ES2689958T3 - Marcador para predecir el pronóstico de cáncer de estómago y procedimiento para predecir el pronóstico de cáncer de estómago - Google Patents

Marcador para predecir el pronóstico de cáncer de estómago y procedimiento para predecir el pronóstico de cáncer de estómago Download PDF

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Joon Oh Park
Se Hoon Park
Ho Yeong Lim
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Abstract

Utilización de un marcador para la predicción del pronóstico del cáncer gástrico, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).

Description

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DESCRIPCIÓN
Marcador para predecir el pronóstico de cáncer de estómago y procedimiento para predecir el pronóstico de cáncer de estómago
[Sector técnico]
La presente invención se refiere a un marcador para predecir el pronóstico de cáncer gástrico, a una composición y a un kit para predecir el pronóstico de cáncer gástrico que comprende un agente para medir el nivel de expresión del mismo, y a un procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico utilizando el marcador.
[Técnica anterior]
En 2005, un total de 65.479 personas, que es el 26,7% de todas las muertes, murieron de cáncer. El cáncer que causa la mayoría de las muertes es el cáncer de pulmón, del cual murieron 28,4 pacientes por cada 100.000 habitantes (21,1%), el siguiente es el cáncer gástrico con 22,6 pacientes (16,8%), el cáncer de hígado con 22,5 pacientes (16,7%), el cáncer colorrectal con 12,5 pacientes (9,3%), en este orden. El cáncer gástrico es conocido como el factor que hace que sea el segundo con más muertes en todo el mundo entre las muertes causadas por el cáncer.
Los síntomas del cáncer gástrico muestran diversos aspectos, que van desde la ausencia de síntomas a dolor severo. Además, en los síntomas del cáncer gástrico aparecen síntomas digestivos comunes sin ningún tipo de característica específica. En general, en la etapa temprana del cáncer gástrico, la mayoría de los casos no presentan ningún síntoma, incluso si los hay, sólo es un poco de indigestión o malestar abdominal superior, lo que hace que la mayoría de las personas lo pase por alto y por lo tanto pueda aumentar la mortalidad del cáncer gástrico.
La mayoría de los procedimientos de examen para el cáncer gástrico hasta el presente han sido físicos. En primer lugar están los rayos-X del estómago, que incluye el procedimiento de doble contraste, los rayos-X por compresión, mucosagrafía y, a continuación, está la gastroscopia que aumenta el rendimiento diagnóstico mediante la búsqueda de una lesión muy pequeña que no aparece en la inspección por rayos-X a través de la inspección del estómago a simple vista y que permite la biopsia del estómago en un lugar sospechoso. Sin embargo, este procedimiento tiene las desventajas de un problema higiénico y de que los pacientes sufren dolor durante la inspección. Por lo tanto, en los últimos años, se han llevado a cabo investigaciones para el diagnóstico del cáncer gástrico mediante la medición del nivel de expresión de los genes marcadores que se expresan específicamente en el estómago, pero las investigaciones sobre los marcadores genéticos para predecir el pronóstico de pacientes con cáncer gástrico son relativamente inferiores. Varias publicaciones (WO2009147656; US2007048749; Xu Z Y y otros, Medicine and Pharmacotherapy 2010, 64: 133-139) dan a conocer marcadores para el pronóstico del cáncer gástrico. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones da a conocer el marcador específico de la presente invención. La tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico depende de la fase patológica en el momento del diagnóstico. Según los datos del Samsung Medical Center, la tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con cáncer gástrico es la siguiente (Kim S y otros, Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 63: 1279-1285). fase II: 76,2%, fase IIIA: 57,6%, fase IIIB: 39,6%, fase IV: 26,3%
Los resultados muestran que la detección temprana del cáncer gástrico puede contribuir significativamente al aumento de la tasa de supervivencia. Sin embargo, dado que el cáncer gástrico que ha sido diagnosticado con la misma etapa muestra diferencias en el pronóstico según el paciente, la predicción exacta del pronóstico del cáncer gástrico, así como la detección temprana del cáncer gástrico son los factores más importantes para un tratamiento eficaz del cáncer gástrico.
Por otro lado, en el diagnóstico de cáncer gástrico, el médico establece la realización de las inspecciones necesarias y a los pacientes que se consideran como más adecuados para el plan de tratamiento. Existen procedimientos para el tratamiento del cáncer, tales como cirugía, terapia endoscópica, quimioterapia y terapia con radiación. El procedimiento para el tratamiento habitualmente se determina considerando el tratamiento para el cáncer gástrico, el tamaño, la ubicación y el alcance del cáncer gástrico, el estado general de salud del paciente y muchos otros factores.
En el caso del tratamiento del cáncer gástrico en fase IB/II sólo con cirugía, se sabe que aproximadamente el 30% de los pacientes recaen en menos de 5 años. En este caso, dado que es imposible predecir en qué pacientes el cáncer gástrico es recurrente, los diferentes tratamientos se aplican según el médico. Por lo tanto, si el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico se puede predecir con precisión, se pueden determinar procedimientos de tratamiento apropiados, tales como cirugía o quimioterapia, basándose en el pronóstico, lo cual puede contribuir en gran medida a la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico y, por lo tanto, se requiere una técnica que pueda predecir con precisión el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico.
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Convencionalmente, se han utilizado observaciones anatómicas (el grado de invasión de células cancerosas y el número de ganglios linfáticos con metástasis) a efectos de predecir el pronóstico de pacientes con cáncer gástrico, pero ha habido la posible intervención del juicio subjetivo del médico y la limitación de una predicción exacta del pronóstico.
[DESCRIPCIÓN]
[Problemas técnicos]
Con tales antecedentes, los inventores de la presente invención, como resultado de las investigaciones para el procedimiento que pueda aumentar la tasa de supervivencia de pacientes con cáncer gástrico mediante la predicción del pronóstico del cáncer gástrico con precisión y la determinación de la dirección del tratamiento apropiado según el pronóstico predicho, identificaron que el pronóstico del cáncer gástrico se puede predecir con precisión mediante la identificación de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico y la medición del nivel de expresión del marcador, para realizar la presente invención.
[Solución técnica]
El objetivo de la presente invención es dar a conocer la utilización de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en la que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer una utilización de una composición para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en la que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con mAs, miembro X3).
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer una utilización de un kit para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en la que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), lYn (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GpR relacionado con MAS, miembro X3).
