasso algorithm）而产生的包含表7中基因的预后预测模型并且将胃癌患者划分成积极预后组或消极预后组的结果确定这种分类与临床结果重合（实施例8和图18、图19）。

如本文所用，术语“用于测量标记的表达水平的试剂”指可以用来确定标记基因或由这些基因编码的蛋白质的表达水平的分子，并且可以优选地是对对所述标记特异的抗体、引物或探针。

如本文所用，术语“抗体”是本领域已知的术语，指针对抗原性位点的特异性蛋白质分子。出于本发明的目的，抗体指与本发明标记特异性结合的抗体并且可以通过常规方法从标记基因编码的蛋白质中制备，其中通过以常规方式将每种基因克隆至表达载体中获得所述蛋白质。其中，包括可以从所述蛋白质产生的部分肽。

如本文所用，术语“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3′末端羟基（游离3`羟基）的核酸序列，它可以与互补模板（template）形成碱基对（base pair）并充当复制模板的起点。在本发明中，可以通过以下方式预测胃癌预后：通过进行使用本发明的标记多核苷酸的有义和反义引物的PCR扩增，所需的产物是否产生。可以基于本领域已知内容修改PCR条件和有义引物和反义引物的长度。

如本文所用，术语“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记（Labeling）作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA（single stranded DNA）探针、双链DNA（double stranded DNA）探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测胃癌预后。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体（例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等），或修饰带电荷的连接体（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）。

在本发明中，用于预测胃癌预后的标记的表达水平可以通过确定标记标记基因的mRNA或由所述基因编码的蛋白质的表达水平来确定。

如本文所用，术语“测量mRNA的表达水平”指确定生物样品中标记基因的mRNA存在及其表达水平以便预测胃癌预后的过程并且通过测量mRNA的量可实现。用于此目的分析方法是但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR（competitive RT-PCR）、实时RT-PCR（Real-time RT PCR）、RNA酶保护测定法（RPA；RNase protection assay）、northern印迹法（northern blotting）、DNA微阵列芯片等。

如本文所用，术语“测量蛋白质的表达水平”指确定生物样品中标记基因内表达的蛋白质存在及其表达水平以便预测胃癌预后的过程，并且可以通过使用与上述基因中表达的蛋白质特异性结合的抗体来确定蛋白质的量。用于此目的分析方法是但不限于western印迹法（western blotting）、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射性免疫测定（Radioimmunoassay）、放射性免疫扩散法（Radioimmunodiffusion）、奥克特洛尼（Ouchterlony）免疫扩散法、火箭（Rocket）电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法（immunoprecipitation assay）、补体结合测定法（complete fixation assay）、FACS、蛋白质芯片（protein chip）等。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

本发明的试剂盒可以用于鉴定用于预测胃癌预后的标记的表达水平以便预测胃癌预后。

本发明的试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、实时RT-PCR试剂盒、实时QRT-PCR试剂盒、微阵列芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。

本发明的试剂盒可以不仅包含用于测量预测胃癌预后的标记的表达水平的引物、探针，或特异性识别所述标记的抗体，还包含适用于分析方法的一类或多类其他组分的组合物、溶液或装置。

根据本发明的例子，用于测量标记基因的mRNA的表达水平的试剂盒可以是包含进行RT-PCR所要求的必需要素的试剂盒。除了对标记基因特异的每对引物之外，这种RT-PCR试剂盒还可以包含试管或其他适宜容器、反应缓冲溶液、脱氧核苷酸（dNTPs）、Taq-聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂和DEPC水（DEPC-water）以及无菌水。

根据本发明的另一个例子，用于测量标记基因编码的蛋白质的表达水平的试剂盒可以包含底物、适宜的缓冲溶液、以生色酶或荧光物质标记的第二抗体和生色底物。

根据本发明的另一个例子，本发明中的试剂盒可以是用于检测预测胃癌预后的标记的试剂盒，其包含为进行DNA微阵列芯片所要求的必需要素。DNA微阵列芯片试剂盒可以包含底物，其中作为探针的基因或与其片段相对应的cDNA与所述底物连接，并且所述底物可以包括定量性对照基因或与其片段相对应的cDNA。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）获得从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式；和b）比较步骤a）中所获得的表达水平或表达模式和预后已知的胃癌患者中相应基因的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式。

如本文所用，术语“从胃癌患者采集的样品”可以是但不限于源自胃癌患者胃部的组织、细胞、全血、血清、血浆，并且优选地是胃肿瘤组织。

如本文所用，术语“预后已知的胃癌患者”指在诊断为患有胃癌的患者当中其疾病进展已经被揭示的患者，例如，因手术后3年内复发而证实具有消极预后的患者或因手术后彻底治愈而证实具有积极预后的患者，并且可以通过从样品获得并且比较表达水平或表达模式精确预测待发现其预后的患者的预后，其中所述样品从上述患者和待发现其预后的患者采集。

根据本发明的例子，可以通过以下方式预测预后：测量来自许多胃癌患者的标记基因的表达水平或表达模式，用所述患者的预后建立测量值的数据库，并且将待发现其预后的患者的表达水平或表达模式输入数据库中。在这种情况下，已知的算法或统计分析程序可以用来比较表达水平或表达模式。此外，该数据库可以进一步再划分成病理学分期、接受的治疗等。

根据本发明的例子，在步骤a）和b）中的胃癌患者是接受相同治疗的患者，并所述治疗可以是放射性疗法、化疗、化放疗、辅助化疗（adjuvant chemotherapy）、胃切除术、胃切除术后化疗或化放疗和辅助化疗或手术后无放射性疗法情况下的胃切除术。

根据本发明的例子，胃癌可以是Ib期或II期胃癌。

在本发明中，可以在mRNA或蛋白质的水平测量标记基因的表达水平，并且可以使用公众已知的方法从生物样品分离mRNA或蛋白质。

用于测量mRNA或蛋白质的水平的分析方法如上文所述。

借助以上分析方法，从预后已知的胃癌患者的样品中测量的胃癌基因标记的表达水平可以与从待发现其预后的患者的样品中测量的胃癌基因标记的表达水平相比较，并且可以通过确定所述表达水平的增加或减少而预测胃癌预后。换言之，如果通过比较表达水平的结果，待发现其预后的患者的样品显示与存在积极预后的胃癌患者的样品相似的表达水平或表达模式，则可以确定具有积极预后，并且相反地，如果它显示与存在消极预后的胃癌患者的样品相似的表达水平或表达模式，则可以确定具有消极预后。

根据本发明的例子，可以通过以下方式预测预后：将标记基因的表达水平与选自表4中列出的基因中的一个或多种基因的表达水平比较并归一化，并且随后使用归一化（normalization）的表达水平。

作为另一个方面，本发明提供一种用于预测胃癌预后的方法，所述方法包括a）测量从胃癌患者采集的样品中用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平以获得定量的表达值；b）将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分；和c）将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者的预后。

步骤a）是用于定量测量标记基因的表达水平的步骤。可以使用已知软件、试剂盒和系统来定量如上文所述的用于测量mRNA或蛋白质水平的分析方法所测量的表达水平，获得标记基因的定量表达值。根据本发明的例子，测量标记基因的表达水平可以使用nCounter分析试剂盒（NanoString Technologies）进行。在这种情况下，标记基因的表达水平可以通过与参比基因的表达水平比较而进行归一化。根据本发明的例子，测量的标记基因表达水平可以通过与选自表4内所列出的参比基因中的一个或多个参比基因的表达水平进行比较而归一化。

根据本发明的例子，在步骤a）中，可以测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因，或者ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因的mRNA或蛋白质的表达水平。

步骤b）是将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分的步骤。

根据本发明的例子，这个预后预测模型可以表述为：

[S=β₁x₁+...+β_nx_n]

