ES2292348B2 - Metodo y kit de diagnostico precoz y/o pronostico del carcinoma oral de celulas escamosas (coce). - Google Patents
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Abstract
Método y kit de diagnóstico precoz y/o pronóstico del carcinoma oral de células escamosas (COCE). Método de diagnóstico precoz y de pronóstico del carcinoma oral de células escamosas (COCE) mediante la evaluación de la sobreexpresión del gen ATPV1C1 y/o sus productos de trascripción. Además compuestos inhibidores de la sobre expresión del gen ATPV1C1 pueden ser utilizados en el tratamiento de dicha enfermedad cancerígena. Así como kit para llevar a cabo el método citado anteriormente.
Description
Método y kit de diagnóstico precoz y/o
pronóstico del carcinoma oral de células escamosas (COCE).
La presente invención se refiere a un método
para el diagnóstico precoz y/o pronóstico del COCE mediante la
evaluación de la sobreexpresión del gen ATP6V1C1, además del uso de
dicho gen y/o sus productos de trascripción para el tratamiento de
esta enfermedad y el kit para llevar a cabo el método citado
anteriormente.
El carcinoma oral de células escamosas (COCE),
tumor maligno de origen epitelial, es la neoplasia más frecuente de
la cavidad oral. Representa entre un 90 y un 95% de todas las
lesiones malignas de la boca.
Aunque clásicamente se consideraba que el cáncer
oral comprendía todas las neoplasias malignas que afecten los
labios, la lengua y los tejidos intraorales, incluida la
orofaringe, en la última edición de la Clasificación Internacional
de Enfermedades (ICD) de la Organización Mundial de la Salud (OMS),
(cf. Moore et al., 2000 Oral Dis, vol. 6; pp.
161-3) sugieren que las lesiones asentadas en la
porción móvil de la lengua, suelo de boca, mucosa bucal, mucosa del
reborde alveolar superior e inferior y paladar, deben ser agrupadas
bajo la denominación de cáncer oral, y que el cáncer de labio,
orofaringe y de glándulas salivales deben ser analizados por
separado.
Estudios epidemiológicos recientes (cf. Nieto A.
et al., 2002 J Oral Pathol Med, vol. 31; pp.
147-52) han demostrado un aumento de la mortalidad
anual por cáncer oral, de un 25% para los hombres y de un 9% para
las mujeres, durante el período de 1975-1994, lo
que hace que el cáncer oral deba ser considerado un problema de
salud pública.
Desafortunadamente, los rasgos
clínico-patológicos de la enfermedad son la única
medida disponible para predecir su pronóstico, guiar el tratamiento
y aconsejar a los pacientes. El tratamiento convencional, ya sea con
cirugía, radioterapia y/o quimioterapia, está asociado con una
elevada morbilidad afectando el habla, la deglución y, en general,
la calidad de vida del paciente. Pese a los avances en estas
intervenciones, la recurrencia de la enfermedad se observa en más
del 50% de los pacientes con altas tasas de mortalidad asociada
(cf. Sieczka E. et al. 2001, Am J Otolaryngol, vol.
22; pp. 395-9). Esto viene acompañado del hecho de
que mientras la habilidad para controlar localmente la enfermedad
ha progresado, la tasa total de supervivencia a los 5 años no ha
mejorado significativamente en las pasadas tres décadas.
El COCE, como enfermedad neoplásica de etiología
multifactorial, es una de las enfermedades más heterogéneas. Pese a
los esfuerzos para identificar biomarcadores, ningún marcador
específico puede ser usado con confianza en la detección precoz o
como indicador de prognosis.
Son las limitaciones de las características
clínicas en pacientes con cáncer oral las que han llevado a la
búsqueda de biomarcadores de pronóstico por parte de diversos
grupos de investigación. Inicialmente los esfuerzos se centraron en
marcadores individuales, como p53, queratinas o p16,
pero su utilidad es limitada dada su penetrancia incompleta y
expresión variable (cf. Gleich LI. et al. 2002, Cancer
Control, vol. 9; pp. 369-78). Es por ello que
los esfuerzos recientes se han centrado en el análisis de los
cambios de expresión génica global con la esperanza de identificar
cambios asociados con la carcinogénesis en estos tumores, y de
identificar firmas genéticas específicas que permitan predecir las
consecuencias de la enfermedad (cf. Villaret DB. et al.