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) obtener el nivel de expresión o el patrón de expresión del ARNm o la proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico; y b) comparar el nivel de expresión o el patrón de expresión obtenido de la etapa a) con el nivel de expresión o el patrón de expresión de ARNm o proteína de los genes correspondientes en un paciente con cáncer gástrico con pronóstico conocido, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NaDPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GpR relacionado con Mas, miembro X3).
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) medir el nivel de expresión del ARNm o la proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico para obtener el valor de la expresión cuantificada; b) aplicar el valor de expresión obtenido en la etapa a) al modelo de predicción del pronóstico para obtener la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico; y c) comparar la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) con el valor de referencia para determinar el pronóstico de un paciente, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY,
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miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
[Efecto ventajoso]
Según la presente invención, el pronóstico del cáncer gástrico puede predecirse con rapidez y precisión, y se puede determinar un plan de tratamiento apropiado basándose en el pronóstico predicho, que presenta la ventaja de contribuir a una reducción significativa de la muerte causada por cáncer gástrico. En particular, según la presente invención, la tasa de supervivencia se puede incrementar notablemente mediante la utilización de las terapias dirigidas desarrolladas para el cáncer gástrico en la fase III, ya que a un paciente que se le ha predicho un pronóstico negativo entre los pacientes con cáncer gástrico en la fase Ib/II muestra un pronóstico similar que un paciente con cáncer gástrico en la fase III y es resistente a la quimioterapia estándar existente.
[Descripción de las figuras]
La figura 1 es un gráfico que muestra la relación entre los riesgos basados en la normalización por cuantiles y la autonormalización utilizando un gen de referencia.
La figura 2 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes C20orf103, COL10A1.
La figura 3 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes MATN3, FMO2.
La figura 4 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes FOXS1, COL8A1.
La figura 5 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes THBS4, ALAS1.
La figura 6 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes CASP8, CLYBL.
La figura 7 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes CST2, HSPC159.
La figura 8 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes MADCAM1, MAF.
La figura 9 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes REG3A, RNF152.
La figura 10 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes UCHL1, ZBED5.
La figura 11 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes GPNMB, HIST1H2AJ.
La figura 12 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes RPL9, DPP6.
La figura 13 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes ARL10, ISLR2.
La figura 14 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes GPBAR1, CPS1.
La figura 15 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes BCL11B, PCDHGA8.
Los valores de p de las figuras 2 a 15 son los valores del resultado de clasificar el nivel de expresión de los genes en alta expresión o baja expresión y el nivel de la expresión génica y de realizar las pruebas de logaritmo-rango.
La figura 16 es el gráfico de Kaplan-Meier que muestra la tasa de supervivencia libre de enfermedad del grupo de pronóstico positivo (bajo riesgo) o del grupo de pronóstico negativo (alto riesgo) clasificados según el modelo de predicción del pronóstico utilizando los genes indicados en la tabla 5.
La figura 17 es el gráfico de Kaplan-Meier que muestra la tasa de supervivencia libre de enfermedad de pacientes con cáncer gástrico en fase Ib/II clasificados en un grupo de pronóstico positivo o un grupo de pronóstico negativo según el modelo de predicción del pronóstico utilizando los genes indicados en la tabla 5.
La figura 18 es el gráfico de Kaplan-Meier que muestra la tasa de supervivencia libre de enfermedad de un grupo de pronóstico positivo (bajo riesgo) o un grupo de pronóstico negativo (alto riesgo) clasificados según el modelo de predicción del pronóstico utilizando los genes indicados en la tabla 7. HR en la figura 18 es la proporción de la función de riesgo acumulado y el valor de p se calculó utilizando 100 permutaciones.
La figura 19 es el gráfico de Kaplan-Meier para grupos de pacientes mediante la clasificación del paciente (alto frente a bajo), que fueron clasificados según el modelo de predicción del pronóstico utilizando los genes indicados en la tabla 7, según la fase patológica (IB + II frente a III + IV). El valor de p se calculó mediante la prueba de logaritmo-rango de dos vías.
La figura 20 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes CDC25B, CDK1.
La figura 21 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes CLIP4, LTB4R2.
La figura 22 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes NOX4, TFDP1.
La figura 23 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes ADRA2C, CSK.
La figura 24 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes FZD9, GALR1.
La figura 25 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes GRM6, INSR.
La figura 26 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión de los genes LPHN1, LYN.
La figura 27 representa el gráfico de Kaplan-Meier según el nivel de expresión del gen de MRGPRX3.
Los valores de p de las figuras 20 a 27 son los valores del resultado de clasificar el nivel de expresión de los genes en alta expresión o baja expresión y el nivel de la expresión génica y de realizar las pruebas de logaritmo-rango.
La figura 28 representa el análisis de corte de GCPS de los genes indicados en la tabla 10. La mejor discriminación fue el caso de la clasificación de los pacientes como el 75% del grupo de alto riesgo y el 25% del grupo de bajo riesgo.
La figura 29 representa la tasa de supervivencia libre de enfermedad de pacientes con cáncer gástrico en fase II en el grupo del descubrimiento basándose en el corte optimizado de GCPS de los genes indicados en la tabla 10.
La figura 30 representa las distribuciones de GCPS de los genes indicados en la tabla 10 en el grupo de descubrimiento frente al grupo de validación, y muestra que la distribución de GCPS en el grupo de descubrimiento
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coincide con la del grupo de validación. Esto representa la robustez analítica de este ensayo.
La figura 31 representa la tasa de supervivencia libre de enfermedad de la cohorte de validación según el algoritmo predefinido GCPS y el punto de corte (rojo = riesgo elevado).
La figura 32 representa la tasa de supervivencia libre de enfermedad de pacientes con cáncer gástrico en fase II que recibieron cirugía basada en GCPS de los genes indicados en la tabla 11 y la radioterapia. El color azul representa un riesgo elevado definido por GCPS.
La figura 33 representa la tasa de supervivencia libre de enfermedad de pacientes con cáncer gástrico en fase II que recibieron sólo cirugía basada en GCPS de los genes indicados en la tabla 11. El color azul representa un riesgo elevado definido por GCPS.
[Modo preferente de la invención]
Como un aspecto para alcanzar los objetivos, la presente invención da a conocer un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GpR relacionado con MAS, miembro X3). También se describen, pero sin estar dentro del alcance de las reivindicaciones, marcadores que comprenden genes seleccionados del grupo que consiste en los genes COL10A1, FMO2, FOXS1, COL8A1, THBS4, CDC25B, CDK1, LTB4R2, TFDP1, ALAS1, CASP8, CLYBL, CST2, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B y PCDHGA8.
