JP2009543044A

JP2009543044A - Ｈｃｃｒ−１を含む乳癌予後マーカー及び肥満誘導組成物

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Publication number: JP2009543044A
Application number: JP2009517999A
Authority: JP
Inventors: ヒュン−キ・キム; ジン−ウ・キム
Original assignee: ヒュン−キ・キム
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2009-12-03
Also published as: US20100205681A1; WO2008004833A1; EP2044442A4; CA2656926A1; CN101512345A; KR100786759B1; EP2044442A1

Abstract

本発明は、ＨＣＣＲ−１を含む乳癌予後マーカー及び肥満誘導組成物に関する発明である。

Description

本発明は、ＨＣＣＲ−１を含む乳癌予後マーカー及び/または肥満誘導組成物に関する。

乳癌では、通常、わきのリンパ線からの転移の有無によって予後を決める。しかし、局部的あるいは枝葉的な治療を受けてから１０年後に陰性リンパ線を持つ乳癌女性の約１/３で乳癌が再発し、陽性リンパ線を持つ患者の約１/３で乳癌が現れない。最近は、初期段階で乳癌と診断される比率が高まっている。これら患者に全身療法を一般的に行うと、たびたび過剰診療になることがある。ＳｔＧａｌｌｅｎ及びＮＩＨコンセンサスによると、第Ｉ段階及び第ＩＩ段階の患者の約７０乃至８０％が補助治療なしにも遠距離転移が起きず、副作用で苦労することがある。このような事実は、不要な治療を受ける患者の数を非常に減少させることができる、さらに敏感で特異な予後分析法の必要性を要求することになる。いくつかの研究で腫瘍の大きさまたはリンパまたは血管侵犯が相当な予後価値を有することが明らかになった。核形態、ＤＮＡ含有量及び増殖の活性などのような定量的な病理学的特徴は、微細転移される可能性の高い腫瘍を分けることができる。患者の結果に影響を及ぼす公知分子の遺伝子変化はＨｅｒ２/ＮＥＵ過発現、ＤＮＡ増幅、ｐ５３突然変異、ＥＲ/ＰＲ状態などを含むが、転移カスケードが多い複雑な段階を含むので、このような因子だけで予後を評価するには依然として不足する。

また、肥満が誘導されたマウスなどは、ダイエット食品や飲み物または高脂血症治療剤の開発時にその効能評価に必要な肥満が誘導されたマウスなどの用途として役に立つよう利用されることができる。

Ｂａｌｌａｒｄ−Ｂａｒｂａｓｈ、他ＡｍＪＣｌｉｎＮｕｔｒ６３（Ｓｕｐｐｌ. ３）、４３７−４４１（１９９６）Ｔｒｅｎｔｈａｍ−Ｄｉｅｔｚ、Ａ．他ＡｍＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ１４５、１０１１−１１１９（１９９７）Ｖａｔｔｅｎ, Ｌ.Ｊ. ＆Ｆｏｓｓ, Ｏ.Ｐ. ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５０, ２３４１−２３４６（１９９０）

本発明は前記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、乳癌予後マーカーを提供することである。

本発明の他の目的は、肥満誘導組成物を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は、ＨＣＣＲ−１タンパク質を含む乳癌予後マーカー用組成物を提供する。

本発明において、前記組成物はＥＲ、ＰＲ、ｐ５３遺伝型及びＨＥＲ２タンパク質で構成された群より選択される一つ以上の薬剤をさらに含むことが好ましく、これに限定されない。

また、本発明において、前記ＨＣＣＲ−１タンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同一範囲にあるすべてのタンパク質が可能である。ここで実質的に同一であるということは、ＨＣＣＲ−１の性質は維持しながら配列番号１に記載されているタンパク質配列の特定部分の置換、欠損、付加などの突然変異及びそれの切片のすべてを含む。

また、本発明はＨＣＣＲ−１タンパク質を含む肥満誘導用組成物を提供する。

また、本発明はＨＣＣＲ−１タンパク質で形質転換された肥満トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。

本発明において、前記動物はマウス、ラット、ウサギ、羊、牛、ヤギ及び豚で構成されたグループの中で選択される肥満トランスジェニック非ヒト哺乳動物が好ましく、これに限定されない。

前記ＨＣＣＲ−１タンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同一範囲にあるすべてのタンパク質が可能である。ここで実質的に同一であるということは、ＨＣＣＲ−１の性質は維持しながら配列番号１に記載されているタンパク質配列の特定部分の置換、欠損、付加などの突然変異及びそれの切片のすべてを含む。