其中，x_n是第n个基因的定量表达值，

β_n是第n个基因的Cox回归估计值（Cox Regression estimate），并且

S代表胃癌预后评分。

步骤c）是将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定患者预后的步骤。

可以将参比值确定为在多个胃癌预后评分分布中第三个四分位数（third quartile）的临界值至第四个四分位数的临界值的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标记基因的表达值来获得所述多个胃癌预后评分分布。此外，可以将参比值确定为在多个胃癌预后评分分布中第二个四分位数（Second quartile）的临界值至第三个四分位数的临界值的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标记基因的表达值来获得所述多个胃癌预后评分分布。优选地，可以将参比值确定为在多个胃癌预后评分分布中第三个四分位数的临界值至第四个四分位数的临界值的范围内的值，其中通过输入来自多位胃癌患者的标记基因的表达值来获得所述多个胃癌预后评分分布。

四分位数的临界值可以定义为在多位胃癌患者根据胃癌预后评分的尺度而分布时，与1/4、2/4、3/4和4/4点相对应的值。在这种情况下，第四个四分位数的临界值可以是从患者所获得的胃癌预后评分当中最大的评分。

根据本发明的一个例子，可以确定具有步骤b）中获得的与参比值相同或较之更大的胃癌预后评分的病例具有消极预后。

根据本发明的一个例子，该临界值可以是0.2205或-0.4478，并且可以确定具有步骤b）中获得的与临界值相同或较之更大的胃癌预后评分的病例具有消极预后。优选地，如果在步骤a）中测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4，LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因的表达水平，则临界值可以是0.2205，并且如果在步骤a）中测量ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因的表达水平，则临界值可以是-0.4478。

在本发明的一个例子中，通过应用梯度套索算法而产生包含表10和表11中基因的预后预测模型，并且通过比较胃癌预后值将胃癌患者划分成积极预后组或消极预后组，其中通过输入表达值和参比值至上式而获得所述胃癌预后值。通过证实消极预后组（高风险）的存活率显著低于积极预后组（低风险）（实施例9，和图29、图31、图32），针对划分组的Kaplan-Meier曲线结果验证了使用本发明标记的预后预测模型的有效性和可靠性。此外，根据以仅接受胃切除术的患者作为受试者而测量标记基因的表达水平所获得的胃癌预后值划分患者的结果确定了，通过证实消极预后组（高风险）的存活率显著低，也可以用本发明的标记预测仅接受胃切除术的患者的预后（实施例9和图33）。

因此，可以根据本发明精确地预测胃癌预后，并且可以获得与预测的预后一致的适宜治疗方案的益处。例如，可以确定对经判定具有积极预后的患者进行标准疗法或侵入性较小的治疗选项，可以确定对经判定具有消极预后的患者进行用于早期胃癌患者的治疗方法或非常具有侵入性（invasive treatment）或实验性疗法。具体而言，对于经诊断患有Ib或II期胃癌的患者，可以根据本发明预测的预后选择适宜治疗方法，因为这些患者可能显示不同的预后。例如，用于III期胃癌患者的治疗方法如手术或抗癌药物可以用于经诊断患有Ib或II期胃癌的患者中预测具有消极预后的患者。

发明方式

下文通过提供实施例更详细地描述了本发明。然而，这些实施例仅意在说明，而不以任何方式限制要求保护的发明。

实施例1：胃癌患者的选择

本研究在三星医学中心（Samsung Medical Center）和三星癌症研究所（Samsung CancerResearch Institue）按照赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki）而实施。本研究由三星医学中心指导委员会批准。在1994年至2005年12月期间，1152位患者的队列（cohort）根据以下标准选自1557位在5-FU/LV（INT-0116方案）辅助化疗后准接受胃切除术的患者：

1）腺瘤组织学诊断，切除肿瘤，无残余肿瘤，

2）D2淋巴结清扫术（D2lymph node dissection），

3）年满18岁的男性和女性，

4）根据AJCC（美国癌症联合委员会）第6版，病理学分期Ib（T2bN0、T1N1或不是T2aN0）至IV期，

5）完整保留手术记录和治疗记录，且根据以下方法接受5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸（5-fluorouracil/leucovorin）辅助化疗（INT-0116方案）至少2次的患者。即，这样的患者，其接受化放疗（总计4500cGy辐射，每日180cGy，1周/5日，持续5周），随后施用5-氟尿嘧啶（400mg/m²/日）和甲酰四氢叶酸（20mg/m²/日）5日（1次），和额外施用1次5-氟尿嘧啶（400mg/m²/日）和甲酰四氢叶酸（20mg/m²/日）。

1557位患者组中有405位患者从本分析中排除，归因于如下原因：

1）接受5-FU/LV辅助化疗少于2次的患者（N=144），

2）显微镜下存在阳性切缘（microscopically positive resection margin）的患者（N=73），

3）双重原发性癌症（double primary cancer）患者（N=53），

4）胃次全切除术后残余胃（remnant stomach）内胃癌复发的患者（N=5），

5）无完整医疗记录的患者（N=11），

6）使用非INT-0116方案的方案的患者（N=65）

7）其他（N=54）。

这项研究采用432位患者进行，其从1557位初步筛选的患者中二次筛查1152位患者后最终随机筛选而来，并且表1中显示了所述患者的医学特征。432位患者根据胃癌病理分期的分类显示了以下组成：Ib期68位、II期167位、IIIA期111位、IIIB期19位和IV期67位（表1）。

表1

实施例2：从胃肿瘤提取RNA

从实施例1中最终筛选的胃癌患者的胃肿瘤提取RNA。为此目的，选择由最大肿瘤组成的原发性肿瘤石蜡块（primary tumor paraffin block）。RNA从福尔马林固定、石蜡包埋的组织（formalin-fixed，paraffin-embedded tissue）中4μm厚度的2至4块切片提取，并且在移至提取管之前，通过微切割法（microdissection）移除非肿瘤要素。随后，根据制造商的说明书，使用High Pure RNA Paraffin试剂盒（Roche Diagnostic,Mannheim,德国）或E.Z.N.A.

FFPE RNA分离试剂盒（Omega Bio-Tek,Norcross,GA,美国）提取完整RNA。使用NanoDrop8000分光光度计（Thermo Scientific）测定提取的RNA的浓度，并且将其在使用之前贮存在-80°C的低温。在实验中，作为不适宜的样品，浓度小于40ng/μl并且A260/A280比率小于1.5或A260/230比率小于1.0的RNA样品不用分析中。

实施例3：全基因组表达概况（Whole genome expression profiling）

根据制造商的说明书，用200ng实施例2中提取的RNA进行Illumina全基因组DASL

（Illumina Whole-Genome DASL

）（cDNA介导的复性、选择、延长和连接，Illumina，美国）测定法。首先，通过以下方式制备PCR模板：使用生物素化的寡-dT（biotinylatedoligodT）引物和随机引物（random primers）将完整RNA逆转录成cDNA，使生物素化的cDNA与一对查询寡聚物（query oligos）复性，延伸查询寡聚物之间的空位并且随后连接。随后，使用一对通用PCR引物（universal PCR primers）扩增的PCR产物与人Ref-8表达珠芯片（humanRef-8Expression BeadChip）（>24,000种注释的转录物）杂交。在杂交后，使用iScan（Illumina，美国）扫描人Ref-8珠芯片。

实施例4：全基因组DASL测定法的质量控制（Quality control of Whole-Genome DASLassay）

过滤并且移除在实施例3中使用的人Ref-8表达珠芯片的24,526种探针当中称作“不存在”的探针。过滤后留下的17,418种探针用于稍后的分析中。将探针的强度通过以2）为底数的对数（logarithm with base2）进行修正并且使用分位数归一化算法归一化（normalization）。作为结果，使用17,418种探针和432份样品进行统计分析。

实施例5：胃癌预测基因的鉴定

为了鉴定其表达水平与临床结果如无疾病存活（disease free survival，DFS）相关的基因，使用Cox比例风险模型（Cox proportional hazard model）进行标准统计分析（standardstatistical analysis），以处理作为连续变量（continuous variables）的基因表达水平。作为结果，通过单变量分析（Univariate analysis）鉴定到17,418种探针当中与无疾病存活率存在显著相关的369种探针，并且表2中显示了该结果（p<0.001）。

