ES2628150T3 - Métodos y productos para pronosticar la evolución clínica o predecir el riesgo de recidiva de una lesión papilar de mama - Google Patents
Métodos y productos para pronosticar la evolución clínica o predecir el riesgo de recidiva de una lesión papilar de mama Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos y productos
Description
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DESCRIPCION
Metodos y productos para pronosticar la evolucion clmica o predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos in vitro y productos para pronosticar la evolucion clmica, o predecir el riesgo y tipo de recidiva, de una lesion papilar de mama, que son utiles como herramienta para seleccionar el tratamiento y seguimiento mas adecuados para cada paciente.
Antecedentes de la invencion
El cancer es uno de los principales problemas sanitarios a escala mundial. De acuerdo con la base de datos GLOBOCAN, administrada por la Agencia Internacional de Investigacion en Cancer, perteneciente a la Organizacion Mundial de la Salud, durante el ano 2000 se diagnosticaron mas de 10 millones de casos de cancer en todo el mundo y el numero de muertes debidas al cancer el mismo ano fue superior a 6 millones de personas.
Las celulas tumorales durante el proceso de hacerse malignas cambian su patron de expresion genica, lo que altera procesos celulares, tales como el mantenimiento de la arquitectura celular, la adhesion celular, la muerte celular y la proliferacion celular. Estas modificaciones no solo generan cambios en las propias celulas, sino que hacen que algunas celulas del estroma reciban senales moleculares alteradas y cambien su patron de comportamiento y su patron de expresion genica, adquiriendo una morfologfa tfpica de miofibroblastos. Las moleculas que secretan estos miofibroblastos en respuesta al tumor adyacente pueden, a su vez, contribuir de manera distinta a estimular el crecimiento e invasion tumorales, de manera que se establece un bucle paracrino entre el tumor y el estroma. En los ultimos anos las evidencias cientificas apuntan, cada vez con mayor precision, a que el estroma peritumoral es uno de los principales inductores de la invasividad tumoral y de fenomenos relacionados con la resistencia a la terapia.
Los metodos y productos para diagnostico que los presentes inventores reivindican, estan comprendidos en este novedoso marco de investigacion, debido a que estan basados en el uso del gen colllal y de la protema proCOL11A1, presente en las celulas del estroma de carcinomas invasivos, como un posible marcador para la clasificacion de papilomas intraductales de mama, de acuerdo con su tendencia a evolucionar a un tumor maligno.
El cancer de mama es la neoplasia con mayor tasa de incidencia y mortalidad entre las mujeres, por lo tanto, el diagnostico precoz y el tratamiento son de vital importancia. En los ultimos anos, con la aparicion de la genetica en la medicina (en particular en la oncologfa medica), se han realizado diversos descubrimientos que influyen en el pronostico y tratamiento del cancer de mama, lo que ha llevado a reclasificar esta patologfa en cuanto a su perfil genetico; los descubrimientos mas significativos han sido sobre el componente epitelial de estos tumores, fundamentalmente los factores de crecimiento epidermico (EGFR y Her-2), que se han convertido en dianas terapeuticas al igual que los receptores de estrogenos y progesterona (Perou C., Sorlie T., Eisen M., 2000, Nature, 406:747-752; Nielsen T., Hsu F., Jensen K., 2004, Clin. Cancer Res, 10:5367-5374). Ademas, se han desarrollado una serie de marcadores inmunohistoqmmicos que son muy utiles para diferenciar entre lesiones benignas y malignas en los casos en que las tecnicas histoqmmicas convencionales son insuficientes. En la mama existen lesiones benignas esclerosantes, principalmente la adenosis esclerosante y la cicatriz radial que, en ocasiones (debido a su patron morfologico), provocan dificultades en el diagnostico diferencial con lesiones malignas infiltrantes (tales como el carcinoma ductal infiltrante y el carcinoma tubular ); esta situacion es aun mas compleja en la biopsia con aguja gruesa, debido a que al no existir una representacion completa de la lesion no se pueden observar sus contornos, lo cual es una de las claves para el diagnostico diferencial, en particular cuando con las tincion convencional no se pueden reconocer las celulas basales mioepiteliales presentes en las lesiones benignas y ausentes en las lesiones malignas infiltrantes.
Existen marcadores inmunohistoqmmicos (tales como la p63, la a-actina, las cadenas pesadas de la miosina de musculo liso, la calponina, la protema s100 o el CD10) que tinen las celulas mioepiteliales de los conductos mamarios, lo que ayuda a diferenciar entre este tipo de lesiones. Entre estos marcadores, la a-actina, las cadenas pesadas de la miosina de musculo liso y la calponina, presentan una alta sensibilidad (89 %) para las celulas basales mioepiteliales; sin embargo, no son espedficas de estas y tinen tambien las celulas musculares lisas vasculares y los miofibroblastos estromales; se presentan problemas similares con s100 y CD10 (Lerwill, M.F., 2004, Am J Surg Path, 28:1076-1091). Werling et al. (Werling, R. W., Hwang, H., Yaziji, H., 2003, Am J Surg Path, 27:8290) estudiaron una serie de casos correspondientes a adenosis esclerosante, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobulillar y carcinoma ductal in situ, analizando el patron de reactividad de los anticuerpos p63, la miosina de musculo liso y la calponina, demostrando que todos ellos tefnan las celulas mioepiteliales de los casos benignos y malignos no infiltrantes, corroborando a su vez la positividad para la miosina y la calponina en miofibroblastos y celulas musculares lisas vasculares. En ese artmulo, p63 fue el marcador que menor reactividad cruzada presento con los fibroblastos estromales, sin tenir ninguno de ellos, lo cual revelo su alta sensibilidad y especificidad para tenir celulas mioepiteliales en comparacion con los otros anticuerpos estudiados; no obstante, tema varias desventajas tales como la tincion en ocasiones discontinua de las celulas mioepiteliales (en particular en los carcinomas in situ)
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as^ como positividad focal hasta en el 11 % de los casos de las celulas tumorales. Meryem et al. describieron, por otra parte, que p63 fue positivo en 13 de un total de 14 casos de carcinoma de mama metaplasico (Meryem, Koker, M., Kleer, C.G., 2004, Am J Surg Path, 28:1506-1512). Actualmente p63 es uno de los marcadores mas usados para el diagnostico diferencial entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de la mama; sin embargo, hasta la fecha no hada ningun marcador estromal que ayudara a diferenciar entre estas lesiones (Mattia Barbareschi, M., Pecciarini L., Cangi G., 2001, Am J Surg Path, 25:1054-1060).
Entre las lesiones de mama, las lesiones que tienen una arquitectura papilar (papiloma intraductal, papilomatosis, papiloma atfpico y carcinoma papilar intraductal) son las mas diffciles de diagnosticar (Collins, L.C. y S.J. Schnitt, Histopathology, 2008. 52(1):20-9). Dada su similitud, el diagnostico correcto de estas lesiones solo mediante morfologfa puede ser complicado, por lo que el anatomopatologo recurre a marcadores diferenciales. El principal indicador de la invasividad de una lesion papilar es la presencia o ausencia de celulas mioepiteliales (Ueng, S.H., et al. Arch Pathol Lab Med, 2009. 133(6):893-907), las cuales que se pueden observar mediante tincion inmunohistoqmmica de los marcadores tratados en el parrafo anterior (Mulligan, A.M. y F.P. O'Malley, Adv Anat Pathol, 2007. 14(2):108-19). Tambien se han utilizado los receptores de estrogenos (Mulligan y O'Malley, citado anteriormente) o distintas citoqueratinas tales como CK5/6 y cK8 (Moumen, M., et al. Int J Dev Biol, 2011. 55(7- 9):763-71). Sin embargo, aunque estas tecnicas ayudan en el diagnostico, no hay un consenso claro respecto la sensibilidad y la precision de estos marcadores (Ueng, S.H., et al. Arch Pathol Lab Med, 2009. 133(6):893-907; Shouhed, D., et al. Am Surg, 2012. 78(10):1161-5).
De todas las lesiones papilares de la mama, el papiloma intraductal es la patologfa que mas discrepancias genera, en cuanto al diagnostico y el tratamiento (Mulligan y O'Malley citado anteriormente). Este desacuerdo se debe principalmente a que, aunque el papiloma intraductal es de por sf una lesion benigna, la asociacion entre el papiloma intraductal y la recidiva en forma de patologfas malignas es bastante alta, llegando hasta el 33 % si la lesion inicial posee atipias (Ueng, S.H., et al. Arch Pathol Lab Med, 2009. 133(6):893-907; Ahmadiyeh, N. et al., Ann Surg Oncol, 2009,16(8):2264-9; Valdes, E.K., et al. Ann Surg Oncol, 2006. 13(4):480-2; Rosen, Papilloma and related benign tumors, en Rosen's breast pathology, R. PP, Editor. 2009, Williams & Wilkins: Philadelphia. pag. 85-136).
De hecho, existe gran controversia sobre como proceder cuando se diagnostica un nuevo caso, dado que existen grupos que abogan por una extirpacion completa de la lesion en todos los casos (Rizzo, M., et al., Ann Surg Oncol, 2008. 15(4):1040-7) o solo en los casos en los que se presenten atipias o papilomas multiples (Agoff, S.N. y T.J. Lawton, Am J Clin Pathol, 2004. 122(3):440-3.; Rosen, E.L., et al., AJR Am J Roentgenol, 2002. 179(5):1185-92).
Es esencial el diagnostico correcto de los papilomas que tienen un comportamiento presumiblemente maligno y el de los benignos (Mulligan y O'Malley citado anteriormente; Choi, Y.D., et al., Acta Cytol, 2006. 50(1):35-40; Gomez- Aracil, V., et al., Cytopathology, 2002. 13(1):22-30), no solo por el bienestar del paciente, debido a que se evitanan intervenciones innecesarias, sino, mas bien, debido a su repercusiones economicas. Marcadores tales como CD44 (Tse, G.M., et al., J Clin Pathol, 2005. 58(11):1185-8) o la ciclina D1 (Saddik, M., et al., Arch Pathol Lab Med, 1999. 123(2):152-6) se han propuesto como genes expresados de forma diferencial entre las distintas lesiones papilares malignas y benignas, pero no existe una correlacion con la recidiva maligna de los papilomas intraductales. Tambien se han propuesto en algunas publicaciones alteraciones geneticas en los papilomas intraductales que son capaces de predecir una mayor susceptibilidad a la recidiva maligna, tal como la perdida de heterocigosidad (PDH) en el cromosoma 16 (Yoshida, M., et al., Virchows Arch, 2012. 460(5):497-504). Sin embargo, debido a problemas que son intrmsecos a la propia tecnica, la ausencia de PDH no implica un diagnostico benigno.
Sigue existiendo, por lo tanto, la necesidad de desarrollar metodos y productos para predecir recidivas de las lesiones papilares de mama, en particular, las recidivas del papiloma intraductal de mama, bien en papilomas benignos o, ventajosamente, en recidivas con evolucion maligna a carcinomas. Dichos metodos y productos senan herramientas utiles para pronosticar la evolucion clmica y/o para predecir el riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama, asf como para seleccionar el tratamiento y seguimiento que sean los mas convenientes para cada paciente (sujeto diagnosticado de lesion papilar de mama) y/o para seleccionar un paciente (sujeto diagnosticado de lesion papilar de mama) para un tratamiento espedfico. De forma adicional, podnan utilizarse dichos metodos y productos para clasificar las lesiones papilares de mama, en concreto, los papilomas intraductales de mama, de acuerdo con su riesgo de recidiva y de hacerse malignas.