前記の構成から分かるように本発明のＨＣＣＲ−１は、乳癌の予後マーカー及び/または肥満誘導用組成物として優れた効果を有する。

乳癌でのＨＣＣＲ−１発現及びＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥの関連性を示す図である。（ａ）はヒト乳癌のＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ｐ５３及びＨＣＣＲ−１発現に対する免疫組織化学染色である。全ての乳癌組織は、病理学的に証明された浸潤性乳管上皮癌から由来した。癌種細胞の核にＥＲ、ＰＲ及びｐ５３そして原形質でＨＣＣＲ−１に対する陽性免疫染色を示す（トップパネル）。ＨＥＲ２免疫組織の化学染色は、癌種細胞の完全な強い膜染色（３＋）を示す（トップパネル）。乳癌種でのＥＲ、ＰＲ、ｐ５３、ＨＥＲ２及びＨＣＣＲ−１に対する陰性免疫染色を示す（下側パネル）。原本拡大、Ｘ１００。（ｂ）ＨＣＣＲ−１とＡｐｏＥとのタンパク質の相互作用を示す。ＨＣＣＲ−１はＡｐｏＥに結合し（左側パネル）、ＡｐｏＥはＨＣＣＲ−１にそれぞれ結合する（右側パネル）。ＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥのタンパク質を生産するトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞から同時−免疫沈殿を行った。免疫沈澱法は、抗−Ｖ５ｍＡｂまたは抗−ＭｙｃｍＡｂで行った。ペレット内のタンパク質は、それぞれ抗−Ｍｙｃ及び抗−Ｖ５ｍＡｂで検出した。（ｃ）ＭＣＦ−７細胞でＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥの位置及び同時存在を示す。Ｃは原形質、Ｎは核、またＭはミトコンドリアを示す。ＨＣＣＲ−１（トップパネル）及びそれの結合タンパク質、ＡｐｏＥの細胞内位置を示す（下側パネル）。ｃＤＮＡコンストラクトはＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥにそれぞれＶ５（トップパネル）及びｃ−Ｍｙｃ（下側パネル）がタグされるように設計した。ボルテージ依存アニオンチャンネル１（ＶＤＡＣ１）をミトコンドリアマーカーとして使用する。（ｄ）は蛍光顕微鏡である。細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＥＧＦＰ−ＨＣＣＲ−１及びｐＥＧＦＰ−ＡｐｏＥで一時的にトランスフェクションさせた。その後、細胞を２５ｎＭＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で培養させた。ＧＦＰ染色のために、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰＲｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で固定した。蛍光イメージをＢｉｏ−ＲａｄＭＲＣ−１０２４ＭＰレーザースキャニング共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して分析した。乳癌組織でＨＣＣＲ−１とＡｐｏＥが互いに反対に調節されることを示す図である。ヒト乳房組織と細胞株でＨＣＣＲ−１（ａ）及びＡｐｏＥの発現パータン（ｂ）を示す。乳癌細胞株（ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、新鮮な一次乳癌組織及びそれらの該当正常カウンターパートでＨＣＣＲ−１ｍＲＮＡの発現を比較した。Ｎは正常乳房組織、Ｃは一次乳癌組織を示す。ヒトベータアクチンｃＤＮＡを対照群プローブとして使用した（下側パネル）。（ｃ、ｄ）はヒト組織及び細胞株におけるＡｐｏＥの発現パターンを示す。ヒト癌細胞株の多重ノーザンブロット（ｃ）または正常１２レインの多重組織ノーザンブロット（ｄ）は、同位元素が示されたＡｐｏＥｃＤＮＡ（トップパネル）またはヒトベータアクチンｃＤＮＡ対照群プローブでプローブした（下側パネル）。（ｅ、ｆ）乳癌でＡｐｏＥの助陽抑制者の役割を示す図である。（ｅ）ＭＣＦ−７乳癌細胞でＡｐｏＥの成長抑制効果を示す。それぞれベクターのみ、ＨＣＣＲ−１、ＡｐｏＥ及び同時−トランスフェクションされた後のＭＣＦ−７細胞の生存を示す。データは、培養１０日間の生存細胞の数を示し、３重実験の平均±Ｓ.Ｄを示す。（ｆ）ＡｐｏＥｃＤＮＡトランスフェクションは、乳癌細胞でアポトーシスを誘導する。それぞれベクターのみ、ＨＣＣＲ−１、ＡｐｏＥ及び同時−トランスフェクションされた細胞でＤＮＡの電気泳動的分析を行い、ベクターまたは遺伝子でトランスフェクションされた細胞をそれぞれ１−、３−、５−及び７−日間培養した。ＤＮＡを２％アガロースゲルで分析し、エチジウムブロマイドで染色した。（ｇ、ｈ）はＭＣＦ−７細胞によるＡｐｏＥ分泌を示す。ＥＬＩＳＡにてＭＣＦ−７細胞でＡｐｏＥを測定した。結果は、３重実験の平均±Ｓ.Ｄを示す。ＡｐｏＥ濃度は、商業用キットである（ＭＢＬＡｐｏＥ４/Ｐａｎ−ＡｐｏＥＥＬＩＳＡｋｉｔ、ＭＢＬＣｏ., Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用してサンドイッチＥＬＩＳＡで決定する。ＭＢＬＡｐｏＥ４/Ｐａｎ−ＡｐｏＥＥＬＩＳＡキット（ＭＬＢＣｏ.，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡでヒトＰａｎ−ＡｐｏＥ（ｇ）またはＡｐｏＥ４を測定した（ｈ）。ＨＣＣＲ−１トランス肥満マウスでＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥの表現型分析及び発現パターンを示す図である。（ａ）はトランスジェニックマウスの製造を示す。標準前核微細注入法を使用してトランスジェニックマウスを製造した。微細注入法のために、トランスジン切片であるＣＭＶ−ＨＣＣＲ−１−ｂＧＨをＣ５７ＢＬ/６Ｎ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＪａｐａｎ）からの単一細胞−ステージ受精胚芽の前核に微細注入した。トランスジェニック（Ｔ/Ｇ）雄及び非Ｔ/Ｇ対照群雄マウスを示す（左側パネル）。Ｔ/Ｇ雌及び非−Ｔ/Ｇ対照群雌マウスを示す（右側パネル）。（ｂ）は肥満及び対照群マウスから由来した腹腔膜、肝臓、膵臓及び心臓のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）の染色を示す。雄Ｔ/Ｇ肥満マウス（トップパネル）、雌Ｔ/Ｇ肥満マウス（２番目パネル）及び対照群非Ｔ/Ｇマウスを示す（下側パネル）。原本拡大、Ｘ２００.（ｃ）は肥満及び対照群マウスの多様な器官でのＡｐｏＥ及びＨＣＣＲ−１の発現レベルを示す。ヒト器官のＡｐｏＥの１２６−１９１アミノ酸に対するＡｐｏＥ（Ａ１．４）マウス単一クローン抗体を使用（ＳａｎｔａＣｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）する。（ｄ）は肥満及び対照群マウスでＡｐｏＥ、レプチン、コレステロール、トリグリセリド、インスリン及びブドウ糖の血清プロフィールを示す。結果は、３重実験の平均±Ｓ.Ｄを示す。

