ES2339132T3 - Metodos y kit para el pronostico de cancer de mama. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar el pronóstico de cáncer de mama en mamíferos, comprendiendo el método: (a) examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los siguientes marcadores moleculares: AMF, ATF4, Cyr61, ER, matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, nectina4, PAR1A, psoriason, Pttg1, Rho-C, Scotin, SDF1, SEMP1, SPF45, STT1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R, y ZO-3; y (b) cuando se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores con respecto al nivel de expresión de los mismos marcadores en pacientes que se ha considerado que tienen un pronóstico moderado; (c) concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia que es inferior al 20% de la de los individuos que sobreviven más de cinco años.
Description
Métodos y kit para el pronóstico de cáncer de
mama.
La presente invención se refiere a un método y a
un kit, incluyendo partes de los mismos, para el pronóstico de
cáncer de mama. En particular, el método implica identificar un
patrón de expresión génica que indica la probabilidad de
supervivencia de una paciente con cáncer de mama y/o la probabilidad
de recidiva de la enfermedad y/o el carácter metastásico del cáncer
en una paciente que se está tratando, o que se ha tratado, para
cáncer de mama.
El cáncer de mama es el cáncer femenino más
común en el RU, los EE.UU. y Dinamarca. También es la forma de
cáncer más común que afecta a las mujeres en el mundo
industrializado. La incidencia del cáncer de mama ha ido en aumento
de manera gradual, y en los EE.UU. es la segunda causa de muerte más
común debida al cáncer. En efecto, en 1997, se estimó que se
notificaron 181.000 nuevos casos en los EE.UU., y se ha estimado que
40.000 personas mueren de cáncer de mama cada año. A pesar de los
esfuerzos globales que se han realizado para combatir este estado,
ha habido muy pocos cambios en la incidencia de cáncer de mama,
aunque la detección temprana y las nuevas terapias han mejorado
ligeramente la supervivencia durante las últimas décadas.
Aunque se desconoce en gran parte el mecanismo
de oncogénesis para la mayoría de carcinomas de mama, existen
varios factores que pueden predisponer a algunas mujeres a
desarrollar cáncer de mama. Estos incluyen la historia de
nacimiento, el estado menstrual, el grado del tumor, el estado de
ER, el tamaño del tumor y la afectación de los ganglios linfáticos
en el momento del diagnóstico y la cirugía. Además, el pronóstico
puede determinarse en diversos grados mediante el uso de mamografía
u otros métodos de obtención de imágenes con rayos x. Sin embargo,
una mamografía tiene riesgos y el tumor de mama puede inducirse por
las propiedades ionizantes de la radiación usada durante la prueba.
Además, tales procedimientos son costosos y los resultados pueden
interpretarse de diferente manera por diferentes técnicos. Por
ejemplo, un estudio mostró considerables desacuerdos clínicos en
aproximadamente un tercio de un conjunto de mamografías que
interpretó un grupo de radiólogos. Además, muchas mujeres
encuentran que someterse a una mamografía es una experiencia
dolorosa.
En la práctica clínica, es importante el
pronóstico de la enfermedad porque determina el tratamiento que se
proporcionará. El pronóstico preciso podría permitir que el
oncólogo, por ejemplo, favorezca la administración de una terapia
hormonal o quimioterapia y recomendar cirugía sólo en los casos más
agresivos de cáncer.
Sin embargo, el diagnóstico temprano se ha
convertido en una característica regular en el cáncer de mama porque
en la actualidad se presentan cada vez más pacientes con la
enfermedad en un estadio muy temprano. Esto ha dificultado más los
métodos convencionales de evaluación de los desenlaces del cáncer, y
cada vez se hace más evidente que no sólo es el tipo de cáncer sino
también el momento adecuado del tratamiento lo que resulta clave en
lo bien o mal que responda una paciente. Por ejemplo, actualmente
muchas pacientes pueden recibir tratamiento innecesario que
frecuentemente provoca efectos secundarios tóxicos, mientras que
otras pacientes pueden someterse a estrategias de tratamiento
conservador cuando, en efecto, un cáncer está más avanzado de lo
previsto. Por tanto, puede ser de vital importancia que se elabore
un pronóstico correcto y preciso en un estadio temprano.
Hasta la fecha, no se ha identificado ningún
conjunto de factores pronóstico satisfactorios para el pronóstico
basándose sólo en la información clínica. Como resultado, la
investigación se ha dirigido a estudiar firmas moleculares que
pueden diagnosticar y pronosticar cáncer. El documento WO 02/103320
da a conocer miles de marcadores genéticos cuya expresión se
correlaciona con el pronóstico clínico, y que pueden usarse para
diferenciar a las pacientes que tienen buenos pronósticos de las
que tienen malos pronósticos. El método para determinar la
expresión implica comparar el patrón de expresión de una muestra de
prueba de tejido tomada de una paciente con el de una muestra de
tejido tomada de una paciente con un buen pronóstico y también con
el de una muestra tomada de una paciente con un mal pronóstico
conocido, y determinar cuál de estas muestras se corresponde más
estrechamente con la muestra de prueba. El documento WO 03/083141 se
refiere a la correlación de la firma molecular de una o más células
de una muestra citológica con el fenotipo de una o más células de
una muestra histológica. Tales métodos de correlación se logran
comparando la firma molecular de las células de una muestra
citológica con la firma molecular de las células que corresponden a
un fenotipo particular. La equivalencia entre las dos firmas indica
que la(s) célula(s) de la muestra tiene(n) el
fenotipo de la muestra. En particular, el documento WO 03/083141
permite comparaciones de firmas moleculares de muestras citológicas
con firmas histológicas de "referencia" de diferentes subtipos
de estados benignos, así como diversos subtipos de estados malignos
de cáncer de mama. Además, el documento WO 03/083141 permite
comparaciones de firmas moleculares de muestras citológicas con
firmas histológicas de pronóstico de la enfermedad o fenotipos de
desenlace a nivel de la célula, el tejido, el sistema y/o el
organismo tal como se observa en sujetos con células que tienen la
firma en una muestra histológica. Esto incluye tasas de mortalidad,
esperanza de vida en diversos estados, sensibilidad o resistencia a
un agente terapéutico o tratamiento particulares.
