KR100786759B1 - Ｈｃｃｒ-1을 포함하는 유방암 예후 마커 및 비만 유도조성물 - Google Patents

Ｈｃｃｒ-1을 포함하는 유방암 예후 마커 및 비만 유도조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HCCR-1을 포함하는 유방암 예후 마커 및 비만 유도 조성물에 관한 발명이다.
HCCR-1 예후 마커, 비만

Description

ＨＣＣＲ-1을 포함하는 유방암 예후 마커 및 비만 유도 조성물{PROGNOSTIC MARKER FOR BREAST CANCER AND COMPOSITION FOR INDUCING OBESITY COMPRISING HCCR-1}
도 1은 유방암에서 HCCR-1 발현 및 HCCR-1 및 ApoE의 관련성을 보여주는 그림. (a) 인간 유방암들의 ER, PR, HER2, p53 및 HCCR-1 발현에 대한 면역조직 화학염색. 모든 유방암 조직은 병리학적으로 증명된 침윤성 유관상피암으로부터 유래하였다. 암종 세포의 핵에 ER, PR, 및 p53 그리고 원형질에서 HCCR-1에 대한 양성 면역염색을 보인다(탑 패널). HER2 면역조직화학 염색은 암종 세포의 완전하게 강한 막 염색(3+)을 보인다(탑 패널). 유방 암종에서 ER, PR, p53, HER2 및 HCCR-1에 대한 음성 면역염색(아래 패널). 원본 확대, X 100. (b) HCCR-1과 ApoE의 단백질 상호작용. HCCR-1은 ApoE에 결합하고(왼쪽 패널) ApoE는 HCCR-1에 각각 결합한다(오른쪽 패널). HCCR-1 및 ApoE 단백질들을 생산하는 트랜스팩션된 MCF-7 세포들로부터 동시-면역침전을 수행하였다. 면역침전법은 항-V5 mAb 또는 항-Myc mAb로 수행하였다. 펠렛내의 단백질은 각각 항-Myc 및 항-V5 mAb로 검출하였다. (c) MCF-7 세포에서 HCCR-1 및 ApoE의 위치 및 동시 존재. C는 원형질, N은 핵 그리고 M은 미토콘드리아를 나타낸다. HCCR-1 (탑 패널) 및 그것의 결합 단백질, ApoE의 세포내 위치(아래 패널). cDNA 컨스트럭트는 HCCR-1 및 ApoE에 각각 V5 (탑 패널) 및 c-Myc (아래 패널)이 태그되게 설계하였다. 볼테이지 의존 애니언 채널 1(VDAC1)을 미토콘드리아 마커로 사용. (d) 형광 현미경. 세포들을 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 pEGFP-HCCR-1 및 pEGFP-ApoE로 일시적으로 트랜스팩션시켰다. 그 후 세포들을 25nM MitoTracker Orange(Molecular Probes, Eugene, OR)로 배양시켰다. GFP 염색을 위하여, ProLong Gold Antifade Reagents (Molecular Probes, Eugene, OR)로 고정하였다. 형광 이미지들을 Bio-Rad MRC-1024MP 레이져 스캐닝 공초점 현미경 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 분석하였다.
도 2는 유방암 조직에서 HCCR-1과 ApoE가 서로 반대로 조절되는 것을 보여주는 그림. 인간 유방 조직과 세포주들에서 HCCR-1 (a) 및 ApoE의 발현 패턴(b). 유방암 세포주(BT-474, MCF-7 및 MDA-MB-231), 신선한 일차 유방암 조직 및 그들의 해당 정상 카운터파트에서 HCCR -1 mRNA 발현 비교. N은 정상 유방 조직, C는 일차 유방암 조직을 나타낸다. 인간 베타 액틴 cDNA를 대조군 프로브로 사용(아래 패널). (c,d) 인간 조직 및 세포주에서 ApoE 발현 패턴. 인간 암 세포주 다중 노던 블럿(c) 또는 정상 12 레인 다중 조직 노던 블럿(d)은 동위원소 표지된 ApoE cDNA (탑 패널) 또는 인간 베타 액틴 cDNA 대조군 프로브로 프로브하였다(아래 패널). (e,f) 유방암에서 ApoE의 조양 억제자 역할을 보여주는 그림. (e)MCF-7 유방암 세포에서 ApoE의 성장 억제 효과를 보여줌. 각각 벡터만, HCCR-1, ApoE 및 동시-트랜스팩션 후의 MCF-7 세포의 생존을 보여 줌. 데이터는 배양 10일 동안 생존 세포의 수를 나타내고 3중 실험의 평균±S.D를 나타낸다. (f) ApoE cDNA 트랜스팩션은 유 방암 세포에서 에팝토시스를 유도. 각각 벡터만, HCCR-1, ApoE 및 동시-트랜스팩션 세포 에서 DNA들의 전기 영동적 분석을 수행. 벡터 또는 유전자로 트랜스팩션된 세포들을 각각 1-, 3-, 5- 및 7-일간 배양. DNA들을 2% 아가로스 젤에서 분석하고 에티디움 브로마이드로 염색. (g,h) MCF-7 세포들에 의한 ApoE 분비. ELISA로 MCF-7 세포에서 ApoE 측정. 결과는 3중 실험의 평균±S.D를 나타낸다. ApoE 농도는 상업용 키트인(MBL ApoE4/Pan-ApoE ELISA kit, MBL Co., Woburn, MA)을 사용하여 샌드위치 ELISA로 결정. MBL ApoE4/Pan-ApoE ELISA 키트(MBL Co., Woburn, MA)는 샌드위치 ELISA로 인간 Pan-ApoE (g) 또는 ApoE4를 측정(h).