以下において本発明を詳しく説明する。

本発明で乳癌に対するＨＣＣＲ−１の予後因子の価値は、３０個の乳房の一次浸潤性管癌でステロイド収容体（ＥＲ及びＰＲ）、ｐ５３突然変異及び高ＨＥＲ２活性のような他の公知の予後マーカーの発現水準と陽性の相関関係を見せることによって、さらに証明された。

また、ＡｐｏＥの分泌はＨＣＣＲ−１発現により阻害される。これと同様に合成ｓｉＲＮＡターゲッティングＨＣＣＲ−１はＡｐｏＥ分泌に対するＨＣＣＲ−１の阻害効果を破壊する。従って、脂質代謝の主調節者であるＡｐｏＥと相互作用するＨＣＣＲ−１は、トランスジェニックマウス系統で肥満を誘導した。肥満ネズミの体重は正常ネズミの体重の約３倍であった。該肥満のネズミは、深刻な高コレステロール血症、高中性脂肪血症及び低インスリン血症を示したが、ＡｐｏＥやレプチンの増加はなかった。また肥満ネズミは腹腔網、肝臓、膵臓及び心臓に病理学的問題を見せた。

従って、ＨＣＣＲ−１発現は、既に公知になった予後因子と結合して、新しい予後マーカーで使われることができ、ＨＣＣＲ−１が物理的相互作用を通じてＡｐｏＥ機能をネガティブに調節してＡｐｏＥ−相互作用するＨＣＣＲ−１はＡｐｏＥのコレステロール低下活性を阻害して、肥満を誘導する。

本発明者らは、一次乳癌組織でＨＣＣＲ−１タンパク質発現がＥＲ、ＰＲ、ｐ５３遺伝型及びＨＥＲ２状態のような他の生物学的マーカーと関連があるかどうかを把握するために、ＨＣＣＲ−１レベルをそれらの正常カウンターパートと共に３０個の乳癌組織のパネルを測定した（表１及び図１ａ）。ＨＣＣＲ−１発現レベルの増加は（ＥＲ＋/ＰＲ＋/ｍｕｔａｎｔｐ５３/ｈｉｇｈＨＥＲ２）、（ＥＲ＋/ＰＲ＋/ｗｉｌｄｐ５３/ＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅＨＥＲ２）及び（ＥＲ＋/ＰＲ＋/ｗｉｌｄｐ５３/ｌｏｗＨＥＲ２）を持つ乳癌組織順であった（表１及び図１ａ；上側パネル）。ＨＣＣＲ−１は（ＥＲ−/ＰＲ−/ｐ５３−/ｌｏｗＨＥＲ２）を持つ乳癌組織では検出されなかった（表１及び図１ａ；下側パネル）。従って、この結果からＨＣＣＲ−１発現を乳癌の予後を予測するときに使用できることが分かる。

前記の表におけるすべての乳癌組織は、病理学的に証明された浸潤性乳管上皮癌に由来した。

酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって同定されたＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥは免疫沈澱法によってＩｎｖｉｔｒｏで確認した（図１ｂ）。同時免疫沈殿の実験によるＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥの間の相互作用を確認するために、本発明者らはＶ５タグが融合したＨＣＣＲ−１を発現するＭＣＦ−７細胞にＡｐｏＥ−Ｍｙｃ融合コンストラクトをトランスフェクションした。同時トランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞でＨＣＣＲ−１タンパク質は特異的にＡｐｏＥと同時沈殿された（図１ｂ）。また、ＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥタンパク質はＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥでトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞溶解物で発現された（図１ｂ）。このような結果は、ＡｐｏＥがＨＣＣＲ−１タンパク質と相互作用するということを証明する。