此外，由于重要的是预测Ib/II期（stage Ib/II）患者的预后，用样品中从Ib/II期患者采集的样品作为对象、以同上文一样的方式鉴定对Ib/II期特异的胃癌预后基因，并且表3中显示了该结果。表3中的p值（p value）代表基因表达水平对临床预后的影响程度，其中较低的p值更显著地影响预后，并且风险比代表对胃癌复发率的影响程度，数字增加或下降具有显著的含义。

根据表2和表3，鉴定到众多Ib/II期特异性预后基因的存在，不过采用整组患者作为对象所鉴定到的预后基因与采用Ib/II期患者作为对象所鉴定到的预后基因重合。

表2

表3

引物编号	符号	登录号	P值	风险
					ILMN_1736078	THBS4	NM_003248.3	1.38572E-06	1.682498015
ILMN_1713561	C20orf103	NM_012261.2	2.55588E-06	1.478694678
					ILMN_1776490	C17orf53	NM_024032.2	6.03826E-06	0.34241099
ILMN_1755318	HIST1H2AJ	NM_021066.2	1.2522E-05	0.470375569
					ILMN_1769168	ARL10	NM_173664.4	1.4066E-05	1.561604462
ILMN_2180606	NAT13	NM_025146.1	1.73444E-05	0.33114386
					ILMN_1726815	HIST1H3G	NM_003534.2	2.23113E-05	0.599169194
ILMN_1663786	EPB41	NM_203342.1	5.97621E-05	0.488778032
					ILMN_1789955	PNRC1	NM_006813.1	7.41079E-05	1.448627279
ILMN_1762003	SEC62	NM_003262.3	8.06626E-05	0.374133795
					ILMN_1757060	CAMK2D	NM_172115.1	8.99236E-05	0.276235186
ILMN_1721127	HIST1H3D	NM_003530.3	0.000100991	0.360536141
					ILMN_2390544	DKFZP564J102	NM_015398.2	0.000123879	1.538277475
ILMN_2249018	LOC389816	NM_001013653.1	0.000139453	0.427195449
					ILMN_1694877	CASP6	NM_001226.3	0.000139804	0.325712607
ILMN_2103685	DEPDC1B	NM_018369.1	0.00014085	0.366505298
					ILMN_1694472	GCK	NM_033508.1	0.000145382	1.428117308
ILMN_1769207	KCTD7	NM_153033.1	0.000190952	1.585238708
					ILMN_1738116	TMEM119	NM_181724.1	0.000198141	1.489761712
ILMN1725314	GBP3	NM_018284.2	0.000198903	0.361133685
					ILMN_1784871	FASN	NM_004104.4	0.000207395	0.056877471
ILMN_1652716	THEX1	NM_153332.2	0.000207846	0.288484984
					ILMN_2050761	EIF4E	NM_001968.2	0.00025774	0.385622247
ILMN_1747911	CDC2	NM_001786.2	0.000263771	0.568007158
					ILMN_1795340	TMPO	NM_001032283.1	0.000264185	0.26979899
ILMN_1780769	TUBB2C	NM_006088.5	0.00027646	0.339197541
					ILMN_2318430	EIF5	NM_001969.3	0.000283832	0.321862089
ILMN_2051373	NEK2	NM_002497.2	0.000305397	0.631359834
					ILMN_1736176	PLK1	NM_005030.3	0.000307467	0.515204021
ILMN_1742238	SET	NM_003011.2	0.000327498	0.403070785
					ILMN_2159044	PDF	NM_022341.1	0.000327825	0.457651002
ILMN_1678669	RRM2	NM_001034.1	0.000346452	0.717686042
					ILMN_1721963	MEN1	NM_130801.1	0.000353953	0.671478274
ILMN_1701331	UBE2M	NM_003969.3	0.000388326	0.036042361
					ILMN_1797693	BRI3BP	NM_080626.5	0.000397118	0.239964969
ILMN_2375386	RNPS1	NM_080594.1	0.000413055	0.225058918
					ILMN_2390974	DNAJB2	NM_006736.5	0.00042772	11.00703115
ILMN_1727709	GPBAR1	NM_170699.2	0.00045926	1.658706421

引物编号	符号	登录号	P值	风险
					ILMN_1792110	C10orf76	NM_024541.2	0.000466902	1.369140571
ILMN_2041327	MRPL37	NM_016491.2	0.000469554	0.053735215
					ILMN_1680419	ASB7	NM_024708.2	0.000480501	0.417937044
ILMN_1684873	ARSD	NM_001669.2	0.000494954	1.491248628
					ILMN_2414399	NME1	NM_000269.2	0.000513696	0.635435354
ILMN_1729368	FZD8	NM_031866.1	0.000538803	1.491192988
					ILMN_2354269	FAM164C	NM_024643.2	0.000560341	0.580400914
ILMN_2220187	GFPT1	NM_002056.1	0.000563592	0.444796775
					ILMN_1693669	WDR79	NM__018081.1	0.000579389	0.432824705
ILMN_2155998	PSMD6	NM_014814.1	0.000581349	0.42069481
					ILMN_2116556	LSM5	NM_012322.1	0.00059526	0.244672115
ILMN_1695079	ZNF101	NM_033204.2	0.000608109	0.497757641
					ILMN_1661424	THAP6	NM_144721.4	0.000613204	0.505963223
ILMN_1705861	AP1M2	NM_005498.3	0.000620207	0.487707134
					ILMN_1788489	HIST1H3F	NM_021018.2	0.000652917	0.536377137
ILMN_1740842	SALL2	NM_005407.1	0.000652976	1.634825796
					ILMN_1677794	BRCA2	NM_000059.3	0.000653428	0.521624269
ILMN_1712755	LRRC41	NM_006369.4	0.000655598	0.254806566
					ILMN_1765532	RDBP	NM_002904.5	0.000661777	0.226006062
ILMN_1655734	BXDC5	NM_025065.6	0.000691174	0.321806825
					ILMN_1665515	MGC4677	NR_024204.1	0.000696851	0.379310859
ILMN_1652280	FBXO32	NM_058229.2	0.000697182	4.158410279
					ILMN_1758067	RGS4	NM_005613.3	0.000731812	1.448721169
ILMN_1677636	COMP	NM_000095.2	0.000731916	1.358640294
					ILMN_2148796	MND1	NM_032117.2	0.000846675	0.525138393
ILMN_1804090	SLC25A10	NM_012140.3	0.000856602	0.410793488
					ILMN__2358914	SLC35C2	NM_015945.10	0.000884827	0.309429971
ILMN_1771385	GBP4	NM_052941.3	0.000892961	0.535961124
					ILMN_1780667	WDR51A	NM_015426.3	0.000908419	0.509178934
ILMN_1710752	NAPRT1	NM_145201.3	0.000910567	0.122773656
					ILMN_1774589	IQCC	NM_018134.1	0.000939997	0.39966678
ILMN_1732158	FMO2	NM_001460.2	0.000962173	1.34318011
					ILMN_1735453	FAM98A	NM_015475.3	0.000981164	0.237917743
ILMN_2265759	SLC2A11	NM_030807.2	0.001008065	1.348676454
					ILMN_2190292	UGT8	NM_003360.2	0.001008405	0.335985912
ILMN_2258471	SLC30A5	NM_022902.2	0.001009148	0.353367403
					ILMN_1801205	GPNMB	NM_001005340.1	0.001012932	1.569348784
ILMN_2224990	HIST1H4J	NM_021968.3	0.001040369	0.433804745
					ILMN_2396875	IGFBP3	NM_000598.4	0.001056099	1.496136094
ILMN_2079004	MDH2	NM_005918.2	0.001059324	0.098117309
					ILMN_2103480	ZNF320	NM_207333.2	0.001120173	0.515683347
ILMN_1756849	HIST1H2AE	NM_021052.2	0.001128782	0.55825351
					ILMN_1751264	CCDC126	NM_138771.3	0.001131162	0.539458225