El colageno es el principal componente de la matriz extracelular (MEC). La adecuada expresion de los genes que codifican los distintos tipos de colageno es necesaria para el adecuado ensamblaje de la MEC durante el desarrollo embrionario y para el mantenimiento de la misma en el organismo adulto. El colageno XI (COL11) es un tipo de colageno que se ha estudiado poco, pero desempena un papel fundamental en la regulacion de las redes fibrilares en matrices cartilaginosas y no cartilaginosas (Li, Y., et al., Cell, 1995, 80:423-430); estas redes de fibras estan implicadas en distintos procesos de morfogenesis durante el desarrollo embrionario en los vertebrados. Se han encontrado transcritos de la cadena alfa 1 (XI) del colageno (COL11A1) durante el desarrollo fetal en tejidos cartilaginosos y tambien en otros tejidos tales como hueso, rinon, piel, musculo, lengua, intestino, dgado, ofdo, cerebro y pulmon (Sandberg, J.M., et al., Biochem. J., 1993, 294:595-602; Yoshioka, H., et al., Dev. Dyn., 1995, 204:41-47). La matriz extracelular tambien desempena un papel importante en determinados procesos biologicos, tales como la diferenciacion, proliferacion y migracion celular; por lo tanto, la desregulacion de la expresion de los
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genes que codifican las protemas que componen la matriz celular esta asociada a procesos carcinogenicos y metastasicos (Boudreau, N. y Bissell, M.J., Curr. Opin. Cell Biol., 1998, 10:640-646; Stracke, M.L., et al., In vivo, 1994, 8:49-58). En el caso particular de COL11A1, se ha demostrado que los fibroblastos del estroma tienen niveles elevados de expresion del gen colllal en carcinomas colorrectales esporadicos, mientras que este gen no se expresa en colon sano (Fischer, H., et al., Carcinogenesis, 2001,22:875-878). Se ha asociado tambien la expresion del gen col11a1 a cancer de pancreas, mama, colon, pulmon, cabeza y cuello (Kim, H. et al., BMC Medical Genomics, 2010, 3:51; lacobuzio-Donahue, C., Am. J. Pathology, 2002, 160(4):1239-1249; Ellsworth, R.E., et al., Clin. Exp. Metastasis, 2009, 26: 205-13; Feng, Y., et al., Breast Cancer Res. Treat., 2007, 103(3):319-329; J. Gast. Liv. dis., 2008; Fischer, H., et al., BMC Cancer, 2001, 1:17-18; Fischer, H., et al., Carcinogenesis, 2001,22:875-878; Suceveanu, A.I., et al., J. Gastrointestin. Liver Dis, 2009, 18(1):33-38; Chong, IW, et al., Oncol Rep, 2006, 16(5):981- 988; Whan, K., Oncogene, 2002, 21:7598-7604; Schmalbach., C.E., et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 2004, 130(3):295-302) y vejiga (documento WO 2005/011619) y la expresion de la protema COL11A1 se ha asociado a cancer de pancreas y de colon (Pilarsky, C., et al., J. Cel. Mol. Med., 2008, 12(6B):2823-35; Erkan, M., et al., Mol. Cancer, 2010, 9:88-103; Bowen, K.B., et al., J. Hist. Cyt., 2008, 56(3):275-283).
Recientemente se ha descrito el uso de la protema proCOL11A1 como un marcador diferencial entre el carcinoma escamoso infiltrante de cabeza y cuello y las patologfas benignas de cabeza y cuello (Garda-Ocana et al., Poster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, Ill Simposio Internacional del IUOPA, Oviedo); como un marcador diferencial entre el adenocarcinoma ductal infiltrante de mama y la adenosis esclerosante (Garda Pravia et al., Resumen ESSR2009/218, “Anti- proCOL11A1, a new marker of infiltrating breast cancer”, British J. Surgery, 2009, 96 (S5):11; Garda-Ocana et al., Poster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, citado anteriormente) y como marcador diferencial entre el adenocarcinoma ductal pancreatico y la pancreatitis cronica (Garda Pravia et al., Resumen ESSR2009/272, “ProCOL11A1 is an efficient marker of pancreatic cancer” Bristish J. Surgery, 2009, 96 (S5):17; Garda-Ocana et al., Poster “Immunohistochemical validation of procollagen COL11A1 as a desmoplastic tumor stroma marker”, 18 de noviembre de 2010, citado anteriormente)).
Recientemente se ha desarrollado un anticuerpo monoclonal dirigido de forma espedfica a la protema proCOL11A1 y valido para la deteccion de dicha protema mediante inmunohistoqmmica, identificado como 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54).
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia objeto identificada en la solicitud como “invencion”, “realizacion”, “aspecto”, etc., que exceda el ambito de la invencion, segun se representa en las reivindicaciones, no forma parte de la invencion reivindicada y solo sirve como informacion anterior para entender mejor la invencion.
Los inventores de la presente invencion han descubierto, mediante analisis inmunohistoqmmico de papilomas intraductales de mama empleando el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54, que la protema proCOL11A1 se expresa en papilomas intraductales de mama que tienen capacidad de mostrar un comportamiento agresivo, y no se expresa en los papilomas intraductales de mama que muestran un comportamiento benigno.
Esta evidencia hace a dicho anticuerpo espedfico de proCOL11A1 en un anticuerpo adecuado para el desarrollo de nuevos metodos y productos in vitro para el diagnostico y/o pronostico de lesiones papilares de mama, mas particularmente, para pronosticar la evolucion clmica y predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, tal como un papiloma intraductal de mama, sobre los que basar la decision terapeutica para cada paciente diagnosticado de una lesion papilar de mama. En concreto, la invencion proporciona unos metodos y productos para la identificacion in vitro, espedfica y con alta sensibilidad, de las lesiones papilares de mama, en particular los papilomas intraductales de mama, con riesgo de evolucion hacia lesiones potencialmente agresivas, y que son susceptibles de ser resecados de forma completa en el momento del diagnostico y sometidos a un seguimiento posterior mas exhaustivo, y para distinguirlos de las lesiones papilares de mama benignas, en particular, los papilomas intraductales de mama que son benignos y que no precisan una estrategia terapeutica agresiva.
En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para pronosticar la evolucion clfnica y/o predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, seleccionado del metodo (A) y el metodo (B), en donde
A) el metodo (A) comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1;
en donde
- la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o
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- la no deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo, y
B) el Metodo (B) comprende
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;
en donde
- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLl1A1 en una muestra de control es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o
- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama, mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para evitar la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion precoz de la posible recidiva, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, la presencia de la protema proCOL11A1; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;
en donde dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento:
- si se detecta la presencia de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en la muestra de control.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para un tratamiento seleccionado de un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOLIlAl; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOLIlAl en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;
en donde dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento:
- si no se detecta la presencia de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en la muestra de control.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOLIlAl; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOLIlAl en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;
en donde dicho tratamiento se selecciona de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos, en donde dicho tratamiento se selecciona:
- si se detecta la presencia de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOLIlAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en la muestra de control.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de la protema proCOLIlAl como un marcador para pronosticar la evolucion clmica, o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
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En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo espedfico que reconoce la protema proCOL11A1 como un marcador para pronosticar la evolucion clmica, o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit que comprende un reactivo que reconoce la protema proCOLIlAl, o un reactivo para la deteccion y/o cuantificacion de la expresion del gen colllal, para pronosticar la evolucion clmica, o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de la inmunotincion para proCOL11A1 en una muestra que es negativa para papiloma intraductal de mama (A) que no presenta recidiva y en una muestra que es positiva para papiloma intraductal de mama (B) que presenta recidiva en forma de carcinoma ductal de mama infiltrante. En el Ejemplo 1 puede encontrarse informacion adicional.
La Figura 2 es un diagrama de barras que muestra el numero de casos clasificados de acuerdo con su inmunomarcaje para proCOL11A1. En el Ejemplo 1 puede encontrarse informacion adicional.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Para ayudar a entender la presente solicitud de patente, a continuacion se explican los significados de algunos de los terminos y expresiones tal como se utilizan dentro del contexto de la presente invencion.
El termino “anticuerpo” se refiere a una glucoprotema que presenta una actividad de union espedfica por una protema particular, la cual se denomina “antfgeno”. El termino “anticuerpo” comprende anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales, los cuales pueden estar intactos o ser fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos de origen no humano. Los “anticuerpos monoclonales” son poblaciones homogeneas de anticuerpos altamente espedficos que estan dirigidos a un unico sitio o “determinante” antigenico.
El termino “cancer” o “carcinoma” se refiere a la enfermedad que caracterizada por una proliferacion descontrolada de celulas anomalas capaces de invadir tejidos adyacentes y de diseminarse a organos a distancia.
La expresion “cancer de mama” o “adenocarcinoma de mama” se refiere a cualquier trastorno proliferativo maligno de celulas de la mama.
El termino “epftopo”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigenico de una protema, el cual es la secuencia de aminoacidos de la protema que reconoce un anticuerpo espedfico.
El termino “especificidad” se refiere a la capacidad de detectar los negativos verdaderos. Una especificidad del 100 % significa que no hay falsos positivos (sujetos que no tienen la enfermedad pero tienen un resultado positivo).
El termino “evolucion clmica” se refiere, en general, a la evolucion del estado clmico del paciente a lo largo del proceso de tratamiento de la enfermedad y, en concreto, en el sentido utilizado en la presente descripcion, aplicado a una lesion papilar de mama incluye la valoracion de la evolucion o recidiva de dicha lesion papilar de mama en una lesion maligna, un carcinoma de mama, o una lesion benigna, y del efecto del tratamiento, o ausencia de tratamiento, aplicado a un sujeto que padece una lesion papilar de mama.
El termino “gen” se refiere a una cadena molecular de desoxirribonucleotidos que codifica una protema.