2000, Laryngoscope; vol. 110; pp.
374-81).
El proyecto Genoma Humano ha sido el catalizador
para el desarrollo de tecnologías de alta productividad que han
permitido mapear y secuenciar genomas complejos. En los últimos
años tales tecnologías se han extendido hasta permitir la medida de
la expresión relativa de miles de genes simultáneamente en un único
experimento. La plataforma con mayor responsabilidad en esta nueva
frontera de la investigación genómica es la de microarrays
de ADN, también conocida como chip de ADN o chip génico.
Existe la necesidad de encontrar un marcador o
marcadores específicos para el diagnóstico precoz o pronóstico del
COCE.
El primer paso dado por los inventores para un
diagnóstico precoz del COCE, la posibilidad de predecir cómo va a
evolucionar, y el desarrollo de terapias génicas específicas, es
descifrar y comprender su comportamiento desde un punto de vista
genético.
Por lo tanto, los inventores de la presente
invención consideraron importante el estudio o análisis previo con
microarrays donde se identificaron diversos genes alterados en el
COCE, y se seleccionaron algunos como pueden ser ADRBK2, ADRB1,
ADRA2B, AXIN 2, ATP6VIC1 y ATP6V0E, para validar su sobreexpresión
en dicho tumor mediante la tecnología de la PCR cuantitativa en
tiempo real (RT-qPCR), y estudiar cómo puede
influir su comportamiento en el crecimiento y desarrollo del
tumor.
Al no encontrar variaciones en la expresión de
los genes estudiados dependientes del estadio tumoral, se demuestra
que la gran mayoría de las alteraciones genéticas observadas en el
COCE aparecen ya en estadios iniciales del tumor, no observándose
grandes cambios durante la evolución posterior del mismo. El hecho
de que el grupo de genes implicados en la patogénesis del COCE sea
un grupo reducido y, además, no varíe sustancialmente durante su
evolución, demuestra que algunos de estos genes podrían ser
utilizados como marcadores tumorales en el diagnóstico y estudio de
la progresión de estos tumores, así como para su uso como dianas
terapéuticas durante el desarrollo de terapias génicas.
Sorprendentemente, de todos los genes estudiados
y que están relacionados con esta enfermedad, ninguno de ellos se
sobreexpresa de forma continua y en cualquier estadio tumoral, a
excepción del gen ATP6V1C1.
Puesto que la V-ATPasa se
compone de un dominio V1 citosólico y un dominio V0 transmembrana,
son dos las variantes de trascripción alternativas que codifican
distintas isoformas que se han encontrado en este gen, ATP6V1C1 y
ATP6V0E.
La V-ATPasa es una bomba de
protones reguladora del pH celular, de ahí su implicación en la
progresión neoplásica. De esta forma, las V-ATPasas
están implicadas en la transformación celular, carcinogénesis y
metástasis tumoral.
Con estos datos se podría llegar a pensar que el
gen ATP6V0E también se sobreexpresa en este tipo de cáncer, pero
los autores de la presente invención han encontrado solamente
relación entre ATP6V1C1 y el COCE.
El pH celular es crucial para diversas funciones
biológicas como la proliferación celular, invasión y metástasis,
resistencia a medicamentos y apoptosis. Las condiciones hipóxicas
son un fenómeno frecuente durante el desarrollo de tumores sólidos
y desencadenan una acidosis intra y extracelular. Esta acidosis
celular parece ser un desencadenante de la apoptosis y permite la
activación de endonucleasas que inducen la fragmentación del ADN.
Para evitar la acidificación intracelular bajo estas condiciones,
los reguladores de pH deben estar sobre-regulados en
las células tumorales. Esto se cumple también en los pacientes con
la sobreexpresión de ATP6V1C1, puesto que la hipoxia también es un
fenómeno característico del COCE, como tumor sólido que es.
Además, los autores de la presente invención han
encontrado una relación estadísticamente significativa entre la
sobreexpresión del gen ATP6V1C1 y el consumo de tabaco. Esta
relación también se debería cumplir en la otra bomba de protones
como es el gen ATP6V0E, pero esta relación no llega a ser
estadísticamente significativa.
Por otro lado, es interesante destacar que el
aumento de la actividad de la bomba de protones reguladora del pH
se logró incrementando la actividad catalítica (relacionada con
ATP6V1C1) y no el número de canales intramembrana (relacionada con
los otros genes estudiados pertenecientes a los complejos V0 y
V1).