도 3은 HCCR-1 트랜스 비만 마우스에서 HCCR-1 및 ApoE 표현형 분석 및 발현 패턴을 나타내는 그림. (a) 트랜스 마우스 제조. 트랜스제닉 마우스를 표준 전핵 미세주입법을 사용하여 제조. 미세주입법을 위하여, 트랜스진 절편인, CMV-HCCR-1-bGH를 C57BL/6N(Charles River Japan)에서 온 단일 세포-스테이지 수정 배아의 전핵으로 미세주입하였다. 트랜스제닉(T/G) 수컷 및 비T/G 대조군 수컷 마우스(왼쪽 패널). T/G 암컷 및 비-T/G 대조군 암컷 마우스(오른쪽 패널). (b) 비만 및 대조군 마우스에서 유래한 복강막, 간, 췌장 및 심장의 헤마톡실린-에오신(HE) 염색. 수컷 T/G 비만 마우스(탑 패널), 암컷 T/G 비만 마우스(두번째 패널) 및 대조군 비 T/G 마우스(아래 패널). 원본 확대, X 200. (c) 비만 및 대조군 마우스의 여러 기관에서 ApoE 및 HCCR-1 발현 레벨. 인간 기관의 ApoE의 126-191 아미노산에 대한 ApoE (A1.4) 마우스 단일클론 항체를 사용(Santa Cruz biotechnology). (d) 비만 및 대조군 마우스에서 ApoE, 렙틴, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인슐린 및 포도당의 혈청 프로화일. 결과들은 3중 실험의 평균±S.D를 나타낸다.
본 발명은 HCCR-1을 포함하는 유방암 예후(prognostic) 마커 및/또는 비만 유도 조성물에 관한 발명이다.
유방암에서는 주로 겨드랑이 림프절에서의 전이의 유무에 의하여 예후를 결정한다. 그러나 국부적이거나 지엽적인 치료를 받은지 10년 후에 음성 림프절을 갖는 유방암 여성의 약 1/3에서 유방암이 재발하고, 양성 림프절을 가지는 환자의 약 1/3에서 유방암이 나타나지 않는다. 최근에는 초기 단계에서 유방암이 진단되는 비율이 높아지고 있다. 이들 환자에게 전신요법을 일반적으로 시행하게 되면 종종 과잉진료가 이루어지게 된다. St Gallen 및 NIH 컨센서스에 따르면 제I단계 및 제 II 단계 환자의 약 70 내지 80%가 보조 치료없이도 원거리 전이가 일어나지 않고, 부작용으로 고생할 수도 있다. 이러한 사실은 불필요한 치료를 받는 환자의 수를 상당하게 감소시킬 수 있는 더욱 민감하고 특이적인 예후 분석법의 필요성을 요구하게 된다. 몇몇 연구에서 종양 크기 또는 림프 또는 혈관 침범이 상당한 예후 가치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 핵 형태, DNA 함량 및 증식 활성 등과 같은 정량적인 병리학적 특징은 미세 전이될 가능성이 높은 종양을 구별해 낼 수 있다. 환자의 결과에 영향을 끼치는 공지 분자의 유전자 변화는 Her2/NEU 과발현, DNA 증폭, p53 돌연변이, ER/PR 상태 등을 포함하나 전이 케스케이드가 많은 복잡한 단계를 포함하 기 때문에 이러한 인자들만으로는 예후를 평가하기에는 여전히 부족하다.
또한 비만이 유도된 실험용 쥐 등은 다이어트 식품이나 음료 또는 고지혈증 치료제 개발시 그 효능평가에 필요한 비만 유도된 실험 쥐 등의 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로 본 발명의 목적은 유방암 예후 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비만 유도 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HCCR-1 단백질을 포함하는 유방암 예후 마커용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 ER, PR, p53 유전형 및 HER2 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 HCCR-1 단백질은 서열정보 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일성 범위에 있는 모든 단백질이 가능하다. 여기서 실질적으로 동일하다는 것은 HCCR-1의 성질은 유지하면서 서열정보 1에 기재된 단백질 서열의 특정 부분의 치환, 결손, 첨가 등의 돌연변이 및 그것의 절편 모두를 포함한다.
또한 본 발명은 HCCR-1 단백질을 포함하는 비만 유도용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 HCCR-1 단백질로 형질전환된 비만 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 염소 및 돼지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 비만 트랜스제닉 비-인간 포유동물이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기 HCCR-1 단백질은 서열정보 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일성 범위에 있는 모든 단백질이 가능하다. 여기서 실질적으로 동일하다는 것은 HCCR-1의 성질은 유지하면서 서열정보 1에 기재된 단백질 서열의 특정 부분의 치환, 결손, 첨가 등의 돌연변이 및 그것의 절편 모두를 포함한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 유방암에 대한 HCCR-1의 예후 인자의 가치는 30개의 유방의 일차 침습성 관암들에서 스테로이드 수용체(ER 및 PR), p53 돌연변이 및 높은 HER2 활성과 같은 다른 공지된 예후 마커들의 발현 수준과의 포지티브 상관관계를 보임에 의하여 더욱 증명되었다.