Aunque esta metodología representa una mejora
con respecto a los métodos clínicos tradicionales de pronóstico,
tiene varias desventajas. Por ejemplo, el análisis de cientos de
marcadores génicos lleva un tiempo considerable y no es
intrínsecamente práctico. Además, no está claro si una muestra que
expresa algunos de los marcadores de buen pronóstico y algunos de
los marcadores de mal pronóstico proporcionaría un pronóstico de una
u otra opción. Por consiguiente, debido a la complejidad de la
metodología, ésta también puede ser imprecisa, en el sentido que se
coloca a las pacientes en el grupo de pronóstico equivocado porque
expresan más de los genes en un grupo que del otro, o no puede
proporcionar una respuesta definitiva. Tal como se explicó
anteriormente, el pronóstico temprano, y preciso, es vital para el
tratamiento apropiado y eficaz. Por tanto, esta claro que se
requiere una firma molecular más simple y más definitiva.
Por tanto, se ha desarrollado un método para
determinar el pronóstico de un cáncer de mama dado que es
relativamente sencillo de realizar, eficaz a la hora de llevarlo a
cabo y proporciona una indicación precisa del desenlace probable de
la enfermedad. El método usa una muestra pequeña pero altamente
representativa de marcadores que, por tanto, son particularmente
precisos en determinar el desenlace probable de un cáncer dado.
Además, el método puede dividirse en tres componentes: un primer
componente que predice la supervivencia probable de un individuo
que presenta cáncer de mama; un segundo componente que predice la
recidiva probable de cáncer en un individuo que presenta cáncer de
mama; y un tercer componente que predice el carácter metastásico del
cáncer. Tal como resultará evidente para los expertos en la
técnica, el segundo componente indica, por tanto, la probabilidad
de supervivencia libre de incidencia de una paciente que presenta
cáncer de mama y el tercer componente indica la naturaleza agresiva
de la enfermedad. En resumen, se ha identificado una pluralidad de
firmas moleculares que tienen relevancia en la determinación del
pronóstico de un cáncer de mama dado. Cada firma molecular
comprende una pluralidad de marcadores genéticos cuya expresión, o
bien alta o bien baja con respecto al tejido de una paciente con
pronóstico moderado (véase más adelante en el presente documento),
es indicativa de un desenlace dado. Además de esto, se ha analizado
cada firma molecular con el fin de identificar qué marcadores
genéticos son los mejores indicadores del desenlace de una
enfermedad dada, en otras palabras, los que contribuyen más a la
capacidad de predicción de la firma molecular. Este subconjunto de
marcadores se conoce colectivamente como la firma molecular
mejorada.
Por ejemplo, se proporciona una primera firma
molecular, que comprende dos conjuntos de marcadores moleculares
cuya alta expresión se correlaciona con la baja tasa de
supervivencia; el primer conjunto comprende aquellos marcadores
moleculares que son los indicadores estadísticamente más
significativos de la baja tasa de supervivencia, éstos se denominan
en el presente documento, colectivamente, la primera firma molecular
primaria [Conjunto (A)]:
- AMF, ATF4, Cyr61, ER, matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, nectina4, PAR1A, psoriason, Pttg1, Rho-C, Scotin, SDF-1, SEMP1, SPF45, SST1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R, ZO-3; y
el segundo conjunto comprende los anteriores más
al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, denominados
en el presente documento, colectivamente, la primera firma molecular
secundaria [Conjunto (B)]:
- Basigina, beta-catenina, BMP1, BMP10, calpaína grande, CD44, CX43, ciclinaD2, EHMS, FAK, FAP, GIRK, HAVR1, Isotopo3, JAK1, LOX12, NET-2, PAR1A2, PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VECAD, Vilip, Wave2.
Hacer referencia en el presente documento a los
marcadores anteriores y siguientes, es hacer referencia a una
proteína conocida cuya identidad completa está disponible en la base
de datos de www.NCBI.LM.NIH.gov, o que conocen bien los expertos en
la técnica.
La referencia en el presente documento a la
expresión alta o baja es con respecto al nivel de expresión del
mismo marcador en las pacientes que se ha considerado que tienen un
pronóstico moderado, es decir, pacientes con un índice pronóstico
convencional, el índice pronóstico de Nottingham (NPI) = 3,4 - 5,4,
en el que el NPI = 0,2 x tamaño de tumor + grado del tumor +
situación ganglionar en el que
NPI (bajo) es < 3,4 y el 86% de las pacientes
sobreviven 15 años
NPI (moderado) es 3,4 -5,4 y el 42% de las
pacientes sobreviven 15 años
NPI (alto) es > 5,4 y el 13% de las pacientes
sobreviven 15 años.
Además, se proporciona una segunda firma
molecular, que comprende dos conjuntos de marcadores moleculares
cuya baja expresión se correlaciona con la baja tasa de
supervivencia; el primer conjunto comprende aquellos marcadores
moleculares que son los indicadores estadísticamente más
significativos de baja tasa de supervivencia, éstos se denominan en
el presente documento, colectivamente, la segunda firma molecular
primaria [Conjunto (C)]:
- ARP2, Atf-3, HuR, MEN1, paracelina, PTP-RK radixina, razón RHO8/gdiG, y
el segundo conjunto comprende los anteriores más
al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, denominados
en el presente documento, colectivamente, la segunda firma molecular
secundaria [Conjunto (D)]:
- aMOT, Atf-1, claudina-1, IL22R, Rock2 Veg1.