El tabaco es un agente tóxico que hace que las
condiciones de hipoxia y acidosis intracelular en el tumor se
incrementen, resultando de todo ello un aumento de la actividad de
la bomba de protones.
Además el hecho de que la correlación entre la
expresión de ATP6V1C1 y el tabaco sea significativa, podría indicar
que el estrés ambiental producido por el tabaco se acompaña de un
mayor desarrollo de los mecanismos de protección celular.
A la luz de lo expuesto, se puede considerar que
el gen ATP6V1C1 inicia el proceso de alteración de acidificación
del medio extracelular antes descrito e imprescindible para la
progresión y diseminación del cáncer y, esto explica su
sobreexpresión persistente y mantenida en todas las muestras
tumorales y su independencia del estadio tumoral.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente
invención proporciona un método in vitro de diagnóstico
precoz y pronóstico de COCE que comprende los siguientes pasos:
a) Obtención de una muestra tumoral biológica
aislada y una muestra de tejido homologo sano del mismo
paciente.
Tras la obtención de las muestras tumoral y sana
se procede a la congelación de las mismas por inclusión en
nitrógeno líquido.
Se puede conservar congelada a una temperatura
de unos -80ºC por un tiempo considerable, que puede ir desde
semanas hasta incluso un año.
Tal y como se describe en los ejemplos de la
presente invención se toman dos muestras de un mismo paciente, una
de tejido tumoral y otra de mucosa oral normal del lado
contralateral. Esto es de suma importancia, ya que se evita el
posible problema de diferencias individuales en la expresión
genética.
En relación al tipo de tejido a analizar, se
pueden realizar dos tipos principales de estudios: los que utilizan
el tejido tumoral íntegro, y los que únicamente emplean fragmentos
de tumor elegidos por medio de técnicas de captura o microdisección
láser. Las técnicas de microdisección láser nos permiten
seleccionar fragmentos de tejido bajo un microscopio. Sin embargo,
se sabe que en la carcinogénesis y el desarrollo tumoral, no sólo
están implicadas las células parenquimatosas (en este caso células
epiteliales), sino que las células estromales también juegan un
papel fundamental. Por tanto, eliminar el estroma en este tipo de
investigaciones, en las que se pretende identificar alteraciones
genéticas de un tumor determinado, también puede eliminar
información vital sobre sus mecanismos de crecimiento e invasión.
Por todo ello, es fundamental incluir el tejido tumoral completo,
incluyendo parénquima y estroma tumoral, reservando el análisis de
tejidos específicos para aquellos casos en los que el diseño
experimental así lo requieran.
b) Normalizar la señal de ATP6V1C1 con la
obtenida en la reacción con una pareja de primers y sonda tipo
taqman que son complementarias a una secuencia del gen GUS, esto es
lo que denominamos ratio ATP6V1C1/GUS.
c) Evaluar la sobreexpresión comparando la ratio
ATP6V1C1/GUS de la muestra problema con la su tejido homólogo
sano.
En una realización preferida de la presente
invención comprende los siguientes primers y sonda tipo taqman:
ATP6V1C1:
- 5'-SEQ ID Nº 1-3'
- 5'-SEQ ID Nº 2-3'
- 5'-6FAM- SEQ ID Nº 3 -TAMRA
\vskip1.000000\baselineskip
GUS:
- 5'-SEQ ID Nº 4-3'
- 5'- SEQ ID Nº 5-3'
- 5'-6-FAM- SEQ ID Nº 6 -TAMRA.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención comprende la evaluación de la sobreexpresión del
gen
ATP6V1C1. Esta se realiza determinando el nivel de los productos de transcripción (ARN mensajero) correspondientes a dicho gen normalizándolo contra un gen control y comparando esta ratio con la obtenida para la muestra normal del mismo paciente., mediante, pero sin limitarnos, análisis Northerm blot, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena ligasa (RT-LCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR), PCR multiplex, PCR tiempo real con doble lectura, microarrays, técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometría de flujo o proteómica.