또한 ApoE의 분비는 HCCR-1 발현에 의하여 저해된다. 이러한 것과 일치하게 합성 siRNA 타겟팅 HCCR-1은 ApoE 분비에 대한 HCCR-1의 저해 효과를 파괴한다. 따라서 지질 대사의 주 조절자인 ApoE와 상호작용하는 HCCR-1은 형질 전환 마우스 라인에서 비만을 유도하였다. 비만 쥐는 정상 쥐보다 약 3배의 체중이 나갔다. 그 비만 쥐들은 심한 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 및 저인슐린혈증을 나타냈으나 ApoE나 렙틴의 증가는 없었다. 또 비만 쥐는 복강망, 간, 췌장 및 심장에 병리학적 문제를 보였다.
따라서 HCCR-1 발현은 이미 공지된 예후 인자들과 결합하여 새로운 예후 마커로 사용될 수 있고, HCCR-1이 물리적 상호작용을 통하여 ApoE 기능을 네가티브하게 조절하여 ApoE-상호작용하는 HCCR-1은 ApoE의 콜레스테롤 저하 활성을 저해하여 비만을 유도한다.
본 발명자들은 일차 유방암 조직에서 HCCR-1 단백질 발현이 ER, PR, p53 유전형 및 HER2 상태와 같은 다른 생물학적 마커와 관련이 있는지를 알기 위하여, HCCR-1 레벨을 그들의 정상 카운터파트와 함께 30개의 유방암 조직의 패널을 측정하였다(표 1 및 도 1a). HCCR-1 발현 레벨의 증가는 (ER+/PR+/mutant p53/high HER2), (ER+/PR+/wild p53/intermediate HER2), 및 (ER+/PR+/wild p53/low HER2)를 가지는 유방암 조직 순이었다(표 1 및 도 1a; 위쪽 패널). HCCR-1은 (ER-/PR-/p53-/low HER2)를 가지는 유방암 조직에서는 검출되지 않았다(표 1 및 도 1a; 아래쪽 패널). 따라서 이 결과들은 HCCR-1 발현을 유방암의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
ER/PR 발현, p53 상태 및 HER2 활성을 포함하는 공지된 유방암 예후 인자와 HCCR-1 발현 레벨의 상관관계
암 조직의 수 ER 상태 PR 상태 p53 상태 HER2 활성 HCCR-1 발현
8 + + 돌연변이 고 매우 강함
8 + + 야생형 중 강함
5 + + 야생형 저 약함
9 - - 널(null) 저 없음
상기 표에서 모든 유방암 조직은 병리학적으로 증명된 침윤성 유관상피암으로부터 유래하였다.
효모 투 하이브리드 스크리닝에 의하여 동정된 HCCR-1 및 ApoE는 면역침전법에 의하여 in vitro 확인하였다(도 1b). 동시면역침전 실험에 의한 HCCR-1 및 ApoE 사이의 상호작용을 확인하기 위하여 본 발명자들은 V5 태크가 융합된 HCCR-1을 발현하는 MCF-7 세포에 ApoE-Myc 융합 컨스트럭트를 트랜스팩션하였다. MCF-7 동시 트랜스팩션된 세포들에서 HCCR-1 단백질은 특이적으로 ApoE와 동시 침천되었다(도 1b). 또 HCCR-1 및 ApoE 단백질들은 HCCR-1 및 ApoE로 트랜스팩션된 MCF-7 세포파쇄물에서 발현되었다(도 1b). 이러한 결과는 ApoE가 HCCR-1 단백질과 상호작용한다는 것을 증명한다.
본 발명자들은 MCF-7 세포에서 HCCR-1의 미토콘드리아 위치를 검출하였다(도 1c). 반면에 ApoE는 단지 사이토졸 분획에서만 발견된다(도 1c; 아래 패널). 그러나 HCCR-1과 ApoE 동시 발현된 MCF-7 세포에 대한 세포분획분석은 이들 두 단백질이 미토콘드리아 분획에서 발견되고 극소량만의 ApoE가 사이토졸에서 발견된다(도 1c; 아래 패널). 이 결과는 동시 발현된 세포에서 ApoE 단백질이 원형질로부터 미토콘드리아로 이동한다는 것을 나타내고 이러한 데이터는 이들의 상호작용을 더욱 증거한다. 또한 형광 이미지들은 HCCR-1이 미토콘드리아에 존재하고(도 1d; 탑 패널) ApoE는 사이토졸에 존재한다는 것을 나타낸다(도 1d: 두 번째 패널). HCCR-1 및 ApoE가 미토콘드리아로 동시 존재를 더욱 확인하기 위하여 동시 트랜스팩션된 세포들을 MitoTracker(Red)로 염색하였다(도 1d). 염색된 세포들을 공초점 현미경으로 분석하였다. 세포들이 HCCR-1 및 ApoE로 동시트랜스팩션된 경우, ApoE는 사이토졸에서 미토콘드리아로 이동하였다(도 1d: 아래 패널). 이러한 결과들은 두 단백질들이 미토콘드리아에 동시에 존재한다는 것을 나타낸다.