引物编号	符号	登录号	P值	风险
					ILMN_1670638	PITPNC1	NM_181671.1	0.001156364	1.432837149
ILMN1805404	GRIN1	NM_021569.2	0.001179724	0.646993195
					ILMN_1735108	ANKS6	NM_173551.3	0.001190605	0.531136784
ILMN_1710428	CDC2	NM_001786.2	0.00120549	0.30663512
					ILMN_1674620	SGCE	NM001099400.1	0.001211609	1.454072287
ILMN_1694400	MSR1	NM_138715.2	0.001211833	1.467532171
					ILMN_2088847	OTUD5	NM_017602.2	0.00121411	0.378973971
ILMN2160209	TACSTD1	NM_002354.1	0.001214616	0.429796469
					ILMN_1803376	AEBP2	NM_153207.3	0.001233925	0.379590397
ILMN_1685431	DZIP1	NM_198968.2	0.001245864	1.355178613
					ILMN_2287276	FAM177A1	NM_173607.3	0.001259789	0.515786967
ILMN2241317	FOXK2	NM_004514.3	0.001263375	0.633792641
					ILMN_1656192	ZNF704	NM_001033723.1	0.001275697	1.462816957
ILMN_1708105	EZH2	NM_152998.1	0.001284332	0.53646297
					ILMN_1778617	TAF9	NM_001015891.1	0.001312314	0.437194069
ILMN_1678423	SPA17	NM_017425.2	0.001322915	0.31024646
					ILMN_1735004	C4orf43	NM_018352.2	0.001330807	0.451219666
ILMN_1766264	PI16	NM_153370.2	0.001342722	1.54312461
					ILMN_1651429	SELM	NM_080430.2	0.001350332	7.120826545
ILMN_1652198	CCM2	NM_001029835.1	0.001360123	1.478634628
					ILMN_1651872	UBIAD1	NM_013319.1	0.001363479	0.483856217
ILMN_1747353	KIF27	NM_017576.1	0.001366794	0.305754215
					ILMN_1735958	METTL2B	NM_018396.2	0.001372067	0.497518932
ILMN_2130441	HLA-H	U60319.1	0.001383524	1.309869151
					ILMN_2320250	NOL6	NM_022917.4	0.001386545	0.198070845
ILMN_1710170	PPAP2C	NM_177526.1	0.001395701	0.643357078
					ILMN_1719870	GCUD2	NM_207418.2	0.001456501	0.604998995
ILMN_2181060	CKAP2	NM_001098525.1	0.001459646	0.663378155
					ILMN_1669928	ARHGEF16	NM_014448.2	0.001462437	0.435748845
ILMN_2233099	SSRP1	NM_003146.2	0.001462983	0.313100651
					ILMN_1788886	TOX	NM_014729.2	0.001464337	1.382074069
ILMN_2150894	ALDH1B1	NM_000692.3	0.001471083	0.478898918
					ILMN_2148469	RASL11B	NM_023940.2	0.001485489	1.301724101
ILMN_1734766	C6orf182	NM_173830.4	0.001504844	0.352005589
					ILMN_1811790	FOXS1	NM_004118.3	0.001525515	1.493899582
ILMN_1711543	C14orf169	NM_024644.2	0.001566629	0.378006897
					ILMN_1660698	GTPBP8	NM_014170.2	0.001588061	0.40836939
ILMN_1721868	KPNA2	NM_002266.2	0.001617872	0.566719073
					ILMN_2344971	FOXM1	NM_202003.1	0.001627322	0.668830609
ILMN_2120340	RUVBL2	NM_006666.1	0.001643506	0.641655709
					ILMN1738938	TIMM8B	NM_012459.1	0.001649996	0.507398524
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引物编号	符号	登录号	P值	风险
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引物编号	符号	登录号	P值	风险
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					ILMN_1777263	MEOX2	NM_005924.4	O.007648662	1.344671457
ILMN_1688666	HIST1H2BH	NM_003524.2	0.007688938	O.679188681
					ILMN_2064926	ITFG1	NM_030790.3	O.007689192	O.430133813
ILMN_1812795	RUNX1T1	NM_175636.1	O.007693535	1.234743018
					ILMN_1783908	B3GNT9	NM_033309.2	0.007740725	0.548726198
ILMN_1689438	BTRC	NM_033637.2	O.007752648	1.397535008
					ILMN_1687652	TGFB3	NM_003239.1	O.007770746	1.352457691
ILMN_1695025	CD2	NM_OO1767.3	O.007797265	1.313736386
					ILMN_1749846	OMD	NM_005014.1	O.007801275	1.462435251
ILMN_1807945	ANP32A	NM_006305.2	0.0078657	0.54232047
					ILMN_166491O	RPSA	NM_001012321.1	O.007938497	O.537155609
ILMN_2407605	GIYD2	NM_024044.2	O.007944606	O.531217635
					ILMN_2152095	RNASEN	NM_013235.3	O.007987447	O.458218869
ILMN_1678464	DCLRE1C	NM_001033858.1	O.007991392	O.619351961
					ILMN_1730529	CAB39L	NM_001079670.1	O.008004106	O.465761281
ILMN_1809285	DCP1A	NM_018403.4	O.008063544	O.499569903
					ILMN_1699440	ZBTB47	NM_145166.2	O.008069873	1.300721326
ILMN_1774083	TRIAP1	NM_016399.2	O.008084101	O.452093496
					ILMN_1796523	FNIP1	NM_133372.2	0.008101041	1.251935595
ILMN_1742379	IFT122	NM_052989.1	0.008107069	O.585299967
					ILMN_1798581	MCM8	NM_032485.4	O.008124758	O.39895875
ILMN_2045994	SEPW1	NM_003009.2	O.008180544	2.170610772
					ILMN_2111237	MN1	NM_002430.2	O.008181064	1.480543494
ILMN_1727558	MRPL27	NM_148571.1	O.008216167	O.49290801
					ILMN_1713613	PIAS2	NM_173206.2	O.008218756	O.533318798
ILMN_2207720	ITM2B	NM_021999.3	O.008268371	0.409229979
					ILMN_1778059	CASP4	NM_033306.2	0.008299631	O.352535107
ILMN_2151281	GABARAPL1	NM_031412.2	0.00830592	1.40344079
					ILMN_2227368	SELT	NM_016275.3	O.008323563	0.629151938
ILMN_1755222	C9orf82	NM_024828.2	0.008376736	0.537845874
					ILMN_1670272	LRP10	NM_014045.3	O.008387951	0.488461901
ILMN_1750044	ZNHIT3	NM_004773.2	O.008414785	0.596203697
					ILMN_1801899	PLEC1	NM_201380.2	O.008415501	O.788422978
ILMN_1667707	SPCS3	NM_021928.1	O.008416213	0.333306413
					ILMN_1784459	MMP3	NM_002422.3	O.008424899	0.743845984
ILMN_1715613	TAOK2	NM_004783.2	O.008428815	O.577192898
					ILMN_1783170	ING3	NM_198267.1	O.008464107	O.45594537
ILMN_2343332	TAF9	NM_001015891.1	O.008467944	O.502769469
					ILMN_1746426	TOMM70A	NM_014820.3	O.008511501	0.451400009