本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞でＨＣＣＲ−１のミトコンドリアの局在を検出した（図１ｃ）。一方、ＡｐｏＥは単にサイトゾル分画でのみ発見される（図１ｃ；下側パネル）。しかし、ＨＣＣＲ−１とＡｐｏＥ同時発現されたＭＣＦ−７細胞に対する細胞分画分析は、これら二つのタンパク質がミトコンドリア分画で発見され、極少量だけのＡｐｏＥがサイトゾルで発見される（図１ｃ；下側パネル）。この結果は、同時発現された細胞でＡｐｏＥタンパク質が原形質からミトコンドリアへ移動することを示し、このようなデータはこれらの相互作用をさらに証明する。また、蛍光イメージはＨＣＣＲ−１がミトコンドリアに存在し（図１ｄ；トップパネル）、ＡｐｏＥはサイトゾルに存在することを示す（図１ｄ；二番目パネル）。ＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥがミトコンドリアに同時に存在することをさらに確認するために、同時トランスフェクションされた細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｒｅｄ）で染色した（図１ｄ）。染色された細胞を共焦点顕微鏡で分析した。細胞がＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥに同時トランスフェクションされた場合、ＡｐｏＥはサイトゾルからミトコンドリアへ移動した（図１ｄ：下側パネル）。このような結果は、二つのタンパク質がミトコンドリアに同時に存在することを示す。

次に、本発明者らはヒトの正常組織、癌組織および細胞株でＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥ発現パターンを調査した。ノーザンブロット分析により、正常組織と比較すると、一次乳癌組織では増加したＨＣＣＲ−１発現がみられた（図２ａ）。ＨＣＣＲ−１は、ＢＴ−４７４（ＥＲ＋/ＰＲ＋/ｍｕｔａｎｔｐ５３/ｈｉｇｈＨＥＲ２）及びＭＣＦ−７（ＥＲ＋/ＰＲ＋/ｗｉｌｄｐ５３/ｌｏｗＨＥＲ２）細胞で多く検出されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲ−/ＰＲ−/ｐ５３−/ｌｏｗＨＥＲ２）細胞では検出されなかった（図２ａ）。ＨＣＣＲ−１発現レベルはＭＣＦ−７よりＢＴ−４７４でさらに高かった（図２ａ）。乳癌組織または細胞におけるＨＣＣＲ−１過発現に対し（図２ａ）、ＡｐｏＥ発現は殆どなかった（図２ｂ）。また、ＡｐｏＥ発現は他の八つの癌細胞株でも検出されなかった（図２ｃ）。ノーザンブロット分析は、テスト済みの１２正常組織の中で肝臓と腎臓でのみ特異的にＡｐｏＥ発現が多いことを示した（図２ｄ）。

ＡｐｏＥの成長阻害効果を測定するために、ＡｐｏＥを乳癌細胞株にトランスフェクションした。ＡｐｏＥトランスフェクションは、７日後にベクターだけをトランスフェクションしたものと比較してみると、８７％の成長阻害を誘導した（図２ｅ）。一方、ＨＣＣＲ−１にトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞成長速度は、７日後にベクターだけをトランスフェクションしたものと比較してみると、４５％増加した（図２ｅ）。ＨＣＣＲ−１にトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞にＡｐｏＥを同時トランスフェクションした場合、成長は６６％で緩和された（図２ｅ）。このような阻害効果は、ＤＮＡ断片化のようなアポトーシスと関連している（図２ｆ）。ＡｐｏＥは、乳癌で腫瘍抑制物としての役割を有するが、このような現象は、ＨＣＣＲ−１が過発現されると逆転する（図２ｅ及び２ｆ）。

ＭＣＦ−７細胞でＡｐｏＥ分泌に対するＨＣＣＲ−１の効果を調査するために、本発明者らはＡｐｏＥでトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞でＰａｎ−ＡｐｏＥ分泌を比較した。細胞培養培地で分泌されたＡｐｏＥは、ＡｐｏＥ４/Ｐａｎ−ＡｐｏＥＥＬＩＳＡキット（ＭＬＢ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で測定した。このキットは、サンドイッチＥＬＩＳＡに基づき、Ｐａｎ−ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ４を測定することができる。ＤＭＥＭで２４時間培養させた後、培地を両側で集めてＰａｎ−ＡｐｏＥ濃度を測定した。野生型細胞では少量（２８.４±０.１ｎｇ/ｍｌ）のＰａｎ−ＡｐｏＥが発見されたが、ＡｐｏＥ−トランスフェクションされた細胞ではその量が増加（３３.０±０.６ｎｇ/ｍｌ）した（図２ｇ）（Ｐ＜０.０５）。ＨｉＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅアルゴリズム（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ターゲッティングＨＣＣＲ−１を使用して考案された合成ｓｉＲＮＡ（ＨＣＣＲ−１ｓｉＲＮＡ−２）は、ＭＣＦ−７乳癌細胞でＰａｎ−ＡｐｏＥ分泌を誘導した（図２ｈ）。ＨＣＣＲ−１ｓｉＲＮＡ−２ＨＣＣＲ−１のエクソン５内の５７９−６００ヌクレトチドに該当するＨＣＣＲ−１ｓｉＲＮＡ−２は、野生型ＭＣＦ−７細胞及びＡｐｏＥでトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞でＰａｎ−ＡｐｏＥ分泌を各々誘導した（図２ｈ）。ＡｐｏＥでトランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞でＰａｎ−ＡｐｏＥ分泌は、対照群であるノン−サイレンシングｓｉＲＮＡ（３３.０±０.３ｎｇ/ｍｌ）と比較してＨＣＣＲ−１ｓｉＲＮＡ−２（５４.５±０.２ｎｇ/ｍｌ）によって、大きく増加した（図２ｈ）（Ｐ＜０.０５）。野生型ＭＣＦ−７細胞で、ＨＣＣＲ−１ｓｉＲＮＡ−２トランスフェクションはＰａｎ−ＡｐｏＥ分泌を多量（４２.４±０.３ｎｇ/ｍｌ）誘導した反面、対照群ｓｉＲＮＡトランスフェクションでの分泌は減少した（２８.３±０.３ｎｇ/ｍｌ）（図２ｈ）（Ｐ＜０.０５）。