다음 본 발명자들은 인간 정상 조직, 암조직 및 세포주에서 HCCR -1 또는 ApoE 발현패턴을 조사하였다. 노던 블럿 분석은 정상 조직과 비교할 때 일차 유방암 조직은 증가된 HCCR -1 발현을 보였다(도 2a). HCCR-1은 BT-474(ER+/PR+/mutant p53/high HER2) 및 MCF-7(ER+/PR+/wild p53/low HER2) 세포에서 풍부하게 검출되었으나 MDA-MB-231(ER-/PR-/ p53-/low HER2) 세포에서는 검출되지 않았다(도 2a). HCCR-1 발현 레벨은 MCF-7보다 BT-474에서 더 높았다(도 2a). 유방암 조직 또는 세포에서 HCCR -1 과발현과 반대로(도 2a), ApoE 발현은 거의 없었다(도 2b). 또한 ApoE 발현은 다른 여덟 암 세포주에서도 검출되지 않았다(도 2c). 노던 블럿 분석은 테스트한 12 정상 조직 중에서 간과 신장에서만 특이적으로 ApoE 발현이 풍부한 것을 나타냈다(도 2d).
ApoE의 성장 저해 효과를 측정하기 위하여, ApoE를 유방암 세포주에 트랜스팩션하였다. ApoE 트랜스팩션은 7일 후에 벡터만 트랜스팩션한 것과 비교하여보니 87% 성장 저해를 유도하였다(도 2e). 반면에 HCCR -1-트랜스팩션된 MCF-7 세포 성장 속도는 7일 후에 벡터만 트랜스팩션한 것과 비교하여 보니 45% 증가하였다(도 2e). HCCR-1-트랜스팩션된 MCF-7 세포에 ApoE를 동시트랜스팩션한 경우, 성장은 66%로 완화되었다(도 2e). 이러한 저해 효과는 DNA 단편화와 같은 에팝토시스와 관련된 것이다(도 2f). ApoE는 유방암에서 종양 억제자로 역할을 하지만 이러한 현상은 HCCR-1가 과발현되면 역전된다(도 2e 및 2f).
MCF-7 세포들에서 ApoE 분비에 대한 HCCR-1의 효과를 조사하기 위하여 본 발명자들은 ApoE-트랜스팩션된 MCF-7 세포들에서 Pan-ApoE 분비를 비교하였다. 세포 배양 배지에서 분비된 ApoE는 ApoE4/Pan-ApoE ELISA 키트(MBL, Woburn, MA)로 측정하였다. 이 키트는 샌드위치 ELISA에 기초하고 Pan-ApoE 또는 ApoE4를 측정할 수 있다. DMEM으로 24 h 배향 후 배지를 약 쪽에서 모아서 Pan-ApoE 농도를 결정하였다. 야생형 세포에서는 소량(28.4±0.1ng/ml)의 Pan-ApoE 가 발견되었으나 ApoE-트랜스팩션된 세포들에서는 그 양이 증가(33.0±0.6ng/ml)하였다(도 2g)(P < 0.05). HiPerformance 알고리즘(Qiagen GmbH, Germany) 타겟팅 HCCR-1을 사용하여 고안된 합성 siRNA(HCCR-1 siRNA-2)는 MCF-7 유방암 세포들에서 Pan-ApoE 분비를 유도하였다(도 2h). HCCR-1 siRNA-2 HCCR-1의 엑손 5 내의 579-600 뉴클레오타이드에 해당하는 HCCR-1 siRNA-2는 야생형 MCF-7 세포 및 ApoE-트랜스팩션된 MCF-7 세포들에서 Pan-ApoE 분비를 각각 유도하였다(도 2h). ApoE-트랜스팩션된 MCF-7 세포들에서 Pan-ApoE 분비는 대조군인 넌-사일런싱 siRNA(33.0±0.3ng/ml)와 비교하여 HCCR-1 siRNA-2(54.5±0.2ng/ml)에 의하여 크게 증가하였다(도 2h)(P < 0.05). 야생형 MCF-7 세포들에서 HCCR-1 siRNA-2 트랜스팩션은 Pan-ApoE 분비를 다량(42.4±0.3 ng/ml)유도한 반면에, 대조군 siRNA 트랜스팩션에서 분비는 감소하였다(28.3±0.3 ng/ml)(도 2h)(P < 0.05).
ApoE 단백질은 식사나 비만과 같은 생활 습관이나 생물학적 인자의 결합을 통하여 유방암의 위험을 조절할 수도 있다. 비만은 전 세계적으로 급격하게 증가하고 있다. 비록 비만이 종양 발생을 유도하거나 촉진하는 기작은 암 위치에 따라 다르지만 역학적 연구들은 비만과 암 타입의 범위는 관련을 가진다. 비만은 폐경 후 여성에서 유방암의 속도를 30-50% 증가시킨다고 알려졌다(Ballard-Barbash, 외 Am J Clin Nutr 63(Suppl. 3), 437-441(1996); Trentham-Dietz, A.외 Am J Epidemiol 145, 1011-1119(1997)). 비만은 내생적인 에스트로겐의 대사와 생체이용성에 영향을 주어서 유방암의 위험에 영향을 준다.