引物编号	符号	登录号	P值	风险
					ILMN_1708164	EIF3A	NM_003750.2	0.0085147	0.273046283
ILMN_2319919	MAGEA2	NM_175743.1	0.008522299	0.564708047
					ILMN_1788166	TTK	NM_003318.3	0.008532079	0.6260955
ILMN_1694731	CLCN7	NM_001287.3	0.008552366	0.047428986
					ILMN_2189037	WDR52	NM_018338.2	0.008579091	0.442426039
ILMN_1654411	CCL18	NM_002988.2	0.008582303	0.534771494
					ILMN_1666372	ATP5H	NM_006356.2	0.00858678	0.339181294
ILMN_1663220	MRPL22	NM_014180.2	0.008657699	0.682213605
					ILMN_1736689	PC	NM_001040716.1	0.008686562	0.491364567
ILMN_1702609	B3GNT5	NM_032047.4	0.008699695	0.35924426
					ILMN_2126399	psiTPTE22	EF535614.1	0.008701089	0.508410979
ILMN_1714438	MUTYH	NM_001048172.1	0.008708257	1.452044111
					ILMN_1697117	TBP	NM_003194.3	0.008717257	1.375754246
ILMN_2160476	CCL22	NM_002990.3	0.00873155	0.626816124
					ILMN_2405156	PPAP2C	NM_177543.1	0.008744942	0.486658323
ILMN_2357976	BAT1	NM_004640.5	0.008748889	0.39869983
					ILMN_1686804	CCRK	NM_012119.3	0.008781738	1.379683611
ILMN_1735908	UTP15	NM_032175.2	0.008795849	0.455716604
					ILMN_1739496	PRRX1	NM_006902.3	0.008810631	1.352203092
ILMN_2215631	OTUD6B	NM_016023.2	0.008824788	0.318170009
					ILMN_1676449	SLIT2	NM_004787.1	0.008825626	1.443309256
ILMN_1717982	BZW1	NM_014670.2	0.008843056	0.496720206
					ILMN_2089902	NUS1	NM_138459.3	0.008924061	0.426437437
ILMN2172269	TMEM183B	NM_001079809.1	0.008947562	0.531376285
					ILMN_1750144	C3orf19	NM_016474.4	0.008998487	1.224881041
ILMN_1686043	FAM164C	NM_024643.2	0.009007654	0.524954198
					ILMN_2342793	FBXW8	NM_153348.2	0.009010131	0.526747165
ILMN_1684554	COL16A1	NM_001856.3	0.009207494	2.157593197
					ILMN_2198878	INPP4B	NM_003866.1	0.009224731	1.355483357
ILMN_2183610	SERAC1	NM_032861.2	0.009237213	0.652929929
					ILMN_1735827	NISCH	NM_007184.3	0.009267976	3.244972339
ILMN_2408815	NAP1L1	NM_139207.1	0.009273677	0.466078202
					ILMN_1736154	ProSAPiP1	NM_014731.2	0.009297408	1.371836507
ILMN_1660043	UBXN11	NM_145345.2	0.009301234	0.414923686
					ILMN_1723087	MDK	NM_002391.3	0.009357376	0.477925138
ILMN_2405190	VAPA	NM_003574.5	0.009380725	0.642869229
					ILMN_2365549	BRPF1	NM_004634.2	0.009418423	0.030900528
ILMN_1688637	TMEM198	NM_001005209.1	0.009454295	0.53441861
					ILMN_2381753	G3BP2	NM_012297.3	0.009454643	0.528560031
ILMN_2119945	NDUFB3	NM_002491.1	0.009512793	0.605900377
					ILMN_2395913	ARHGAP11A	NM_199357.1	0.009513189	0.52537859
ILMN_1799105	COL17A1	NM_000494.3	0.009521418	0.569237452
					ILMN_1786707	C19orf63	NM_175063.4	0.009549933	0.705859833

引物编号	符号	登录号	P值	风险
					ILMN_1695962	SLC12A9	NM_020246.2	0.00955532	0.632986434
ILMN_2213247	SPCS2	NM_014752.1	0.009568632	0.468103464
					ILMN1722016	LY6G5C	NM_001002849.1	0.009572932	1.337326232
ILMN_1809141	ING4	NM_198287.1	0.009584963	0.47920737
					ILMN_1682332	GYPC	NM_016815.2	0.009633083	1.887056171
ILMN_1761363	VAMP4	NM_003762.3	0.009646552	0.476950334
					ILMN_1785179	UBE2G2	NM_003343.4	0.009701867	0.617105146
ILMN_1763000	ADAP2	NM_018404.2	0.009748952	1.681799633
					ILMN_1716224	STARD4	NM_139164.1	0.009783456	0.489406267
ILMN_1739587	UTY	NM_007125.3	0.009816309	0.439298478
					ILMN_1680643	KIAA1333	NM_017769.2	0.009820691	0.460192694
ILMN_2407879	SORBS2	NM_003603.4	0.009831185	1.548113873
					ILMN_2275533	DIAPH3	NM_030932.3	0.009833778	0.686553443
ILMN_1773645	GMPPB	NM_021971.1	0.009837559	0.446130182
					ILMN_1764091	R3HDM2	NM_014925.2	0.009843159	0.685043284
ILMN_2400500	LASS2	NM_181746.2	0.009847868	0.442253821
					ILMN_2334350	BTBD3	NM_014962.2	0.00985416	0.459870001
ILMN_1660602	C1orf43	NM_015449.2	0.009874084	0.617987793
					ILMN_2170353	PTPLB	NM_198402.2	0.009918567	0.400585431
ILMN_1794492	HOXC6	NM_153693.3	0.00992158	0.721974031
					ILMN_2364357	RPS6KB2	NM_003952.2	0.009937711	0.244179599
ILMN_2147503	ALG13	NM_018466.3	0.009946793	0.352771071
					ILMN_2177460	AQR	NM_014691.2	0.009953961	0.404663806
ILMN_1668525	NR3C1	NM_001018076.1	0.009992789	0.617215381
					ILMN_2258543	PRDM2	NM_012231.3	0.009994008	1.364891701

实施例6：鉴定用于自我归一化(self-normalization)的参比基因(reference genes)

减少临床领域中发现的预后基因数目的方式之一是在每种情况下自我归一化，因为不可能一次用整组患者作为对象进行归一化。目前，实时QRT-PCR(实时定量逆转录聚合酶链反应)广泛地用来测量基因的表达水平，但是当使用QTR-PCR时，不能测量人类中的全部基因以便进行分位数归一化，并且当使用旧石蜡块而非使用新样品时存在生成的实时QRT-PCR信号显著较低的问题。

因此，为了在临床领域可靠使用鉴定的胃癌预后基因，本发明人尽力鉴定参比基因用于测量的基因表达水平的自我归一化。因此，通过分析实施例3中用WG-DASL测量的基因表达水平数据，鉴定了不具有预后特征并且在每种不同情况下均显示最小变化的50种参比基因，并且表4中显示了该结果。表4中列出的50种参比基因中一个或多种基因的组合可以用于胃癌预后基因的表达水平的归一化。

表4

探针编号	登录号	符号
			ILMN_2403446	NM_007011.5	ABHD2
ILMN_1708502	NM_014423.3	AFF4
			ILMN_1780806	NM_025190.3	ANKRD36B
ILMN_2415467	NM_080550.2	AP1GBP1
			ILMN_1722066	NM_018120.3	ARMC1
ILMN_2352934	NM_004318.2	ASPH
			ILMN_1808163	NM_022338.2	C11orf24
ILMN_1693431	NM_153218.1	C13orf31
			ILMN_1733288	NM_016546.1	C1RL
ILMN_2202940	NM_020244.2	CHPT1
			ILMN_2188533	NT_007592.15	CICK0721Q.1
ILMN_1795754	NM_001289.4	CLIC2
			ILMN_2373779	NM_198189.2	COPS8
ILMN_1796180	NM_021117.2	CRY2
			ILMN_1651499	NM_020462.1	ERGIC1
ILMN_1751425	NM_024896.2	ERMP1
			ILMN_1712095	NM_005938.2	FOXO4
ILMN_1747305	NM_175571.2	GIMAP8
			ILMN_1737308	NM_002064.1	GLRX
ILMN_2168215	NM_016153.1	HSFX1
			ILMN_1789018	NM_012218.2	ILF3
ILMN_1809141	NM_016162.2	ING4
			ILMN_1807767	NM_014615.1	KIAA0182
ILMN_1776963	NM_006816.1	LMAN2
			ILMN_1743583	NM_130473.1	MADD