ATP6V1C1. Esta se realiza determinando el nivel de los productos de transcripción (ARN mensajero) correspondientes a dicho gen normalizándolo contra un gen control y comparando esta ratio con la obtenida para la muestra normal del mismo paciente., mediante, pero sin limitarnos, análisis Northerm blot, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena ligasa (RT-LCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR), PCR multiplex, PCR tiempo real con doble lectura, microarrays, técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometría de flujo o proteómica.
En una realización aún más preferida, se extrae
el ARN total de las muestras y se comprueba la cantidad y calidad
de ARN obtenido por electroforesis en gel de agarosa convencional o
empleando un bioanalizador Agilent. Posteriormente se realiza una
retrotranscripción y obtención de ADN copia (cADN). Se procede a la
cuantificación del gen ATP6V1C1, preferiblemente mediante PCR
cuantitativa empleando un sistema de PCR en tiempo real y usando
sondas taqman marcadas con FAM. Como gen control se empleará GUS,
también con sondas taqman marcadas preferiblemente con FAM, si se
emplean PCRs individuales, o bién otros marcadores si se requiere
el empleo de PCR multiplex y de sistemas de PCR en tiempo real con
doble lectura. Para ambos genes se deben incorporar al experimento
curvas de calibrado construidas con diluciones seriadas de muestras
control. La cuantificación de ATP6V1C1 y GUS se realiza tanto para
la muestra tumoral como normal. La cantidad de ATP6V1C1 se
normaliza frente a GUS y las cantidades se expresan en forma de
ratios ATPIV1C1/GUS.
La tecnología de la PCR cuantitativa en tiempo
real (RT-qPCR) es un método que permite la
cuantificación de ácidos nucleicos con gran exactitud y fiabilidad.
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en
tiempo real la amplificación de un fragmento de interés.
Combina el método de amplificación de la PCR
desarrollado por Mullis, con la utilización de moléculas de
fluorocromo para poder monitorizar paso a paso y de manera
cuantificable el proceso de amplificación de un segmento específico
de ADN de interés.
El término "sobreexpresión del gen
ATP6V1C1" significa en esta invención cuando hay un 5% ó más de
expresión con respecto a un tejido sano. Esta sobreexpresión puede
considerar indicativa de patología tumoral cuando la ratio
ATP6V1C1/GUS en el tejido presuntamente tumoral supera 2 veces la
misma ratio en el tejido normal. Si hay una clara sobreexpresión de
ATP6V1C1 en el tejido tumoral, lo que se da cuando la ratio
ATP6V1C1/GUS en este tejido supera 2 veces la misma ratio en el
tejido normal, se considera probable que el tejido es o será
tumoral y que se ha iniciado los procesos que llevarán a la
diseminación.
Un segundo aspecto de la presente invención
proporciona un kit para el diagnóstico precoz o pronóstico de COCE
capaz de llevar a cabo los métodos descritos con anterioridad.
Este kit comprende reactivos para llevar a cabo
la amplificación de los ARN mensajeros de ATP6V1C1 y del gen
control a partir de la muestra problema y los reactivos para llevar
a cabo la amplificación de los ARN mensajeros de ATP6V1C1 y del gen
control a partir de la muestra sana. Por ejemplo primers para
amplificación y sondas taqman para la detección de ATP6V1C1 y
GUS.
En una realización preferida de la presente
invención el kit comprende:
a) primers para amplificación y sondas taqman
para la detección por PCR en tiempo real de los ARN mensajeros de
ATP6V1C1 y GUS.
ATP6V1C1:
- 5'-SEQ ID Nº 1-3'
- 5'-SEQ ID Nº 2-3'
- 5'-6FAM- SEQ ID Nº 3c -TAMRA
\vskip1.000000\baselineskip
GUS:
- 5'- SEQ ID Nº 4-3'
- 5'- SEQ ID Nº 5-3'
- 5'-6-FAM- SEQ ID Nº 6 -TAMRA.
\vskip1.000000\baselineskip
b) curvas de calibrado del gen ATP6V1C1 en
diluciones de 1, 10, 50, 100 y 1000 copias por microlitro de un
vector plasmídico que contenga las secuencias apropiadas del gen,
que son aquellas que amplifica los primers del apartado
anterior).
