WO2018074865A2 - 유방암 예후 예측용 조성물 및 방법 - Google Patents

유방암 예후 예측용 조성물 및 방법 Download PDF

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이한별
윤성로
김선
권선영
김민수
김효기
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서울대학교병원
서울대학교산학협력단
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the present invention includes a composition for predicting the prognosis of breast cancer, comprising a preparation for measuring the expression level of a gene for predicting the prognosis of breast cancer, a kit for predicting prognosis of the breast cancer comprising the composition, and measuring the expression level of the gene breast cancer
  • the present invention relates to a method of providing information for predicting the prognosis.
  • breast cancer can predict the prognosis by pathological observation, the standardization and quantification of observations are difficult and the reliability of prognosis is low. Therefore, the clinical practice recommends chemotherapy for most early breast cancer patients.
  • the nature of chemotherapy is very painful for patients and requires economic expenditure. Therefore, predicting the patient's prognosis and reducing unnecessary chemotherapy will greatly help the patient's quality of life.
  • Oncotype DX® which is currently used as a standard among breast cancer prognostic tools constructed using gene analysis, is a real-time PCR-based test and it is difficult to analyze many genes simultaneously in terms of cost and efficiency.
  • the prediction of breast cancer prognosis by analysis of multigene markers is superior to the prediction by single marker or analysis by clinicopathological factors.
  • Next-generation sequencing (NGS) is a large-scale sequencing technology that is more efficient than previous technologies, and is rapidly becoming the standard platform for all genome research due to the rapid drop in test price. In clinical applications, information for determining treatment can be obtained faster, more sensitively, and more reproducibly than conventional PCR.
  • a gene set related to prognosis was constructed by using the expression level of estrogen receptor-positive breast cancer and analyzed based on NGS.
  • One aspect provides a composition for predicting prognosis of breast cancer.
  • Another aspect provides a kit for predicting prognosis of breast cancer.
  • Another aspect provides a method of providing information for predicting prognosis of breast cancer.
  • compositions for predicting prognosis of breast cancer comprising an agent for measuring mRNA expression levels of the genes listed in Table 1 below.
  • ACTB actin beta
  • accession No. for the nucleotide sequence is NM_001101.
  • APOBEC3B Homo sapiens apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B and the accession No. for the nucleotide sequence is NM_004900.
  • ASF1B is the anti-silencing function 1B histone chaperone and the accession No. for the nucleotide sequence is NM_018154.
  • mRNA expression level measurement is a process of confirming the presence and expression of mRNA of the gene in a biological sample in order to predict the prognosis of breast cancer, can be known by measuring the amount of mRNA.
  • the expression levels are RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, DNA It may be measured by microarray, or hyperparallel sequencing.
  • the composition may be used in an analysis for confirming the presence and expression level of mRNA of the gene using superparallel sequencing.
  • the composition can be, for example, one used in an RNA-sequencing assay or a targeted RNA-sequencing assay.
  • the term “superparallel sequencing” may also be referred to as Next Generation Sequencing (NGS) or high-throughput sequencing.
  • the hyperparallel sequencing includes a method currently known as next generation sequencing and a method that can be developed in the future.
  • the hyperparallel sequencing comprises a group consisting of sequencing by synthesis, ion-torrent sequencing, pyrosequencing, ligation sequencing, nanopore sequencing, and single-molecule real-time sequencing. It may be selected from.
  • the agent for measuring the expression level may comprise a primer pair or probe that specifically hybridizes to the mRNA of the gene or cDNA thereof. Since the nucleotide sequence of the gene is known in the art, a person skilled in the art can specifically hybridize with a primer pair or a specific region capable of specifically amplifying a specific region of each gene based on the nucleotide sequence. You can design
  • the probe may be a single stranded DNA probe or an RNA probe.
  • the agent may be a set of oligonucleotides that specifically hybridize to mRNA of the gene or cDNA thereof.
  • the set of oligonucleotides may comprise one or more oligonucleotides that specifically hybridize to their respective mRNAs or cDNAs for said gene.
  • the agent comprises at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 70, at least 90, at least 100, or at least 150 different oligos that specifically hybridize to mRNA or cDNA of each gene. May comprise a set of nucleotides.