HCCR-1은 형질전환 마우스에서 심한 비만을 유도하였다. 비만 마우스는 3세대상 번식하였고 동일한 성별과 나이의 마우스에 비하여 3배 정도의 무게를 보였다(도 3a). 특히 비만은 동일한 나이의 암컷(도 3a; 오른쪽 패널)보다 수컷 형질전환 마우스에서 더 심하게 나타났다(도 3a; 왼쪽 패널). 수컷 비만 마우스는 동일한 나이의 정상 마우스(24.5±1.0 g)에 비하여 62.2±3.7g 체중이 나갔다(도 3a; 왼쪽 패널)(P < 0.0001). 또 동일한 연령의 암컷 비만 마우스(43.1±1.3 g)와 정상 마우스(21.7±1.5 g)에도 상당한 체중 차이가 존재하였다(도 3a; 오른쪽 패널)(P < 0.0001).
비만 마우스는 복강막, 간, 췌장 및 심장을 포함하는 병리학적 질환을 보였다(도 3b). 형질전환 수컷에서, 복강막은 다량의 지방과 지방세포의 비대를 보였다(도 3b; 탑 패널). 간은 간세포에서 소포성 및 대포성(macrovesicular) 지방 변화가 확산되는 것을 보였다(도 3b; 탑 패널). 형질전환 수컷의 췌장은 그들의 수와 크기가 증가하는 랑게르한스 섬의 섬세포 과형성을 나타내었다(도 3b; 탑 패널). 심장 판막은 중도 점액성 변화 및 비대를 보였다(도 3b; 탑 패널). 형질전환 수컷과 비교하여, 형질전환 암컷은 단지 소량의 액포 변화를 가지는 덜 지방 변화를 가지는 복강막의 온화한 세포 크기와 부피를 보였다(도 3b; 두번째 패널). 또 췌장의 섬세포 과형성 및 심장 판막의 점액성 변화를 덜 나타내었다(도 3b; 두 번째 패널). 이들 이상들은 정상 대조군 수컷에서는 관찰되지 않았다(도 3b; 아래 패널).
HCCR-1 및 ApoE 발현 프로화일은 대조군 및 형질전환 마우스로부터 유래한 몇 조직들로 구성된 웨스턴 블럿으로 서로 대비하였다(도 3c). 예를 들어 ApoE는 뇌, 폐, 간, 신장, 장, 복강과 같은 대조군 마우스 조직에서는 높게 발현되었으나 혈질전환 마우스로부터 유래한 동일 조직에서는 매우 적게 발현되거나 발현되지 아니하였다. 반면에 HCCR-1 레벨은 비록 형질전환 수컷 및 암컷 마우스에서는 과발현되었지만 대조군의 이들 조직에서는 매우 적게 발현되거나 발현되지 아니하였다. 이 HCCR-1 및 ApoE의 상호 배타적인 발현 패턴은 도 2a 및 2b에서 보여준 데이터를 상기하게 하고 이것은 그들이 다르게 그러나 반대적인 생물학적 결과를 얻는 신호 경로에 의하여 협력적인 형태조절된다는 것을 나타낸다.
비만 수컷 마우스에서 전체 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 레벨은 동일 연령의 정상 대조군 마우스와 비교하였을 때 크게 증가하였다(P < 0.05). 비만 수컷 마우스에서 전체 콜레스테롤(184.8±5.4mg/dl), HDL 콜레스테롤(152.9±0.4mg/dl), LDL 콜레스테롤(46.7±0.7mg/dl) 및 트리글리세라이드(21.9±2.3mg/dl) 레벨은 정상 마우스보다 HCCR-1 형질전환 수컷 마우스에서 각각 4.2, 4.0, 3.8, 및 2.7 배 증가하였다(도 3d)(P < 0.05). 정상 수컷 마우스에서 전체 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 레벨은 각각 43.8±1.0mg/dl, 38.4±1.0mg/dl, 12.3±0.6mg/dl 및 8.0±0.1mg/dl이었다.
그러나 동일 연령의 비만 마우스 및 정상 마우스사이의 ApoE 및 렙틴의 큰 차이는 없었다(도 3d). 비만 수컷, 비만 암컷 및 정상 대조군 마우스에서 ApoE 레벨은 각각 0.9±0.1mg/dl, 0.9±0.1mg/dl 및 1.4±0.3mg/dl이었다(도 3d). 또 비만 수컷, 비만 암컷 및 정상 대조군 마우스에서 렙틴의 레벨은 각각 0.3±0.1ng/dl, 0.3±0.1ng/dl 및 0.3±0.1ng/dl이었다(도 3d). 혈청 인슐린 레벨은 형질전환 비만 마우스 및 대조군 마우스 사이에 차이가 없었다(도 3d). 비만 수컷, 비만 암컷 및 정상 대조군 마우스에서 인슐린 레벨은 각각 2.3±0.6μIU/ml, 2.0±0.3μIU/ml 및 2.0±0.6μIU/ml이었다.