Todavía se proporciona adicionalmente una
tercera firma molecular, que comprende dos conjuntos de marcadores
moleculares cuya alta expresión se correlaciona con una baja
incidencia de supervivencia libre de cáncer; el primer conjunto
comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores
estadísticamente más significativos de una baja incidencia de
supervivencia libre de cáncer, éstos se denominan en el presente
documento, colectivamente, la tercera firma molecular primaria
[Conjunto (E)]:
- AAMP, AMFR, Bmp8, BMP9, beta-catenina, CAR, Creb12, DRIM, EHMS, endomuscina2, FAK, FAP, Isotopo1, Kiss1/ck19, Notch1, PAR1A, Par1A2. PLC-delta, psoriasina, PTTG1, RhoC, Rock1, SDF1, SST1, ST15, TEM6, TEM7R; y
el segundo conjunto comprende los anteriores más
al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, denominados
en el presente documento, colectivamente, la tercera firma molecular
secundaria [Conjunto (F)]:
- Angiotensina2R1, ATF4, Bmp10, CASM, catepsinaS, CX43, elastasa-PMN, GIRK, HAVR1, HIN, Isotopo3, Kiss-1, LOX12, NOS3, PMSA, S100A4, SEMP1, TACC2, ubiquitina, WISP2.
Además, se proporciona una cuarta firma
molecular, que comprende dos conjuntos de marcadores moleculares
cuya baja expresión se correlaciona con una baja incidencia de
supervivencia libre de cáncer; el primer conjunto comprende
aquellos marcadores moleculares que son los indicadores
estadísticamente más significativos de una baja incidencia de
supervivencia libre de cáncer, estos se denominan en el presente
documento, colectivamente, la cuarta firma molecular primaria
[Conjunto (G)]:
- Bmp3, IL22R, IL24, JAK1, PTP-RK, Rho8/GdiG, Snail, WASP; y
el segundo conjunto comprende los anteriores más
al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, denominados
en el presente documento, colectivamente, la cuarta firma molecular
secundaria [Conjunto (H)]:
- ATF3, Bmp4, BMPR1A, MEN1, paracelina.
Todavía se proporciona adicionalmente una quinta
firma molecular que comprende dos conjuntos de marcadores
moleculares cuya alta expresión se correlaciona con cáncer
metastásico; el primer conjunto comprende aquellos marcadores
moleculares que son los indicadores estadísticamente más
significativos de un cáncer metastásico, éstos se denominan en el
presente documento, colectivamente, la quinta firma molecular
primaria [Conjunto (I)]:
- BAF57, BNDF, CAR1, CASM, catepsina-L, Creb 1/2, CXCR10, DRIM, HERG, IL7R, IL-11, Kiss1, MKK1, PMN-elastasa, PTTP1, SDF5, TACC2, ubiquitina, VIPR1, VUDP; y
el segundo conjunto comprende los anteriores más
al menos uno de los siguientes marcadores moleculares denominados
en el presente documento, colectivamente, la quinta firma molecular
secundaria [Conjunto (J)]:
- angiomotina, BMP7, ciclinaD1, ADN ligasa-1, IGFBP7, LYVE1, NET2, RHO8, SRBC, Stath4, TGAsa-3, vinculina, WAVE2.
Finalmente, se proporciona una sexta firma
molecular que comprende dos conjuntos de marcadores moleculares
cuya baja expresión se correlaciona con cáncer metastásico; el
primer conjunto comprende aquellos marcadores moleculares que son
los indicadores estadísticamente más significativos de un cáncer
metastásico, éstos se denominan en el presente documento,
colectivamente, la sexta firma molecular primaria [Conjunto
(K)]:
- paracelina; y
el segundo conjunto comprende el anterior más al
menos uno de los siguientes marcadores moleculares denominados en
el presente documento, colectivamente, la sexta firma molecular
secundaria [Conjunto (L)]:
- ALCAM, eplin, ER-beta, glypic3, JAK1, MAGI-1, PEDF, PKC-eta, stathlin, WWOX.
Por tanto, se han determinado al menos seis
firmas moleculares que comprenden doce conjuntos de marcadores
moleculares (seis primarios y seis secundarios), que tienen uso en
el pronóstico de cáncer de mama. El esclarecimiento de estas firmas
ha llevado más de una década de trabajo, tiempo durante el que se
han examinado sistemática y cuidadosamente cientos de muestras de
tejido canceroso de mama y muchos cientos más de marcadores
genéticos moleculares. Sin embargo, habiendo completado esta ardua
tarea, sorprendentemente, se ha encontrado que, de hecho, es
necesario examinar muy pocos genes con el fin de proporcionar un
pronóstico preciso para una muestra dada de tejido canceroso de
mama. Aún más sorprendentemente, ha podido reducirse adicionalmente
este número identificando aquellos marcadores moleculares que
contribuyen más al desenlace predictivo de estas firmas
moleculares, así por ejemplo, en el caso de la firma molecular
relacionada con cáncer metastásico, sólo es necesario examinar
20/21 genes. Esto significa que esta metodología tiene aplicación
inmediata y puede realizarse rápidamente y de manera rutinaria en
un contexto clínico. De hecho, se sugiere que esta metodología forma
parte de un régimen de tratamiento convencional de una paciente con
cáncer de mama de modo que el oncólogo pertinente, en un estadio
temprano, pueda determinar el desenlace de una enfermedad particular
y así ajustar el tratamiento en consecuencia. Por tanto, por
ejemplo, en el caso de un individuo que presenta una firma
indicativa de baja supervivencia o metástasis ganglionar (es decir,
es probable que el cáncer se propague) podría recomendarse una
forma de terapia inmediata y agresiva. De manera similar, cuando un
individuo presenta una firma indicativa de baja supervivencia libre
de enfermedad, y por tanto, es más probable que tenga una recidiva
de la enfermedad, podrían requerirse visitas y pruebas de
seguimiento más frecuentes. Por el contrario, si un individuo tiene
una firma indicativa de no metástasis, el oncólogo puede recomendar
un tratamiento menos invasivo y agresivo, ahorrando así a la
paciente cualquier malestar innecesario y efectos secundarios no
deseados. Por tanto, este método no sólo sirve para garantizar que
los individuos reciban tratamiento personalizado según sus
características genéticas, sino que puede mejorar la calidad de vida
de una paciente durante el tratamiento, garantizando que sólo se
recomienda una terapia agresiva en aquellos casos en los que
es
necesario.