  • the agent may comprise 30 to 40 oligonucleotides that specifically hybridize to their mRNA or cDNA for the ACTB gene.
  • the agent may be a set of DNA oligonucleotides.
  • the DNA oligonucleotide may be chemically synthesized.
  • the DNA oligonucleotide may be transcribed to generate an RNA oligonucleotide that specifically hybridizes to mRNA of each gene or cDNA thereof.
  • the transcription may be in-vitro transcription.
  • the agent may comprise one or more DNA oligonucleotides that are transcribed into one or more oligonucleotides that hybridize specifically to their respective mRNAs or cDNAs for said gene.
  • the agent may comprise one or more DNA oligonucleotides such as for each of the 149 genes.
  • the agent may be a set of oligonucleotides having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1-9241.
  • a set of oligonucleotides having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 316 may be transcribed to produce a set of oligonucleotides that specifically hybridize to mRNA of the ACTB, APOBEC3B, ASF1B, ASPM, and AURKA genes or their cDNAs. Can be generated.
  • the breast cancer may be an estrogen receptor-positive (ER +).
  • kits for predicting prognosis of breast cancer comprising the composition.
  • the kit may include a composition, solution, or device suitable for measuring mRNA expression level, in addition to primer pairs, probes, or oligonucleotides for measuring mRNA expression level of the gene.
  • the kit may be a kit including the components required to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit may include enzymes such as reaction buffers, dNTPs, Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNases, RNase inhibitors, DEPC-water and the like in addition to the primer pairs.
  • the kit may be in the form of a microarray in which the probe or oligonucleotide is immobilized on a substrate.
  • the probes or oligonucleotides of the kit can be hybridized with libraries prepared for targeting RNA-sequencing.
  • the probe or oligonucleotide can be associated with a substance such as biotin.
  • a part of the library hybridized with the probe or oligonucleotide may be separated by streptavidin magnetic beads.
  • Another aspect is a probe for prognostic prediction of breast cancer, comprising in vitro transcription of the set of DNA oligonucleotides or a set of oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-9241 to generate a set of RNA oligonucleotides. It provides a method of manufacturing.
  • RNA-sequencing eg, targeted RNA-sequencing.
  • Another aspect provides a method of providing information for predicting prognosis of breast cancer, comprising measuring mRNA expression levels of the genes of Table 1 in an individual to predict the prognosis of breast cancer.
  • the method may include incubating the mRNA isolated from the individual or its cDNA with an agent for measuring the mRNA expression level of the gene to determine the mRNA expression level of the gene.
  • the formulation is as described above.
  • the agent may be an oligonucleotide that specifically binds to mRNA of the gene or cDNA thereof.
  • the agent comprises at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 70, at least 90, at least 100, or at least 150 different oligos that specifically hybridize to mRNA or cDNA of each gene. May comprise a set of nucleotides.
  • the incubation may form a hybridized complex of mRNA of the gene or cDNA thereof and the oligonucleotide.
  • the mRNA of the gene or cDNA thereof in the hybrid complex may be termed a captured target transcript.
  • the agent may be obtained by transcription of DNA oligonucleotides in vitro.
  • the DNA oligonucleotide may be chemically synthesized.
  • the agent may comprise one or more DNA oligonucleotides that are transcribed into one or more oligonucleotides that hybridize specifically to their respective mRNAs or cDNAs for said gene.
  • the agent may comprise one or more DNA oligonucleotides such as for each of the 149 genes.
  • the DNA oligonucleotide may be a set of oligonucleotides having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1-9241.
  • the method may further comprise the step of separating the hybrid complex. Separation of the hybrid composite may be made by magnetic particles. For separation by the magnetic particles, the oligonucleotide may be combined with a material such as biotin. The oligonucleotides bound to biotin form hybrid complexes with mRNAs or cDNAs specific thereto, and the hybrid complexes can be separated by streptavidin-coated magnetic particles. The hybrid complex can also be separated by washing away nontargeted transcripts that do not form hybrid complexes with the oligonucleotides in the incubation reaction.
  • Measurement of the expression level can be performed by RT-PCR, competitive RT-PCR, real time RT-PCR, RNase protection assay, northern blotting, DNA microarray, or hyperparallel sequencing. Since the method targets a large number of genes to be analyzed, measurement of expression levels by hyperparallel sequencing may be efficient.