En una realización más preferida las curvas de
calibrado del gen GUS en diluciones de 1, 10, 50, 100 y 1000 copia
de un vector plasmídico que contenga las secuencias apropiadas del
gen, es decir, aquella que amplifica los primers del apartado a),
aunque se puede optar por kits ya existentes de este gen
control.
c) Se puede completar con elementos, por ejemplo
tubos, para recogida de muestras de biopsias, y en una realización
más preferida, provistos de inhibidores de ARNasas para una mejor
preservación de la muestra y evitar así el uso de nitrógeno
líquido.
Un tercer aspecto de la presente invención
proporciona el uso del gen ATP6V1C1 como diana terapéutica para la
elaboración de inhibidores para su sobrexpresión que comprende:
a) construir un vector plasmídico de
interferencia mediante el uso del vector pSilencer
2.1-U6 de la casa Ambion, modificado adecuadamente
para que exprese un siRNA.
Esta modificación consiste primero en la
obtención de dos oligonucleótidos complementarios que contienen una
secuencia corta de 21 nucleotidos que corresponde a una región
específica del ARN mensajero de ATP6V1C1 (codones 280 a 300), sin
homología con otros genes conocidos, y secuencias "stem loop";
segundo en la hibridación de ambas cadenas oligonucleotídicas para
generar una secuencia de doble cadena y por último el ligamiento al
vector pSilencer 2.1-U6 vacío.
b) transfección de los ADNs plasmídicos
construidos mediante el uso del kit LipofectAMINE de
Invitrogen.
Un cuarto aspecto de la presente invención
proporciona un compuesto inhibidor de la sobrexpresión del gen
ATP6V1C1, en una realización preferida dicho inhibidor de ATP6V1C1
es un compuesto con capacidad para interferir con la función de
dicho gen a nivel de ácido nucléico o proteína. En una realización
aún mas preferida, dicho compuesto inhibidor se puede seleccionar,
pero sin limitarse, entre un péptido, una proteína, un
oligonucléotido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona el uso de compuestos inhibidores de la sobreexpresión
del gen ATP6V1C1 para la elaboración de una composición
farmacéutica para el tratamiento de COCE.
A lo largo de las reivindicaciones y de la
descripción de la presente invención, la palabra "comprende" y
las variaciones de la misma, no pretenden excluir otros aditivos,
componentes o pasos. Los ejemplos se proporcionan a modo de
ilustración y no tienen el propósito de limitar la presente
invención.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad del método de la presente
invención.
Trece pacientes con COCE (ocho hombres, cinco
mujeres, media de edad de 64,86 años, rango: 25-92
años) se incluyeron en este estudio. El diagnóstico de COCE fue
realizado por biopsia e histopatología. Todos los pacientes fueron
diagnósticos consecutivos de COCE en el Servicio de Cirugía
Maxilofacial del Complejo Hospitalario de Santiago de Compostela,
España.
Una muestra de biopsia fresca de tumor con su
correspondiente muestra de tejido de la mucosa oral normal tomada
en paralelo se obtuvo de cada paciente.
De todos los pacientes se recogió historial de
consumo de tabaco, datos sobre la localización anatómica del
carcinoma y estadio del tumor (Tabla 1). Todos los pacientes fueron
informados sobre la naturaleza del estudio y dieron su
consentimiento por escrito.
Se clasificaron los tumores en función del
estadio tumoral en el momento del diagnóstico de la siguiente forma
y según la 5ª edición del Manual de Estadiaje del Cáncer del
Ameriacan Joint Committee on Cancer: I con un estadio tumoral
del 12,5%, II con un estadio tumoral del 25%, III con un estadio
tumoral del 37,5% y IV con un estadio tumoral del 50%.
Muestras quirúrgicas de biopsia fresca del tumor
con muestra paralela de tejido de la mucosa oral normal se
obtuvieron de cada paciente, se congelaron inmediatamente por
inmersión en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC hasta su
empleo. El tejido congelado fue finalmente pulverizado en un
mortero bajo nitrógeno líquido, tras lo cual se añadió 0,6 mL de
tampón de tisis (Rneasy mini kit, Quiagen, Hilden, Germany). Todos
los pasos se realizaron de acuerdo a las instrucciones del producto.
La integridad del ARN se comprobó mediante una electroforesis en
geles de agarosa al 1%. Todo el equipamiento (eg. Homogeneizadores,
mortero, tubos) fueron pretratados con ARNsas y lavados con agua
tratada con diethyl pryrocarbonato antes de su uso.