necesario.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención
se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los marcadores moleculares en el conjunto (A), y;
- (b)
- cuando se determina el alto nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, dicha metodología, en la parte (a) de la misma,
comprende además determinar el nivel de expresión de los genes que
codifican para al menos un marcador molecular en el conjunto (B),
con el fin de determinar si estos genes tienen un alto nivel de
expresión; y/o el nivel de expresión de los genes que codifican
para los marcadores moleculares en el conjunto (C), con el fin de
determinar si estos genes se subexpresan; y/o determinar el nivel de
expresión de los genes que codifican para al menos un marcador
molecular en el conjunto (D), con el fin de determinar si estos
genes se subexpresan y, si se identifican los anteriores patrones
de expresión, concluir que el individuo tiene una baja probabilidad
de supervivencia.
En aún un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los marcadores moleculares en el conjunto (C), y;
- (b)
- cuando se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, dicha metodología, en la parte (a) de la misma,
adicional o alternativamente, comprende determinar el nivel de
expresión de los genes que codifican para al menos un marcador
molecular en el conjunto (D) con el fin de determinar si estos genes
se subexpresan y, si es así, concluir que el individuo tiene una
baja probabilidad de supervivencia.
En aún una realización preferida adicional de
este aspecto de la invención, dicha metodología, en la parte (a) de
la misma, comprende además determinar el nivel de expresión de los
genes en el conjunto (A) y/o al menos un gen en el conjunto (B) con
el fin de determinar si estos genes se sobreexpresan y, si es así,
concluir que el individuo tiene una baja probabilidad de
supervivencia.
En aún un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los marcadores moleculares en el conjunto (E), y;
- (b)
- cuando se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una alta probabilidad de recidiva de cáncer.
Hacer referencia en el presente documento a la
recidiva de cáncer incluye hacer referencia a la recidiva de cáncer
de manera local, en la mama, o en un sitio remoto o hacer referencia
a la metástasis.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, la metodología comprende además, en la parte (a) de la
misma, determinar el nivel de expresión de los genes que codifican
para al menos un marcador molecular en el conjunto (F), con el fin
de determinar si estos genes tienen un alto nivel de expresión; y/o
determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para
los marcadores moleculares en el conjunto (G), con el fin de
determinar si estos genes se subexpresan; y/o determinar el nivel de
expresión de los genes que codifican para al menos un marcador
molecular en el conjunto (H), con el fin de determinar si estos
genes se subexpresan, y si se identifican los patrones de expresión
anteriores, concluir que el individuo tiene una alta probabilidad
de recidiva de cáncer.
En aún un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los marcadores moleculares en el conjunto (G), y;
- (b)
- cuando se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que los individuos de los que se ha tomado la muestra de tejido tienen una alta probabilidad de recidiva de cáncer.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, dicha metodología, en la parte (a) de la misma,
adicional o alternativamente, comprende determinar el nivel de
expresión de los genes que codifican para al menos un marcador
molecular en el conjunto (H), con el fin de determinar si estos
genes se subexpresan y, si es así, concluir que el individuo tiene
una alta probabilidad de recidiva de cáncer.
En aún una realización preferida adicional de
este aspecto de la invención, dicha metodología, en la parte (A) de
la misma, comprende además determinar el nivel de expresión de los
genes en el conjunto (E) y/o al menos un gen en el conjunto (F) con
el fin de determinar si estos genes se sobreexpresan y, si es así,
concluir que el individuo tiene una alta probabilidad de recidiva
de cáncer.
En aún un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los marcadores moleculares en el conjunto (I), y;
- (b)
- cuando se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una forma de cáncer metastásico.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, la metodología además comprende, en la parte (a) de la
misma, determinar el nivel de expresión de los genes que codifican
para al menos un marcador molecular en el conjunto (J), con el fin
de determinar si estos genes tienen un alto nivel de expresión; y/o
determinar el nivel de expresión del gen que codifica para el
marcador molecular en el conjunto (K), con el fin de determinar si
este gen se subexpresa; y/o determinar el nivel de expresión de los
genes que codifican para al menos un marcador molecular en el
conjunto (L), con el fin de determinar si estos genes se subexpresan
y, si se identifican los patrones de expresión anteriores, concluir
que el individuo tiene una forma de cáncer metastásico.
En aún un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de
mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para el marcador molecular en el conjunto (K), y;
- (b)
- cuando se determina un bajo nivel de expresión para este marcador;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una forma de cáncer metastásico.
En aún una realización preferida adicional de la
invención, dicha metodología, en la parte (a) de la misma,
adicional o alternativamente, comprende determinar el nivel de
expresión de los genes que codifican para al menos un marcador
molecular en el conjunto (L) con el fin de determinar si estos genes
se subexpresan y, si es así, concluir que el individuo tiene una
forma de cáncer metastásico.
En aún una realización preferida adicional de
este aspecto de la invención, dicha metodología, en la parte (a) de
la misma, comprende además determinar el nivel de expresión de los
genes en el conjunto (I) y/o al menos un marcador molecular en el
conjunto (J) con el fin de determinar si estos genes se
sobreexpresan y, si es así, concluir que el individuo tiene una
forma de cáncer metastático.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona cualquier combinación seleccionada de todo el método
mencionado anteriormente.
En cada uno de los anteriores métodos de la
invención, el ensayo, idealmente, se lleva a cabo para tejido
canceroso de mama humano y, aún más preferiblemente, tejido
canceroso de mama humano femenino.