  • the hyperparallel sequencing may be selected from the group consisting of sequencing by synthesis, ion torrent sequencing, pyro sequencing, sequencing by ligation, nanopore sequencing, and single-molecule real time sequencing.
  • the determination of the expression level can be performed, for example, via targeted RNA-sequencing assays.
  • the breast cancer may be estrogen receptor positive.
  • a composition or kit for predicting prognosis of breast cancer, or an information providing method for predicting prognosis of breast cancer is based on expression information of a gene set configured for accurate prediction, thereby providing a reliable result.
  • the composition, kit, or information providing method can be analyzed using ultra-parallel sequencing using probes optimized to accurately and effectively generate expression data for multiple genes, enabling rapid, sensitive and reproducible prognostic diagnosis. Let's do it.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a probe design.
  • Oncotype DX® calculates the Recurrent Score (RS) with 21 genes to score prognostic predictions for breast cancer patients with values from 0 to 100.
  • the RS value of Oncotype DX was applied to a public data set to select new candidate genes with high correlation between RS and individual genes.
  • the open data used were ER +, 7 data of GSE7390, GSE2034, GSE2990, GSE4922, GSE12093, GSE3494, and GSE6532 on Affymetrix platform satisfying Lymph node-conditions.
  • the RS value was calculated using a recurrence-scoring algorithm of the following formula described in the paper (Paik S et al. "A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer.” New England Journal of Medicine 351.27 (2004): 2817-2826).
  • the algorithm uses 16 genes except 5 reference genes, and the calculation formula and range limit of each group score are as described in FIG. 1 of the paper. Finally the RS value was readjusted from 0 to 100.
  • the mean correlations between the RS values of each sample and the expression values of genes were calculated using the average values of Pearson's correlation and Spearman's rank correlation.
  • the absolute value of the mean correlation coefficient for the seven data is 0.5 or more, it was determined that there is a correlation between RS and individual genes.
  • 135 genes correlated with RS were selected and 16 genes included in the algorithm were added to these genes to obtain a candidate gene group consisting of a total of 149 genes shown in Table 1 above.
  • Microarray data from breast cancer data provided by SurvExpress For the Wang Foekens Breast GSE2034 (Affymetrix) and Breast Invasive Carcinoma TCGA (Agilent) data sets, 16 genes included in the Oncotype DX recurrence-scoring algorithm (excluding reference genes) and 1.1. Kaplan-Meier plots of 135 candidate genes analyzed to correlate with RS were plotted and compared.
  • SurvExpress is a tool and database for online validation of biomarkers for cancer gene expression data using survival analysis (Raul Aguirre-Gamboa et al., PLoS One. 2013; 8 (9): e74250).
  • 1 shows the results of comparing Kaplan-Meier survival analysis curves to GSE2034 microarray data.
  • 2 shows the results of comparing Kaplan-Meier survival analysis curves to TCGA data.
  • the horizontal axis represents time and the vertical axis represents survival probability.
  • Exon region information of each gene was confirmed with reference to the RefSeq database for the genes selected in Example 1 above.
  • information on intergenic regions including a promoter, a ribosomal binding site (RBS), and a transcription factor binding site was also identified to confirm the influence of transcription-related factors of each gene.
  • the start point of the probe was set in the intergenic region by extending a portion in the upstream direction on the reference genome based on the start point of the coding sequence among the recombined sequences. From this starting point, the probes were designed sequentially so that some of the probes overlap the probes in the next sequence. The degree of overlap between the probes was adjusted based on the capture efficiency of the area in the previous study. When the sequence of the site to which the probe is bound has a high GC ratio or a specific sequence appears repeatedly, the capture sequence is increased by adjusting the probe sequence differently from the sequence of the site to which the probe is bound.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a probe design.
  • probe sequences for each gene are as shown in Tables 2 to 4 below.