이상에서 본 발명은 HCCR-1이 다른 공지된 예후 마커와 함께 유방암의 새로운 예후 마커로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 HCCR -1 단백질이 ApoE와 직접적인 결합을 통하여 증식 억제 작용을 저해하여 종양을 일으키고 따라서 ApoE 활성을 네가티브하게 저해한다는 것을 알 수 있었다. 더욱 중요한 것은 HCCR-1 형질전환 마우스가 특히 수컷 마우스에서 비만을 발생한다는 것을 알 수 있다. 다양한 암 타입과 비만의 관계에 대한 증거들의 발생과 관련하여 본 발명자들은 HCCR-1이 말초성 세포에서 간으로 콜레스테롤 청소와 관련된 ApoE와 상호작용을 하고 사실 HCCR-1에 대한 형질전환 마우스는 유방암 뿐 아니라 비만과도 관련된 병리학적 결함을 나타낸다. 따라서 본 발명은 여성에게서 많이 발생하는 질환인 유방암과 비만에 대한 치료전략을 수립할 수 있게 하고 특히 HCCR-ApoE 상호작용 타겟팅 약물의 개발을 가능케한다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: 조직과 세포주들
인간 정상 및 암 조직들은 수술 중에 얻었다. 모든 환자들은 개별 동의를 받았다. 조직 샘플의 사용은 병원의 윤리위원회로부터 승인을 받았다. 포유류 세포주들은 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA)에서 얻었다. BT-474, MCF-7 및 MDA-MB-231은 유선 유래 인간 유방암 세포주이다. MCF7 및 MDA-MB-231 세포들은 낮은 HER2를 발현하고, BT-474 세포들은 높은 HER2를 발현한다. BT-474 및 MCF-7 세포들은 ER-포지티브이고 PR-포지티브 세포들이다. MDA-MB-231은 ER-네가티브이고 PR-네가티브 세포주이다. MCF-7 세포들은 야생형 p53을 가지고, MDA-MB-231 세포들은 널 타입 p53을 가진다. BT-474 세포들은 돌연변이된 p53을 가진다.
실시예 2: 발현 벡터 설계 및 DNA 트랜스팩션
HCCR -1 또는 ApoE의 코딩 지역을 포함하는 발현 벡터는 다음과 같이 설계되었다.
먼저 HCCR -1 또는 ApoE cDNA를 포함하는 원핵 발현벡터인 pCEV-LAC로부터 SalI 절편을 분리하였다. 그 후, pcDNA3.1-V5-His(Invitrogen, CA) 또는 pcDNA3.1-Myc-His를 BamH I 및 Sal I 처리하여 SalI를 가지는 컴파티빌 말단을 만들었다. HCCR-1 또는 ApoE 코딩 서열을 함유한 SalI 절편을 XhoI-처리된 pcDNA3.1. Lipofectamine 2000(Gibco BRL, Rockville, MD)에 삽입하여서 유방암 세포에 HCCR -1 또는 ApoE 발현벡터를 삽입하는데 사용하였다. 간단하게 요약하면, 2 × 105 세포들을 60mm 조직 배양 디쉬(Costar, Cambridge, MA)에 시딩하였다. 습식 5% CO2 배양기에서 밤새 배양 후, 그 세포들을 15ml lipofectamine 시약과 5mg DNA를 포함하는 150ml의 lipofectamine-DNA 복합체로 처리하였다. 각각 세포들을 0.6mg/ml G418에 대하여 저항성을 나타내는 것을 선택하였다. 선택된 트랜스팩턴트들을 웨스턴 블럿에 의하여 HCCR -1 또는 ApoE 발현을 스크리닝하였다.
실시예 3: 효모 투-하이브리드 스크리닝 및 베타 갈락토시데이즈 분석
MATCHMAKER LexA 투-하이브리드 시스템을 HCCR-1 융합 단백질에 결합할 수 인간 피탈 뇌 MATCHMAKER cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 단백질을 동정하기 위하여 사용하였다. 모든 실험은 리포터로 lacZ 및 leu 유전자들을 발현하는 p8op-lacZ로 형질전환된 효모 균주EGY48(Clontech)에서 수행하였다. 본 발명자들은 LexA DNA-결합 도메인을 포함하는 효모 투-하이브리드 벡터(pLexA) (Clontech)에 HCCR -1 cDNA 절편을 삽입하였다. LexA-HCCR-1을 발현하는 효모 세포들은 B42AD 융합 단백질들을 발현하는 인간 피탈 뇌 cDNA 라이브러리(Invitrogen)로 형질전환하였다. 라이브러리 형질전환 후 세포들을 AD 융합 단백질들 검출 기회를 개량하기 위하여 베이트(HCCR-1) 및 AD/라이브러리 플라즈미드 모두에 대하여 선택하는 최소 합성 드롭아웃 넌 인덕션 배지(시그마)에 플레이트하였다. HCCR-1과 결합 단백질 ApoE 사이의 상호작용을 확인하기 위하여, HCCR-1과 ApoE를 발현하는 플라즈미드를 효모 세포에 동시 형질전환하였다.