En cada uno de los métodos anteriores de la
invención, idealmente, la muestra del tejido que se examina, se
somete a ensayo para determinar la presencia de ARN, preferiblemente
de ARN total y, aún más preferiblemente, la cantidad de ARNm.
Resultará evidente para los expertos en la técnica que se conocen
bien las técnicas disponibles para medir el contenido de ARN, en
efecto, las que ponen en práctica de manera rutinaria los que
trabajan en el campo del diagnóstico clínico.
En una realización alternativa de la invención,
el método implica someter a ensayo la proteína codificada por cada
uno de los marcadores moleculares y así, normalmente, pero no
exclusivamente, implica el uso de agentes que se unen a las
proteínas pertinentes y así identificar las mismas. Agentes comunes
son los anticuerpos y, lo más idealmente, anticuerpos monoclonales
que, ventajosamente, se han marcado con un marcador adecuado
mediante lo cual puede determinarse la existencia del anticuerpo
unido. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de
ensayo para identificar proteínas y, en efecto, los trabajadores en
el campo del diagnóstico clínico las usan a
diario.
diario.
Además, la metodología de la invención puede
implicar la amplificación de un marcador seleccionado antes de la
identificación del mismo y en este caso, normalmente, la
amplificación se llevará a cabo usando una reacción de PCR en la
que se usan sondas de oligonucleótidos específicas para el marcador
molecular de interés con el fin de amplificar el mismo antes de
determinar la presencia y, teniendo en cuenta el grado de
amplificación, la cantidad del mismo.
En métodos preferidos adicionales de puesta en
práctica de la invención, se determina el nivel de expresión de un
marcador molecular dado teniendo en cuenta una muestra control, en
el que la muestra control es una muestra de tejido de mama que está
libre de cáncer o de una paciente con un pronóstico moderado tal
como se define en el presente documento. Todavía más idealmente,
esta muestra de tejido de mama se toma de un individuo que no
presenta la enfermedad. Todavía alternativamente, el control es un
patrón reconocido para la expresión de cada gen pertinente en un
individuo sano.
El nivel de expresión génica puede medirse
mediante PCR cuantitativa en tiempo real, usando un método dado a
conocer en Jiang et al. 2003a, o Parr y Jiang 2004.
La probabilidad de supervivencia significa la
probabilidad de que la paciente estará viva durante los próximos 10
años. La probabilidad de recidiva significa la probabilidad que el
cáncer volverá a presentarse en el plazo de 10 años. Una forma de
cáncer metastásico significa que el cáncer se habrá propagado desde
el órgano o tejido de origen hasta otra parte del cuerpo.
Según aún un aspecto adicional de la invención,
se proporciona un kit para realizar uno cualquiera o más de los
métodos mencionados anteriormente, comprendiendo dicho kit:
- (a)
- una pluralidad de sondas para detectar al menos un conjunto de los marcadores moleculares especificados en los métodos mencionados anteriormente; y
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones pertinentes para el uso de dichas sondas.
En aún un aspecto preferido adicional de la
invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico de
cáncer de mama en mamíferos que comprende:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (A), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
En aún una realización adicional de la
invención, dicho kit comprende además:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (C) y/o al menos un transcrito para al menos uno de los genes en el conjunto (B) o (D), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
En aún un aspecto preferido adicional de la
invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico de
cáncer de mama en mamíferos que comprende:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (E), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
En aún un aspecto preferido de la invención,
dicho kit comprende además:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (G) y/o al menos un transcrito para al menos uno de los genes en el conjunto (F) o (H), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
En aún un aspecto preferido adicional de la
invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico de
cáncer de mama en mamíferos que comprende:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (I), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
En aún un aspecto preferido adicional de la
invención, dicho kit comprende además:
- (a)
- una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcrito de cada uno de los genes en el conjunto (K), y/o al menos un transcrito para al menos uno de los genes en el conjunto (J) o (L), y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de dichos genes.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un kit que comprende cualquier combinación seleccionada
de los conjuntos de sondas mencionados anteriormente para
identificar los conjuntos de marcadores moleculares mencionados
anteriormente.
Según aún un aspecto adicional de la invención,
se proporciona una micromatriz que comprende uno cualquiera o más
de los conjuntos de sondas mencionados anteriormente para
identificar el nivel de expresión de uno cualquiera o más de los
conjuntos de marcadores moleculares mencionados anteriormente.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un kit para determinar la probabilidad de supervivencia y/o
recidiva de cáncer de mama y/o la naturaleza metastásica de un
cáncer en una paciente, comprendiendo el kit:
- (a)
- al menos una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas para identificar al menos un conjunto de marcadores moleculares descritos en los métodos anteriores; y, opcionalmente,
- (b)
- una segunda micromatriz que comprende una pluralidad de sondas para identificar el mismo conjunto de marcadores moleculares en un patrón interno que representa el nivel normal de expresión de dichos marcadores.
La invención también proporciona una micromatriz
o conjunto de sondas tal como se describió anteriormente.
La presente invención se describirá ahora
mediante los siguientes ejemplos haciendo referencia a las tablas
1-3 y a las figuras 1-4 en las
que:
La figura 1 muestra una curva de supervivencia
de Kaplan-Meier para todos los marcadores en la
tabla 1.
La figura 2 muestra una curva de supervivencia
de Kaplan-Meier para los marcadores indicados con un
* en la tabla 1.
La figura 3 muestra una curva de supervivencia
de Kaplan-Meier para todos los marcadores en la
tabla 2.