探针编号	登录号	符号
			ILMN_1774844	NM_032960.2	MAPKAPK2
ILMN_1761858	NM_033290.2	MID1
			ILMN_1670801	NM_000254.1	MTR
ILMN_1780937	NM_025128.3	MUS81
			ILMN_1784113	NM_020378.2	NAT14
ILMN_2147133	NM_173638.2	NBPF15
			ILMN_2361185	NM_024878.1	PHF20L1
ILMN_1704529	NM_021130.3	PPIA
			ILMN_2357577	NM_006251.5	PRKAA1
ILMN_2353202	NM_152882.2	PTK7
			ILMN_1813753	NM_002825.5	PTN
ILMN_1677843	NM_001031677.2	RAB24
			ILMN_1773561	NM_021183.3	RAP2C
ILMN_1749006	NM_052862.2	RCSD1
			ILMN_2373266	NM_139168.2	SFRS12
ILMN_2117716	NM_005088.2	SFRS17A
			ILMN_2379835	NM_003352.4	SUMO1
ILMN_1712075	NM_015286.5	SYNM
			ILMN_1674866	NM_006354.2	TADA3L
ILMN_2390227	NM_015043.3	TBC1D9B
			ILMN_1657983	NM_018975.2	TERF2IP
ILMN_1705213	NM_022152.4	TMBIM1
			ILMN_1756696	NM_207291.1	USF2
ILMN_2054442	NM_001099639.1	ZNF146
			ILMN_2352590	NM_006974.2	ZNF33A

随后，为了证实采用参比基因进行的自我归一化的有效性，研究了针对WG-DASL数据的分位数归一化和自我归一化数据之间的相关性。图1中显示了基于两种归一化方法的风险比(hazard ratio)。作为结果，确定了分位数归一化和自我归一化方法之间的密切相关性(图1)。

实施例7：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-(1)

7-1：使用监督主成分分析的预后预测模型

为了建立预后预测模型，使用由Bair和Tibshirani开发的改进的主成分分析法(rvisedPrincipal Component analysis，SuperPC)(PLoS Biol.2004Apr；2(4)：E108.Epub2004Apr13)。为了开发和评价基于SuperPC分析的胃癌预后预测模型，使用Richard Simon开发的BRB矩阵工具(SimonR等人，Cancer Inform2007；3：11-7)程序。

在SuperPC分析中，可以确定用于以所需水平预测预后的p-值阈值，并且在BRB矩阵工具程序中，默认p-值是0.001。临界P值可以在任何区域中小于0.01，并且通过预定义的p-值和计算有效成分，SuperPC分析可以包括表2和表3中列出的预后基因的子集。为了以被认可的有效性建立预后预测模型，将10倍交叉验证法和SuperPC分析与BRB矩阵工具组合。作为SuperPC分析的例子，为了建立预后预测模型，使用0.00001的临界p-值和两种有效成分，并且SuperPC预后预测模型由7个预后基因组成，并且在图16中显示这种预测模型(表5和图16)。此外，在图2至图5中显示了代表根据7个所选择的预后基因的表达水平的存活率的Kaplan-Meier曲线。

表5

	基因编号	基因符号	权重(wi)
				1	ILMN_1713561	C20orf103	0.152677
2	ILMN_1672776	COL10A1	0.038261
				3	ILMN_1663171	MATN3	0.016428
4	ILMN_1732158	FMO2	0.08681
				5	ILMN_1811790	FOXS1	0.068965
6	ILMN_2402392	COL8A1	0.060799
				7	ILMN_1736078	THBS4	0.088377

图2至图5确定，根据表5中列出的7种基因中每一种的表达水平，将患者队列划分成积极预后组或消极预后组，并且与消极预后组的存活率相比，积极预后组的存活率显得高。这些结果在临床上代表，可以通过测量本发明中胃癌预后基因的表达水平精确地预测胃癌患者的预后。

此外，根据图16，建立表5中列出的7种基因的预后预测模型并且将患者根据所述模型进行划分的结果显示，与消极预后组（高风险）的存活率相比，划分至积极预后组（低风险）中的组的存活率显著更高，这与实际临床结果对应（图16）。这些结果显示，表5中列出的7种预后基因可以用于预测胃癌预后。

另外，将已经根据该预后预测模型划分的患者中的Ib/II期胃癌患者再划分成积极预后组或消极预后组，并且图17中显示了代表所划分组的无疾病存活率的Kaplan-Meier曲线。作为结果，与划分入消极预后组的Ib/II期胃癌患者的存活率相比，根据SuperPC预后预测模型划分入积极预后组的Ib/II期胃癌患者的存活率显著更高（图17）。

具体而言，在SuperPC预后预测模型（使用表5中7种基因的表达水平）中，可以通过下式计算预后指数。如果通过下式计算的确定预后指数大于-0.077491，则从中采集样品的患者可以划入消极预后组中。

∑Iwi xi-4.51425

[wi和xi分别代表基因的第i位权重（weight）和对数表达水平]

7-2：采用常规预后系数的对比评价

本发明人使用多变量Cox分析作为标准统计分析以确定基于本发明中预后基因的预后预测是否比常规预后系数提供更有意义的预后信息。具体而言，研究了多变量Cox模型，所述模型显示由SuperPC预后指数（表5）和10倍交叉验证法评价的无疾病存活率、肿瘤细胞侵入深度（pT期(pTstage)）、由肿瘤细胞转移的淋巴结的数目（P Node）。

多变量分析结果确定，与pT期和P Node无关的7种预后基因是接受治疗型胃切除术和辅助化疗的胃癌患者的无疾病存活率的优异预测物（HR=1.9232，95%CI，1.4066，2.6294，P<0.0001，表6）。

表6

协变量	b	SE	P	期望(b)	期望(b)的95％置信区间
						HER2＝阳性	-0.3020	0.2510	0.2289	0.7393	0.4531to1.2062
PNODE	0.5548	0.08754	＜0.0001	1.7415	1.4683to2.0657
						Tstage	0.7339	0.1696	＜0.0001	2.0831	1.4965to2.8997
预测的风险＝“高”	0.6540	0.1604	＜0.0001	1.9232	1.4066to2.6294

实施例8：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-(2)

8-1：使用梯度套索方法的预后预测模型

使用梯度套索算法(Sohn I等人：Bioinformatics2009；25：1775-81)筛选在实施例5中鉴定的369种胃癌预后基因中可以用于预测胃癌预后的基因。在梯度套索预后模型中，可以使用下式计算预后评分，并且如果随机样品的预后评分为正，可以预测为积极(positive)预后。

是从训练集估计的回归系数(regression coefficient)，X是训练集的基因表达水平的向量。]

在使用梯度套索选择基因后，必需使用独立数据集(data set)验证易感性。为此目的，使用留一交叉验证法(leave one out cross validation，LOOCV)。具体而言，留一交叉验证法将在通过梯度套索产生预后预测算法时使用N-1份样品(训练数据)，不包括来自患者组的一份样品(测试数据)，并且用来通过将相同样品应用于预后算法将剩余一份样品划入积极预后组或消极预后组。这种过程反复对患者组的N份样品进行。在完成将全部样品划分入积极预后组或消极预后组后，通过统计分析比较积极预后组和消极预后组之间的存活率。

在进行留一交叉验证法期间通过梯度套索算法筛选出26种预后基因并且表7中列出了筛选的基因。此外，在图5至图15中显示了代表根据26种筛选的预后基因的表达水平的存活率的Kaplan-Meier曲线。根据图5至图15，确定了根据表7中列出的26种基因中每一种的表达水平将患者组划分成积极预后组或消极预后组，并且与消极预后组的存活率相比，积极预后组的存活率显得更高。这些结果临床上代表，可以通过测量本发明中胃癌预后基因的表达水平来精确地预测胃癌患者的预后。

表7

随后，使用26种选择的基因（梯度套索和留一交叉验证法）、根据这种预后预测模型，将患者组划分成积极预后组或消极预后组。另外，根据病理学分期，将已经划分成积极预后组或消极预后组的患者组再划分，从而可能根据病理学分期预测预后。

8-2：评价使用梯度套索方法的预后预测模型

为了确定是否使用26种预后基因预测的预后是否与实际临床结果重合，在Kaplan-Meier曲线中显示划分成积极预后组和消极预后组的组的无疾病存活率（图18）。作为结果，与消极预后组（高风险）的5年无疾病存活率相比，积极预后组（低风险）的5年无疾病存活率显著更高（71.7%对47.7%），并且该结果似乎对应于复发率2.12的风险比（95%CI，1.57，2.88，P=0.04，图18）。因此，确定使用26种预后基因进行分类的胃癌患者的预后与实际临床结果重合。