El termino “gen col11a1” se refiere al gen que codifica un componente del colageno XI denominado “cadena pro- a1(XI)”, el cual se combina con otras dos cadenas de colageno (pro-a2(XI) y pro-a1(II)) para formar una molecula de procolageno (proCOL11A1) que se procesa de forma enzimatica en las celulas para formar las fibras de colageno XI. El gen col11a1 humano (tambien conocido como COLL6 o STL2), cuya secuencia genica de referencia es NG_008033.1, ocupa unas 150 kilobases (kb), contiene 68 exones, se emplaza en el cromosoma 1 (1p21) entre los pares de bases 103342023 y 103574052, y codifica una protema de 181 KDa que consiste en 1806 aminoacidos (de acuerdo con la isoforma) que contiene un peptido senal (aminoacidos 1-36). Este gen esta conservado en seres humanos, chimpances, vacas, pollos, ratones, ratas y pez cebra. Las mutaciones en este gen se han asociado a los smdromes Stickler II y Marshall. Los polimorfismos de un nucleotido en este gen se han asociado a la susceptibilidad de padecer hernia discal lumbar. Se han descrito varios transcritos que difieren principalmente en la transcripcion de las variantes del exon 6, por ejemplo, una de 7,2 kb que codifica la isoforma A (NM_001854.3 (GI:98985806), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011), que consiste en 1806 aminoacidos, otra de 7,3 kb, que codifica la
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isoforma B (NM_080629.2, base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011) que consiste en 1806 aminoacidos (GI:98985810), otra de 6,9 kb, que codifica la isoforma C (NM_080630.3 (GI:299523252), base de datos NCBI a fecha 21 de julio de 2011) que consiste en 1690 aminoacidos (GI:299523253), otra de 7,2kb que codifica la isoforma E (NM_001190709.1, base de datos NCBI a fecha del 1 de agosto de 2011) que consiste en 1767 aminoacidos (GI:299523257), etc. El termino “col11a1”, como se usa en el presente documento, no se refiere unicamente al gen humano sino tambien a los ortologos de otras especies. Se observa expresion baja y homogenea del gen col11a1 en todos los tejidos analizados excepto en adipocitos, donde es considerablemente mas elevada (BioGPS: Gene Atlas U133A). En lmeas celulares, se detecta expresion elevada en celulas UASMC (celulas de musculo liso de arteria umbilical), celulas HN_NP (celulas precursoras neuronales), celulas HN_Os (osteoblastos), celulas Panc-1 (celulas de cancer de pancreas), celulas H522 (celulas de cancer de pulmon) y celulas U251 (celulas de glioma) (RefExA), celulas A-204 (celulas de rabdomiosarcoma de corazon), celulas sAoS-2 (celulas de osteosarcoma de medula osea) y celulas SK-MEL28 (celulas de cancer de piel) (GeneCards).
Las expresiones “igual a” o “inferior a”, aplicados al nivel de expresion de una protema, en concreto al nivel de expresion de la protema proCOL11A, significa que la cantidad o concentracion de dicha protema en una muestra espedfica es sustancialmente la misma (igual que), o menor (inferior que) que la de otra muestra considerada como muestra de control o valor de referencia; por lo tanto, el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, tal como un papiloma intraductal de mama, sin tendencia a evolucionar a carcinoma (es decir, con un bajo riesgo de recidiva) es igual (sustancialmente el mismo) o inferior (menor que) al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control obtenida a partir de una poblacion de sujetos de control sin historial de tumores de mama o de lesiones papilares de mama (por ejemplo, papiloma intraductal de mama) sin riesgo de recidiva y/o de evolucion a carcinoma, o sin antecedentes medicos de carcinoma invasivo. En el contexto de la presente invencion, se considera que un nivel de expresion de una protema, tal como el nivel de expresion de la protema proCOL11A1, en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es “igual a” el nivel de expresion de dicha protema en la muestra de control cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto es sustancialmente el mismo que el nivel de expresion de dicha protema, por ejemplo, esta comprendido entre el valor de referencia (nivel de expresion de la protema proCOL11A1) mas/menos una cantidad menor del 3 % de dicho valor de referencia. Asimismo, en el contexto de la presente invencion, se considera que un nivel de expresion de una protema, tal como el nivel de expresion de la protema proCOL11A1, en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es “inferior” (o “menor”) cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto disminuye, por ejemplo, el 3 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 % o incluso el 100 %, con respecto al valor de referencia.
La expresion “lesion papilar de mama” se refiere a un grupo heterogeneo de lesiones de mama de arquitectura papilar. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de lesiones papilares de mama incluyen papilomas intraductales, papilomatosis, papiloma atfpico y carcinomas papilares intraductales. En una realizacion particular de la invencion, para todos los aspectos de la invencion considerados, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
La expresion “papiloma intraductal de mama” se refiere a una proliferacion papilomatosa y, por lo tanto, epitelial, vellosa, con un eje conjuntivo-vascular, baja actividad mitotica, fase de metaplasia apocrina y ausencia de patron cribiforme. Dada su presentacion puede ser solitario o unico y multiple. Es una masa que se forma en conductos grandes en la region subareolar, que es una gran masa cuando es un papiloma unico o una masa pequena cuando hay varios juntos. Puede estar asociado con alteraciones hiperplasicas en los lobulillos.
El termino “predecir”, como se usa en el presente documento, aplicado al riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, se refiere a la determinacion de la probabilidad de que una lesion papilar de mama progrese o recidive (o no) a una lesion maligna en un sujeto diagnosticado de dicha lesion papilar de mama.
El termino “probabilidad”, como se usa en el presente documento, mide la frecuencia con la que se obtiene un resultado (o conjunto de resultados) cuando se realiza un experimento aleatorio, para el que se conocen todos los resultados posibles, en condiciones suficientemente estables. La probabilidad de obtener un resultado espedfico puede ser “alta”, es decir, la frecuencia con la que se obtiene un resultado es superior al 50 %, o “baja”, es decir, la frecuencia con la que se obtiene tal resultado es inferior al 50 %. De acuerdo con la presente invencion, la probabilidad de que se detecte la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o la probabilidad de que el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama sea superior al nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de control, es mas alta en los casos en los que dicha lesion papilar de mama evoluciona a una lesion maligna, tal como, por ejemplo, un carcinoma invasivo. Como entenderan los expertos en la materia, la probabilidad no tiene por que ser del 100% para todos los sujetos evaluados, aunque preferentemente debena serlo. Sin embargo, dicho termino, en el contexto de la presente invencion, requiere que una parte estadfsticamente significativa de los sujetos diagnosticados de una lesion papilar de mama puedan identificarse como sujetos que tienen una probabilidad mas alta de obtener un resultado espedfico, por ejemplo, que una lesion papilar de mama evolucione a o recidive en una lesion potencialmente maligna o recidiva maligna. El experto en la materia puede determinar si un suceso es estadfsticamente significativo o no, sin grandes complicaciones, utilizando distintas herramientas conocidas de evaluacion estadfstica, por ejemplo, mediante el test de Student, el test de Mann-
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Whitney, la determinacion de intervalos de confianza, la determinacion del valor p, , etc. Puede encontrarse informacion adicional sobre estas herramientas estad^sticas en Dowdy y Wearden, Statistics for Research. John Wiley & Sons, New York 1983. Los intervalos de confianza preferentes son al menos del 50 %, al menos del 60 %, al menos del 70 %, al menos del 80 %, al menos del 90 % o al menos del 95 %. Los valores p son, preferentemente, de 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 o inferiores.
El termino “proCOL11A1” se refiere a la cadena al del colageno XI, cuyo procesamiento da lugar al colageno XI al (COL11A1). proCOL11A1 tiene un dominio central de triple helice con una estructura en forma de baston flanqueado por propeptidos que no son del colageno en los extremos N y C terminal; estos propeptidos pueden eliminarse mediante peptidasas espedficas a medida que secretan al exterior de la celula, generando COL11A1 maduro, donde las cadenas al de colageno XI se ensamblan entre sf y con las cadenas a2 y/o a3 para formar fibras de colageno XI. El gen colllal codifica proCOL11A1. Se han descrito varias isoformas de proCOL11A1 humano, por ejemplo, la isoforma A [NM_001854.3 (GI:98985806), base de datos NCBI a fecha de 21 de julio de 2011] que consiste en 1806 aminoacidos, la isoforma B [NP_542196.2 (GI:98985810), base de datos NCBI a fecha de 21 de julio de 2011], la isoforma C [NM_080630.3 (GI:299523252), base de datos NCBI a fecha de 21 de julio de 2011], etc. El termino “proCOL11A1”, como se usa en el presente documento, no se refiere unicamente a la protema proCOL11A1 humana sino tambien a los ortologos de otras especies.
El gen col11a1 codifica una protema que consiste en 1806 aminoacidos, que tiene su region de triple helice entre los aminoacidos 529 y 1542. Tiene dos dominios que no siempre estan presentes en la protema madura, el C terminal (aminoacidos 1564-1806) y el N terminal (aminoacidos 37-511). Forma parte del colageno tipo XI, que en el cartflago esta formado por tres cadenas que forman una triple helice, la a1 (XI), la a2 (XI) (que codifica el gen COL11A2) y la a3 (XI) (generada por sobreglucosilacion de a1 (II)), que puede ser sustituida por la a1(V). Es un componente de la matriz extracelular del cartflago hialino, aunque tambien se expresa en tejidos no cartilaginosos y en lmeas celulares tumorales o en lmeas celulares transformadas por virus, pero en este caso no siempre se coexpresan las tres cadenas del colageno tipo XI, lo que podna significar que las fibras tengan una composicion de cadenas distinta a la del cartflago, que es homotrimerica o heterotfpica en estas zonas (Yoshioka,H., J Biol Chem, 1990; 265(11):6423- 6426; Lui, LCH, Biochem J, 1995; 311:511-516). Se cree que participa en la fibrilogenesis, regulando el crecimiento lateral de las fibras de colageno II, sirviendo de soporte para dichas fibras y emplazandose en el interior de la fibra formada (Weis, MA., J Biol Chem 2010; 285(4):2580-2590). Se sintetiza como procolageno, que se procesa de forma proteolftica tras la secrecion eliminandose los peptidos N (37-511) y C (1564-1806) terminales (Halsted, KC., Mod Pathol 2008; 21(10):1246-1254). Dentro del peptido amino terminal (NTD) esta contenida una region Npp (propeptido amino) o TSP (38-229), que tambien se encuentra en otros 7 tipos de colageno, en la laminina y en la trombospondina, y contiene un sitio de procesamiento para BMP-1 (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507- 39515, Gregory, Ke., J Biol Chem 2000; 275(15): 11498-11506). Esta region no siempre se elimina en el caso de a1(XI), permaneciendo en ocasiones expuesta en la superficie de las fibras de colageno durante un tiempo prolongado (Fallahi, A., Prot Sci 2005; 14:1526-1537). Esta region es muy similar a los dominios LNS, que tienen posibles sitios de union para heparina y calcio, lo que podna significar una actividad de comunicacion celula-ME por union a los proteoglicanos de heparan sulfato (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507-39515, Fallahi, A., Prot Sci 2005; 14:1526-1537), incluso despues de ser proteolizada del dominio helicoidal. Ademas, el NTD incluye una region variable, que tiene secuencias y caractensticas distintas de acuerdo al corte y empalme alternativo, combinando los exones 6-7-8 del gen. Estas variantes tienen especificidad tisular y temporal (Warner, L., J Biol Chem 2006; 281(51):39507-39515), e influyen en el tiempo de procesamiento de Npp.
La expresion “pronosticar la evolucion clmica”, en el sentido en que usa en el presente documento, de una lesion papilar de mama se refiere a predecir, en general, la evolucion del estado clmico de la lesion papilar de mama a lo largo del proceso de tratamiento de la enfermedad y, en particular, si recidivara en un carcinoma de mama. A modo de ejemplo, si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control, entonces el pronostico de la evolucion clmica sera de recidiva en carcinoma de mama. Asimismo, si no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra es inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control, entonces el pronostico de la evolucion clmica sera de no recidiva en carcinoma de mama.
El termino “protema” se refiere a una cadena molecular de aminoacidos, con una actividad biologica. El termino incluye todas las formas de modificaciones postraduccionales, por ejemplo glucosilacion, fosforilacion o acetilacion. Los terminos “protema”, “peptido” y “polipeptido” se usan indistintamente en la presente descripcion.