El cADN de doble cadena se sintetizó a partir
del ARN total usando el kit SuperScript
double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen,
Carlsbad, CA). El ARN antisentido (aARN) se obtuvo a partir del
cADN de doble cadena usando T7 MEGAscript kit (Ambion, Austin, TX);
alicuotas de cada mezcla de reacción se comprobó por electroforesis
en un gel de agarosa al 1% para determinar el rendimiento; el aARN
se purificó usando el protocolo Rneasy Mini. Finalmente, las sondas
fluorescentes de cADN se obtuvieron por transcripción reversa a
partir del aARN empleándose el kit CyScribe
first-strand cDNA labeling (Amersham Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ), con cyanine 5-dCTP (Cy5)
para marcar el aRNA del tumor, o cyanine 3-dCTP
(Cy3) para el aRNA normal.
Se adquirieron los microarrays Atlas Glass Human
3.8 I (Clontech), que contienen oligonuecleotidos largos de cADN
correspondientes a 3500 genes humanos. Los portaobjetos se
hibridaron con 80 \muL de las sondas de cADN marcadas con Cy5 y
Cy3 en 2 mL de solución de hibridación GlassHyb (Clontech) a 50ºC
en una cámara Atlas Glass Hybridization. Después de 16 horas de
hibridación, se realizaron los pasos de lavado recomendados en el
protocolo de la casa comercial. Tras un lavado final con agua
destilada, los portaobjetos se secaron por centrifugación a 1500 x
g durante 5 minutos.
Las señales de hibridación se leyeron
empleándose un escaner fluorescente de doble laser Affymetrix 418
(GMS 418). Las imágenes escaneadas se inspeccionaron visualmente
para detectar posibles artefactos que pudieran dar falsos
positivos, y luego fueron analizadas con el software Imagene 4.1
(Biodiscovery, El Segundo, CA). La intensidad del cada punto en el
array se calculó tras sustraer el ruido de fondo. Por cada punto en
el array, las señales de hibridación del análisis de imágenes rinde
valores para el fluorocromo Cy5 (tejido tumoral) y Cy3 (tejido
normal). La normalización de los datos y el análisis estadístico se
realizó empleando el sistema SOLAR (ALMA Bioinformatics SL,
Madrid). Para ajustar la intensidad media de los puntos de cada
imagen a un valor común, todas las señales de los puntos en cada
canal se multiplicaron por un factor de escala. El valor común
escogido fue la media de todas la intensidades de los puntos sobre
todas las réplicas.
Las intensidades de señal para los canales de
Cy3 y Cy5 se normalizaron por el método lowess y se
calcularon las ratios de los datos frente a canales control. El
cálculo de la curva lowess es útil para corregir la desviación de
la ratio de los valores de la presunción estadística de que la
mayoría de los puntos no tienen expresión diferencial. Los valores
de expresión diferencial normalizada (log ratio) se ordenaron por
su probabilidad de ser diferentes de 0, según el valor absoluto del
estadístico t. El método de los z-scores se empleó
para estimar cuán diferente es el valor de la expresión diferencial
normalizada de 0. El z-score local mide el número
de desviaciones estándar que el dato de un punto particular se
desvía de la media. Los z-scores se calculan dentro
de una ventana alrededor de cada dato puntual (se emplea la
estructura local del conjunto de datos). Altos valores de
z-score y bajos valores de p pueden ser una buena
combinación para detectar genes diferencialmente expresados.
La cuantificación mediante PCR ligada a la
transcripción reversa en tiempo real (rtRT-PCR) se
realizó en el equipo CHROMO4 System (MJ Research) a partir del ARN
de 8 parejas de muestras (tumor y tejido normal). Las
amplificaciones por PCR se realizaron empleando los productos de
expressión Assays-on-Demand Gene
(Applied Biosystems). La expresión del gen GUS sirvió como un
control interno. Se obtuvieron los datos y se generaron curvas de
amplificación mediante el software del CHROMO4 System. Todas las
amplificaciones se realizaron por duplicado y el dato de ciclo
umbral (Ct) fue promediado para los cálculos subsiguientes de
valores de expresión relativos. La cuantificación de los datos de
rtRT-PCR se realizó como sigue: El valor Ct para
los genes de interés para cada muestra se normalizó contra el valor
Ct del correspondiente gen control endógeno (GUS): \DeltaC_{t}
= C_{t \ Taget \ gene} - C_{tGUS}.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que el proceso de desregulación del pH
relacionada con la carcinogénesis y proliferación no ha sido
estudiado en el carcinoma de células escamosas de la cavidad oral,
se analizaron cinco pacientes con COCE. Para detectar genes
regulados diferencialmente relacionados con el mecanismo regulador
del pH citosólico y la acidez tumoral, hemos realizado un perfil de
expresión mediante arrays de cADN empleando células normales de la
mucosa bucal pertenecientes al mismo paciente como muestra control.