ＡｐｏＥタンパク質は、食事や肥満のような生活習慣や生物学的因子の結合を通じて、乳癌の危険を調節することもできる。肥満は全世界的に急激に増加している。たとえ肥満が腫瘍の発生を誘導または促進するメカニズムが癌の位置によって異なるとしても、力学的研究において、肥満と癌のタイプの範囲は関連がある。肥満は、閉経後の女性に乳癌の速度を３０−５０％増加させると知らされている（Ｂａｌｌａｒｄ−Ｂａｒｂａｓｈ、他ＡｍＪＣｌｉｎＮｕｔｒ６３（Ｓｕｐｐｌ. ３）、４３７−４４１（１９９６）；Ｔｒｅｎｔｈａｍ−Ｄｉｅｔｚ、Ａ．他ＡｍＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ１４５、１０１１−１１１９（１９９７））。肥満は内因性エストロゲンの代謝と生体利用性に影響を与えて、乳癌の危険に影響を与える。

ＨＣＣＲ−１はトランスジェニックマウスで深刻な肥満を誘導した。肥満マウスは３世代以上繁殖し、同一の性別と年齢のマウスに比して、３倍程度の重さがあった（図３ａ）。特に、肥満は同一の年齢の雌（図３ａ；右側パネル）より雄のトランスジェニックマウスでさらに深刻であった（図３ａ；左側パネル）。雄の肥満マウスの体重は同じ年齢の正常マウス（２４.５±１.０ｇ）に比して、６２.２±３.７ｇであった（図３ａ；左側パネル）（Ｐ＜０.０００１）。また、同一の年齢の雌肥満マウス（４３.１±１.３ｇ）と正常マウス（２１.７±１.５ｇ）にも相当な体重の差が存在した（図３ａ；右側パネル）（Ｐ＜０.０００１）。

肥満マウスは、腹腔膜、肝臓、膵臓及び心臓を含む病理学的疾患を見せた（図３ｂ）。形質転換雄の腹腔膜は、多量の脂肪と脂肪細胞の肥大を見せた（図３ｂ；トップパネル）。肝臓は、肝臓細胞で消泡性及び大砲性（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ）の脂肪変化の拡散を見せた（図３ｂ；トップパネル）。形質転換雄の膵臓は、それらの数と大きさが増加するランゲルハンス島の島細胞の過形成を示した（図３ｂ；トップパネル）。心臟瓣膜は、中道粘液性変化及び肥大を見せた（図３ｂ；トップパネル）。形質転換雄と比較して、形質転換雌は単に少量の液胞変化がある脂肪変化が少ない腹腔膜の適度な細胞の大きさと体積を見せた（図３ｂ；２番目パネル）。また膵臓の島細胞の過形成及び心臟瓣膜の粘液性変化を少なく示した（図３ｂ；２番目パネル）。これらの異常は正常的な対照群の雄では観察されなかった（図３ｂ；下パネル）。

ＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥ発現プロファイルは、対照群及びトランスジェニックマウスから由来したいくつかの組織で構成されたウェスタンブロットで互いに対比した（図３ｃ）。例えば、ＡｐｏＥは脳、肺、肝臓、腎臓、腸、腹腔のような対照群マウスの組織では高発現されたが、トランスジェニックマウスから由来した同一の組織では非常に少なく発現されるかあるいは発現されなかった。一方、ＨＣＣＲ−１レベルは形質転換雄及び雌マウスでは過発現されたが、対照群のこれら組織では非常に少なく発現されるかあるいは発現されなかった。このＨＣＣＲ−１及びＡｐｏＥの相互排他的な発現パターンは、図２ａ及び図２ｂのデータを想起させ、これはそれらが異なるように、しかし反対的な生物学的結果を得るシグナル経路によって、協力的な形態に調節されることを示す。

肥満雄マウスで全体コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセライドのレベルは、同一年齢の正常対照群マウスと比較して大きく増加した（Ｐ＜０.０５）。肥満雄マウスで全体コレステロール（１８４.８±５.４ｍｇ/ｄｌ）、ＨＤＬコレステロール（１５２.９±０.４ｍｇ/ｄｌ）、ＬＤＬコレステロール（４６.７±０.７ｍｇ/ｄｌ）及びトリグリセライド（２１.９±２.３ｍｇ/ｄｌ）のレベルは正常マウスよりＨＣＣＲ−１形質転換雄マウスで各々４.２、４.０、３.８及び２.７倍増加した（図３ｄ）（Ｐ＜０.０５）。正常雄マウスで全体コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセライドのレベルは、各々４３.８±１.０ｍｇ/ｄｌ、３８.４±１.０ｍｇ/ｄｌ、１２.３±０.６ｍｇ/ｄｌ及び８.０±０.１ｍｇ/ｄｌであった。