El termino “recidiva” se refiere, en general, a la reaparicion de la lesion tras un periodo relativamente largo de ausencia de enfermedad. El termino “recidiva”, en el sentido utilizado en el presente documento, aplicado a una lesion papilar de mama, se refiere en particular a la reaparicion de una lesion papilar de mama en forma de lesion maligna, tal como en forma de un carcinoma de mama o tumor de mama, adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
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El termino “riesgo”, como se usa en el presente documento, se refiere al riesgo relativo o probabilidad de que una lesion papilar de mama espedfica evolucione a una lesion potencialmente maligna, tal como, por ejemplo, a un carcinoma de mama o tumor de mama, adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico. El riesgo puede ser “alto” o “elevado” o, como alternativa, “bajo” o “reducido”. El riesgo puede determinarlo un experto en la materia sin grandes complicaciones utilizando distintas herramientas de evaluacion estadfstica conocidas, de acuerdo con la informacion obtenida sobre la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 o del nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
El termino “sensibilidad” se refiere a la deteccion de positivos verdaderos (por ejemplo, diagnostico positivo de una patologfa, cuando el paciente tiene de dicha patologfa); una sensibilidad del 100% significa que no hay falsos negativos (diagnostico negativo en pacientes que tienen dicha patologfa).
El termino “sujeto” o “individuo” se refiere a un miembro de una especie de los mairnferos, e incluye, pero sin limitacion, animales domesticos, primates y seres humanos; el sujeto es, preferentemente, un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.
El termino “superior a”, aplicado al nivel de expresion de una protema, en concreto el nivel de expresion de la protema proCOL11A, significa que la cantidad o concentracion de dicha protema en una muestra espedfica es mayor que en otra muestra considerada como la muestra de control o valor de referencia; por lo tanto, el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, tal como un papiloma intraductal de mama, con tendencia a evolucionar a carcinoma (es decir, con riesgo de recidiva maligna) es mayor que (superior) el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control obtenida de una poblacion de sujetos de control sin antecedentes de tumores de mama o de lesiones papilares de mama (por ejemplo, papiloma intraductal de mama) sin riesgo de recidiva y/o de evolucion a carcinoma, o sin antecedentes medicos de carcinoma invasivo. En el contexto de la presente invencion, se considera que un nivel de expresion de una protema, tal como el nivel de expresion de la protema proCOL11A1, en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es “superior a” (o “mayor que”) el nivel de expresion de dicha protema en una muestra de control (valor de referencia) cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto aumenta, por ejemplo, el 3 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 % o incluso mas, cuando se compara con el valor de referencia para dicha protema en la muestra de control, o cuando aumenta, por ejemplo, al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso mas, cuando se compara con el valor de referencia para dicha protema.
El termino “tratamiento”, como se usa en el presente documento, se refiere en general a la aplicacion de una terapia para aliviar o eliminar una patologfa, o para reducir o eliminar uno o mas smtomas asociados a dicha patologfa. Dicha terapia puede incluir una intervencion quirurgica, un tratamiento farmacologico, un tratamiento por radioterapia, etc.
El termino “tumor” se refiere a cualquier masa de tejido anomala producto de un proceso neoplasico benigno (no canceroso) o maligno (canceroso).
El termino “variante”, como se usa en el presente documento, aplicado a las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, se refiere a secuencias sustancialmente similares. En general, las variantes tienen la misma actividad biologica, desde el punto de vista cualitativo, que la secuencia nativa. Una variante de una secuencia polipeptfdica puede ser un derivado de una secuencia polipeptfdica que comprende la adicion, delecion o sustitucion de uno o mas aminoacidos presentes en la secuencia nativa. Las variantes de las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo pueden diferir de las secuencias descritas en las regiones marco conservadas o en las regiones determinantes de complementariedad o las CDR, de cualquiera de las cadenas pesada o ligera. A modo de ejemplo, el termino “variante”, aplicado al anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54) incluye secuencias de aminoacidos que tienen al menos, aproximadamente, el 70%, 75%, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoacidos de las CDR comprendidas en la region variable de la cadena pesada o la region variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal 1E8.33, siempre y cuando la variante resultante conserve la actividad biologica de la secuencia nativa, es decir, la variante del anticuerpo conserve la capacidad de reconocer de forma espedfica la protema proCOL11A1.
Metodos para el pronostico de evolucion clinica/prediccion de riesgo
La presente invencion es a base del descubrimiento de que la expresion de la protema proCOL11A1 esta aumentada en los papilomas intraductales de mama, una lesion papilar de mama que es representativa de este grupo de lesiones, que tienen tendencia a evolucionar a carcinoma de mama.
Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se refiere un metodo in vitro para pronosticar la evolucion clmica y/o
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predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, en lo sucesivo denominado en el presente documento “primer metodo de la invencion”, seleccionado del metodo (A) y el metodo (B), en donde
A) el Metodo (A) comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1;
en donde
- la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o
- la no deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo, y
B) el Metodo (B) comprende
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;
en donde
- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLl1A1 en una muestra de control es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o
- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo.
El primer metodo de la invencion es un metodo altamente sensible y espedfico, y esta basado en el hecho de que los sujetos o individuos diagnosticados de una lesion papilar de mama, tal como, por ejemplo, un papiloma intraductal de mama, con tendencia a recidivar o evolucionar a carcinoma, expresan y muestran proCOL11A1 o tienen niveles elevados de proCOL11A1 en terminos absolutos o en comparacion con los correspondientes niveles en muestras control, procedentes de sujetos sin antecedentes medicos de tumores de mama o con lesiones papilares de mama, por ejemplo, papilomas intraductales de mama, sin riesgo de recidiva, o con otras lesiones benignas de mama.
Para poner en practica cualquiera de las alternativas [Metodo (A) o (Metodo (B)] del primer metodo de la invencion, se obtiene del individuo a estudiar una muestra, tal como una muestra biologica. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicha muestra incluyen un cilindro de tejido obtenido mediante biopsia con aguja gruesa (BAG), una trozo de tejido mamario obtenido a traves de cirugfa, por ejemplo, mediante una biopsia, citologfa o reseccion quirurgica, asf como un fluido biologico, tal como sangre, suero, fluido aspirado de pezon, orina, etc. Dependiendo del tipo de muestras, para simplificar su almacenamiento y manipulacion, estas se pueden fijar en formol e incluir en parafina o, como alternativa, se pueden congelar primero y despues incluir en un medio criosolidificable.
Las muestras a analizar pueden obtenerse de sujetos previamente diagnosticados de una lesion papilar de mama o de sujetos no diagnosticados. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
Metodo (A)
En una realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1 [Metodo (A)], en donde la deteccion de la presencia de la protema proCOLIlAl en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o en donde la no deteccion de la presencia de la protema proCOLIlAl en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo.
La presencia de proCOLIlAl en la muestra a analizar puede detectarse mediante cualquier metodo convencional que permita detectar la presencia de una protema, en concreto proCOLIlAl, en una muestra. En una realizacion particular, dicha muestra es una muestra de tejido mamario. Dentro del marco de la invencion puede utilizarse para detectar la presencia de proCOLIlAl practicamente cualquier metodo convencional para la deteccion de la presencia de una protema en una muestra de tejido. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos metodos incluyen metodos basados en el uso de anticuerpos, tecnicas de cromatograffa de afinidad, ensayos de union a ligando, etc.
En una realizacion particular, la deteccion de la presencia de proCOLIlAl se realiza mediante un inmunoensayo basado en la formacion de un complejo de tipo antfgeno-anticuerpo, mediante el uso de uno (o mas anticuerpos) que reconocen uno (o mas) epftopos de proCOLIlAl, y la posterior visualizacion de los complejos formados por cualquier tecnica adecuada, incluyendo tanto tecnicas radiactivas como no radiactivas tales como, por ejemplo,
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tecnicas colorimetricas, fluorimetricas, luminiscentes (por ejemplo, tecnicas bioluminiscentes, tecnicas quimioluminiscentes, etc.), etc., utilizando para tal fin, cuando sea apropiado, anticuerpos secundarios marcados con marcadores apropiados.
Los anticuerpos a utilizar para poner en practica esta realizacion particular del primer metodo de la invencion [Metodo (A)] son anticuerpos espedficos que reconocen la protema proCOL11A1, o un fragmento antigenico de proCOL11Al, es decir, anticuerpos que reconocen un epftopo de proCOL11A1. Los anticuerpos que pueden utilizarse en tales ensayos pueden ser sueros policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv (Fv monocatenario), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, combicuerpos, etc., los cuales son capaces de reconocer y unirse a proCOL11A1, o a un fragmento antigenico de la misma; dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos de origen no humano. Ventajosamente, el anticuerpo que reconoce la protema proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce de forma espedfica el subdominio VAR en el propeptido N terminal de proCOL11A1. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos que detectan de forma espedfica proCOL11A1 se mencionan en la solicitud de patente internacional PCT/ES2012/070616 [documento WO 2013/021088]. En una realizacion particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54), un anticuerpo que reconoce de forma espedfica la protema proCOL11A1, sin detectar otras protemas con alta homologfa de secuencia, tal como la protema COL5A1.
El anticuerpo que reconoce a proCOL11A1 puede estar, de forma opcional, conjugado a un soporte. Ademas, dicho anticuerpo que reconoce a proCOL11A1 puede estar o no marcado; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores que pueden utilizarse incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos o cofactores enzimaticos, inhibidores enzimaticos, partmulas, colorantes, etc. Los anticuerpos no marcados pueden utilizarse en ensayos de union, mientras que los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos.
Existe una amplia variedad de ensayos bien conocidos para los expertos en la materia que pueden usarse para poner en practica esta realizacion particular del primer metodo de la invencion [Metodo (A)], utilizando dichos ensayos anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) que reconocen a proCOLl1A1 y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); estan incluidos entre estas tecnicas la transferencia de Western o inmunotransferencia, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimatico) competitivo, DAS-ELISA (ELISA tipo sandwich con doble anticuerpo), ensayos inmunohistoqmmicos, ensayos inmunohistoqmmicos, tecnicas de deteccion multiple basadas en el uso de microesferas, biochips o micromatrices de protemas que incluyen anticuerpos espedficos, o ensayos basados en precipitacion coloidal, etc.
En una realizacion particular preferente, la deteccion de la presencia de proCOL11A1 de acuerdo con el Metodo (A) se lleva a cabo mediante un ensayo inmunohistoqmmico, un metodo histopatologico conocido basado en la utilizacion de un anticuerpo espedfico, normalmente marcado con un marcador (por ejemplo, una enzima), que puede transformar un sustrato en un compuesto visible sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antfgeno (proCOL11A1 en este caso), aplicado a una muestra de tejido organico. Con el uso de una de las tecnicas espedficas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluorescema, etc.), el complejo antfgeno-anticuerpo formado puede emplazarse e identificarse en las muestras de tejido o citologicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antigenicos caractensticos de distintas celulas y se puede determinar el tipo de celula implicado en la muestra.