El objetivo es evitar efectos espúreos debidos a variaciones
interindividuales o temporales. Como se muestra en la Tabla 2,
identificamos 6 de 12 genes con niveles de expresión
significativamente alterados.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen con un mayor z-score fue
ATPV1E1, seguido de ATPV1C1. Es de destacar que la mayoría de los
genes sobreexpresados se relación con el complejo VI de la ATPasa.
Más aún, el nivel de sobreexpresión y la presencia o ausencia de la
sobreexpresión misma varía entre genes, pese a que para funcionar
la H+-V-ATPasa debe formar un complejo único. Es
conocido que ATPV1C1 juega un papel regulador de la actividad pH. Se
ha decrito que ATPV1E1 es necesario para el ensamblaje de las
subunidades V0 y V1 y la actividad de la
H+-V-ATPasa, al menos en levadura. El interés se
volcó en comprobar el posible papel central de ATPV1C1 en la
regulación de la actividad ATPasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se validaron los cambios observados en ensayos
con microarrays por medio del empleo de PCR en tiempo real. Para
ello se reclutaron 8 pacientes con COCE y se seleccionaron dos
transcritos génicos (ATPV1C1 y ATPV0E). Igualmente se compararon
las muestras tumorales contra su propio tejido normal. Los
resultados obtenidos con la PCR en tiempo real en ambos transcritos
se muestran en la Tabla 3. Los resultados corroboraron la
sobre-regulación observada mediante microarrays y
confirmaron el incremento persistente de expresión de ATPV1C1 en
COCE comparado con las células control. Se observa sin embargo una
mayor variabilidad respecto a ATPV0E, sobreexpresándose únicamente
en 3 de las 8 muestras analizadas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Hemos encontrado un incremento en los niveles de
ARN mensajero de ATPVOC en varias muestras con COCE, pero ese
incremento era moderado respecto al tejido normal, pese a que casi
todos los tumores eran de grado II a IV. ATPV0C es una proteína del
canal V0, y aunque se ha descrito que puede unirse a papiloma E5
oncoproteínas y otros factores que regulan proliferación, su
inhibición no parece que altere de forma significativamente
diferente a otras proteínas estructurales e igualmente
fundamentales de ambos complejos. Por lo tanto, ATPV1C1 es una pieza
reguladora clave, anterior en cuanto a proceso de metastatización y
fundamental en el mismo y por tanto una mejor diana para
silenciamiento.
Los resultados del estudio describen por primera
vez en COCE la regulación del pH activada por la bomba de protones
v-ATPasa y que se encuentra involucrada en la
transformación celular. Estas bombas de protones
v-ATPasas pueden estar relacionadas con la
adquisición de la capacidad de crecimiento y expansión por parte de
las células tumorales COCE y ATPC1V1 puede jugar un papel clave en
dicho proceso.
<110> Universidade de Santiago de
Compostela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método y Kit de diagnóstico precoz
y/o pronóstico del carcinoma oral de células escamosas (COCE)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1596.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagaaaac ctgtcag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattagcca acagattctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggaagata gcaaagacaa agttc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaatatgt ggttggagag ctcatt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagtgaag atcccctttt ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer tipo Taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer tipo taqman
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagcactct cgtcgtcggt gactgttca
\hfill29
Claims (19)
1. Método in vitro para el diagnóstico
precoz o pronóstico de COCE mediante la evaluación de la
sobreexpresión del gen ATP6V1C1.
2. Método según la reivindicación anterior, que
comprende:
- a.
- obtener una muestra tumoral biológica aislada y una muestra de tejido homólogo sano del mismo paciente y
- b.
- evaluar la sobreexpresión del gen comparando el ratio ATP6C1V1/gen control de la muestra problema con la de su tejido homólogo sano.
3. Método según la reivindicación anterior que
además comprende los siguientes pasos intermedios:
- a.