为了确定通过以下方式预测的预后结果是否与实际临床结果重合，所述方式为将已经根据病理学分期划分成积极预后组和消极预后组的患者再划分以便可以根据病理学分期预测预后，在图19中显示了Kaplan-Meier曲线，所述曲线代表根据预后划分的处于每种病理学分期的患者组的无疾病存活率。作为结果，由总计432位患者组成的队列划分成145位患者处于低风险Ib/II期（low-risk，stage Ib/II）（5年无疾病存活率为84.8%）；90位患者处于高风险Ib/II期（high-risk，stage Ib/II）（5年无疾病存活率为61.1%）；83位患者处于低风险III/IV期（low-risk，stage III/IV）（5年无疾病存活率为48.9%），和114位患者处于高风险III/IV期（high-risk，stage III/IV）（5年无疾病存活率36.9%）。具体而言，确定在Ib/II期中，与消极预后组（高风险Ib/II）的存活率相比，积极预后组（低风险Ib/II）的存活率显著地更高，并且甚至在III/IV期，与消极预后组（高风险III/IV）的存活率相比，积极预后组（低风险III/IV）的存活率显著地更高（图19）。

结果表明，可以通过采用统计分析算法处理预后基因的表达水平、根据所述预后精确地将处于病理学分期的患者分类，并且可以根据预测的预后，通过选择适宜的治疗改善胃癌患者的存活率。例如，从诊断为Ib/II期的患者测量预后基因的表达水平，通过测量相对于参比基因的相对表达水平自我归一化，并且，随后如果根据梯度套索算法划分入消极预后组Ib/II期，则可以确定患者的预后与III期的预后相似，并且可以通过使用针对III期患者的治疗方法延长患者的存活。

8-3：采用常规预后系数的对比评价

预测胃癌预后的已知预后因素为确定肿瘤细胞侵入深度（pT期）和由肿瘤细胞转移的淋巴结的数目（P Node）。本发明人使用多变量Cox分析作为标准统计分析来确定基于本发明中预后基因的预后预测是否比常规预后系数提供更有意义的预后信息。具体而言，研究了多变量Cox模型，所述模型显示由梯度套索指数（7表中列出的26种预后基因）和留一交叉验证法评价的无疾病存活率、肿瘤细胞侵入深度（pT期）、由肿瘤细胞转移的淋巴结的数目（P Node）或病理学分期（AJCC第6版）。在这种情况下，pT期被分为pT1/T2和T3，并且通过用0.1替换0求得P Node的对数。

多变量分析结果确定，与pT期和P Node无关的26种预后基因是接受治疗性胃切除术和辅助化疗的胃癌患者的无疾病存活率的优异预测物（HR=1.859，95%CI，1.367，2.530，P=0.000078，表8）。同样地，如表9中所示，确定可以利用26种预后基因独立地预测处于最末病理学分期的无疾病存活率（HR=1.773，95%CI，1.303，2.413，P<0.00001，表9中的Pstage是pTstage和PNode的组合）。

表8

表9

实施例9：开发和评价基于胃癌预后基因的预后预测模型-（3）

9-1：使用nCounter测定法开发和评价用于II期胃癌患者的胃癌预后评分

通过将梯度套索算法应用于从WG-DASL测定法内所用的队列中获得的II期胃癌患者(N＝186)的肿瘤样品，鉴定到提供稳健(robust)预后信息的8种胃癌预后基因的组合(表10)。利用8种基因的归一化表达水平和Cox回归估计值的线性组合(linearcombination)开发了胃癌预后评分(Gastric Cancer Prognostic Score，GCPS)。使用nCounter分析试剂盒(系统；NanoString Technologies)进行基因表达水平的测量。

表10

基因符号	回归估计值
		C20orf103	0.0636
CDC25B	-0.0175
		CDK1	-0.1005
CLIP4	0.4822
		LTB4R2	-03950
MATN3	0.2982
		NOX4	0.0288
TFDP1	-0.2886

通过分析临界值(cut-off)，确定将25％患者分配入消极预后组的GCPS为最稳健(robust)的(图28)。选择该临界值用于将来的独立验证队列中的验证。作为应用优化的临界值至该队列的结果，如图29中所示，与低风险组84.3％的5年无疾病存活率(顶部图)相比，基于该预测模型，通过基因表达水平确定高风险组的5年无疾病存活(底部图)为42.6％(p＜0.0001)。

由于过度拟合问题，必需用修订算法和临界值，用未用于鉴定基因的独立患者队列作为对象验证GCPS。为此目的，首先获得用于验证的患者队列。将GPS应用于2期胃癌患者的独立验证队列，所述2期胃癌患者接受与用于鉴定患者胃癌预后基因的患者(n＝186，发现队列)相同的化疗-放疗。作为结果，风险评分分布与图30十分相似，所述图30代表这种测定法(assay)的稳健分析性能。

应用从发现队列获得的预定义的GCPS临界值(0.2205)至验证队列并且基于等级分布产生Kaplan-Meier曲线的结果确定，这种算法可以精确鉴定接受化放疗的2期胃癌患者中患胃癌风险较高的患者(图31)。如图31中所示，这8种预后基因的GPS成功预测出高风险组(5年DFS，58.7％，底部图)和低风险组(5年DFS，86.3％，顶部图)中216位患有2期胃癌的患者(P＝.00004，HR＝3.15)。

9-2：GCPS的优化

根据该实施例，在验证可以通过胃癌预后基因的表达概况鉴定接受化放疗的2期患者中的高风险患者后，将发现队列和验证队列合并为一个队列以开发第二代GCPS。为了基于无疾病存活率的Cox比例风险模型开发预测模型，使用梯度套索(最小绝对收缩和选择算子)算法。表11代表使用2期数据集(phase2data set，N＝402)时所获得的构成预测模型的13种基因(探针)，其中所述2期数据集是发现集合和验证集合的组合。

表11

基因符号	回归估计值
		ADRA2C	-0.0156
C20orf103	0.1082
		CLIP4	0.3891
CSK	-0.6654
		FZD9	-0.0829
GALR1	-0.0509
		GRM6	-0.0244
INSR	0.0251
		LPHN1	-0.0126
LYN	-0.0012
		MATN3	0.2134
MRGPRX3	-0.0009
		NOX4	0.0951

将患者的GCPS计算为[S=β₁x₁+...+β_nx_n]。其中，x_n是第n位基因的定量表达值，β_n是表10和表11中列出的第n位基因的回归估计值（Regression estimate），并且S代表胃癌预后评分。随后，从2期数据集估计风险评分分布的第一个四分位数和第三个四分位数的临界值（Q1=-0.9842，Q3=-0.4478）。通过应用该临界值至最终验证集合的306位患者中，分别将GCPS低于Q1的患者和GCPS大于Q3的患者分配至低风险组和高风险组中。作为结果，如图24中所显示，Kaplan-Meier曲线确定，与其他组的患者相比，被预测为高风险组的患者的存活率（底部图）显著地较低（图32）。

9-3：在仅接受手术的II期胃癌患者中验证第二代GCPS

为了测试GCPS对仅接受手术而未接受化疗或放射疗的患者的性能，检查了306位诊断患有2期胃癌的患者的癌组织，其中所述患者在三星医学中心仅接受根治性胃切除术而不接受辅助化疗（adjuvant chemotherapy）或手术后放射疗法。根据以下标准选择患者。

在诊断患有2期病理学分期的476位胃癌患者中（这些患者从1995年4月至2006年9月在三星医学中心仅接受根治性胃切除术（curative gastrectomy）而不接受辅助化疗或手术后放射疗法），根据以下标准选择306位患者。