しかし、同一年齢の肥満マウスと正常マウスとの間にＡｐｏＥ及びレプチンの大きい差はなかった（図３ｄ）。肥満雄、肥満雌及び正常対照群マウスでＡｐｏＥのレベルは各々０.９±０.１ｍｇ/ｄｌ、０.９±０.１ｍｇ/ｄｌ及び１.４±０.３ｍｇ/ｄｌであった（図３ｄ）。また、肥満雄、肥満雌及び正常対照群マウスでレプチンのレベルは、各々０.３±０.１ｎｇ/ｄｌ、０.３±０.１ｎｇ/ｄｌ及び０.３±０.１ｎｇ/ｄｌであった（図３ｄ）。血清インスリンのレベルは、形質転換肥満マウスと対照群マウスとの間に差がなかった（図３ｄ）。肥満雄、肥満雌及び正常対照群マウスでインスリンのレベルは各々２.３±０.６μＩＵ/ｍｌ、２.０±０.３μＩＵ/ｍｌ及び２.０±０.６μＩＵ/ｍｌであった。

以上において、本発明は、ＨＣＣＲ−１が他の公知になった予後マーカーと共に乳癌の新しい予後マーカーとして使用され得ることが分かる。また、ＨＣＣＲ−１タンパク質がＡｐｏＥと直接的な結合を通じて増殖抑制作用を阻害して、腫瘍を起こし、従ってＡｐｏＥ活性をネガティブに阻害することが分かった。さらに重要なことは、ＨＣＣＲ−１トランスジェニックマウスの中で、特に雄のマウスで肥満が発生されることである。多様な癌のタイプと肥満の関係に対する証拠の発生と関連し、本発明者らはＨＣＣＲ−１が末梢性細胞から肝臓へのコレステロール除去と関連するＡｐｏＥと相互作用をし、ＨＣＣＲ−１に対するトランスジェニックマウスは、乳癌だけでなく肥満と関連されている病理学的欠陥を示すことを見付けた。従って、本発明により、女性に多く発生する疾患である乳癌と肥満に対する治療戦略を立てることができ、特に、ＨＣＣＲ−ＡｐｏＥ相互作用を目的とする薬品の開発が可能となる。

以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１：組織と細胞株
ヒト正常組織及び癌組織は手術中に得た。すべての患者の個別同意を受けた。組織サンプルの使用は、病院の倫理委員会から承認を受けた。哺乳類細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、有線由来ヒト乳癌細胞株である。ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は低ＨＥＲ２を発現し、ＢＴ−４７４細胞は高ＨＥＲ２を発現する。ＢＴ−４７４及びＭＣＦ−７細胞はＥＲ−ポジティブであり、ＰＲ−ポジティブ細胞である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＥＲ−ネガティブであり、ＰＲ−ネガティブ細胞株である。ＭＣＦ−７細胞は野生型ｐ５３を有し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はヌルタイプｐ５３を有する。ＢＴ−４７４細胞は突然変異されたｐ５３を有する。

実施例２：発現ベクター設計及びＤＮＡトランスフェクション
ＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥのコード領域を含む発現ベクターは次の通り設計された。

先ず、ＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥｃＤＮＡを含む原核生物発現ベクターであるｐＣＥＶ−ＬＡＣからＳａｌＩ切片を分離した。その後、ｐｃＤＮＡ３.１−Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）またはｐｃＤＮＡ３.１−Ｍｙｃ−ＨｉｓをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ処理してＳａｌＩを有するコンパチブルカンファタブル末端を作った。ＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥコード配列を含有したＳａｌＩ切片をＸｈｏＩ−処理されたｐｃＤＮＡ３.１.Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に挿入して、乳癌細胞にＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥ発現ベクターを挿入するときに使用した。簡単に要約すると、２×１０^５個の細胞を６０ｍｍ組織培養ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）にシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。湿式５％のＣＯ_２培養基で一夜培養後、その細胞を１５ｍｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬と５ｍｇＤＮＡを含む１５０ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ＤＮＡ複合体で処理した。各々の細胞を０.６ｍｇ/ｍｌＧ４１８に対して抵抗性を示すものを選択した。選択されたトランスフェクタントをウェスタンブロットによってＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥ発現をスクリーニングした。

実施例３：酵母ツーハイブリッドスクリーニング及びベータガラクトシダーゼ分析
ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＬｅｘＡツーハイブリッドシステムをＨＣＣＲ−１融合タンパク質に結合できるヒト皮脱脳ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）からタンパク質を同定するために用いた。すべての実験はレポーターでｌａｃＺ及びｌｅｕ遺伝子を発現するｐ８ｏｐ−ｌａｃＺに形質転換された酵母菌株ＥＧＹ４８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で行った。本発明者らはＬｅｘＡＤＮＡ−結合ドメインを含む酵母ツーハイブリッドベクター（ｐＬｅｘＡ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＨＣＣＲ−１ｃＤＮＡ切片を挿入した。ＬｅｘＡ−ＨＣＣＲ−１を発現する酵母細胞はＢ４２ＡＤ融合タンパク質を発現するヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。ライブラリー形質転換後の細胞を、ＡＤ融合タンパク質の検出機会を改良するために、ベイト（ＨＣＣＲ−１）及びＡＤ/ライブラリープラスミド全てに対して選択する最小合成ドロップアウトナンインダクション培地（シグマ）にプレートした。ＨＣＣＲ−１と結合タンパク質ＡｐｏＥとの間の相互作用を確認するために、ＨＣＣＲ−１とＡｐｏＥを発現するプラスミドを酵母細胞に同時に形質転換した。