Brevemente, en una realizacion particular del metodo (A), la muestra, que puede ser una muestra recien obtenida, una muestra congelada o una muestra incluida en parafina y fijada usando un agente protector (por ejemplo, formol o similar), que comprende tejido mamario a analizar con el fin de detectar la presencia de proCOL11A1 mediante un ensayo inmunohistoqmmico, se tine con un anticuerpo espedfico para proCOL11A1 y se determina la frecuencia de celulas que se han tenido y la intensidad de la tincion. En caso de ser necesario, la muestra a analizar se somete a un tratamiento acondicionante que puede incluir uno o mas de los siguientes procedimientos: fijar el tejido, obtener cortes de grosor adecuado, recuperar el antfgeno, bloquear las moleculas que puedan interferir en la reaccion indirecta, evitar uniones inespedficas, etc. Ventajosamente, la deteccion de proCOL11A1 en la muestra a analizar mediante dicho ensayo inmunohistoqmmico se lleva a cabo en paralelo con muestras de tejido o citologicas usadas como un marcador positivo y como un marcador negativo y, si se desea, como referencia se pueden usar tejidos sanos del mismo origen que el de la lesion papilar de mama que se esta analizando. Tambien es comun usar un
control de fondo. Normalmente, se asigna a la muestra un valor indicativo de la expresion total, lo que se calcula de
acuerdo con la frecuencia de celulas tenidas y de la intensidad en cada una de las celulas tenidas. Los criterios tfpicos para asignar valores de expresion a las muestras se describen en, por ejemplo, Handbook of
Immunohistochemistry and In Situ Hybridization in Human Carcinomas, M. Hayat Ed., 2004, Academic Press.
En Ejemplo 1 describe un ensayo inmunohistoqmmico para detectar la presencia de proCOL11A1, en el cual la muestra que comprende tejido mamario a analizar, previamente acondicionada, se pone en contacto con el anticuerpo monoclonal frente a proCOL11A1 y, cuando finaliza el periodo de incubacion, se revela con
diaminobencidina (DAB) usando un sistema de deteccion adecuado.
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La deteccion de la presencia de proCOL11A1 mediante un ensayo inmunohistoqmmico tiene varias ventajas, puesto que se utiliza de forma generalizada en los laboratorios de anatoirna patologica, lo que hace posible aplicar de forma inmediata el primer metodo de la invencion, en particular el metodo (A), mediante dicha tecnica y, ademas, es una tecnica altamente automatizada, lo que facilita realizarla en las mismas condiciones.
Tras la deteccion de la presencia de proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, es posible relacionar la deteccion de la presencia (o la no deteccion de la presencia - ausencia) de proCOL11A1 en dicha muestra con el pronostico de evolucion clmica de dicha lesion papilar o con la prediccion del riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
Por lo tanto, en una etapa posterior, el metodo (A) implica correlacionar la deteccion de la presencia (o la no deteccion de la presencia - ausencia) de proCOL11A1 con un pronostico de evolucion clmica de dicha lesion papilar o con la prediccion del riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama.
Esta correlacion puede indicar que:
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es de recidiva en carcinoma de mama cuando se detecta la presencia de la protema proCOLllAl en la muestra del sujeto bajo estudio diagnosticado de una lesion papilar de mama; o que
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es de no recidiva en carcinoma de mama, cuando no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto bajo estudio diagnosticado de una lesion papilar de mama.
Como alternativa, esta correlacion puede indicar que:
- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es alto cuando se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama bajo estudio; o que
- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es bajo cuando no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto bajo estudio diagnosticado de una lesion papilar de mama.
Un especialista puede utilizar esta informacion de forma eficaz para seleccionar el tratamiento mas adecuado a administrar al sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, de acuerdo con el riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama.
En el sentido utilizado en el presente documento, la expresion “deteccion de la presencia de proCOL11A1”, o similar, se refiere a la capacidad de detectar proCOL11A1 en la muestra analizada, utilizando cualquiera de los metodos a los que se ha hecho referencia anteriormente. Asimismo, en el sentido utilizado en el presente documento, la expresion “no deteccion de la presencia de proCOL11A1”, o similar, se refiere a la incapacidad de detectar proCOL11A1 en la muestra analizada utilizando cualquiera de los metodos a los que se ha hecho referencia anteriormente.
Metodo (B)
En otra realizacion particular, el primer metodo de la invencion comprende comparar el nivel de expresion de la protema proCOLllAl en la muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama con el nivel de expresion de dicha protema proCOLllAl en una muestra de control, en donde un nivel de expresion de la protema proCOLllAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLllAl en una muestra de control es indicativo de que el riesgo de recidiva es alto, o en donde un nivel de expresion de la protema proCOLllAl en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOLllAl en una muestra de control es indicativo de que el riesgo de recidiva es bajo. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
Las caractensticas de la muestra a analizarya se han mencionado anteriormente.
El metodo (B) comprende determinar el nivel de expresion de la protema proCOLllAl en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama y compararlo con el nivel de expresion de dicha protema proCOLllAl en una muestra de control.
En una realizacion particular, la determinacion del nivel de expresion de la protema proCOLllAl se lleva a cabo mediante la cuantificacion o determinacion de la cantidad o concentracion de dicha protema proCOLllAl en dicha muestra.
La cantidad o concentracion de protema proCOLllAl presente en dichas muestras puede cuantificarse mediante cualquier metodo convencional que permita detectar y cuantificar dicha protema en las muestras a analizar. En este
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caso, el metodo (B) comprende la realizacion de una etapa de extraccion para obtener un extracto de protemas que contenga dicha protema. Los extractos de protemas pueden obtenerse mediante metodos convencionales (Chomczynski y et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
Para determinar la cantidad o concentracion de protemas en una muestra puede utilizarse practicamente cualquier metodo convencional, debidamente adaptado, dentro del marco de la presente invencion, para cuantificar la cantidad o concentracion de protema proCOL11A1 presente en una muestra. A modo de ejemplo no limitativo, la cantidad o concentracion de dicha protema proCOL11A1 puede determinarse mediante metodos convencionales, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos con capacidad de union a proCOL11A1 y la posterior cuantificacion de los complejos formados. En una realizacion particular, el metodo (B) comprende poner en contacto el extracto de protemas de la muestra con una composicion que comprende uno o mas anticuerpos espedficos contra uno o mas epftopos de la protema proCOL11A1, en condiciones que permiten la formacion de complejos anticuerpo:proCOL11A1, y determinar la cantidad o concentracion de protema proCOL11A1 presente en la muestra. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos metodos incluyen metodos basados en el uso de anticuerpos, tecnicas de cromatograffa de afinidad, ensayos de union a ligando, etc.
En una realizacion particular, la deteccion de la presencia de proCOL11A1 se realiza mediante un inmunoensayo basado en la formacion de un complejo de tipo antigeno-anticuerpo, mediante el uso de uno (o mas anticuerpos) que reconoce uno (o mas) epftopos de proCOL11A1, y la posterior visualizacion y cuantificacion de los complejos formados mediante cualquier tecnica apropiada, incluyendo tanto tecnicas radiactivas como no radiactivas tales como, por ejemplo, tecnicas colorimetricas, fluorimetricas, luminiscentes (por ejemplo, bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc., utilizando paratal fin, cuando sea apropiado, anticuerpos secundarios marcados con los marcadores apropiados.
Los anticuerpos a utilizar para la puesta en practica de esta realizacion particular del primer metodo de la invencion [Metodo (B)] son anticuerpos espedficos que reconocen la protema proCOL11A1, o un fragmento antigenico de proCOL11A1, es decir, anticuerpos que reconocen un epftopo de proCOL11A1. Los anticuerpos que pueden utilizarse en tal tipo de ensayos pueden ser sueros policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv (Fv monocatenario), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, combicuerpos, etc., que son capaces de reconocer y unirse a proCOL11A1, o a un fragmento antigenico de la misma; dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos de origen no humano. Ventajosamente, el anticuerpo que reconoce la protema proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce de forma espedfica el subdominio VAR, en el propeptido N terminal de proCOL11A1. Se han mencionado ejemplos ilustrativos de anticuerpos que detectan de forma espedfica proCOL11A1 en relacion con el metodo (A), cuyo contenido se incorpora en presente documento como referencia. La solicitud de patente internacional PCT/ES2012/070616 [documento WO 2013/0211088] describe unos anticuerpos que reconocen de forma espedfica el subdominio VAR, en el propeptido N terminal de proCOL11A1. En una realizacion particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54).
El anticuerpo que reconoce a proCOL11A1 puede estar, opcionalmente, conjugado a un soporte. Ademas, dicho anticuerpo que reconoce a proCOL11A1 puede estar marcado o no; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores que pueden utilizarse incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos o cofactores enzimaticos, inhibidores enzimaticos, partmulas, colorantes, etc. Los anticuerpos no marcados pueden utilizarse en ensayos de union, mientras que los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos.
Existe una amplia variedad de ensayos bien conocidos por los expertos en la materia que se pueden usar para la puesta en practica de esta realizacion particular [Metodo (B)] del primer metodo de la invencion, utilizando dichos ensayos anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) que reconocen a proCOL11A1 y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); entre estas tecnicas se incluyen transferencia de Western o inmunotransferencia, ELISA, RIA, EIA competitivo, DAS-ELISA, ensayos inmunohistoqmmicos, ensayos inmunohistoqmmicos, tecnicas de deteccion multiple basadas en el uso de microesferas, biochips o micromatrices de protemas que incluyen anticuerpos espedficos, o ensayos basados en precipitacion coloidal, etc.
En una realizacion particular preferente, la deteccion de la presencia de proCOL11A1 de acuerdo con el metodo (B) se lleva a cabo mediante un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), un metodo de inmunodeteccion conocido que se basa en la utilizacion de uno o dos anticuerpos espedficos, uno de ellos habitualmente marcado con un enzima, que puede transformar un sustrato en un compuesto visible sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antfgeno (proCOL11A1 en este caso), aplicado a un extracto de protema que proviene por lo general de un fluido biologico (por ejemplo, sangre, suero, orina, fluido aspirado de pezon, etc.) o de un trozo de tejido, o aplicado al propio fluido biologico. Con el uso de cualquiera de las tecnicas espedficas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluorescema, etc.), el complejo antfgeno-anticuerpo formado puede detectarse y cuantificarse en las muestras a estudiar, pudiendo cuantificar facilmente los niveles de protema a analizar en muestras de distinto origen.
Brevemente, en una realizacion particular del metodo (B), la muestra, que puede ser una muestra recien obtenida o
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una muestra de sangre, muestra de suero, muestra de orina, fluido aspirado de pezon, congelados, etc., que comprende un fluido biologico con el fin de detectar la presencia de proCOL11A1 mediante un ensayo inmunohistoqmmico, , se pone en contacto con el anticuerpo/anticuerpos anti-pro-COL11A1 marcados y se cuantifica la concentracion de la protema de acuerdo con la intensidad de la reaccion enzimatica asociada al marcaje del anticuerpo. En caso necesario, la muestra a analizar se somete a un procedimiento de extraccion de protemas con el fin de concentrar dichas protemas, facilitando su deteccion, mediante metodos convencionales (Chomczynski y et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532). Ventajosamente, la deteccion de proCOL11A1 en la muestra a analizar mediante dicho ensayo inmunohistoqmmico se lleva a cabo en paralelo con muestras que contienen niveles conocidos de proCOL11A1 como referencia (curva patron), que consisten en muestras humanas de una concentracion conocida, protema proCOL11A1 recombinante o extractos de lmeas celulares que expresan la protema, que permitiran, por comparacion de las intensidades obtenidas, calcular la concentracion de proCOL11A en las muestras a analizar.