La figura 4 muestra una curva de supervivencia
de Kaplan-Meier para los marcadores indicados con un
* en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron tejidos tumorales de mama y
tejidos normales asociados inmediatamente después de la cirugía y
se congelaron hasta su uso. Esto se realizó con la aprobación de un
comité ético local y tuvo lugar principalmente entre
1991-1994, con un número limitado recogido entre
1995-1996. El presente análisis se basa en una
mediana de seguimiento de 10 años a junio de 2004. El presente
estudio usó tejidos cancerosos de mama (n = 120) y tejidos de
referencia normales (n = 32). Se adquirieron líneas celulares de
cáncer de mama humano MCF-7 y MDA MB 231, línea
celular de fibroblastos humanos MRC-5 de la
Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, Salisbury,
Inglaterra). Se adquirieron células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC) de TCS Biologicals (Oxford, Inglaterra). Se obtuvo
información sobre la patología, información clínica durante y tras
la cirugía, desenlaces clínicos de la paciente, poco después de la
cirugía o en el momento del seguimiento.
Los tejidos mamarios se congelaron en cortes.
Los cortes se dividieron en las tres partes siguientes: una parte
para la histología de rutina, una parte para la inmunohistoquímica y
la otra parte fue para la preparación del ARN.
Se obtuvieron cortes congelados de los tejidos a
un espesor de 5-10 \mum y se conservaron para la
inmunohistoquímica y la histología de rutina (Jiang et al.
2003a). Se homogeneizaron 15-20 cortes adicionales
usando un homogeneizador portátil, en disolución de extracción de
ARN helada. Se determinó la concentración de ARN usando un
espectrofotómetro UV. Se llevó a cabo la transcripción inversa
usando un kit de RT con un cebador de oligo-dt
anclado suministrado por AbGene^{TM}, usando 1 \mug de ARN
total en placas de 96 pocillos. Se verificó la calidad del ADNc
usando cebadores de \beta-actina. El kit de
extracción de ARN y el kit de RT se obtuvieron de AbGene Ltd,
Surrey, Inglaterra, RU. Se diseñaron los cebadores de PCR usando
Beacon Designer (California, EE.UU.) y se sintetizaron por
Invitrogen^{TM} Ltd (Paisley, Escocia, RU). La agarosa de calidad
para biología molecular y el marcador de tamaño molecular de ADN
fueron de Invitrogen. La mezcla madre para la PCR de rutina y la
PCR cuantitativa fue de AbGene.
El nivel de transcriptos de los miembros de la
familia CCN de los ADNc preparados anteriormente se determinó
usando PCR cuantitativa en tiempo real, basada en la tecnología
Amplifluor^{TM} (Nazarenko et al. 1997), modificada a
partir de un método notificado previamente (Jiang et al.
2003a y 2003b). En resumen, se diseñaron un par de cebadores de PCR
usando el software Beacon Designer (versión 2, California, EE.UU.).
Para uno de los cebadores (de manera rutinaria para el cebador
antisentido en el laboratorio), se añadió una secuencia adicional,
conocida como la secuencia Z (5'actgaacctgaccgtaca'3) que es
complementaria a la sonda universal Z (Nazarenko et al.
1997) (Intergen Inc., Inglaterra, RU). Se adquirió un kit de
detección Taqman^{TM} para \beta-actina de
Perkin-Elmer^{TM}.
La reacción se llevó a cabo usando lo siguiente:
mezcla madre Hot-start Q (Abgene), 10 \rhomol de
cebador directo específico, 1 \rhomol de cebador inverso que
tiene la secuencia Z, 10 \rhomol del sonda marcada con FAM
(Intergen Inc.), y ADNc a partir aproximadamente de 50 ng de ARN
(calculado a partir del ARN de partida en la reacción de RT). La
reacción se llevó a cabo usando IcyclerQ^{TM}
(Bio-Rad^{TM}) que está equipado con una unidad
óptica que permite la detección en tiempo real de 96 reacciones,
usando la siguiente condición: 94ºC durante 12 minutos, 50 ciclos
de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 40 segundos y 72ºC durante
20 segundos (Jiang et al. 2003b, 2003c, Parr y Jiang 2004).
Los niveles de los transcritos se generaron a partir de un patrón
interno (Jiang et al. 2003a) que se amplificó de manera
simultánea con las mezclas. Los resultados se muestran en este caso
de dos maneras: niveles de transcritos basados en cantidades iguales
de ARN, o como una razón diana/CK19.
Se obtuvieron cortes congelados de tumor de mama
y el tejido de referencia a un espesor de 6 \mum usando un
criostato (Jiang et al 2003c). Se montaron los cortes sobre
portaobjetos para microscopio Super frost plus, se secaron al aire
y luego se fijaron en una mezcla de acetona al 50% y metanol al 50%.
Entonces, se colocaron los cortes en tampón de lavado
"Optimax" durante 5-10 minutos hasta su
rehidratación. Se incubaron los cortes durante 20 minutos en una
disolución de bloqueo de BSA al 0,6% y se sondaron con un anticuerpo
primario. Tras lavados exhaustivos, los cortes se incubaron durante
30 minutos en un anticuerpo biotinilado secundario (inmunoglobulina
porcina anti-cabra/ratón/conejo Multilink, Dako
Inc.). Tras los lavados, se aplicó entonces el complejo
avidina-biotina (Vector Labs) a los cortes, seguido
de lavados exhaustivos. Entonces, se añadió el cromógeno
diaminobencidina a los cortes que se incubaron en la oscuridad
durante 5 minutos. Entonces, se tiñeron los cortes para el recuento
en hematoxilina de Gill y se deshidrataron en grados ascendentes de
metanol antes de aclarar en xileno y montar bajo un cubreobjetos. Se
cuantificó la tinción citoplasmática de las respectivas proteínas
usando el software Optimas 6.0 tal como se describió previamente
(Davies et al. 2000, King et al. 2004) y se muestran
en este caso como densidad de tinción relativa.
El análisis estadístico se llevó a cabo usando
la prueba de la U de Mann-Whitney y la prueba de
Kruskal-Wallis. El análisis de supervivencia se
llevó a cabo usando la curva de supervivencia de
Kaplan-Meier y el análisis de una variable
(SPSS11).