実施例４：同時−トランスフェクション及び免疫沈殿
ＨＣＣＲ−１−Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）融合タンパク質及びＡｐｏＥ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコードするｐｃＤＮＡ３.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で細胞をトランスフェクションさせた。４８時間後、その細胞を集めて溶解バッファーでライシスした。その溶解液を３０分間免疫前血清（マウス）及び４℃のタンパク質Ａ−セファロスで予め浄化した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析試薬キット（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により標準の牛血清アルブミンを使用して決定した。予め浄化された細胞破砕液アリコート（１ｍｇ）を１：５００希釈液の抗−Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または１：２５０希釈液の抗−Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｍＡｂ及び４０ｍｌの１：１タンパク質Ａ−セファロースビーズスラリ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で４℃のＰＢＳで１６時間培養した。免疫複合体を遠心分離（２,０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃）で集め、バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７.５、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、１０％のグリセロール及び１％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）で４回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＴＢＳで１：１０００希釈液の抗−Ｍｙｃまたは１：３０００希釈液の抗−Ｖ５抗体でウェスタンブロットを行った。

実施例５：細胞内局在
細胞内局在決定をミトコンドリア分離キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって行った。簡単に要約すると、細胞を８５０×ｇで２分間遠心分離して収集し、そのペレットを８００μｌ試薬Ａで浮遊させた後、正確に２分間氷で維持させた。１０μｌの試薬Ｂを前記浮遊液に添加し、毎分最大スピードでボルテックスしながら５分間氷で維持させた。８００μｌ試薬Ｃを前記溶液に添加し、混合するためにチューブを３〜４回振った。その溶液を４℃で１０分間７００×ｇで遠心分離し、そのペレットを粗核分画に使用した。上澄み液を４℃で１０分間１２,０００×ｇで遠心分離し、原形質分画のために新しいチューブにその上澄み液を移した。そのペレットを５００μｌ試薬Ｃで洗浄し、分離されたミトコンドリア分画に使用した。各分画はＢＣＡタンパク質分析試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）で定量した。サンプルバッファーで沸かした抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行って、標準方法によってニトロセルロースに移した。膜を０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ（ｐＨ７.４）内の５％脱脂牛乳でブロットキンし、ミトコンドリア位置マーカーに対する一次抗体である抗−Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、抗−ｃ−Ｍｙｃ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）または抗−ＶＤＡＣ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で培養した。

実施例６：免疫蛍光及び蛍光顕微鏡
カバースリップをＨＣｌ、蒸溜水で３回及び１００％エタノールで２回洗浄した。その後、乾燥したカバースリップを５μｇ/ｍｌＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ., ＭＯ）で３７℃で一夜コーティングした。ＭＣＦ−７細胞を６ウェルプレートで予めコーティングされたカバースリップの上にシーディングした。その後、一日培養後にその細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｐＥＧＦＰ−ＨＣＣＲ−１及びｐＥＧＦＰ−ＡｐｏＥで一時的にトランスフェクションした。さらに２４−２８時間培養し、その細胞を２５ｎＭＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で３７℃で１５分培養した。細胞を固定する前に２ｍｌＰＢＳで３回洗浄した。その後、カバースリップ上の細胞を４℃で１０分間４％のスクロスを含む４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞を−２０℃で１分間１００％のメタノールで処理してＰＢＳで３回洗浄した。ＧＦＰ染色のために、細胞をＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅ試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して固定させた。蛍光イメージをＢｉｏ−ＲａｄＭＣＲ−１０２４ＭＰレーザースキャニング共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して分析して得た。

実施例７：免疫染色化学分析及び染色の解釈
免疫染色化学実験のために、ヒト正常乳房及び乳癌組織のパラフィン切片（５μｍ厚さ）を使用した。その切片を親和−精製されたポリクローナル抗−ＨＣＣＲ−１抗体で２時間培養した。アミノエチルカボゾル（ＡＥＣ）を発色原として使用した。免疫染色後の切片をヘマトキシリンで染色した。病理学者がＥＲ、ＰＲ及びｐ５３に対する最も活性的な染色地域で少なくとも５００腫瘍細胞を計数した。ＥＲ、ＰＲ及びｐ５３に対する陽性染色を核染色として定義した。大体、認められるカットオフ値によって腫瘍細胞の１０％陽性染色をＥＲ、ＰＲ及びｐ５３に対する陽性結果として使用した。ＨＥＲ２免疫化学染色の結果を染色基準によって定義した。ＨＥＲ２に対する陽性染色を膜染色で定義した。原形質染色は陽性と見なさなかった。免疫反応性がないか（スコア０）、不完全であるか、薄い膜染色（スコア１＋）を見せる腫瘍細胞を陰性と見なした。ＨＥＲ２は、完全な弱から中間の膜染色（弱い陽性；スコア２＋）または完全な強い膜染色（強い陽性；スコア３＋）が１０％以上の腫瘍細胞で観察される場合、陽性と定義した。