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Abstract

유방암 예후 예측을 위한 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 유방암의 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유방암의 예후 예측용 키트, 및 상기 유전자의 발현 수준을 측정하여 유방암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

유방암 예후 예측용 조성물 및 방법
본 발명은 유방암 예후 예측을 위한 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 유방암의 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유방암의 예후 예측용 키트, 및 상기 유전자의 발현 수준을 측정하여 유방암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
유방암은 병리학적 관찰로 대략적인 예후를 예측할 수 있으나, 관찰결과에 대한 표준화와 정량화가 어렵고 예후예측에 대한 신뢰성이 낮아, 실제 임상에서는 대부분의 초기 유방암 환자에게 항암치료를 권하고 있다. 항암치료의 특성상 환자가 겪는 고통이 매우 크고 경제적 지출이 요구된다. 따라서, 환자의 예후를 예측하여 불필요한 항암치료를 줄인다면, 환자의 삶의 질에 큰 도움이 될 것이다.
현재 유전자 분석을 이용하여 구성된 유방암 예후예측 도구 중 표준으로 사용되고 있는 Oncotype DX® 등은 실시간 PCR 기반의 검사로서 비용과 효율성의 측면에서 많은 유전자를 동시에 분석하기 어렵다. 단일 마커에 의한 예측이나 임상병리학적 요인에 의한 분석에 비해 다유전자 마커의 분석에 의한 유방암 예후 예측이 우월하다. 차세대 서열분석법(NGS)은 이전의 기술에 비해 효율성이 월등한 대용량 서열분석기술로, 급격한 검사가격의 하락으로 현재 모든 유전체 연구의 표준 플랫폼으로 빠르게 자리잡고 있다. 임상에 적용할 경우 치료를 결정하기 위한 정보를 기존 PCR 방식보다 빠르고 민감하고 재현성 높게 얻을 수 있어 유용성이 높다.
이에 본 발명에서는 에스트로겐 수용체 양성 유방암의 발현량을 이용하여 예후와 관련된 유전자 세트를 구성하고, NGS 기반으로 분석하고자 하였다.
일 양상은 유방암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 유방암의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 유방암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 표 1에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 유방암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
Figure PCTKR2017011606-appb-T000001
상기 유전자 symbol에 해당하는 명칭 및 accession No.에 대해서는 공개된 문헌 또는 데이터베이스를 통해 통상의 기술자에게 알려진 정보를 참조한다. 상기 공개 데이터베이스로서 HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)를 참조할 수 있다. 상기 149개의 유전자 중 일부를 예로서 설명하면 다음과 같다: ACTB에 대한 명칭은 actin beta이고 뉴클레오티드 서열에 대한 accession No.는 NM_001101이다. APOBEC3B에 대한 명칭은 Homo sapiens apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B이고 뉴클레오티드 서열에 대한 accession No.는 NM_004900이다. ASF1B에 대한 명칭은 anti-silencing function 1B histone chaperone이고 뉴클레오티드 서열에 대한 accession No.는 NM_018154이다.
본 명세서에서 용어 "mRNA 발현 수준 측정"은 유방암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 해당 유전자의 mRNA 존재 여부 및 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 상기 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 마이크로어레이, 또는 초병렬 시퀀싱에 의해 측정되는 것일 수 있다. 상기 조성물은, 초병렬 시퀀싱을 이용하여 상기 유전자의 mRNA의 존재 여부 및 발현 정도를 확인하기 위한 분석에서 사용되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, RNA-시퀀싱 분석 또는 표적화(targeted) RNA-시퀀싱 분석에서 사용되는 것일 수 있다.
용어 "초병렬 시퀀싱"은, 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing: NGS) 또는 고용량 시퀀싱(high-throughput sequencing)으로도 명명될 수 있다. 상기 초병렬 시퀀싱은 현재 차세대 염기서열 분석법으로 알려진 방법 및 장래 개발될 수 있는 방법을 포함한다. 상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱(sequencing by synthesis), 이온 토렌트(Ion-Torrent) 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 유전자의 염기서열은 당해 분야에 알려진 상태이므로, 통상의 기술자는 상기 염기서열을 바탕으로 각 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 또는 특정 영역과 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 디자인할 수 있다. 상기 프로브는 단일가닥 DNA 프로브 또는 RNA 프로브일 수 있다.