Como otro aspecto, la presente invención da a conocer una composición para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico.
El pronóstico clínico de cada cáncer gástrico, aunque en la misma fase patológica, es diferente y el procedimiento de tratamiento adecuado debe utilizarse según el pronóstico a efectos de aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico. Por consiguiente, la presente invención da a conocer una composición para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico y un agente para medir el nivel de expresión del mismo a efectos de predecir con precisión el pronóstico de los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico y determinar la dirección del tratamiento apropiado en base al pronóstico previsto para aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marcador" se refiere a una molécula asociada cuantitativa o cualitativamente con la presencia de fenómenos biológicos, y el marcador de la presente invención se refiere al gen que es la base para predecir un buen o mal pronóstico a los pacientes con cáncer gástrico.
Los marcadores de la presente invención tienen valores de p significativamente bajos y una alta fiabilidad para predecir el pronóstico del cáncer gástrico y, en particular, los marcadores indicados en las tablas 5, 7, 10, y 11 pueden clasificar el grupo de pacientes en un grupo de pronóstico positivo o un grupo de pronóstico negativo, dependiendo del nivel de expresión del mismo, y el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico se puede predecir con precisión midiendo el nivel de expresión de los marcadores, ya que la tasa de supervivencia de los grupos de pronóstico positivo es mayor que la del grupo de pronóstico negativo según el gráfico de Kaplan-Meier que muestra la tasa de supervivencia de estos grupos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "pronóstico" se refiere a la expectativa en el desarrollo médico (por ejemplo, la posibilidad de supervivencia a largo plazo, la tasa de supervivencia libre de enfermedad, etc.), incluye el pronóstico positivo o el pronóstico negativo, el pronóstico negativo incluye la progresión de la enfermedad, tal como la recurrencia, crecimiento tumoral, metástasis y mortalidad por resistencia a fármacos, y el pronóstico positivo incluye la remisión de la enfermedad, tal como el estado libre de enfermedad, la mejora de la enfermedad, tal como la regresión del tumor, o la estabilización.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "predecir” se refiere a adivinar sobre el desarrollo médico, y, para el objetivo de la presente invención, adivinar el desarrollo de la enfermedad (progresión de la enfermedad, mejora, recurrencia del cáncer gástrico, crecimiento tumoral, resistencia a fármacos) de los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico.
En un ejemplo de la presente invención, el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico se predijo mediante la clasificación de los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico en un grupo de pronóstico positivo o un grupo de pronóstico negativo, y además, el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico se predijo mediante la clasificación de los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico de fase patológica según el pronóstico (ejemplos 7 a 9).
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Un marcador adicional descrito para predecir el pronóstico del cáncer gástrico puede ser la combinación de los genes C20orf103, COL10A1, MATN3, FMO2, FOXS1, COL8A1 y THBS4, la combinación de los genes ALAS1, C20orf103, CASP8, CLYBL, COL10A1, CST2, FMO2, FOXS1, HSPC159, MADCAM1, MAF, REG3A, RNF152, THBS4, UCHL1, ZBED5, GPNMB, HIST1H2AJ, RPL9, DPP6, ARL10, ISLR2, GPBAR1, CPS1, BCL11B y PCDHGA8, la combinación de los genes C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 y TFDP1, o la combinación de los genes ADRA2C, C20orf103, cLiP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LyN, MATN3, MRGPRX3 y NOX4 y la combinación de los genes C20orf103, CDC25B, CDK1, CLlp4, LTB4R2, mAtN3 , NOX4 y TFDP1. El marcador, según la presente invención, es la combinación de los genes ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 y NOX4.
Los inventores de la presente invención identificaron que los genes anteriores pueden predecir con precisión el pronóstico del cáncer gástrico mediante el siguiente procedimiento. Los inventores de la presente invención extrajeron ARN de tejido tumoral embebido en parafina y fijado en formalina de cáncer gástrico, midieron el nivel de expresión de genes utilizando ARN extraído y el kit de ensayo DASL de todo el genoma y, a continuación, se realizó un análisis estadístico estándar utilizando el modelo de riesgos proporcionales de Cox en el que el nivel de expresión del gen se procesa como una variable continua. Como resultado, se identificaron 369 genes para predecir el pronóstico del cáncer gástrico (tabla 2) con una gran correlación con la tasa de supervivencia libre de enfermedad mediante análisis univariante y se identificaron los genes para predecir el pronóstico del cáncer gástrico patológico en fase Ib/II (tabla 3). A continuación, se creó el modelo de predicción del pronóstico que comprende los genes de la tabla 5 mediante la aplicación del algoritmo superPC para el nivel de expresión de los genes identificados, y los pacientes con cáncer gástrico se clasificaron en el grupo de pronóstico positivo o el grupo de pronóstico negativo según el modelo de predicción. Los resultados del gráfico de Kaplan-Meier para el grupo clasificado verificaron la validez y la fiabilidad del modelo de predicción del pronóstico utilizando marcadores de la presente invención, mostrando que la tasa de supervivencia del grupo de pronóstico positivo es mayor que la del grupo de pronóstico negativo (ejemplo 7 y las figuras 16, 17). Además, los resultados de la creación del modelo de predicción del pronóstico que comprende los genes de la tabla 7 mediante la aplicación del algoritmo lasso en gradiente para el nivel de expresión de los genes identificados y la clasificación de los pacientes con cáncer gástrico en el grupo de pronóstico positivo o el grupo de pronóstico negativo, identificaron que la clasificación coincide con el resultado clínico (ejemplo 8 y las figuras 18, 19).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente para la medición de los niveles de expresión de los marcadores" se refiere a una molécula que se puede utilizar para determinar los niveles de expresión de los genes marcadores o proteínas codificadas por estos genes, y puede ser, de manera preferente, un anticuerpo, cebador o sonda, que es específico para los marcadores.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo", que es el término conocido en la técnica, se refiere a una molécula de proteína específica dirigida a los sitios antigénicos. Para el objetivo de la presente invención, el anticuerpo se refiere al anticuerpo que se une específicamente al marcador de la presente invención y se puede preparar mediante procedimientos convencionales a partir de la proteína, que es codificada por el gen marcador, obtenida mediante clonación de cada gen en el vector de expresión de una manera convencional, en el que se incluye un péptido parcial que puede producirse a partir de la proteína.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cebador" se refiere a la secuencia corta de ácido nucleico, como la secuencia de ácido nucleico con el grupo hidroxilo terminal en 3 corto libre (grupo hidroxilo 3’ libre), que puede formar una pareja de bases con una plantilla complementaria y funciona como el punto de partida para la copia de una plantilla. En la presente invención, el pronóstico del cáncer gástrico puede predecirse a través de si el producto deseado es creado mediante la realización de la amplificación por PCR utilizando los cebadores de sentido y antisentido del polinucleótido marcador de la presente invención. Las condiciones de la PCR y la longitud de los cebadores de sentido y antisentido se pueden modificar basándose en lo que se conoce en la técnica.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sonda" se refiere al fragmento de ácido nucleico, tal como ARN o ADN, de unos pocas a cientos de bases de longitud, que puede construir la unión específica con ARNm y puede determinar la presencia de ARNm específico debido al mantenimiento del marcaje. La sonda se puede preparar en forma de sonda de oligonucleótidos, sonda de ADN de una sola cadena, sondas de ADN de doble cadena y sonda de ARN, etc. En la presente invención, el pronóstico del cáncer gástrico puede predecirse a través de si está hibridada o no mediante la realización de la hibridación utilizando el polinucleótido marcador de la presente invención y la sonda complementaria. La elección adecuada de la sonda y las condiciones de hibridación se pueden modificar basándose en lo que se conoce en la técnica.