Se han cuantificado 453 moléculas frente a la
información clínica completa que incluye un seguimiento de 10 años.
Tras el análisis de las tasas de supervivencia e incidencia de
recidiva de la enfermedad, se han desarrollado tres firmas, la
firma molecular de supervivencia y la firma molecular de predicción
de incidencia y la firma molecular metastásica.
Tal como se muestra en la tabla 1, se
encontraron 51 moléculas que tienen una correlación positiva con la
baja supervivencia y 14 inversamente correlacionados con la baja
supervivencia. La figura 1 muestra que se prevé que el 92,2% de los
individuos que tienen lo que se denomina en el presente documento
una "buena firma" (es decir, que no tienen un alto nivel de
expresión de las moléculas en la columna de la izquierda de la tabla
1, y que no tienen subexpresión de las moléculas en la columna de
la derecha de la tabla 1), sobrevivirá durante hasta 148,9 meses,
mientras que se prevé que sólo el 8,3% de los individuos que tienen
lo que se denomina en el presente documento una "mala firma"
(es decir, que tienen una alta expresión de las moléculas en la
columna de la izquierda de la tabla 1, y una subexpresión de las
moléculas en la columna de la derecha en la tabla 1) sobrevivirán
durante hasta 40 meses. Este resultado es estadísticamente
significativo, con un valor de p < 0,00001.
Usando la curva de supervivencia de
Kaplan-Meier y el análisis de una variable, se
mejoró la firma molecular identificando aquellas moléculas que
contribuyen más a la precisión estadística (identificadas con * en
la tabla 1). Se encontró que 33 marcadores moleculares primarios, 25
de los cuales tienen una correlación positiva con baja
supervivencia y 8 de los cuales tienen una correlación negativa con
baja supervivencia, representan la mayoría de la significación
estadística. La figura 2 muestra la curva de supervivencia prevista
usando la primera y la segunda firmas moleculares primarias,
teniendo el 93,2% de los individuos una buena firma que prevé que
sobrevivirán durante hasta 149,69 meses, y teniendo sólo el 14,4% de
los individuos una mala firma que prevé que sobrevivirán durante
hasta 52,3 meses (p < 0,000001).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 2, se
encontraron 48 moléculas que tienen una correlación positiva con la
aparición de incidencia (recidiva y metástasis) y 13 inversamente
correlacionados con la aparición de incidencia. La figura 3 muestra
que se prevé que el 94,5% de los individuos que tienen una buena
firma (es decir, que no tienen una alta expresión de las moléculas
en la columna de la izquierda de la tabla 2, y que no tienen
subexpresión de las moléculas en la columna de la derecha de la
tabla 2) no tendrán recidiva de la enfermedad (es decir,
supervivencia libre de enfermedad) durante hasta 150,4 meses,
mientras que se prevé que sólo el 34,5% de los individuos que
tienen una mala firma (es decir, que tienen una alta expresión de
las moléculas en la columna de la izquierda de la tabla 2, y una
subexpresión de las moléculas en la columna de la derecha de la
tabla 2) vivirán libres de enfermedad durante hasta 72,4 meses (p
< 0,00001).
Como con la firma de supervivencia anterior,
también se mejora esta firma, y se encontró que 36 marcadores
moleculares primarios (indicados con * en la tabla 2), 28 de los
cuales tienen una correlación positiva con recidiva, y 8 de los
cuales tienen una correlación negativa con recidiva, representan la
mayoría de la significación estadística. La figura 4 muestra la
curva de supervivencia prevista usando la tercera y la cuarta firmas
moleculares primarias, teniendo el 91,7% de los individuos una
buena firma que prevé que no tendrán recidiva de la enfermedad
durante hasta 148,4 meses, y teniendo sólo el 5,88% de los
individuos una mala firma que prevé que sobrevivirán, sin ninguna
recidiva de la enfermedad, durante hasta 44,2 meses (p <
0,000001).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 3, se
encontraron 37 moléculas que tienen una correlación positiva con
metástasis ganglionar y 10 inversamente correlacionados con la
metástasis ganglionar. La combinación de estas 37 moléculas ha
mostrado que el 91% de los tumores con una mala firma (es decir, que
tienen una alta expresión de las moléculas en la columna de la
izquierda de la tabla 3, y una subexpresión de las moléculas en la
columna de la derecha de la tabla 3) desarrollaron metástasis
ganglionar. Además, el 88,9% de los tumores con buena firma (es
decir, que no tienen una alta expresión de las moléculas en la
columna de la izquierda de la tabla 3, y que no tienen subexpresión
de las moléculas en la columna de la derecha de la tabla 3) no
tienen metástasis ganglionar (p = 0,00024).
Como antes, se ha modificado esta firma
mejorando la combinación, y se ha encontrado que también se
pronosticó bien una combinación de 21 genes primarios, 20 de los
cuales se correlaciona positivamente con la metástasis ganglionar y
1 de los cuales se correlaciona negativamente con la metástasis
ganglionar (indicados con * en la tabla 3). El 89,1% de los tumores
con una mala firma tuvieron metástasis ganglionar y el 86,8% de los
tumores con una buena firma no tuvieron metástasis ganglionar (p =
0,0000205).