상기 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 세트일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 세트는 상기 각 유전자에 대해서 그의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 제제는 상기 각 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 10종 이상, 20종 이상, 30종 이상, 50종 이상, 70종 이상, 90종 이상, 100종 이상, 또는 150종 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 ACTB 유전자에 대해서 그의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 30개 내지 40개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 제제는 DNA 올리고뉴클레오티드의 세트일 수 있다. 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 전사됨으로써 상기 각 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것일 수 있다. 상기 전사는 인 비트로 전사일 수 있다.
상기 제제는, 상기 각 유전자에 대하여 그의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 전사되는 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 제제는 상기 149개의 유전자 각각에 대해 그와 같은 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 제제는 서열번호 1 내지 9241의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트는 전사됨으로써 ACTB, APOBEC3B, ASF1B, ASPM, 및 AURKA 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 세트를 생성할 수 있다.
상기 유방암의 예후 예측용 조성물에서, 상기 유방암은 에스트로겐 수용체 양성(estrogen receptor-positive, ER+)을 나타내는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 조성물을 포함하는, 유방암의 예후 예측용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 쌍, 프로브, 또는 올리고뉴클레오티드 외에도, mRNA 발현 수준의 측정방법에 적합한 조성물, 용액, 또는 장치를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 구성요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 프라이머 쌍 외에도 반응 완충액, dNTPs, Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 프로브 또는 올리고뉴클레오티드가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 상기 키트의 프로브 또는 올리고뉴클레오티드는 표적화 RNA-시퀀싱을 위해 제조된 라이브러리와 혼성화될 수 있다. 표적화 RNA-시퀀싱을 위해, 상기 프로브 또는 올리고뉴클레오티드는 비오틴과 같은 물질과 결합될 수 있다. 이 경우, 스트렙타비딘 자성 비드에 의해 상기 프로브 또는 올리고뉴클레오티드와 혼성화된 라이브러리의 일부가 분리될 수 있다.
다른 양상은, 상기 DNA 올리고뉴클레오티드의 세트 또는 서열번호 1 내지 9241의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트를 인 비트로 전사하여 RNA 올리고뉴클레오티드의 세트를 생성하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 생성된 RNA 올리고뉴클레오티드의 세트는 RNA-시퀀싱, 예를 들면, 표적화 RNA-시퀀싱을 위해 시료 중의 mRNA 또는 cDNA와 인큐베이션될 수 있다.
또 다른 양상은, 유방암의 예후를 예측하고자 하는 개체에서 상기 표 1의 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위하여, 상기 개체로부터 분리된 mRNA 또는 그의 cDNA와 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 상기 제제에 대해서는 전술된 바와 같다.
상기 인큐베이션에서, 상기 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 제제는 상기 각 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 10종 이상, 20종 이상, 30종 이상, 50종 이상, 70종 이상, 90종 이상, 100종 이상, 또는 150종 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션에 의해 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA와 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성 복합체(hybridized complex)가 형성될 수 있다. 상기 혼성 복합체 중 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA는 포획된(captured) 표적 전사체로 명명될 수 있다.
상기 제제는 DNA 올리고뉴클레오티드를 인 비트로 전사하여 수득되는 것일 수 있다. 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 제제는, 상기 각 유전자에 대하여 그의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 전사되는 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 제제는 상기 149개의 유전자 각각에 대해 그와 같은 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 9241의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트일 수 있다.
상기 방법은, 상기 혼성 복합체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 혼성 복합체의 분리는 자성 입자에 의해 이루어지는 것일 수 있다. 상기 자성 입자에 의한 분리를 위하여, 상기 올리고뉴클레오티드는 비오틴과 같은 물질과 결합된 것일 수 있다. 비오틴과 결합된 상기 올리고뉴클레오티드는 그에 특이적인 mRNA 또는 cDNA와 혼성 복합체를 형성하고, 상기 혼성 복합체가 스트렙타비딘이 코팅된 자성 입자에 의해 분리될 수 있다. 또한, 인큐베이션 반응물 중 상기 올리고뉴클레오티드와 혼성 복합체를 형성하지 않은 비표적(nontargeted) 전사체를 워싱함으로써(wash away) 상기 혼성 복합체를 분리할 수 있다.
상기 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, DNA 마이크로어레이, 또는 초병렬 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 다수 유전자를 분석 대상으로 하므로, 초병렬 시퀀싱에 의한 발현 수준의 측정이 효율적일 수 있다. 상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱, 이온 토렌트 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 발현 수준의 측정은 예를 들면, 표적화 RNA-시퀀싱 분석을 통해 수행될 수 있다.