Los cebadores o sondas de la presente invención se pueden sintetizar químicamente utilizando el procedimiento de soporte sólido de fosforamidita u otros procedimientos bien conocidos. La secuencia de ácido nucleico también se puede modificar utilizando muchos medios conocidos en la técnica. Entre los ejemplos no limitantes de estas modificaciones se encuentran la metilación, la adición de bloqueo, la sustitución con uno o más análogos de nucleótidos naturales y la modificación entre nucleótidos, por ejemplo, la modificación del cuerpo de conexión sin carga (por ejemplo, metil fosfonato, fosfotriéster, fosforamidita, carbamatos, etc.), o del cuerpo de conexión cargado (por ejemplo, fosforotioato, fosforoditioato, etc.).
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En la presente invención, el nivel de expresión del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico se puede determinar mediante la identificación del nivel de expresión de ARNm del gen marcador o de la proteína codificada por el gen.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "medir el nivel de expresión de ARNm" se refiere al procedimiento para identificar la presencia de ARNm del gen marcador en la muestra biológica y el nivel de expresión del mismo a efectos de predecir el pronóstico del cáncer gástrico y es posible midiendo la cantidad de ARNm. Los procedimientos de análisis para esto son, pero sin limitarse a éstos, RT-PCR, RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, ensayo de protección de ARNasa (RPA), transferencia Northern, chip de micromatriz de ADN, etc.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "medir el nivel de expresión de la proteína" se refiere al procedimiento para identificar la presencia de proteína expresada en el gen marcador en la muestra biológica y el nivel de expresión de la misma a efectos de predecir el pronóstico del cáncer gástrico y se puede determinar la cantidad de proteína mediante la utilización del anticuerpo que se une específicamente a la proteína expresada en el gen anterior. Los procedimientos de análisis para esto son, pero sin limitarse a los mismos, transferencia Western, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), radioinmunoensayo, radioinmunodifusión, inmunodifusión de Ouchterlony, electroforesis de Rocket, inmunotinción de tejidos, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de fijación completa, FaCS, chip de proteínas, etc.
Como otro aspecto, la presente invención da a conocer la utilización de un kit para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o de proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico.
Se puede utilizar un kit de la presente invención para identificar el nivel de expresión del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico a efectos de predecir el pronóstico del cáncer gástrico.
Un kit de la presente invención puede ser un kit de RT-PCR, un kit de RT-PCR en tiempo real, un kit de QRT-PCR en tiempo real, un kit de chip micromatriz o un kit de chip de proteínas.
Un kit de la presente invención puede comprender no sólo el cebador, la sonda para medir el nivel de expresión del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico o el anticuerpo que reconoce específicamente el marcador, sino también la composición, en solución o dispositivo de uno o más tipos de otros componentes adecuados para el procedimiento de análisis.
Según el ejemplo de la presente invención, un kit para medir el nivel de expresión de ARNm de los genes marcadores puede ser un kit que comprende los elementos esenciales necesarios para llevar a cabo la RT-PCR. El kit de RT-PCR puede comprender, además de cada pareja de cebadores que son específicos para el gen marcador, un tubo de ensayo u otro recipiente adecuado, solución tampón de reacción, desoxinucleótidos (dNTP), Taq-polimerasa y transcriptasa inversa, ADNasa, inhibidor de ARNasa, y DEPC-agua y agua estéril.
Según otro ejemplo de la presente invención, un kit para medir el nivel de expresión de proteína codificada por los genes marcadores puede comprender sustrato, solución tampón adecuada, anticuerpo secundario marcado con enzima cromogénica o sustancia fluorescente y sustrato cromogénico.
Según otro ejemplo de la presente invención, un kit en la presente invención puede ser un kit para detectar el marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, que comprende los elementos esenciales necesarios para la realización del chip de micromatriz de ADN. El kit del chip de micromatriz de ADN puede comprender el sustrato al que el gen o el ADNc correspondiente al fragmento del mismo se unen como sonda, y el sustrato puede comprender el gen de control cuantitativo o el ADNc correspondiente al fragmento del mismo.
Como otro aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) obtener el nivel de expresión o el patrón de expresión de ARNm o de la proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico; y b) comparar el nivel de expresión o patrón de expresión obtenido en la etapa a) con el nivel de expresión o patrón de expresión de ARNm o proteína de los genes correspondientes en un paciente con cáncer gástrico con pronóstico conocido.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico" puede ser, pero sin limitarse a los mismos, tejido, célula, sangre entera, suero, plasma originado del estómago de un paciente con cáncer gástrico y, de manera preferente, tejido tumoral gástrico.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "paciente con cáncer gástrico con pronóstico conocido" se refiere al paciente cuya progresión de la enfermedad se muestra entre los pacientes que fueron diagnosticados con cáncer gástrico, por ejemplo, el paciente confirmado con un pronóstico negativo debido a la recurrencia dentro
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de los 3 años después de la cirugía o el paciente confirmado con un pronóstico positivo debido a estar completamente curado después de la cirugía, y el pronóstico del paciente cuyo pronóstico debe establecerse se puede predecir con precisión mediante la obtención y la comparación de los niveles de expresión o los patrones de expresión de las muestras recogidas del paciente anterior y el paciente cuyo pronóstico debe establecerse.