1）腺瘤组织学诊断，

2）切除肿瘤，无残余肿瘤，

3）D2淋巴结清扫术，

4）年满18岁，

5）根据AJCC（美国癌症联合委员会）第6版，病理学分期II（T1N2、T2aN1、T2bN1和T3N0），

6）完整保留手术记录和治疗记录。

在476位患者的队列中170位患者被从本分析中排除，归因于如下原因：

1）无完整医疗记录的患者（N=66），

2）无疾病死亡或无法解释的死亡（N=43），

3）纠正的病理学分期（N=45）

4）石蜡块不可获得（N=15），

5）双重原发性癌症（N=1）。

如图33中所示，作为应用第二代GCPS至仅接受手术的2期胃癌患者队列的结果，虽然使用接受化放疗的患者队列开发了GCPS，但是与低风险组相比，根据GCPS划入高风险组的患者（底部图）经鉴定具有不良预后（p=0.00287）。这个结果表明，由GCPS定义的高风险患者基本上具有未被抗癌药物和放射疗法改善的不良预后，并且需要为这些患者开发新疗法。

Claims (24)

1.一种用于预测胃癌预后的标记，其包含选自以下基因的一种或多种：C20orf103（染色体20可读框103）、COL10A1（X型胶原蛋白α1）、MATN3（母系蛋白3）、FMO2（含黄素的单加氧酶2）、FOXS1（叉头框蛋白S1）、COL8A1（VIII型胶原蛋白α1）、THBS4（血小板应答蛋白4）、CDC25B（细胞分裂蛋白25同源物B）、CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶1）、CLIP4（含有CAP-GLY结构域的接头蛋白家族成员4）、LTB4R2（白三烯B4受体2）、NOX4（NADPH氧化酶4）、TFDP1（转录因子Dp-1）、ADRA2C（α-2C-肾上腺素能受体）、CSK（c-src酪氨酸激酶）、FZD9（卷曲家族受体9）、GALR1（甘丙肽受体1）、GRM6（谷氨酸受体促代谢型6）、INSR（胰岛素受体）、LPHN1（蛛毒素受体1）、LYN（v-yes-1 Yamaguchi肉瘤病毒相关癌基因同源物）、MRGPRX3（MAS相关性GPR成员X3）、ALAS1（δ-氨基乙酰丙酸合酶1）、CASP8（胱天蛋白酶8，凋亡相关性半胱氨酸肽酶）、CLYBL（类柠檬酸裂合酶β）、CST2（半胱氨酸蛋白酶抑制物SA）、HSPC159（半乳糖苷结合样凝集素）、MADCAM1（粘膜血管地址素细胞黏附分子1）、MAF（v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物（禽））、REG3A（再生性胰岛起源蛋白3α）、RNF152（环指蛋白152）、UCHL1（遍在蛋白羧基端酯酶L1（遍在蛋白硫酯酶））、ZBED5（含有BED型的锌指蛋白5）、GPNMB（糖蛋白（跨膜）nmb）、HIST1H2AJ（组蛋白簇1，H2aj）、RPL9（核糖体蛋白L9）、DPP6（二肽基肽酶6）、ARL10（ADP-核糖基化因子样10）、ISLR2（富含亮氨酸重复的免疫球蛋白超家族2）、GPBAR1（G蛋白偶联胆酸受体1）、CPS1（氨甲酰基-磷酸合酶1）、BCL11B（B-细胞CLL/淋巴瘤11B（锌指蛋白））和PCDHGA8（原钙粘蛋白γ亚家族A8）基因。

2.根据权利要求1所述的标记，其中所述标记是C20orf103、COL10A1、MATN3、FMO2、FOXS1、COL8A1和THBS4基因。

3.根据权利要求1所述的标记，其中所述标记是ALAS1、C20orf103、CASP8、CLYBL、COL10A1、CST2、FMO2、FOXS1、HSPC159、MADCAM1、MAF、REG3A、RNF152、THBS4、UCHL1、ZBED5、GPNMB、HIST1H2AJ、RPL9、DPP6、ARL10、ISLR2、GPBAR1、CPS1、BCL11B和PCDHGA8基因。

4.根据权利要求1所述的标记，其中所述标记是C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因。

5.根据权利要求1所述的标记、其中所述标记是ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因。

6.根据权利要求1所述的标记，其中所述胃癌是Ib或II期胃癌。

7.一种用于预测胃癌预后的组合物，其包含用于测量根据权利要求1至6任一项所述的用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中用于测量所述基因的mRNA表达水平的试剂是与所述基因特异性结合的引物对或探针。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中用于测量所述蛋白质表达水平的试剂是对所述基因编码的蛋白质特异的抗体。

10.一种用于预测胃癌预后的试剂盒，其包含用于测量根据权利要求1至6任一项所述的用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平的试剂。

11.一种用于预测胃癌预后的方法，其包括a）获得从胃癌患者采集的样品中根据权利要求1至6任一项所述的用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式；和b）比较步骤a）中获得的表达水平或表达模式与预后已知的胃癌患者中相应基因的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品是胃肿瘤组织。

13.根据权利要求11所述的方法，其中通过使用与所述基因特异性结合的引物对或探针测量所述基因的mRNA的表达水平并且通过使用对相应蛋白质特异的抗体测量所述蛋白质的表达水平。

14.根据权利要求11所述的方法，其中通过与选自表4中列出的参比基因的一个或多个参比基因的mRNA表达水平或由所述参比基因编码的蛋白质的表达水平比较，将所述基因的mRNA或由所述基因编码的蛋白质的表达水平归一化。

15.根据权利要求11所述的方法，其中在步骤a）和b）中的胃癌患者是接受相同治疗的患者，并所述治疗选自放射性疗法、化疗、化放疗、辅助化疗、胃切除术、胃切除术后的化疗或化放疗，和辅助化疗或手术后无放射性疗法情况下的胃切除术。

16.一种用于预测胃癌预后的方法，包括a）测量从胃癌患者采集的样品中根据权利要求1至6任一项所述的用于预测胃癌预后的标记的mRNA或蛋白质的表达水平或表达模式，以获得定量的表达值；b）将步骤a）中获得的表达值应用于预后预测模型以获得胃癌预后评分；和c）将步骤b）中获得的胃癌预后评分与参比值比较以确定所述患者的预后。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤a）中测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4、LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因；或ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因的mRNA或蛋白质的表达水平。

18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤b）中的预后预测模型表述为：

[S=β₁x₁+...+β_nx_n]

其中，x_n是第n位基因的定量表达值，

β_n是第n位基因的Cox回归估计值，并且

S代表胃癌预后评分。

19.根据权利要求16所述的方法，其中将步骤c）中的参比值定义为在胃癌预后评分分布中第三个四分位数临界值至第四个四分位数临界值范围内的值，所述胃癌预后评分根据下式从多位胃癌患者获得：

[S=β₁x₁+...+β_nx_n]

其中，x_n是第n位基因的定量表达值，

β_n是第n位基因的Cox回归估计值，并且

S代表胃癌预后评分。

20.根据权利要求16所述的方法，其中将步骤c）中的参比值定义为在胃癌预后评分分布中第二个四分位数临界值至第三个四分位数临界值范围内的值，所述胃癌预后评分根据下式从多位胃癌患者获得：

[S=β₁x₁+...+β_nx_n]

其中，x_n是第n位基因的定量表达值，

β_n是第n位基因的Cox回归估计值，并且

S代表胃癌预后评分。

21.根据权利要求16所述的方法，其中确定具有步骤b）中获得的与所述参比值相同或较之更大的胃癌预后评分的病例具有消极预后。

22.根据权利要求19所述的方法，其中第三个四分位数的临界值是0.2205或-0.4478，并且确定具有步骤b）中获得的与所述临界值相同或较之更大的胃癌预后评分的病例具有消极预后。

23.根据权利要求22所述的方法，其中在步骤a）中测量C20orf103、CDC25B、CDK1、CLIP4，LTB4R2、MATN3、NOX4和TFDP1基因的表达水平的情况下，所述临界值是0.2205。

24.根据权利要求22所述的方法，其中在步骤a）中测量ADRA2C、C20orf103、CLIP4、CSK、FZD9、GALR1、GRM6、INSR、LPHN1、LYN、MATN3、MRGPRX3和NOX4基因的表达水平的情况下，所述临界值是-0.4478。

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