상기 유방암은 에스트로겐 수용체 양성을 나타내는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 유방암의 예후 예측용 조성물 또는 키트, 또는 유방암의 예후 예측을 위한 정보제공방법은, 정확한 예측을 위해 구성된 유전자 세트의 발현 정보에 기초하므로 신뢰성 높은 결과를 제공한다. 상기 조성물 또는 키트, 또는 정보제공방법은 다수 유전자에 대한 발현 데이터를 정확하고 효과적으로 생성할 수 있도록 최적화된 프로브를 이용하고, 초병렬 시퀀싱을 통해 분석될 수 있어 신속하고 민감하며 재현성 높은 예후 진단을 가능하게 한다. 또한, 유방암의 재발 가능성에 따라 적절한 치료법을 선택할 수 있게 하고 환자의 생존율을 높이는데 기여할 수 있다.
도 1은 GSE2034 마이크로어레이 데이터에 대해 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 TCGA 데이터에 대해 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 프로브 디자인의 모식도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 유방암 예후예측 유전자 선정
1.1. 후보 유전자의 선정
Oncotype DX®는 21종의 유전자로 재발 점수(Recurrent Score: RS)를 계산하여 0 내지 100의 값으로 유방암 환자의 예후 예측을 점수화한다. Oncotype DX의 RS 값을 공개 데이터 세트에 적용하여, RS와 개별 유전자간의 상관관계가 높은 새로운 후보 유전자를 선정하고자 하였다.
사용된 공개 데이터는 ER+, Lymph node- 조건을 만족하는 Affymetrix platform의 GSE7390, GSE2034, GSE2990, GSE4922, GSE12093, GSE3494, 및 GSE6532의 7개 데이터였다. 7개 데이터의 각 샘플마다 논문에 기재된 하기 식의 재발-점수 알고리즘을 이용하여 RS 값을 산출하였다(Paik S et al. "A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer." New England Journal of Medicine 351.27 (2004): 2817-2826).
RS = +0.47 × HER2 group score - 0.34 × ER group score + 1.04 × proliferation group score + 0.10 × invasion group score + 0.05 × CD68 - 0.08 × GSTM1 - 0.07 × BAG1
상기 알고리즘은 reference 유전자 5종을 제외한 16종의 유전자를 이용하고 각 그룹 점수의 산출식과 범위 한계값은 상기 논문의 도 1에 기재된 바에 따른다. 최종적으로 RS 값은 0 내지 100으로 재조정되었다.
RS와 개별 유전자 간 상관관계를 구하기 위하여, 각 샘플의 RS 값과 유전자의 발현값 간 평균 상관관계를 Pearson's correlation과 Spearman's rank correlation의 평균값을 이용하여 구하였다. 7개 데이터에 대한 평균 상관계수의 절대값이 0.5 이상인 경우 RS와 개별 유전자 간 상관관계가 있는 것으로 판단하였다. 그 결과, RS와 상관관계가 있는 135개의 유전자를 선정하고 이들 유전자에 상기 알고리즘에 포함된 16개의 유전자를 더하여, 상기 표 1에 기재된 총 149개의 유전자로 이루어진 후보 유전자군을 얻었다.
1.2. 후보 유전자 검증
SurvExpress에서 제공되는 유방암 데이터 중 마이크로어레이 데이터 Wang Foekens Breast GSE2034 (Affymetrix) 및 Breast Invasive Carcinoma TCGA (Agilent) 데이터 세트에 대해, Oncotype DX 재발-점수 알고리즘에 포함된 16개 유전자(reference 유전자 제외) 및 1.1.에서 RS와 상관관계가 있는 것으로 분석된 135개의 후보 유전자의 카플란-마이어 플롯을 그려 비교하였다. SurvExpress는 생존 분석을 이용하여 암 유전자 발현 데이터에 대하여 바이오마커의 유효성을 온라인 상에서 검증하는 도구이자 데이터베이스이다(Raul Aguirre-Gamboa et al., PLoS One. 2013; 8(9): e74250).