Según el ejemplo de la presente invención, el pronóstico se puede predecir mediante la medición de los niveles de expresión o los patrones de expresión de los genes marcadores de muchos pacientes con cáncer gástrico, la construcción de una base de datos de los valores medidos con el pronóstico de los pacientes e introducción del nivel de expresión o el patrón de expresión del paciente cuyo pronóstico debe establecerse en la base de datos. En este caso, el algoritmo conocido o el programa de análisis estadístico pueden utilizarse para comparar los niveles de expresión o los patrones de expresión. Además, la base de datos se puede subdividir aún más en la fase patológica, el tratamiento recibido, etc.
Según el ejemplo de la presente invención, los pacientes con cáncer gástrico en las etapas a) y b) son los pacientes que recibieron el mismo tratamiento y el tratamiento puede ser la radioterapia, quimioterapia, quimiorradioterapia, quimioterapia adyuvante, gastrectomía, quimioterapia o quimiorradioterapia después de gastrectomía y gastrectomía sin radioterapia después de la quimioterapia adyuvante u operación.
Según el ejemplo de la presente invención, el cáncer gástrico puede ser cáncer gástrico en la fase Ib o II.
En la presente invención, el nivel de expresión del gen marcador se puede medir en el nivel de ARNm o proteína, y la separación de ARNm o proteína de la muestra biológica se puede realizar utilizando el procedimiento conocido públicamente.
El procedimiento de análisis para medir el nivel de ARNm o proteína es tal como se ha descrito anteriormente.
A través de los procedimientos de análisis anteriores, se puede comparar el nivel de expresión del gen marcador de cáncer gástrico medido de la muestra del paciente con cáncer gástrico con pronóstico conocido con el nivel de expresión del gen marcador de cáncer gástrico medido de la muestra del paciente cuyo pronóstico debe establecerse, y puede predecirse el pronóstico del cáncer gástrico mediante la determinación del aumento o disminución del nivel de expresión. En otras palabras, si la muestra de un paciente cuyo pronóstico debe establecerse muestra un nivel de expresión o un patrón de expresión similar a la muestra del paciente con cáncer gástrico con pronóstico positivo como resultado de la comparación de los niveles de expresión, se puede determinar que tiene un pronóstico positivo, y por el contrario, si se muestra un nivel de expresión o un patrón de expresión similar a la muestra del paciente con cáncer gástrico con pronóstico negativo, se puede determinar que tiene un pronóstico negativo.
Según el ejemplo de la presente invención, el pronóstico se puede predecir mediante la comparación y la normalización del nivel de expresión del gen marcador con el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes indicados en la tabla 4 y, a continuación, la utilización del nivel de expresión normalizado.
Como otro aspecto, la presente invención da a conocer un procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) medir el nivel de expresión del ARNm o la proteína del marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico para obtener el valor de expresión cuantificado; b) aplicar el valor de expresión obtenido en la etapa a) al modelo de predicción del pronóstico para obtener la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico; y c) comparar la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) con el valor de referencia para determinar el pronóstico del paciente.
La etapa a) es la etapa para medir el nivel de expresión del gen marcador de forma cuantitativa. El valor de expresión cuantificada del gen marcador se puede lograr utilizando un software, kits y sistemas conocidos para cuantificar los niveles de expresión medidos mediante el procedimiento de análisis para medir el nivel de ARNm o de proteína, tal como se ha descrito anteriormente. Según un ejemplo de la presente invención, la medición del nivel de expresión del gen marcador puede realizarse utilizando el kit de ensayo nCounter (NanoString Technologies). En este caso, el nivel de expresión del gen marcador se puede normalizar mediante la comparación con el nivel de expresión del gen de referencia. Según el ejemplo de la presente invención, el nivel de expresión medido del gen marcador se puede normalizar mediante la comparación con los niveles de expresión de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en los genes de referencia indicados en la tabla 4.
Según el ejemplo de la presente invención, en la etapa a), se puede medir el nivel de expresión de ARNm o de proteína de los genes C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 y TFDP1, no incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones, o los genes ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 y NOX4.
La etapa b) es la etapa para aplicar el valor de expresión obtenido en la etapa a) al modelo de predicción del pronóstico para obtener la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico.
Según el ejemplo de la presente invención, el modelo de predicción del pronóstico se puede expresar como:
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[S — B1 Xi + ... + BnXn]
en el que Xn es el valor de expresión cuantificada del gen n-ésimo,
Pn es la estimación de la regresión Cox del gen n-ésimo, y S representa la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico.
La etapa c) es la etapa para comparar la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) con el valor de referencia para determinar el pronóstico del paciente.
El valor de referencia se puede determinar como un valor en un intervalo desde el valor de corte para el tercer cuartil hasta el valor de corte para el cuarto cuartil en la distribución de las múltiples puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas mediante la introducción de los valores de expresión de los genes marcadores de los múltiples pacientes con cáncer gástrico. Además, el valor de referencia se puede determinar como un valor en un intervalo desde el valor de corte para el segundo cuartil hasta el valor de corte para el tercer cuartil en la distribución de las múltiples puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas mediante la introducción de los valores de expresión de los genes marcadores de los múltiples pacientes con cáncer gástrico. De manera preferente, el valor de referencia se puede determinar como un valor en un intervalo desde el valor de corte para el tercer cuartil hasta el valor de corte para el cuarto cuartil en la distribución de las múltiples puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas mediante la introducción de los valores de expresión de los genes marcadores de los múltiples pacientes con cáncer gástrico.
El valor de corte para el cuartil se puede definir como el valor correspondiente a los puntos 1/4, 2/4, 3/4 y 4/4 cuando los múltiples pacientes con cáncer gástrico se distribuyen según el tamaño de la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico. En este caso, el valor de corte para el cuarto cuartil puede ser la mayor puntuación entre las puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas de los pacientes.
Según un ejemplo de la presente invención, se puede determinar que el caso en el que la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) es igual o mayor que el valor de referencia tiene pronóstico negativo.
Según un ejemplo de la presente invención, el valor de corte puede ser 0,2205 o -0,4478, y se puede determinar que el caso en el que la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) es igual o mayor que el valor de corte tiene pronóstico negativo. De manera preferente, el valor de corte puede ser 0,2205 si se miden los niveles de expresión de los genes C20orf103, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NoX4 y TFDP1 en la etapa a), y el valor de corte puede ser -0,4478 si se miden los niveles de expresión de los genes ADRA2C, C20orf103, CLIP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 y NOX4 en la etapa a).
