CN105483226B - 一种检测strap基因转录水平的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测STRAP基因转录水平的方法及试剂盒。本发明所述方法及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测STRAP基因的转录水平，能够满足临床检验实际工作的需要，利用STRAP基因转录水平的检测能够预测肺腺癌转移风险、诊断肺腺癌是否转移、判断肺腺癌是否复发。

Description

一种检测STRAP基因转录水平的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于检测STRAP转录水平的试剂盒及方法。
背景技术
肺癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势。肺癌患者中80％以上是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其5年存活率仅为15％。侵袭和转移是NSCLC重要的生物学特征。尽管不断进步、发展的医疗技术，放疗、化疗、生物靶向治疗等其他治疗手段的不断应用与发展，以及各种先进医疗设备的使用，不断提高肺癌的早期诊断率，提升肺癌的手术切除率，但是肺癌患者的5年生存率并未得到实质性的提高。
肺腺癌是肺癌最常见的病理类型，其发生发展是一个连续的、多基因参与的极为复杂的生物学过程。肺腺癌多数起源于支气管粘膜上皮，少部分起源于大支气管的粘液腺，早期不易被诊断，具有高度浸润、高破坏性、易侵犯血管和淋巴管壁从而发生远处转移的生长特征。虽然在基因和转录水平方面已进行了许多研究，但其癌变发生、发展机制仍不清楚，目前仍然缺乏有效的用于肺腺癌发生、发展、侵袭、转移方面监测的生物分子标志物。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种检测STRAP基因转录水平的方法，其能够简捷、直观、准确的对STRAP基因的转录水平进行检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种检测STRAP基因转录水平的方法，具体包括以下步骤：
1)特异性引物的设计
根据被证实的STRAP和ACTIN序列，设计特异性扩增引物；
2)逆转录合成cDNA
提取待测样本总RNA，以该总RNA为模板逆反录合成cDNA；
3)PCR扩增
将步骤2获得的cDNA稀释后作为模板，用步骤1)获得的STRAP和ACTIN基因的特异性扩增引物采用实时定量PCR中的染料法进行扩增反应；以ACTIN为内参基因、SRAP为目的基因，采用2-△△CT法进行数据相对定量分析，即可获得STRAP基因相对转录水平。
进一步，STRAP基因的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，STRAP基因的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步，ACTIN基因的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，ACTIN基因的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步，提取待测样本的总RNA的OD260/OD280值为1.7-2.2；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
进一步，所述PCR扩增反应的条件为：先于95°温度下处理10分钟；再以95℃变性15秒、60℃退火60秒为一个循环，共循环45次。
本发明的目的之二在于提供一种试剂盒，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测STRAP基因的转录水平，能够满足临床检验实际工作的需要，利用STRAP基因转录水平的检测预测肺腺癌转移风险、诊断肺腺癌是否转移、判断肺腺癌是否复发。
为实现以上目的，本发明的技术方案如下：
用于检测STRAP基因转录水平的试剂盒，所述试剂盒包括STRAP和ACTIN基因的特异性扩增引物、逆转录反应液、PCR反应液。
进一步，所述STRAP基因的特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
进一步，所述ACTIN基因的特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。
本发明的有益效果在于：
本发明所述方法及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测STRAP基因转录水平，能够满足临床检验实际工作的需要，利用STRAP基因转录水平的检测能够预测肺腺癌转移风险、诊断肺腺癌是否转移、判断肺腺癌是否复发。
附图说明
图1为待测样本的RNA的电泳图；
图2为10个实验样本的STRAP基因的扩增曲线；
图3为10个实验样本的STRAP基因的扩增反应产物的溶解度曲线；
图4为10个实验样本的ACTIN基因的扩增曲线；
图5为10个实验样本的ACTIN基因的扩增反应产物的溶解度曲线。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1肺腺癌转移差异表达基因的筛选
(1)数据筛选
根据TCGA数据库中对肺腺癌患者AJCC癌症分期记录，将肺腺癌患者分为两组：肺腺癌转移组合非转移组。共筛选出212例未发生转移患者，186例发生淋巴结转移或/且远端转移患者。下载TCGA数据库中腺癌转移组和非转移组患者mRNA表达数据，并进行高通量mRNA表达数据整合分析。(数据来自肺腺癌患者和对照组的实体瘤组织)。
(2)筛选差异表达的基因
通过转录组数据分析软件对TCGA数据库中肺腺癌(转移组和非转移组)mRNA原始数据进行背景校正和标准化后进行t-test得到P值，筛选差异表达mRNA，分析过程中设定P值＜0.01，共筛选出1257个差异表达的mRNA,其中表达水平上调的基因585个,表达水平下调的基因672个。