도 1은 GSE2034 마이크로어레이 데이터에 대해 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 비교한 결과를 나타낸다. 도 2는 TCGA 데이터에 대해 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 비교한 결과를 나타낸다. 각 그래프에서 가로축은 시간을 나타나고 세로축은 생존 확률을 나타낸다.
도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 기존 Oncotype DX 알고리즘의 16종의 유전자에 비해 새로 선정된 유전자들로 그려진 곡선에서 보다 뚜렷한 차이가 나타났다. 이를 통해, 새로 선정된 유전자들을 이용하여 유방암의 예후를 예측하는 것이 더욱 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 선정된 유전자에 대한 프로브 제작
2.1. 엑손 서열의 재조합
전술된 실시예 1.에서 선정된 유전자에 대해 RefSeq 데이터베이스를 참조하여 각 유전자의 엑손 영역 정보를 확인하였다. 이와 함께, 각 유전자의 전사 관련 인자에 의한 영향을 확인할 수 있도록 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 및 전사인자 결합 부위 등을 포함한 intergenic 영역에 대한 정보도 확인하였다.
각 유전자에 대하여 엑손 서열을 이어 붙여 하나로 연결된 암호화 서열(concatenated coding sequence)을 제작하였다. 이때, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 가능성을 배제하고 각 유전자의 모든 엑손 영역이 연결되어 하나의 전사체(trascript)를 형성한다고 가정하였다. 또한, 유전자의 전사 수준에 영향을 미칠 수 있는 전사인자 결합 부위의 서열도 전사체에 포함되도록 하였다.
2.2. 프로브 제작
각 유전자에 대해 엑손 서열이 재조합된 서열 중 암호화 서열의 시작지점을 기준으로 레퍼런스 게놈 상에서 upstream 방향으로 일정 부분 확장하여 intergenic 영역에서 프로브의 시작지점을 설정하였다. 이 시작지점으로부터 프로브의 일부가 다음 순서의 프로브와 겹치도록 순차적으로 프로브를 디자인하였다. 프로브 간 겹쳐지는 정도는 선행 연구에서의 해당 영역의 포획(capture) 효율에 기반하여 조절하였다. 프로브가 결합되는 부위의 서열이 높은 GC ratio를 지니거나 특정 서열이 반복적으로 나타날 경우, 결합되는 부위의 서열과 다르게 프로브 서열을 조정하여 포획 효율을 증가시켰다.
도 3은 프로브 디자인의 모식도를 나타낸다.
유방암 예후예측 유전자로 선정된 149개 유전자에 대한 프로브 제작 결과, 각 유전자에 대한 프로브 서열은 하기 표 2 내지 표 4에 기재된 바와 같다.
Figure PCTKR2017011606-appb-T000002
Figure PCTKR2017011606-appb-T000003
Figure PCTKR2017011606-appb-T000004

Claims (18)

  1. 하기 표에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 유방암의 예후 예측용 조성물:
    Figure PCTKR2017011606-appb-I000001
    .
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 세트인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 전사됨으로써 상기 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 DNA 올리고뉴클레오티드의 세트인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1 내지 9241의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 유방암은 에스트로겐 수용체 양성을 나타내는 것인 조성물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유방암의 예후 예측용 키트.
  8. 청구항 4 또는 5의 제제를 인 비트로(in vitro) 전사하여 RNA 올리고뉴클레오티드의 세트를 생성하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 프로브를 제조하는 방법.
  9. 유방암의 예후를 예측하고자 하는 개체에서 하기 표에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법:
    Figure PCTKR2017011606-appb-I000002
    .
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 mRNA 또는 그의 cDNA와 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이고, 인큐베이션에 의해 상기 유전자의 mRNA 또는 그의 cDNA와 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성 복합체(hybridized complex)가 형성되는 것인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 제제는 DNA 올리고뉴클레오티드를 인 비트로 전사하여 수득되는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 9241의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 세트인 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 혼성 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 혼성 복합체는 자성 입자에 의해 분리되는 것인 방법.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 발현 수준은 초병렬 시퀀싱에 의해 측정되는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 초병렬 시퀀싱은 합성에 의한 시퀀싱, 이온 토렌트 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 및 단일-분자 실시간 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 청구항 9에 있어서, 상기 유방암은 에스트로겐 수용체 양성을 나타내는 것인 방법.
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