La deteccion de la presencia de proCOL11A1 mediante un ensayo de inmunodeteccion tipo ELISA tiene varias ventajas, debido a que se utiliza de forma generalizada en los laboratorios de bioqmmica, lo que posibilita que se pueda aplicar de forma inmediata el primer metodo de la invencion, en particular el metodo (B) mediante dicha tecnica y, adicionalmente, es una tecnica altamente automatizada, lo que facilita su realizacion en las mismas condiciones.
El metodo (B) comprende la etapa de comparar la cantidad o concentracion de protema proCOL11A1 determinada en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama objeto de estudio, con la cantidad o concentracion de protema proCOL11A1 de la muestra de control (valor de referencia). En una realizacion particular, la muestra de control es una muestra procedente de sujetos sin ningun antecedente medico de tumores de mama o de lesiones papilares de mama (por ejemplo, papiloma intraductal de mama), sin riesgo de recidiva y/o de evolucion a carcinoma.
Por lo tanto, una vez que se ha establecido el valor de referencia, se compara el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en estudio con el valor de referencia. Como resultado de esta comparacion, el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto puede ser “superior a” (mayor que), “inferior que” (“menor que”) o “igual a” dicho valor de referencia para dicha protema en la muestra de control. Como se discute anteriormente, en el contexto de la presente invencion, se considera que el nivel de expresion de la protema de interes (proCOL11A1) en la muestra del sujeto en estudio es “superior a” el valor de referencia para dicha protema cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto en estudio aumenta, por ejemplo, el 3%, el 5%, el 10%, el 25%, el 50%, el 100% o incluso mas, cuando se compara con el valor de referencia para dicha protema, o cuando aumenta, por ejemplo, al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso mas, cuando se compara con el valor de referencia para dicha protema. Asimismo, en el contexto de la presente invencion, se considera que un nivel de expresion del gen de interes en la muestra del sujeto es “inferior que” el valor de referencia para dicha protema cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto en estudio disminuye, por ejemplo, el 3 %, el 5 %, el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 % o incluso el 100 %, cuando se compara con el valor de referencia para dicha protema. De forma adicional, en el contexto de la presente invencion, se considera que un nivel de expresion del gen de interes en la muestra del sujeto es “igual a” el valor de referencia para dicha protema cuando el nivel de expresion de dicha protema en la muestra del sujeto en estudio es sustancialmente el mismo que el valor de referencia para dicha protema (es decir, el valor de referencia ± 3 %).
De forma adicional, en una etapa posterior, el metodo (B) comprende la etapa de correlacionar el resultado obtenido tras comparar la cantidad o concentracion de protema proCOL11A1 en la muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama con la cantidad o concentracion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control, con el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar o con la prediccion del riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
Esta correlacion puede indicar que:
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es recidiva en carcinoma de mama cuando la cantidad o concentracion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior a la cantidad o concentracion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control, o que
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es no recidiva en carcinoma de mama, cuando la cantidad o concentracion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es inferior que la cantidad o concentracion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
Como alternativa, esta correlacion puede indicar que:
- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es alto cuando la cantidad o concentracion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior que la cantidad o
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concentracion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control, o que
- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es bajo cuando la cantidad o concentracion de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior que la cantidad o concentracion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
En otra realizacion particular del metodo (B), la determinacion del nivel de expresion de la protema proCOL11A1 se lleva a cabo mediante la cuantificacion del nivel de expresion del gen colllal en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama. En este caso, la puesta en practica del metodo (B) comprende determinar el nivel de expresion del gen colllal en una muestra de dicho sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama y comparar el nivel de expresion de dicho gen colllal en dicha muestra con el nivel de expresion del gen colllal en una muestra de control y, finalmente, correlacionar el resultado obtenido tras dicha comparacion con el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar y/o con la prediccion del riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama.
El nivel de expresion genica puede cuantificarse mediante la cuantificacion del nivel del ARNm codificante de dicho gen (colllal) o, como alternativa, del nivel del ADN complementario (ADNc) a dicho ARNm. En este caso, el metodo (B) comprende realizar una etapa de extraccion para obtener el RNA total, lo que puede realizarse mediante tecnicas convencionales (Chomczynski y et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532; Molina, M.A., et al., Cancer Res., 1999, 59: 4356-4362).
Dentro del marco de la presente invencion puede utilizarse practicamente cualquier metodo convencional para cuantificar el nivel de ARNm del gen col11a1 o de su correspondiente ADNc. A modo ejemplo no limitativo, el nivel de ARNm del gen col11a1 puede cuantificarse mediante el uso de metodos que comprenden la amplificacion del ARNm y la cuantificacion del producto de la amplificacion de dicho ARNm, tales como electroforesis y tincion o, como alternativa, mediante transferencia de Southern y el uso de sondas adecuadas, transferencia de Northern y el uso de sondas espedficas para el ARNm del gen col11a1 o del ADNc correspondiente, mapeo con nucleasa S1, RT-LCR, hibridacion, micromatrices, etc. En una realizacion particular la amplificacion y cuantificacion del ARNm correspondiente al gen col11a1 se realizan al mismo tiempo mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR). De forma similar, el nivel del ADNc correspondiente a dicho ARNm del gen col11a1 tambien puede cuantificarse mediante el uso de tecnicas convencionales; en este caso, el metodo de la invencion incluye una etapa de smtesis del correspondiente ADNc mediante transcripcion inversa (RT) del ARNm correspondiente, seguida de amplificacion y cuantificacion del producto de la amplificacion de dicho ADNc. En una realizacion particular, la amplificacion se lleva a cabo de manera cualitativa o cuantitativa mediante una reaccion en cadena de la polimerasa, por ejemplo, PCR o RT-PCT, usando cebadores de oligonucleotido que amplifican de forma espedfica una region del gen col11a1; en una realizacion particular, dicha RT-PCR se lleva a cabo en presencia de la pareja de cebadores de oligonucleotido cuyas secuencias de nucleotidos se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
De acuerdo con esta realizacion particular del metodo (B), el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto en estudio, se compara con el nivel del ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc determinado en la muestra de control (valor de referencia). En una realizacion particular, la muestra de control es una muestra procedente de sujetos sin ningun antecedente medico de tumores de mama o de lesiones papilares de mama (por ejemplo, papiloma intraductal de mama) sin riesgo de recidiva y/o de evolucion a carcinoma. De forma adicional, se puede usar si se desea un control positivo, por ejemplo, una lmea celular que expresa el gen col11a1 y/o un control negativo, por ejemplo, una lmea celular que no expresa el gen col11a1.
De forma adicional, de acuerdo con esta realizacion particular del metodo (B), el resultado obtenido tras la comparacion del nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto en estudio, con el nivel del ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra de control (valor de referencia), se correlaciona con el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar o con la prediccion del riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
Esta correlacion puede indicar que:
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es de recidiva en carcinoma de mama cuando el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, es superior al nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc determinado en la muestra de control, o que
- el pronostico de la evolucion clmica de dicha lesion papilar de mama es de no recidiva en carcinoma de mama cuando el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior que el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc determinado en la muestra de control.
Como alternativa, esta correlacion puede indicar que:
- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es alto cuando el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama
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- el riesgo de recidiva de la lesion papilar de mama es bajo cuando el nivel de ARNm del gen colllal o el nivel del correspondiente ADNc, determinado en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, es igual o inferior que el nivel de ARNm del gen col11a1 o el nivel del correspondiente ADNc determinado en la muestra de control.
El especialista puede utilizar esta informacion de forma eficaz para seleccionar el tratamiento a administrar al sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama mas apropiado, de acuerdo con riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama.
Dada la falta de marcadores fiables, hoy en dfa existe una gran controversia en cuanto al tratamiento de las lesiones papilares de mama y, en particular, del papiloma intraductal de mama (una lesion papilar de mama benigna con una probabilidad de recidiva en una patologfa maligna bastante alta (33 %) cuando la lesion inicial presenta atipias), por lo que algunos especialistas son partidarios de realizar una extirpacion completa de la lesion en todos los casos, mientras que otros son partidarios de la extirpacion completa de la lesion cuando esten presenten atipias o papilomas multiples.
Ahora, mediante la informacion proporcionada por el primer metodo de la invencion [metodo (A) y metodo (B)], el especialista puede seleccionar el tratamiento a administrar al sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama mas adecuado de acuerdo con el riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama, optimizando asf la atencion terapeutica a aplicar al sujeto y evitando las desventajas asociadas con la aplicacion de un tratamiento no adecuado.
En una realizacion particular, la lesion papilar de mama que padece el sujeto en estudio es un papiloma intraductal de mama.
En otra realizacion particular, la recidiva de la lesion papilar de mama es una recidiva en carcinoma de mama o en tumor de mama.
En otra realizacion particular, la recidiva de la lesion papilar de mama es una recidiva en adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
Metodos de seleccion
Existen distintos tratamientos que pueden aplicarse al sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, aunque existen discrepancias con respecto el tratamiento concreto a aplicar. A modo de ejemplo, algunos especialistas son partidarios de tratar las lesiones papilares de mama mediante la extirpacion quirurgica de la mama; otros especialistas son partidarios de tratar dichas lesiones mediante la extirpacion quirurgica de la lesion papilar de mama mediante cirugfa conservadora, por ejemplo, pero sin limitarse a la reseccion por mamotomo o reseccion por cilindros. En ocasiones, estos tratamientos estan acompanados de un tratamiento farmacologico y/o posterior radioterapia, y de un seguimiento de la evolucion de las lesiones y/o del tratamiento aplicado por el especialista.
Ahora se ha descubierto que, dado que es posible correlacionar la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 y/o la cuantificacion del nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama con el pronostico de su evolucion clmica y/o con la prediccion del riesgo de recidiva de dicha lesion, el especialista puede elegir el tratamiento mas apropiado a aplicar a dicho sujeto de acuerdo con el riesgo de recidiva de dicha lesion papilar de mama. Por lo tanto, se optimiza la atencion terapeutica del sujeto y se evitan las desventajas asociadas con la aplicacion de un tratamiento no apropiado, por ejemplo, se evitan intervenciones quirurgicas innecesarias con la consiguiente repercusion economica que ello conlleva.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para la seleccion de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama, mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion, y el tratamiento farmacologico preventivo para evitar la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva, en lo sucesivo en el presente documento denominado “segundo metodo de la invencion”, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;
en donde dicho sujeto es seleccionado para dicho tratamiento:
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- si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
Por lo tanto, de acuerdo con el segundo metodo de la invencion, se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 y/o se determina el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama que se esta evaluando, y se correlaciona el resultado obtenido con la posibilidad de seleccionar a dicho sujeto para que reciba un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva.
Las caractensticas de la muestra, del sujeto a tratar y de la protema proCOL11A1 ya se han mencionado anteriormente en relacion con el primer metodo de la invencion, al igual que los metodos para detectar y/o cuantificar dicha protema, y se incorporan en el presente documento como referencia.