실시예 4: 동시-트랜스팩션 및 면역침전
HCCR -1-V5-His(Invitrogen) 융합 단백질 및 ApoE-Myc-His(Invitrogen)를 코딩하는 pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 세포를 트랜스팩션시켰다. 48시간 후, 그 세포들을 모아서 라이시스 버퍼로 라이시스하였다. 그 파쇄액을 30분 동안 프리이뮨 혈청(마우스) 및 단백질 A-세파로스로 4℃에서 전정화하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 시약 키트(PIERCE, Rockford, IL)로 표준으로 소 혈청 알부민을 사용하여 결정하였다. 전정화된 세포 파쇄액 앨리쿼트(1 mg)를 1:500 희석액의 항-V5(Invitrogen) 또는 1:250 희석액의 항-Myc(Invitrogen) mAb 및 40ml의 1:1 단백질 A-세파로스 비드 슬러리(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)로 PBS에서 4℃에서 16시간 배양하였다. 면역 복합체들을 원심분리(2,000 × g, 5min, 4℃)로 모으고, 버퍼(20mM Tris, pH 7.5, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 150mM NaCl, 2mM Na3VO4, 10% 글리세롤 및 1% Nonidet P-40)로 4회 세척하고, SDS-PAGE를 수행하고 TBS에서 1:1000 희석액의 항-Myc 또는 1:3000 희석액의 항-V5 항체로 웨스턴 블럿을 하였다.
실시예 5: 세포내 위치
세포내 위치는 미토콘드리아 분리 키트(Pierce, Rockford, IL)에 따라 수행하였다. 간단하게 요약하면, 세포들을 850 × g에서 2분간 원심분리하여 수집하고 그 펠렛을 800㎕ 시약 A로 부유시키고, 다음 정확히 2분간 얼음에서 유지시켰다. 10㎕의 시약 B를 상기 부유액에 첨가하고 매분 최대 스피드로 볼텍싱하면서 5분간 얼음에서 유지시켰다. 800㎕ 시약 C를 상기 용액에 첨가하고 혼합하기 위하여 서너번 튜브를 흔들었다. 그 용액을 4℃에서 10분간 700 × g로 원심분리하고, 그 펠렛을 조 핵 분획에 사용하였다. 상등액을 4℃에서 10분간 12,000 × g로 원심분리하고 원형질 분획을 위하여 새로운 튜브에 그 상등액을 옮겼다. 그 펠렛을 500㎕ 시약 C로 세척하고, 분리된 미토콘드리아 분획에 사용하였다. 각 분획은 BCA 단백질 분석 시약 키트(Pierce)로 정량하였다. 샘플 버퍼에서 끓인 추출물들은 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고 표준 방법에 의하여 나이트로셀루로스로 옮겼다. 막들을 0.05% Tween 20을 가지는 TBS(pH 7.4)내의 5% 탈지 우유로 불럭킹을 하고 및 미토콘드리아 위치 마커에 대한 일차 항체들인 항-V5(Invitrogen, Carlsbad, CA), 항-c-Myc(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 항-VDAC1(Santa Cruz Biotechnology)로 배양하였다.
실시예 6: 면역형광 및 형광 현미경
커버슬립들을 HCl, 증류수로 3회 및 100% 에탄올로 2회 세척하였다. 그 후 건조된 커버슬립들을 5㎍/ml Poly-L-Lysine(Sigma-Aldrich Corp., MO)로 37℃에서 밤새 코팅하였다. MCF-7 세포들을 6 웰 플레이트에서 미리코팅된 커버슬립 위에 시딩하였다. 그 후 하루 배양 후에 그 세포들을 LipofectAMINE 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 pEGFP-HCCR-1 및 pEGFP-ApoE로 일시적으로 트랜스팩션하였다. 24-28시간 더 배양 후 그 세포들을 25nM MitoTracker Orange(Molecular Probes, Eugene, OR)로 37℃에서 15분 배양하였다. 세포들을 고정 전에 2ml PBS로 3회 세척하였다. 그 후 커버슬립 위의 세포들을 4℃에서 10분간 4% 스쿠로스를 포함하는 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 세포들을 -20℃에서 1분간 100% 메탄올로 처리하고 PBS로 3회 세척하였다. GFP 염색을 위하여, 세포들을 ProLong Gold Antifade 시약(Molecular Probes, Eugene, OR)을 사용하여 고정시켰다. 형광 이미지들을 Bio-Rad MRC-1024MP 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 분석하고 얻었다.
실시예 7: 면역염색화학 분석 및 염색 해석
면역염색화학 실험을 위하여 정상 인간 유방 및 유방암 조직의 파라핀 절편(5㎛ 두께)을 사용하였다. 그 절편들을 친화-정제된 폴리클로날 항-HCCR-1 항체로 2시간 배양하였다. 아미노에틸 카보졸(AEC)을 발색원으로 사용하였다. 면역염색 후 절편들을 헤마톡시린으로 염색하였다. 병리학자가 ER, PR 및 p53에 대한 가장 활성적인 염색 지역에서 적어도 500 종양 세포를 계수하였다. ER, PR, 및 p53에 대한 포지티브 염색을 핵 염색으로 정의하였다. 대부분 인정되는 컷오프 값에 따라, 종양 세포들의 10% 양성 염색을 ER, PR 및 p53에 대한 포지티브 결과로 사용하였다. HER2 면역화학 염색 결과들을 염색 기준에 따라 정의하였다. HER2에 대한 양성 염색을 막 염색으로 정의하였다. 원형질 염색은 양성으로 간주하지 않았다. 면역반응성이 없거나(스코어 0) 불완전하거나 희미한 막 염색(스코어 1+)를 보이는 종양세포들을 음성으로 간주하였다. HER2는 완전하게 약에서 중간 막 염색(약한 양성;스코어 2+) 또는 완전히 강한 막염색(강한 양성; 스코어 3+)이 10% 이상의 종양 세포들에서 관찰될 경우에 양성으로 정의하였다.