En un ejemplo de la presente invención, se creó el modelo de predicción del pronóstico que comprende los genes en las tablas 10 y 11 mediante la aplicación del algoritmo lasso en gradiente, los pacientes con cáncer gástrico se clasificaron en el grupo de pronóstico positivo o el grupo de pronóstico negativo mediante la comparación del valor del pronóstico del cáncer gástrico obtenido mediante la introducción del valor de expresión en la fórmula anterior con el valor de referencia. Los resultados del gráfico de Kaplan-Meier para el grupo clasificado verificó la validez y la fiabilidad del modelo de predicción del pronóstico utilizando marcadores de la presente invención al mostrar que la tasa de supervivencia del grupo de pronóstico negativo (riesgo elevado) es significativamente menor que la del grupo de pronóstico positivo (riesgo bajo) (ejemplo 9 y figuras 29, 31, 32). Además, los resultados de la clasificación de los pacientes según el valor del pronóstico del cáncer gástrico obtenido mediante la medición del nivel de expresión del gen marcador con los pacientes que recibieron sólo gastrectomía en cuestión identificaron que el pronóstico de los pacientes que recibieron sólo gastrectomía también se puede predecir con el marcador de la presente invención al mostrar que la tasa de supervivencia del grupo de pronóstico negativo (riesgo elevado) es significativamente baja (ejemplo 9 y figura 33).
Por lo tanto, el pronóstico del cáncer gástrico se puede predecir con precisión según la presente invención y se puede conseguir el beneficio de un plan de tratamiento adecuado según el pronóstico predicho. Por ejemplo, se puede determinar que se continúe con la terapia estándar u opciones de tratamiento menos invasivas para los pacientes que se considera que tienen un pronóstico positivo, se puede determinar que se continúe el procedimiento de tratamiento para los pacientes con cáncer gástrico en una fase superior o un tratamiento muy agresivo o experimental para los pacientes que se considera que tienen un pronóstico negativo. En particular, se puede elegir el procedimiento de tratamiento adecuado según el pronóstico predicho, según la presente invención, para los pacientes que son diagnosticados con cáncer gástrico en fase Ib o fase II, ya que pueden mostrar un pronóstico diferente. Por ejemplo, se pueden utilizar procedimientos de tratamiento, tales como la cirugía o fármacos contra el cáncer, para los pacientes con cáncer gástrico en fase III para los pacientes que son predichos con un pronóstico negativo entre los pacientes que son diagnosticados con cáncer gástrico en fase Ib o fase II.
[Modo de la invención]
En lo sucesivo, la presente invención se describe con más detalles a través de los ejemplos. Sin embargo, estos
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ejemplos simplemente pretenden ilustrar, pero de ninguna manera limitar, la presente invención reivindicada. Ejemplo 1: Selección de pacientes con cáncer gástrico
El presente estudio se realizó en el Samsung Medical Center y el Samsung Cancer Research Institute según la Declaración de Helsinki. El presente estudio fue aprobado por el Consejo de Administración del Samsung Medical Center. Durante el período de 1994 a diciembre de 2005, se seleccionó una cohorte de 1.152 pacientes de los 1.557 pacientes que recibieron gastrectomía después de quimioterapia adyuvante de 5-FU/LV (régimen INT-0116) según los siguientes criterios:
1) diagnóstico histológico de adenoma, resección del tumor sin tumor residual,
2) disección de los ganglios linfáticos D2,
3) hombres y mujeres de más de 18 años de edad,
4) de la fase patológica Ib (T2bN0, TIN1 o No T2aN0) a la fase IV según el AJCC (American Joint Committee on Cancer), 6a edición,
5) conservación completa de los registros quirúrgicos y los registros de tratamiento, y los pacientes que recibieron quimioterapia adyuvante con 5-fluorouracilo/leucovorina (régimen INT-0116), como mínimo, dos veces, según los procedimientos siguientes, es decir, los pacientes que recibieron quimiorradioterapia (una radiación total de 4.500 cGy con 180 cGy al día, 1 semana/5 días, durante 5 semanas) seguido de la administración de 5-fluoro-uracilo (400 mg/m2/día) y leucovorina (20 mg/m2/día) durante 5 días (1 vez) y una vez adicional de la administración de 5-fluoro-uracilo (400 mg/m2/día) y leucovorina (20 mg/m2/día).
Se excluyeron del análisis 405 pacientes del grupo de 1.557 pacientes debido a las siguientes razones:
1) pacientes que recibieron quimioterapia adyuvante con 5-FU/LV menos de dos veces (N = 144),
2) pacientes con un margen de resección microscópicamente positivo (N = 73),
3) pacientes con cáncer primario doble (N = 53),
4) pacientes con cáncer gástrico recurrente en el estómago remanente después de gastrectomía subtotal (N = 5),
5) pacientes sin registros médicos completos (N = 11),
6) pacientes que utilizaron algo distinto del régimen iNt-0116 (N = 65)
7) otros (N = 54).
Este estudio se realizó con un cribado aleatorio final de 432 pacientes después de un cribado secundario de 1.152 pacientes de los 1.557 pacientes seleccionados inicialmente, y las características médicas para los pacientes se muestran en la tabla 1. La clasificación de los 432 pacientes según la fase patológica del cáncer gástrico mostró la composición de 68 en la fase Ib, 167 en la fase II, 111 en la fase IIIA, 19 en la fase IIIB y 67 en la fase IV (tabla 1).
[Tabla 1]
Características
N=432
Edad (años)
Mediana, intervalo
53, 23-74
Género
Masculino
280 (64,8%)
Femenino
152 (35,2%)
Tipo de gastrectomía
Gastrectomía subtotal
256 (59,3%)
Gastrectomía total
175 (40,5%)
Otras
1 (0,2%)
Extensión de la cirugía
Resección del bazo
73 (16,9%)
Resección del bazo, páncreas
8 (1,9%)
Ubicación del tumor
Distal 1/3
231 (53,5%)
Central 1/3
130 (30,1%)
Cardias, unión GE
53 (12,3%)
Total, muticéntrico
17 (3,9%)
Estómago remanente
1 (0,2%)
Grado
Tubular de bien a moderadamente diferenciado
111 (25,7%)
Tubular escasamente diferenciado
200 (46,3%)
Célula en anillo de sello
101 (23,4%)
Mucinoso
14 (3,2%)
Papilar
3 (0,7%)
Hepatoide
2 (0,5%)
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Ejemplo 2: Extracción de ARN del tumor gástrico
Se extrajo ARN del tumor gástrico de los pacientes con cáncer gástrico cribados finalmente en el ejemplo 1. Para ello, se seleccionó el bloque de parafina con tumor primario que consistía en el tumor más grande. Se extrajo ARN de 2 a 4 secciones de 4 pm de grosor en tejido embebido en parafina fijado con formalina y se extrajeron los elementos no tumorales mediante microdisección antes de pasar al tubo de extracción. A continuación, se extrajo el ARN total utilizando el kit High Pure RNA Paraffin (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania) o el kit FFPE RnA Isolation E.Z.N.A.® (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante. La concentración del ARN extraído se determinó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 8000 (Thermo Scientific) y se almacenó a una temperatura baja de -80°C antes de su utilización. En el experimento, la muestra de ARN con una concentración de menos de 40 ng/pl y una proporción de A260/A280 de menos de 1,5 o una proporción de A260/230 de menos de 1,0 no se utilizó en el análisis por ser una muestra inadecuada.