実施例８：ノーザンブロット分析
ＨＣＣＲ−１ｃＤＮＡまたは９５４−ｂｐ全長ＡｐｏＥｃＤＮＡを使用して、色々なヒト組織でＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥ発現を調査するために、ノーザンブロット分析を行った。ｍＲＮＡ発現のレベルをベータ−アクチンの発現レベルと比較して、定量化した。

実施例９：サンドイッチＥＬＩＳＡによる培養上澄み液からＡｐｏＥ検出
乳癌細胞の増殖期の間、ＡｐｏＥ生成の力学を研究するために、１０^６個の細胞をＦＢＳ（１０％）を有するＤＭＥＭ下の７５−ｃｍ^２で８日間繁殖させた。５０ｍｌの培地アリコートを８日間、毎２４時間ごとに収集してＡｐｏＥ濃度測定時まで−２０℃で維持した。ＡｐｏＥ濃度を商業的なキット（ＭＬＢＡｐｏＥ４/Ｐａｎ−ＡｐｏＥＥＬＩＳＡｋｉｔ、ＭＢＬＣｏ.，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。ＭＢＬＡｐｏＥ４/Ｐａｎ−ＡｐｏＥＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬＣｏ.，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）は、サンドイッチＥＬＩＳＡによってヒトＡｐｏＥ４またはＰａｎ−ＡｐｏＥを測定した。その分析には、ＡｐｏＥに対する親和精製された多重クローン抗体及びＡｐｏＥ４に対するモノクローナル抗体を用いた。

実施例１０：ＤＮＡ断片化分析
ＨＣＣＲ−１またはＡｐｏＥ−トランスフェクションされた乳癌細胞、ｐｃＤＮＡ３.１だけトランスフェクションされた細胞及び野生型細胞を各々３、５及び７日間培養した後収集した。そしてその細胞を溶解して１００μｇ/ｍｌプロテイナーゼＫを含有する溶解バッファーで４８℃でオーバーナイト処理した。１/５体積の５ＭＮａＣｌ及び同一体積のイソプロピルアルコールを添加してＤＮＡを沈殿させた。そのＤＮＡペレットをＴＥバッファーに再溶解させ、０.１ｍｇ/ｍｌのＲＮａｓｅＡでｆｏｒ１ｈａｔ３７℃で１時間処理した。各サンプルに対して１０μｇＤＮＡを２％のアガロースゲルで分画し、エチジウムブロマイドで染色して紫外線下で観察した。

実施例１１：トランスジェニックマウスの生産
トランスジェニックマウスは、Ｖａｔｔｅｎ, Ｌ.Ｊ. ＆Ｆｏｓｓ, Ｏ.Ｐ. ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５０, ２３４１−２３４６（１９９０）に記載されたように標準前核微細注入法を使用して製造した。微細注入のために、トランスジーンの切片であるＨＣＣＲ−１をＮｒｕＩ及びＸｍｎＩダブルダイジェスチョンによってｐｃＤＮＡ３.１−Ｖ５−Ｈｉｓのベクター骨格なしに分離した。ＣＭＶ−ＨＣＣＲ−１−ｂＧＨの注射された切片を分離し、イレクトロイルージョン及び透析を通じて、分離及び精製して最終濃度２ｎｇ/ｍｌＤＮＡ注入バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ/０.１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）で薄めて、Ｃ５７ＢＬ/６Ｎ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＪａｐａｎ）からの単一細胞−ステージ修正胚芽の前核に微細注入した。その後、微細注入で生存した２０−２５個の注射されたＤＮＡ受精卵を注射後２−３時間または翌日に記載のように収容体ＣＤ−１（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＪａｐａｎ）マウスの輸卵管の中に移植した。ポテンシャル形質転換ファウンダ動物を３週令で離乳させ、ＰＣＲを使用してＨＣＣＲ−１トランスジーンの存在に対する標準プロトコールで製造されたマウステイルゲノムＤＮＡをスクリーニングして同定し、永続的な系統を開発するために野生型に育つようにした。

実施例１２：統計分析
体重及びＡｐｏＥ、全体コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、トリグリセリド、レプチン及びインスリンの血清濃度は平均±Ｓ.Ｄで示した。ｔ検定及びＤｕｎｎｅｔｔ’ｓマルチプル比較をすべての統計分析に使用した。

ここに前記のように記載されたように、本発明のＨＣＣＲ−１は、乳癌の予後マーカー及び/または肥満を誘導する組成物として、優れた効果を有している。

Claims

ＨＣＣＲ−１タンパク質を含む乳癌予後マーカーとして使用する、組成物。
前記組成物がＥＲ、ＰＲ、ｐ５３遺伝型及びＨＥＲ２タンパク質からなる群より選択される一つ以上の薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＣＣＲ−１タンパク質の配列が配列番号１に記述されている、請求項１に記載の組成物。
ＨＣＣＲ−１タンパク質を含む、肥満誘導用組成物。
ＨＣＣＲ−１タンパク質で形質転換された、肥満トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
前記哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、羊、牛、ヤギ及び豚からなる群より選択される、請求項５に記載の肥満トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
前記ＨＣＣＲ−１タンパク質の配列が配列番号１に記述されている、請求項４または５に記載の組成物。