En una realizacion particular, el tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion comprende la realizacion de una mastectoirna parcial o total incluye, por ejemplo, un tratamiento que vana desde cirugfa conservadora de la mama hasta la mastectomfa radical modificada de Merola-Patey, segun sea el caso. El especialista en la campo puede aplicar el tratamiento farmacologico preventivo que considere mas adecuado al caso para prevenir la recidiva. Ademas, los especialistas pueden realizar un seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion con el fin de detectar de forma temprana la posible recidiva, para cuyo fin estableceran las directrices que consideren mas oportunas segun sea el caso.
Una vez analizada la presencia y/o la cantidad de protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en estudio, es posible evaluar la posibilidad de seleccionar a dicho sujeto para recibir un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, que permita la deteccion temprana de la posible recidiva. La posibilidad de seleccionar a un sujeto para que reciba dicho tratamiento se establece a base de la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 o del nivel de expresion de dicha protema en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, de forma que, si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control, entonces dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento. En caso contrario, el sujeto no sera seleccionado para ese tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
El segundo metodo de la invencion permite, por lo tanto, seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en necesidad de tratamiento, para recibir un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva. Por lo tanto, si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto analizada, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control, entonces dicho sujeto es, a priori, un candidato adecuado para recibir un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva.
Este segundo metodo de la invencion es una valiosa herramienta para el tratamiento de lesiones papilares de mama debido a que, a la vista de los resultados proporcionados evaluando el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama mediante un metodo como el proporcionado por la presente invencion, el especialista puede seleccionar (o descartar) al sujeto que se esta evaluando para que reciba un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permita asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, lo que permite la deteccion temprana de la posible recidiva de acuerdo con la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1, o del nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en la muestra procedente de dicho sujeto. Por lo tanto, los metodos y medios que proporciona la presente invencion pueden ayudar a los especialistas a seleccionar el tratamiento mas adecuado a administrar a un sujeto con una lesion papilar de mama y a evitar los efectos adversos asociados con la administracion de un tratamiento no necesario en el caso de sujetos sin riesgo de
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recidiva o de evolucion de una lesion papilar en carcinoma de mama.
Como alternativa, en otro aspecto la invencion proporciona un metodo para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para un tratamiento seleccionado de un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama, en los sucesivo en el presente documento denominado como “tercer metodo de la invencion”, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;
en donde dicho sujeto es seleccionado para dicho tratamiento:
- si no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
De acuerdo con el tercer metodo de la invencion, se detecta la protema proCOL11A1 y/o se determina el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama que se esta evaluando y se correlaciona el resultado obtenido con la posibilidad de seleccionar a dicho sujeto para recibir un tratamiento seleccionado de (i) un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y (ii) un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama.
En una realizacion particular, el tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de la lesion papilar de mama mediante cirugfa conservadora se lleva a cabo mediante mamotomo o cilindros.
Las caractensticas de la muestra, del sujeto a tratar y de la protema proCOL11A1 ya se han mencionado anteriormente en relacion con el primer metodo de la invencion, al igual que los metodos para detectar y/o cuantificar dicha protema, y se incorporan en el presente documento como referencia.
Una vez analizada la presencia y/o la cantidad de protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en estudio, es posible evaluar la posibilidad de seleccionar a dicho sujeto para recibir un tratamiento seleccionado de (i) un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y (ii) un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama. La posibilidad de seleccionar a un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para que reciba dicho tratamiento se establece en base a la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 o al nivel de expresion de dicha protema en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, de forma que si no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control, entonces dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento. En caso contrario, el sujeto no se seleccionara para ese tratamiento seleccionado de (i) un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de
mama por cirugfa conservadora y (ii) un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de
mama. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
En una realizacion particular, el especialista selecciona el sujeto en estudio para un tratamiento que comprende la extirpacion de la lesion papilar de mama por cirugfa conservadora. En una realizacion concreta, el tratamiento que comprende la extirpacion de la lesion papilar de mama por cirugfa conservadora comprende la reseccion por mamotomo, la reseccion por cilindros de dicha lesion papilar de mama o la reseccion en bloque que comprende el conducto afectado.
En otra realizacion particular, el especialista selecciona el sujeto en estudio para un tratamiento que no comprende la extirpacion de la lesion papilar de mama por cirugfa conservadora.
El tercer metodo de la invencion permite, por lo tanto, seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en necesidad de tratamiento, para recibir un tratamiento seleccionado de (i) un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y (ii) un tratamiento que comprende la no
extirpacion de dicha lesion papilar de mama. Por lo tanto, si en la muestra del sujeto analizada no se detecta la
presencia de la protema proCOL11A1, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra es igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control, entonces dicho sujeto es, a priori, un candidato adecuado para recibir dicho tratamiento anteriormente mencionado.
Este tercer metodo de la invencion es una valiosa herramienta para el tratamiento de lesiones papilares de mama debido a que, a la vista de los resultados proporcionados evaluando el riesgo de recidiva de una lesion papilar de
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mama mediante un metodo, tal como el proporcionado por la presente invencion, el especialista puede seleccionar (o descartar) al sujeto que se esta evaluando para que reciba un tratamiento seleccionado de (i) un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y (ii) un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama, de acuerdo con la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1, o del nivel de expresion de la protema proCOL11A1, en la muestra procedente de dicho sujeto. Por lo tanto, los metodos y medios proporcionados por la presente invencion pueden ayudar a los especialistas a seleccionar el tratamiento mas apropiado a administrar a un sujeto con una lesion papilar de mama y evitar los efectos adversos asociados con la administracion de un tratamiento ineficaz.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, en lo sucesivo en el presente documento denominado “cuarto metodo de la invencion”, que comprende
- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o
- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;
en donde dicho tratamiento se selecciona de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos, en donde dicho tratamiento se selecciona:
- si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o
- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior que el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
De acuerdo con el cuarto metodo de la invencion, se detecta la protema proCOL11A1 y/o se determina el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama que se esta evaluando y se correlaciona el resultado obtenido con la posibilidad de seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, en donde dicho tratamiento se selecciona de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos.
Las caractensticas de la muestra, del sujeto a tratar y de la protema proCOL11A1 ya se han mencionado anteriormente en relacion con el primer metodo de la invencion, al igual que los metodos para detectar y/o cuantificar dicha protema, y se incorporan en el presente documento como referencia.
Una vez analizada la presencia y/o la cantidad de protema proCOL11A1 en la muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama en estudio, es posible evaluar la posibilidad de seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, en donde dicho tratamiento se selecciona de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos. La posibilidad de seleccionar dicho tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama se establece a base de la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 o del nivel de expresion de dicha protema en una muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, de forma que, si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en la muestra de control, entonces se selecciona para aplicar a dicho sujeto un tratamiento seleccionado de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos. En caso contrario, ese tratamiento no se seleccionara para ese sujeto con lesion papilar de mama. En una realizacion particular, dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
En una realizacion particular, el especialista selecciona un tratamiento farmacologico para aplicar a un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama. El especialista en el campo elegira el tratamiento farmacologico que considere mas adecuado para el caso a tratar; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de farmacos que pueden utilizarse en dicho tratamiento farmacologico incluyen docetaxel, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, metotrexato, ciclofosfamida, etc. Por lo tanto, en una realizacion particular, el tratamiento farmacologico comprende la administracion de un farmaco adecuado para el tratamiento de una lesion papilar de mama, tal como, por ejemplo, docetaxel, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, metotrexato, ciclofosfamida o, en general, cualquier farmaco que el especialista considere adecuado.
En otra realizacion particular, el especialista selecciona un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama a aplicar a un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama. La extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama puede realizarse mediante cualquiera de las tecnicas mencionadas anteriormente en la presente descripcion o cualquier otra tecnica que el especialista en el campo considere adecuada.
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En otra realizacion particular, el especialista selecciona un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama a aplicar a un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama y un tratamiento farmacologico.
En otra realizacion particular, el cuarto metodo de la invencion comprende adicionalmente, si se desea, un posterior tratamiento por radioterapia que puede incluir, pero sin limitacion, radioterapia externa, radioterapia locorregional o radioterapia interna/braquiterapia, y/o el seguimiento de la evolucion de la enfermedad o del tratamiento aplicado, durante un periodo de tiempo adecuado de acuerdo con el especialista.
El cuarto metodo de la invencion permite, por lo tanto, seleccionar un tratamiento seleccionado de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos, para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama. Por lo tanto, si en la muestra del sujeto analizada se detecta la presencia de la protema proCOL11A1, o si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control, entonces dicho sujeto es, a priori, un candidato adecuado para recibir dicho tratamiento seleccionado de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama y una combinacion de los mismos.
Este cuarto metodo de la invencion constituye una valiosa herramienta para el tratamiento de lesiones papilares de mama debido a que, a la vista de los resultados proporcionados evaluando el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama mediante un metodo tal como el proporcionado por la presente invencion, el especialista puede seleccionar (o descartar) el tratamiento (farmacologico y/o quirurgico) a aplicar al sujeto que se esta evaluando, de acuerdo con la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1, o del nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en la muestra procedente de dicho sujeto. Por lo tanto, los metodos y medios proporcionados por la presente invencion pueden ayudar a los especialistas a seleccionar el tratamiento mas adecuado a administrar a un sujeto con una lesion papilar de mama y a evitar los efectos adversos asociados con la administracion de un tratamiento ineficaz.
Usos
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de la protema proCOL11A1 como marcador para pronosticar la evolucion clmica, o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
En una realizacion particular, la lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
En otra realizacion particular, la recidiva de la lesion papilar de mama es una recidiva en un carcinoma de mama o un tumor de mama. En otra realizacion particular, dicha recidiva es una recidiva en adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo espedfico que reconoce la protema proCOL11A1, o un fragmento del mismo que reconoce la protema proCOLl1A1, como marcador para pronosticar la evolucion clmica, o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
Las caractensticas del anticuerpo espedfico que reconoce la protema proCOL11A1, o un fragmento del mismo que reconoce la protema proCOL11A1, se han mencionado en relacion con el primer metodo de la invencion, en particular, en relacion con el metodo (A), y se incorporan en el presente documento como referencia. Ventajosamente, el anticuerpo que reconoce la protema proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce de forma espedfica el subdominio VAR en el propeptido N terminal de proCOL11A1. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos que detectan de forma espedfica proCOL11A1 se mencionan en la solicitud de patente internacional PCT/ES2012/070616 [documento WO 2013/021088]. En una realizacion particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54), un anticuerpo que reconoce de forma espedfica la protema proCOL11A1, sin detectar otras protemas con alta homologfa de secuencia, tal como la protema COL5A1.
En una realizacion particular, la lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
En otra realizacion particular, la recidiva de la lesion papilar de mama es una recidiva en un carcinoma de mama o tumor de mama. En otra realizacion particular, dicha recidiva es una recidiva en adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar
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invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama , cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un kit que comprende un reactivo que reconoce la protema proCOLIlAl, o un reactivo para la deteccion y/o cuantificacion de la expresion del gen colllal, para pronosticar la evolucion clmica y/o para predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, o para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama.