Ejemplo 3: Obtención del perfil de expresión del genoma completo
Se realizó el ensayo Illumina Whole-Genome DASL® (hibridación, selección, extensión y ligadura mediada por ADNc (“cDNA-mediated Annealing, Selection, Extension, and Ligation”), Illumina, Estados Unidos) con 200 ng de ARN extraído del ejemplo 2 según las instrucciones del fabricante. En primer lugar, se preparó la plantilla de PCR mediante la transcripción inversa del ARN completo en ADNc utilizando cebadores oligo-dT y aleatorios biotinilados, la hibridación de ADNc biotinilado a una pareja de oligos de búsqueda, la extensión del espacio entre los oligos de búsqueda y, a continuación, la ligadura. Posteriormente, los productos de la PCR amplificados utilizando una pareja de cebadores de PCR universales se hibridaron al HumanRef-8 Expression BeadChip (> 24.000 transcripciones anotadas). Después de la hibridación, los HumanRef 8 BeadChips se rastrearon utilizando iScan (Illumina, Estados Unidos).
Ejemplo 4: Control de calidad del ensayo DASL del genoma completo
La sonda denominada "ausente" entre las 24.526 sondas de HumanRef-8 Expression BeadChip utilizado en el ejemplo 3 se filtró y se extrajo. Se utilizaron 17.418 sondas después de la filtración en el análisis posterior. La intensidad de la sonda se modificó mediante el logaritmo con base 2) y se normalizó utilizando el algoritmo de normalización por cuantiles. Como resultado, se realizó el análisis estadístico utilizando las 17.418 sondas y las 432 muestras.
Ejemplo 5: Identificación del gen de predicción del cáncer gástrico
A efectos de identificar el gen cuyo nivel de expresión se asocia con resultados clínicos, tales como la supervivencia libre de enfermedad (DFS), se realizó el análisis estadístico estándar utilizando el modelo de riesgo proporcional Cox para procesar los niveles de expresión de genes como variables continuas. Como resultado, se identificaron 369 sondas con la asociación significativa de la tasa de supervivencia libre de enfermedad entre 17.418 sondas mediante el análisis univariante, y los resultados se muestran en la tabla 2 (p <0,001).
Además, dado que es importante predecir el pronóstico de los pacientes en la fase Ib/II, se identificó el gen del pronóstico del cáncer gástrico específico para la fase Ib/II con la muestra recogida de pacientes en fase Ib/II entre las muestras en cuestión de la misma manera que anteriormente, y los resultados se muestran en la tabla 3. El valor de p en la tabla 3 representa el grado de los efectos de los niveles de expresión de los genes en el pronóstico clínico con menor valor de p que afecta más significativamente al pronóstico y la proporción de riesgo representa la grado de los efectos sobre la tasa de recurrencia del cáncer gástrico con un significado importante de aumento o disminución de las cifras.
Según las tablas 2 y 3, se identificó la presencia de un número de genes de pronóstico específicos de la fase Ib/II, aunque los genes de pronóstico identificados con todo el grupo de pacientes en cuestión coinciden con los genes de pronóstico identificados con los pacientes en fase Ib/II en cuestión.

Claims (14)

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    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Utilización de un marcador para la predicción del pronóstico del cáncer gástrico, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NaDpH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
  2. 2. Utilización de una composición para la predicción del pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o proteína de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en la que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), nOX4 (NAdPh oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
  3. 3. Utilización, según la reivindicación 2, en la que el agente para medir el nivel de expresión de ARNm del gen es la pareja de cebadores o sonda que se une específicamente al gen y el agente para medir el nivel de expresión de la proteína es el anticuerpo específico para la proteína codificada por el gen.
  4. 4. Utilización de un kit para la predicción del pronóstico del cáncer gástrico que comprende agentes para medir el nivel de expresión de ARNm o proteína de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico, en la que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FzD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
  5. 5. Procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) obtener el nivel de expresión o el patrón de expresión de ARNm o proteína de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico; y b) comparar el nivel de expresión o el patrón de expresión obtenido en la etapa a) con el nivel de expresión o el patrón de expresión de ARNm o proteína de los genes correspondientes en un paciente con cáncer gástrico con pronóstico conocido, en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY, miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
  6. 6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que el nivel de expresión de ARNm del gen se mide utilizando la pareja de cebadores o sonda que se une específicamente al gen y el nivel de expresión de la proteína se mide utilizando el anticuerpo específico para la proteína correspondiente.
  7. 7. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que el nivel de expresión de ARNm del gen o la proteína codificada por el gen se normaliza mediante la comparación con el nivel de expresión de ARNm de uno o más genes de referencia seleccionados del grupo que consiste en los genes de referencia indicados en la tabla 4 o el nivel de expresión de la proteína codificada por los genes de referencia.
  8. 8. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que los pacientes con cáncer gástrico en las etapas a) y b) son los pacientes que recibieron el mismo tratamiento, y el tratamiento se selecciona del grupo que consiste en radioterapia, quimioterapia, quimiorradioterapia, quimioterapia adyuvante, gastrectomía, quimioterapia o quimiorradioterapia después de gastrectomía, y gastrectomía sin radioterapia después de quimioterapia adyuvante u operación.