\vskip1.000000\baselineskip
- Davies et al. 2000: Davies G, Jiang W G, Mason M D. Cell-cell adhesion and signalling intermediates in human prostate cancer. Journal of Urology, 2000, 163, 985-992
- Jiang et al. 2003a: Jiang W G, Watkins G, Lane J, Douglas-Jones A, Cunnick G H, Mokbel M, Mansel R E. Prognostic value of Rho family and rho-GDIs in breast cancer. Clinical Cancer Research, 2003, 9 (17), 6432-6440
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- Jiang et al. 2003c: Jiang W G, Grimshaw D, Lane J, Martin T A, Parr C, Davies G, Laterra J, and Mansel R E. Retroviral hammerhead transgenes to cMET and HGF/SF inhibited growth of breast tumour, induced by fibroblasts. Clinical Cancer Research, 2003, 9, 4274-4281
- King et al 2004: King J A C, Ofori-Acquah A F, Stevens T, Al-Mehdi A B, Fodstad O; Jiang W G. Prognostic value of ALCAM in human breast cancer. Breast Cancer Research, 2004, R478-487
- Nazarenko et al. 1997: Nazarenko I A, Bhatnagar S K, Hohman R J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acids Res 1997; 25: 2516-21
- Parr and Jiang 2004: Parr C and Jiang W G. The Notch receptors, Notch-1 and Notch-2, in human breast cancers. International Journal of Molecular Medicine, 2004 Nov.;14(5): 779-786
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Método para determinar el pronóstico de
cáncer de mama en mamíferos, comprendiendo el método:
- (a)
- examinar una muestra de tejido canceroso de mama de un individuo con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes que codifican para los siguientes marcadores moleculares: AMF, ATF4, Cyr61, ER, matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, nectina4, PAR1A, psoriason, Pttg1, Rho-C, Scotin, SDF1, SEMP1, SPF45, STT1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R, y ZO-3; y
- (b)
- cuando se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores con respecto al nivel de expresión de los mismos marcadores en pacientes que se ha considerado que tienen un pronóstico moderado;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia que es inferior al 20% de la de los individuos que sobreviven más de cinco años.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la parte (a) comprende además determinar el nivel de expresión de
los genes que codifican para al menos uno de los siguientes
marcadores moleculares: basigina, beta-catenina,
BMP1, BMP10, calpaína grande, CD44, CX43, ciclinaD2, EHMS, FAK, FAP,
GIRK, HAVR1, Isotopo3, JAK1, LOX12, NET-2, PAR1A2,
PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VECAD, Vilip,
Wave-2.
3. Método según la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, en el que la parte (a) comprende además determinar
el nivel de expresión de los genes que codifican para los siguientes
marcadores moleculares: ARP2, Atf-3, HuR, MEN1,
paracelina, PTP-RK radixina y razón RHO8/gdiG; y
- (b)
- cuando se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores;
- (c)
- concluir que el individuo del que se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método según la reivindicación 3, en el que
la parte (a) comprende además determinar el nivel de expresión de
los genes que codifican para al menos uno de los siguientes
marcadores moleculares: aMOT, Atf-1,
claudina-1, IL22R, Rock 2, Veg1.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tejido canceroso es de un
ser humano.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tejido canceroso es de una
mujer.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se determina el nivel de
expresión sometiendo a ensayo para determinar la presencia de ARN o
ARNm.
8. Método según una cualquiera de la
reivindicaciones 1-7, en el que se determina el
nivel de expresión sometiendo a ensayo para determinar la(s)
proteína(s) codificada(s) por los marcadores
moleculares.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
el método implica el uso de agentes que se unen a la(s)
proteína(s) pertinente(s) y así la(s)
identifica(n).
10. Método según la reivindicación 9, en el que
los agentes son anticuerpos.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que se amplifica el
marcador seleccionado, antes de realizar la parte (a).
12. Método según la reivindicación 11, en el que
se amplifica el marcador mediante PCR.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se determina el nivel de
expresión de un marcador molecular dado teniendo en cuenta una
muestra control, en el que la muestra control es una cualquiera de
lo siguiente: una muestra de tejido de mama que está libre de
cáncer, una muestra de tejido de mama tomada de un individuo que no
presenta cáncer, o un patrón reconocido para la expresión de cada
marcador molecular pertinente en un individuo sano.
14. Kit para determinar el pronóstico de cáncer
de mama en mamíferos que consiste en:
- (a)
- una pluralidad de sondas limitadas a aquéllas para identificar al menos un transcrito de cada uno de los genes en el siguiente conjunto de marcadores: AMF, ATF4, Cyr61, ER, matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, nectina4, PAR1A, psoriason, Pttg1, Rho-C, Scotin, SDF1, SEMP1, SPF45, SST1, DT15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R y ZO-3; y
- (b)
- reactivos e instrucciones opcionales que determinan, o muestran cómo determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
15. Kit según la reivindicación 14, en el que
dicho kit consiste además en:
- (a)
- una pluralidad de sondas que pueden identificar al menos un transcrito de al menos uno de los genes en el siguiente conjunto de marcadores: basigina, beta-catenina, BMP1, BMP10, calpaína grande, DC44, CX43, ciclinaD2, EHMs, FAK, FAP, GIRK, HAVR1, Isotopo3, JAK1, LOX12, NET-2, PAR1A2, PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VECAD, Vilip, Wave2, y/o al menos un transcrito de cada uno de los genes en el siguiente conjunto de marcadores ARP2, Atf-3, HuR, MEN1, paracelina, PTP-RK radixina y razón RHO8/gdiG, y/o al menos un transcrito de al menos uno del siguiente conjunto de marcadores: aMOT, Atf-1, claudina-1, IL22R, rock 2, y;
- (b)
- opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.
16. Kit para determinar la probabilidad de
supervivencia y/o recurrencia de cáncer de mama y/o la naturaleza
metastásica de un cáncer en una paciente, consistiendo el kit
en:
- (a)
- al menos una micromatriz que consiste en al menos un conjunto de sondas limitadas a aquéllas para identificar los conjuntos de marcadores moleculares que consisten en las firmas moleculares descritas en las reivindicaciones 1-4; y opcionalmente,
- (b)
- una micromatriz secundaria que comprende una pluralidad de sondas para identificar el mismo conjunto de marcadores moleculares en un patrón interno que representa el nivel de expresión de dichos marcadores en o bien un individuo libre de cáncer o bien una paciente con pronóstico moderado.
17. Micromatriz según la reivindicación 16.
18. Conjunto de sondas según las
reivindicaciones 14-15.
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