En una realizacion particular, dicho reactivo que reconoce la protema proCOL11A1 es un anticuerpo espedfico que reconoce la protema proCOL11A1, o un fragmento del mismo que reconoce la protema proCOL11A1. Las caractensticas de dicho anticuerpo espedfico que reconoce la protema proCOL11A1, o un fragmento del mismo que reconoce la protema proCOLllAI, se han mencionado en relacion con el primer metodo de la invencion, en particular, en relacion con el metodo (A) y se incorporan en el presente documento como referencia. Ventajosamente, el anticuerpo que reconoce la protema proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce de forma espedfica el subdominio VAR en el propeptido N terminal de proCOL11A1. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos que detectan de forma espedfica proCOL11A1 se mencionan en la solicitud de patente internacional PCT/ES2012/070616 [documento WO 2013/021088]. En una realizacion particular, dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 1E8.33 (Garda-Ocana, et al., Int J Oncol. 2012; 40(5):1447-54), un anticuerpo que reconoce de forma espedfica la protema proCOL11A1, sin detectar otras protemas con alta homologfa de secuencia, tal como la protema COL5A1.
En otra realizacion particular, dicho reactivo para la deteccion y/o cuantificacion de la expresion del gen colllal comprende una pareja de cebadores de oligonucleotido que amplifican de forma espedfica una region del gen colllal y/o una sonda de nucleotidos que reconoce una region del gen colllal; en una realizacion particular, dicha pareja de cebadores de oligonucleotido comprende los oligonucleotidos cuyas secuencias de nucleotidos se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
En una realizacion particular, la recidiva de la lesion papilar de mama es una recidiva en un carcinoma de mama o tumor de mama. En otra realizacion particular, dicha recidiva es una recidiva en adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
En otra realizacion particular, la lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
A la vista de lo anterior, el experto en la materia entendera que la invencion permite adicionalmente clasificar las lesiones papilares de mama, en particular, los papilomas intraductales de mama, de acuerdo con su tendencia o su riesgo a recidivar y/o evolucionar a carcinomas (hacerse malignos), lo que es util para decidir sobre el tratamiento y regimen de seguimiento mas adecuados para cada sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, mediante la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1, o la cuantificacion del nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1, en una muestra de dicho sujeto. Por lo tanto, la invencion proporciona metodos y productos para la deteccion in vitro, altamente sensible y espedfica, de las lesiones papilares de mama, en particular de los papilomas intraductales de mama, con riesgo a evolucionar a lesiones agresivas y, por lo tanto, susceptibles de reseccion (es decir, de ser extirpados de forma quirurgica) en el momento del diagnostico y de ser sometidos a un seguimiento posterior mas exhaustivo, y distinguirlos de las lesiones papilares de mama, en particular de los papilomas intraductales de mama, que son benignas y que no precisan una estrategia terapeutica agresiva.
El siguiente ejemplo ilustra la invencion y no debe ser considerado en un sentido limitativo de la misma.
EJEMPLO 1
Expresion diferencial de procol11A1 en papilomas intraductales de mama y correlacion con agresividad biologica
1.1 Materiales y Metodos
Inmunohistoqmmica
Se cortaron con un microtomo cortes de biopsias con aguja gruesa (BAG) fijados en formol e incluidos en parafina, de pacientes con al menos 5 anos de seguimiento despues de la extraccion del corte histologico. Los cortes de 34 pm se secaron durante una noche a 54-56 °C en una estufa. Se aplico un pretratamiento con tampon CC2 [sigla de cell conditioning 2: acondicionante celular 2] [Ventana Medical Systems, Inc.; n.° de catalogo 950-123] a 98 °C durante 32 minutos. Tras una titulacion para ajustar la concentracion de anticuerpo adecuada, entre 65, 26 y 13 pg/ml, se incubaron las preparaciones con el anticuerpo monoclonal 1E8.33 espedfico para proCOL11A1 a una
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concentracion de 26 |jg/ml en diluyente de anticuerpo (Ventana-Roche, Tucson, Arizona) durante 32 minutes a temperatura ambiente. Se empleo el sistema de deteccion “Optiview” (Ventana) y se revelo con diaminobencidina (DAB) (Ventana).
Se analizaron 61 casos de papiloma intraductal con el anticuerpo monoclonal 1E8.33 espedfico para proCOL11A1. La inmunotincion se evaluo con un ensayo doble ciego realizado por 2 observadores distintos. Se considero positivo cuando al menos una celula con morfologfa fibroblastica tema un inmunoprecipitado.
1.2 Analisis de los datos estadisticos
Se utilizo el test exacto de Fisher para calcular la distribucion de frecuencias. Se asumio una p<0,05 como significativa.
1.3 Resultados
Se estudio la expresion de la protema proCOL11A1 en cortes histologicos de cilindros tisulares de biopsias de papilomas intraductales, procedentes de pacientes con al menos 5 anos de seguimiento despues de la extraccion del corte histologico, analizados con anticuerpos espedficos para la protema proCOL11A1 (1E8.33). El objetivo de estos experimentos fue determinar si la presencia de inmunomarcaje proCOL11A1 podfa asociarse a una recidiva maligna. Veintiseis de los 61 casos analizados fueron positivos para el inmunomarcaje con el anticuerpo espedfico para la protema proCOL11A1, es decir, presentaban expresion de la protema proCOL11A1, y 35 fueron negativos (Figura 1A).
De los 26 casos positivos, 10 pacientes presentaron recidiva maligna en forma de carcinoma infiltrante de mama, tras al menos 5 anos de seguimiento (Figura 1B), 3 pacientes presentaron recidiva en forma de papiloma o lesion benigna y 13 pacientes no presentaban recidiva hasta el momento del analisis inmunohistoqmmico de los tejidos.
De los 35 casos negativos, sin expresion de proCOL11A1, solo un paciente presento recidiva en forma de carcinoma infiltrante y 4 pacientes presentaron recidiva benigna (Figura 2).
De acuerdo con el test de Fischer, la frecuencia de la tincion positiva para proCOL11A1 mostro diferencias estadfsticamente significativas (p<0,005) entre el grupo de pacientes con recidivas malignas y el grupo de pacientes con recidivas benignas, y entre el grupo de pacientes con recidivas malignas y el grupo de pacientes sin recidiva.
Ademas, se calculo la sensibilidad para predecir recidivas (72 %), la sensibilidad para predecir recidivas malignas (91 %), la especificidad para detectar recidivas (70 %) y la especificidad para detectar recidivas malignas (68 %), asf como los valores predictivos positivos (los VPP) y los valores predictivos negativos (los VPN) para detectar recidivas (las VPP 69 % y las VPN 88 %) y recidivas malignas (VPP 61 % y VPN 97 %). Estos resultados demuestran que este marcador (proCOL11A1) tiene una alta sensibilidad para predecir recidivas, siendo aun mayor para predecir recidivas malignas.
1.4 Conclusiones
La inmunotincion con el anticuerpo monoclonal 1E8.33, que es espedfico para proCOL11A1, es altamente sensible y espedfico en la deteccion de pacientes con papiloma intraductal de mama que van a desarrollar una recidiva o una recidiva maligna.
Claims (17)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo in vitro para pronosticar la evolucion cKnica y/o predecir el riesgo de recidiva de una lesion papilar de mama, seleccionado del metodo (A) y el metodo (B), en dondeA) el metodo (A) comprende- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1;en donde- la deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es alto, o- la no deteccion de la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es indicativa de que el riesgo de recidiva es bajo, yB) el Metodo (B) comprende- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOLIlAl en una muestra de control;en donde- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama superior al nivel de expresion de dicha protema proCOLl1A1 en una muestra de control es indicativo de que el riesgo de recidiva es alto, o- un nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control es indicativo de que el riesgo de recidiva es bajo.
- 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha muestra es una muestra de tejido de mama o una muestra de fluido biologico.
- 3. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende adicionalmente obtener de dicha muestra un extracto de protemas o un extracto que comprende el ARN total.
- 4. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la deteccion de la protema proCOL11A1 comprende poner en contacto el tejido de mama, o el extracto de protemas de la muestra, con un anticuerpo espedfico para la protema proCOL11A1, en condiciones que permiten la formacion de un complejo de anticuerpo-protema proCOL11A1.
- 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde dicho anticuerpo espedfico para la protema proCOL11A1 es un anticuerpo que reconoce un epftopo emplazado en el dominio VAR del extremo N terminal de la protema proCOL11A1.
- 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, en donde dicho anticuerpo espedfico para la protema proCOL11A1 es el anticuerpo monoclonal 1E8.33.
- 7. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la deteccion y/o cuantificacion del complejo de anticuerpo-protema proCOL11A1 formado se lleva a cabo mediante una tecnica seleccionada del grupo que consiste en transferencia de Western, ELISA, RIA, EIA competitivo, DAS-ELISA, tecnicas inmunocitoqmmicas e inmunohistoqmmicas, tecnicas de deteccion multiple basadas en el uso de microesferas, biochips o micromatrices de protemas que incluyen anticuerpos espedficos, o ensayos basados en precipitacion coloidal.
- 8. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha recidiva es una recidiva en un carcinoma de mama o tumor de mama.
- 9. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha recidiva es una recidiva en adenocarcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar in situ, carcinoma lobulillar invasivo, carcinoma tubular, carcinoma medular, carcinoma mucinoso o coloide, carcinoma papilar, carcinoma inflamatorio, carcinoma cribiforme, enfermedad de Paget de mama, cancer de mama invasivo o cancer de mama metastasico.
- 10. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha lesion papilar de mama es un papiloma intraductal de mama.
- 11. Un metodo para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, para un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permite asegurar la extirpacion completa de la lesion y el tratamiento farmacologico preventivo para prevenir la recidiva, asf como el510152025303540455055seguimiento exhaustivo de la evolucion de la lesion, que permite la deteccion temprana de la posible recidiva, que comprende- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;en donde dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento:- si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
- 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicho tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama mediante un metodo que permite asegurar la extirpacion completa de la lesion, comprende la realizacion de una mastectoirna parcial o total.
- 13. Un metodo para seleccionar un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama para un tratamiento seleccionado de un tratamiento que comprende la extirpacion de dicha lesion papilar de mama por cirugfa conservadora y un tratamiento que comprende la no extirpacion de dicha lesion papilar de mama, que comprende- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;en donde dicho sujeto se selecciona para dicho tratamiento:- si no se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es igual o inferior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
- 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde dicho tratamiento que comprende la extirpacion de la lesion papilar de mama por cirugfa conservadora comprende la reseccion por microtomo, la reseccion por cilindros de dicha lesion papilar de mama o la reseccion en bloque que comprende el conducto afectado.
- 15. Un metodo para seleccionar un tratamiento para un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama, que comprende- detectar en una muestra de un sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama la presencia de la protema proCOL11A1; o- comparar el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra con el nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en una muestra de control;en donde dicho tratamiento se selecciona de un tratamiento farmacologico, un tratamiento que comprende la extirpacion quirurgica de dicha lesion papilar de mama, y una combinacion de los mismos, en donde dicho tratamiento se selecciona:- si se detecta la presencia de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama; o- si el nivel de expresion de la protema proCOL11A1 en dicha muestra del sujeto diagnosticado de una lesion papilar de mama es superior al nivel de expresion de dicha protema proCOL11A1 en la muestra de control.
- 16. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde dicho tratamiento farmacologico comprende la administracion de un farmaco seleccionado del grupo que consiste en docetaxel, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, metotrexato, ciclofosfamida o sus combinaciones.
- 17. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 15 o 16, en donde dicho tratamiento comprende adicionalmente el posterior tratamiento por radioterapia.
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