  9. 9. Procedimiento para predecir el pronóstico del cáncer gástrico que comprende a) medir el nivel de expresión de ARNm o proteína de un marcador para predecir el pronóstico del cáncer gástrico en una muestra recogida de un paciente con cáncer gástrico para obtener el valor de expresión cuantificada; b) aplicar el valor de expresión obtenido en la etapa a) al modelo de predicción del pronóstico para obtener la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico; y c) comparar la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) con el valor de referencia para determinar el pronóstico del paciente,
    en el que el marcador es una combinación de todos los genes C20orf103 (marco de lectura abierto 103 del cromosoma 20), MATN3 (matrilina 3), CLIP4 (familia de proteínas enlazadoras que contienen un dominio CAP-GLY,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    miembro 4), NOX4 (NADPH oxidasa 4), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), CSK (tirosina quinasa c-src), FZD9 (receptor 9 de la familia Frizzled), GALR1 (receptor de galanina 1), GRM6 (receptor metabotrópico de glutamato 6), INSR (receptor de insulina), LPHN1 (latrofilina 1), LYN (homólogo de oncogén relacionado viral v-yes-1 del sarcoma de Yamaguchi) y MRGPRX3 (GPR relacionado con MAS, miembro X3).
  10. 10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que el modelo de predicción del pronóstico en la etapa b) se expresa como:
    [S = B1 x1 + ... + Bnxn]
    en el que xn es el valor de expresión cuantificada del gen n-ésimo,
    Bn es la estimación de la regresión Cox del gen n-ésimo, y S representa la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico.
  11. 11. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que el valor de referencia en la etapa c) se define como un valor en un intervalo desde el valor de corte para el tercer cuartil hasta el valor de corte para el cuarto cuartil en la distribución de las puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas de los múltiples pacientes con cáncer gástrico, según la siguiente fórmula:
    [S = B1 x1 + ... + Bnxn]
    en la que xn es el valor de expresión cuantificada del gen n-ésimo,
    Bn es la estimación de la regresión Cox del gen n-ésimo, y S representa la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico.
  12. 12. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que el valor de referencia en la etapa c) se define como un valor en un intervalo desde el valor de corte para el segundo cuartil hasta el valor de corte para el tercer cuartil en la distribución de las puntuaciones del pronóstico del cáncer gástrico obtenidas de los múltiples pacientes con cáncer gástrico, según la siguiente fórmula:
    [S = B1 x1 + ... + Bnxn]
    en la que xn es el valor de expresión cuantificada del gen n-ésimo,
    Bn es la estimación de la regresión Cox del gen n-ésimo, y S representa la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico.
  13. 13. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que en el caso de que la puntuación del pronóstico del cáncer gástrico obtenida en la etapa b) sea igual o mayor que el valor de referencia se determina que tiene pronóstico negativo.
  14. 14. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que el valor de corte para el tercer cuartil es -0,4478 en el caso de medir el nivel de expresión de los genes ADRA2C, C20orf103, cLiP4, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MATN3, MRGPRX3 y NOX4 en la etapa a).
    imagen1
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 2a]
    C20oif103 (Valor de p del logaritmo-rango< ,0001)
    imagen2
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 2b]
    COLIOAI (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0032)
    imagen3
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 3a]
    MATN3 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0382)
    imagen4
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 3b]
    FM02 (Valor de p del logaritmo-rango < ,0001)
    imagen5
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 4a]
    FOXS1 (Valor de p del logaritmo-rango < ,0001)
    imagen6
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 4b]
    COL8A1 (Valar de p del logaritmo-rango < ,0001)
    imagen7
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 5a]
    TNUBS4 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0004)
    imagen8
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 5b]
    ALAS1 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,001231)
    imagen9
    Probabilidad de supervivencia ^ Probabilidad de supervivencia
    imagen10
    imagen11
    CLYBL (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0287)
    imagen12
    imagen13
    •t-H-HHrm , .t! ¡ia| t )t t 1}} i IH—f-------(■
    fe co
    Expresión gemca baja
    UBI---
    5 Vt-H
    co
    Q.
    Expresión genica elevada
    o
    co
    100
    150
    Tiempo (meses)
    [Figura 7b]
    HSPC159 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0104)
    Expresión genica elevada
    CQ
    di o
    Expresión gemca baja
    CZ>
    O
    100
    Probabilidad de supervivencia
    imagen14
    [Figura 8b]
    MAF (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0004)
    imagen15
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 9a]
    REG3A (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0003)
    imagen16
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura 9b]
    RNF152 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0025)
    imagen17
    imagen18
    H CO
    V <=>
    Expresión gemca baja
    Expresión gemca elevada
    O
    100
    150
    Tiempo (meses)
    LFigura 10b]
    ZBED5 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0023)
    oo
    Expresión gemca baja
    Expresión gemca elevada
    TS <=
    O oj
    a
    Probabilidad de supervivencia
    [Figura lia]
    GPNMB (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0022)
    imagen19
    imagen20
    i g¡ a i ii 111 n il_
    OQ
    Expresión gemca elevada
    (V <D
    £2. -.r>
    Im lit un 11 iiiiHi Expresión genica baja
    a ^r.
    100
    150
    Tiempo (meses)
    [Figura 12a]
    RPL9 (valor de p del logaritmo-rango = 0,0164)
    Expresión gemca elevada
    <D <£>
    Q- o
    Expresión gemca baja
    CS CTJ
    imagen21
    rc oo
    Expresión genica baja
    ai <o
    Expresión genica elevada
    ~u <=>
    0-
    100
    150
    Tiempo (meses)
    [Figura 13a]
    ARL.10 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,001 i)
    Expresión gemca baja
    ai <ct
    a,<=l
    mu i;ii iii ii iii¡ m i ii. Expresión gemca elevada
    "O 'T.
    Probabilidad de supervivencia
    imagen22
    imagen23
    co
    Expresión genica baja
    EL ¿=>
    Expresión genica elevada
    ps ^
    o
    100
    150
    Tiempo (meses)
    [Figura 14b]
    CPS1 (Valor de p del logaritmo-rango = 0,0003)
    oo
    o
    ^rimiiii ibi 11 mi i. Expresión génica elevada
    -wiir i 11 i-i—h-
    Expresion gemca baja
    .Q C-ni
    ^rimiiii ibi 11 mi h Expresión génica elevada
    -wiir i 11 i-i—h-
    Expresion gemca baja
    100
    Probabilidad de supervivencia
    imagen24
    Probabilidad de supervivencia
    imagen25
    Función de supervivencia
    Ajuste solo mediante expresión gónica
    imagen26
    imagen27
    Probabilidad de supervivencia
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    Probabilidad de supervivencia
    imagen29
    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen30
    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen31
    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
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    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen43
    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen44
    iog (valor de P)
    imagen45
    Fracción libre de casos
    imagen46
    Densidad
    imagen47
    Fracción libre de casos
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    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen49
    Supervivencia libre de enfermedad
    imagen50
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