- hacer reaccionar la muestra con una pareja de primers y sonda tipo taqman complementarias a una secuencia del gen ATP6V1C1;
- b.
- normalizar la señal de ATP6V1C1 con la obtenida en la reacción con una pareja de primers y sonda tipo taqman que son complementarias a una secuencia de un gen control (ratio ATP6V1C1/gen control).
4. Método según la reivindicación 3, donde los
primers y sondas para ATP6V1C1 y gen control son los
siguien-
tes:
tes:
- a.
- para ATP6V1C1:
- 1.
- SEQ ID Nº1
- 2.
- SEQ ID Nº 2
- 3.
- 6FAM- SEQ ID Nº 3 -TAMRA
\vskip1.000000\baselineskip
- b.
- para GUS:
- 1.
- SEQ ID Nº 4
- 2.
- SEQ ID Nº5
- 3.
- 6FAM- SEQ ID Nº 6 -TAMRA.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 y 4, donde el gen control es GUS.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde la evaluación de la sobreexpresión del
gen ATP6V1C1 comprende:
- a.
- determinar el nivel de los productos de transcripción (ARN mensajero) correspondientes a dicho gen,
- b.
- normalizarlo contra un gen control y
- c.
- comparar esta ratio con la obtenida para la muestra sana del mismo paciente.
7. Método según la reivindicación 1, donde la
evaluación de la sobrexpresión se realiza mediante análisis
Northern blot, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción
en cadena de la polimerasa (RT-PCR),
retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena ligasa
(RT-LCR), retrotranscripción en combinación con la
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real
(RT-qPCR), PCR multiplex, PCR tiempo real con doble
lectura, microarrays, técnicas basadas en el empleo de anticuerpos,
técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo,
citometría de flujo o proteómica.
8. Método según la reivindicación anterior,
donde la evaluación de la sobrexpresión se realiza mediante
retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR).
9. Kit para el diagnóstico precoz o pronóstico
de COCE, capaz de llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos
en las reivindicaciones 1 a 6.
\newpage
10. Kit según reivindicación anterior que
comprende:
- a.
- reactivos para llevar a cabo la amplificación de los ARN mensajeros de ATP6V1C1 y del gen control a partir de la muestra problema y
- b.
- reactivos para llevar a cabo la amplificación de los ARN mensajeros de ATP6V1C1 y del gen control a partir de la muestra sana.
11. Kit según las reivindicaciones 9 y 10, donde
el gen control es el gen GUS.
12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
9 a 11, donde la detección de los ARNm es mediante PCR en tiempo
real.
13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
8 a 12, que además comprende elementos para recogida de muestras de
biopsias.
14. Kit según la reivindicación anterior, donde
los tubos de recogidas de muestras incluyen inhibidores de
ARNasas.
ARNasas.
15. Uso del gen ATP6V1C1 como diana terapéutica
para la elaboración de inhibidores para su sobreexpresión.
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|---|---|---|---|
| ES200601549A ES2292348B2 (es) | 2006-06-08 | 2006-06-08 | Metodo y kit de diagnostico precoz y/o pronostico del carcinoma oral de celulas escamosas (coce). |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| ES200601549A ES2292348B2 (es) | 2006-06-08 | 2006-06-08 | Metodo y kit de diagnostico precoz y/o pronostico del carcinoma oral de celulas escamosas (coce). |
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| ES2292348A1 ES2292348A1 (es) | 2008-03-01 |
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- 2006-06-08 ES ES200601549A patent/ES2292348B2/es active Active
-
2007
- 2007-06-05 WO PCT/ES2007/070109 patent/WO2007144445A1/es active Application Filing
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|---|---|---|---|---|
| JP2006094733A (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-13 | As One Corp | 癌の検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| ALA-EDDIN AM. et al. Identification of genes associated with head and neck carcinogenesis by cDNA microarray comparison between matched primary normal epithelial and squamous carcinoma cells. Oncogene. 2002, Vol 21, páginas 2634-2640, todo el documento. * |
| CARINCI F. et al. Genetic Portrait of mild and severe lingual dysplasia. Oral Oncology. Abril 2005, Vol 41(4), páginas 365-374, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007144445A1 (es) | 2007-12-21 |
| ES2292348A1 (es) | 2008-03-01 |
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