数据分析结果表明，与未发生转移的肺腺癌的实体瘤组织(NM)相比，发生转移的肺腺癌的实体瘤组织(ME)中STRAP基因的表达水平显著升高。
实施例2PCR扩增引物的设计及合成
根据被证实的STRAP和ACTIN序列，设计特异性扩增引物。PCR扩增引物委托北京Invitrogen公司合成，最优的PCR扩增引物详见表1。
表1 STRAP和ACTIN基因的扩增引物
STRAP基因的上游扩增引物 GCAAACTGTGGTAGGAAAAACG
STRAP基因的下游扩增引物 ACTAACTGCAACATATGATTGACGC
ACTIN基因的上游扩增引物 ACTTAGTTGCGTTACACCCTT
ACTIN基因的下游扩增引物 GTCACCTTCACCGTTCCA
实施例3提取样本总RNA
实验样本如表2所示。其中，“未转移”和“转移”指的是肺腺癌患者肿瘤细胞的“未转移”和“转移”。
表2 实验样本
样本序号 样本名称
1 未转移1
2 未转移2
3 未转移3
4 未转移4
5 未转移5
6 转移1
7 转移2
8 转移3
9 转移4
10 转移5
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行待测样本RNA提取，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出(每个样本取100mg))后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后：
(1)加入Trizol 1ml，室温下保存5分钟；
(2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，混合均匀，室温下放置10分钟；
(3)以12000rpm的转速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的于-20℃预冷的异丙醇,充分颠倒混合均匀，置于冰上10分钟；
(4)以12000rpm的转速离心15分钟后弃掉上清液，按1：1的比例向Trizol液中加入75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，振荡混合，4℃下以12000rpm的转速离心5分钟；
(5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的的水溶解沉淀；
(6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,于-70℃温度下冻存；
(7)取5μl RNA，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。
RNA质量判定标准为：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。待测样本的RNA的电泳图如图1所示。样本的RNA浓度及纯度结果如表3所示。
表3 样本RNA浓度及纯度
Sample ID Nucleic Acid Conc. Unit O260/O280 O260/O230
未转移1 54.3 ng/μl 1.85 1.8
未转移2 159.5 ng/μl 1.97 1.8
未转移3 53.2 ng/μl 1.88 1.8
未转移4 78.5 ng/μl 1.8 1.8
未转移5 72.4 ng/μl 1.84 1.8
转移1 305.8 ng/μl 1.97 1.84
转移2 51.8 ng/μl 1.85 1.8
转移3 176 ng/μl 2.02 1.81
转移4 226.1 ng/μl 1.92 1.88
转移5 174.6 ng/μl 1.99 1.8
实施例4逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，具体操作如下：使用逆转录试剂盒,用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA,在PCR管中分别加入以下组分：5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/l dNTP 1.25μl，0.1mmol/l DTT 2.5μl，30μmmol/lOligo dT 2μl,200U/μl MMLV 1.25μl，模板RNA 1μg，加入灭菌水至总体系25μl。42℃孵育1小时,72℃10分钟,以12000rpm的转速离心30秒。cDNA放入-20℃的冰箱保存备用。
实施例5PCR扩增反应
表4 RCR反应各组分及相应体系
成分 体积
SYBR Green Mix 10μl
上游引物(5μm/μl) 0.5μl
下游引物(5μm/μl) 0.5μl
模板DNA 2.0μl
无酶水 12μl
将各样品cDNA稀释10倍后取2μl作为模板，分别用STRAP基因的扩增引物和ACTIN基因的扩增引物采用实时定量PCR中的染料法进行扩增，PCR反应各组分及反应体系如表4所示，PCR扩增反应条件为：先于95°温度下处理10分钟；再以95℃变性15秒、60℃退火60秒为一个循环，共循环45次。同时在60-95℃温度下进行溶解曲线分析。根据PCR扩增反应结果，以ACTIN为内参基因、STRAP为目的基因，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出样品STRAP基因的相对转录水平。图2为10个实验样本的STRAP基因的扩增曲线，图3为10个实验样本的STRAP基因的扩增反应产物的溶解度曲线。图4为10个实验样本的ACTIN基因的扩增曲线，图5为10个实验样本的ACTIN基因的扩增反应产物的溶解度曲线。表5为10个实验样本的相对定量结果。
表5 相对定量结果
备注：以未转移1样本为对照样本。
由上述结果可知，与未发生转移的肺腺癌的实体瘤组织(NM)相比，发生转移的肺腺癌的实体瘤组织(ME)中STRAP基因的转录水平显著升高。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.STRAP基因在制备检测转移的肺腺癌的试剂盒中的应用。
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