실시예 8: 노던 블럿 분석
HCCR -1 cDNA 또는 954-bp 전장 ApoE cDNA를 사용하여 여러 인간 조직에서 HCCR-1 또는 ApoE 발현을 조사하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. mRNA 발현의 레벨을 베타-액틴의 발현 레벨과 비교하여 정량화하였다.
실시예 9: 샌드위치 ELISA에 의한 배양 상등액에서 ApoE 검출
유방암 세포의 증식기 동안 ApoE 생성의 역학을 연구하기 위하여, 106 세포를 FBS(10%)를 가지는 DMEM 하의 75-㎠에서 8일 동안 번식시켰다. 50ml의 배지 앨리쿼트를 8일 동안 매 24시간마다 수집하여 ApoE 농도 측정때까지 -20℃에서 유지하였다. ApoE 농도를 상업적인 키트인 (MBL ApoE4/Pan-ApoE ELISA kit, MBL Co., Woburn, MA)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해서 결정하였다. MBL ApoE4/Pan-ApoE ELISA 키트(MBL Co., Woburn, MA)는 샌드위치 ELISA에 의하여 인간 ApoE4 또는 Pan-ApoE를 측정하였다. 그 분석은 ApoE에 대한 친화 정제된 다중클론 항체 및 ApoE4에 대한 단클론 항체를 사용하였다.
실시예 10: DNA 절편화 분석
HCCR -1 또는 ApoE-트랜스팩션된 유방암 세포들, pcDNA3.1 만 트랜스팩션된 세포들 및 야생형 세포들을 각각 3,5 및 7일간 배양한 후 수집하였다. 그리고 그 세포들을 파쇄하고 100㎍/ml 프로테이즈 K를 함유하는 라이시스 버퍼에서 48℃에서 오버나잇 처리하였다. 1/5부피의 5M NaCl 및 동일 부피의 이소프로필 알콜을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 그 DNA 펠렛을 TE 버퍼에 재용해시키고 0.1mg/ml의 RNase A로 for 1 h at 37℃에서 1시간 처리하였다. 각 샘플에 대하여 10㎍ DNA를 2% 아가로스 젤에서 분획하고 에티디움 브로마이드로 염색하여 UV 레이 하에서 보았다.
실시예 11: 형질전환 마우스의 생산
형질전환 마우스는 Vatten, L.J. & Foss, O.P. Cancer Res 50, 2341-2346 (1990)에 기재된 바와 같이 표준 전핵 미세주입법을 사용하여 제조하였다. 미세주입을 위하여 트랜스진의 절편인 HCCR-1을 Nru I 및 Xmn I 더블 다이제스천에 의하여 pcDNA3.1-V5-His의 벡터 골격이 없이 분리하였다. CMV-HCCR-1-bGH의 주사된 절편을 분리하고 일렉트로일루션 및 투션을 통하여 분리하고 정제하고 최종 농도 2ng/ml DNA 주입 버퍼(10mM Tris/0.1mM EDTA, pH 7.4)로 희석하고, C57BL/6N (Charles River Japan)에서 온 단일 세포-스테이지 수정 배아의 전핵으로 미세주입하였다. 그 후 미세주입에서 생존한 20-25 주사된 DNA 수정란들을 주사 후 2-3시간 또는 다음날 기재된 바와 같이 한 수용체 CD-1(Charles River Japan) 마우스의 수란관 속으로 이식하였다. 포텐셜 형질전환 화운더 동물들을 3주령에서 이유시키고, PCR을 사용하여 HCCR-1 트랜스진의 존재에 대한 표준 프로토콜로 제조된 마우스 테일 지노믹 DNA를 스크리닝하여 동정하고, 영속적인 라인을 개발하기 위하여 야생형으로 자라게 하였다.
실시예 12:　통계 분석
체중 및 ApoE, 전체 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세라이드, 렙틴 미 인슐린의 혈청 농도는 평균±S.D로 나타내었다. t-test 및 and Dunnett's 멀티플 비교를 모든 통계 분석에 사용하였다.
상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 HCCR-1은 유방암의 예후 마커 및/또는 비만 유도용 조성물로 우수한 효과를 가진다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. HCCR-1 단백질을 포함하는 비만 유도용 조성물.
  5. HCCR-1 단백질로 형질전환된 비만 트랜스제닉 비-인간 포유동물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 염소 및 돼지로 구성된 그룹 중에서 선택되는 비만 트랜스제닉 비-인간 포유동물.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 HCCR-1 단백질의 서열은 서열번호 1에 기재된 것을 특징으로 하는 조성물.
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