MX2007001640A - Metodos y kit para el pronostico de cancer de mama. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo y kit, que incluye partes del mismo, para el pronostico de cancer de mama. En particular, el metodo involucra identificar un patron de expresion de gen o firma molecular, que indica la probabilidad de supervivencia de un paciente con cancer de mama, y/o la probabilidad de recurrencia de la enfermedad en un paciente a ser tratado, o que ha sido tratado, por cancer de mama, y la probabilidad de un paciente que tiene una forma metastasica de cancer. Se han identificado seis firmas moleculares, que comprenden doce grupos/series de marcadores moleculares, los cuales tienen relevancia en la determinacion del pronostico de un cancer de mama dado. Cada firma molecular comprende una pluralidad de marcadores geneticos cuya expresion, ya sea alta o baja con respecto al tejido normal, es indicativa de un resultado dado, tal como supervivencia o recurrencia.

Description

MÉTODOS Y KIT PARA EL PRONOSTICO DE CÁNCER DE MAMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método y kit, que incluye partes del mismo, para el pronóstico de cáncer de mama. En particular, el método involucra identificar un patrón de expresión de gen que indica la probabilidad de supervivencia de un paciente con cáncer de mama y/o la probabilidad de recurrencia de la enfermedad y/o el carácter metastásico del cáncer, en un paciente a ser tratado, o que ha sido tratado por cáncer de mama.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de mama es el cáncer femenino más común en el Reino Unido, Estados Unidos y Dinamarca. Es también la forma más común de cáncer que afecta a las mujeres en el mundo industrializado. La incidencia de cáncer de mama ha sido gradualmente incrementada, y en los Estados Unidos, es la segunda causa más común de muerte debido al cáncer. Sin embargo, en 1997, se estimó que 181,000 nuevos casos fueron reportados en los Estados Unidos y se ha estimado que 40,000 personas mueren de cáncer de mama cada año. Debido a los esfuerzos globales que se han hecho por combatir esta condición, ha habido muy poco cambio en la incidencia del cáncer de mama, aunque la detección temprana y nuevas terapias han mejorado marginalmente la supervivencia durante algunas décadas pasadas. Mientras el mecanismo de tumorigénesis para la mayoria de los carcinomas de mama es ampliamente desconocido, existe un número de factores que pueden predisponer a algunas mujeres a desarrollar cáncer de mama. Estos incluyen historial de nacimiento, condición menstrual, grado de tumor, estado ER, tamaño de tumor y la implicación de nudos linfáticos al tiempo del diagnóstico y cirugía. Adicionalmente, el pronóstico se puede determinar a grados variantes por el uso de mamografia u otros métodos de formación de imágenes por rayos X. Sin embargo, un mamograma no es sin riesgo y el tumor de mama puede ser inducido por las propiedades ionizantes de la radiación usada durante la prueba. Además, tales procesos son costosos y los resultados pueden ser interpretados de manera diferente por diferentes especialistas. Por ejemplo, un estudio mostró desacuerdos clínicos principales en aproximadamente un tercio de una serie de mamogramas que fueron interpretados por un grupo de radiologistas . Sin embargo, muchas mujeres encuentran que someterse a un mamograma es una experiencia dolorosa. En práctica clinica, el pronóstico de la enfermedad es importante, debido a que determina el tratamiento que se dará. El pronóstico exacto podrá permitir al oncologista, por ejemplo, a favorecer la administración de terapia de hormona o quimioterapia y cirugia recomendada solamente en los casos más agresivos de cáncer. Sin embargo, el diagnóstico temprano ha llegado a ser un factor regular en cáncer de mama, debido a que más y más pacientes están ahora presentándose con la enfermedad en una etapa muy temprana. Esto ha hecho métodos convencionales para valorar el resultado del cáncer más dificil, y ha llegado a ser incrementadamente más evidente que no solamente con el tipo de cáncer, sino también la programación del tratamiento que es clave para como tan bien o escasamente responde un paciente. Por ejemplo, muchos pacientes pueden actualmente, recibir tratamiento innecesario que frecuentemente ocasiona efectos colaterales tóxicos, mientras otros pacientes pueden ser puestos en estrategias de tratamiento conservativo cuando en efecto, un cáncer es más avanzado que el predicho. Puede por lo tanto, ser de vital importancia que se haga un pronóstico correcto y exacto en una etapa temprana. A la fecha, no se han identificado una serie de predictores satisfactorios para el pronóstico, basados solo en la información clinica. Como un resultado, la búsqueda se ha cambiado a buscar firmas moleculares que puedan diagnosticar y pronosticar cáncer. El documento WO 02/103320, describe cientos de marcadores genéticos cuya expresión está correlacionada con pronósticos clínicos, y los cuales pueden ser usados para distinguir pacientes que tienen buenos pronósticos a partir de pronósticos pobres. El método para determinar la expresión involucra comparar el patrón de expresión de una muestra de prueba de tejido tomada a partir de un paciente, con aquel de una muestra de tejido tomada a partir de un paciente con un buen pronóstico y también con aquel de una muestra tomada a partir de un paciente con un pobre pronóstico conocido, y determinar a cual de estas muestras corresponde más estrechamente la muestra de prueba. Aunque esta metodología representa un mejoramiento sobre los métodos clínicos tradicionales de pronósticos, tiene un número de desventajas. Por ejemplo, analizar cientos de marcadores genéticos toma considerable tiempo y no es inherentemente práctico. Además, no es claro si una muestra que expresa algunos de los marcadores de buen pronóstico y algunos de los marcadores de mal pronóstico, da un pronóstico de una o de otra opción. Por consiguiente, debido a la complejidad de la metodología, pueden ser ya sea inexactos, en el sentido de que los pacientes sean puestos en el grupo de pronóstico incorrecto, debido a que expresan más de los genes en un grupo que el otro, o pueden ser incapaz de proporcionar una respuesta definida. Como se explicó previamente, el pronóstico temprano y exacto es vital para el tratamiento apropiado y efectivo. Es claro por lo tanto, que se requiere una firma molecular más definitiva, más simple. Se ha desarrollado por lo tanto, un método para determinar el pronóstico de un cáncer de mama dado, el cual es relativamente directo de realizar, eficiente para emprenderse y proporciona una indicación exacta del resultado probable de la enfermedad. El método usa una muestra pequeña pero altamente representativa de marcadores, los cuales son particularmente exactos en la determinación del resultado probable de un cáncer dado. Sin embargo, el método se puede dividir en tres componentes: un primer componente que predice la probabilidad de supervivencia de un individuo que presenta cáncer de mama; un segundo componente que predice la probabilidad de recurrencia de cáncer de un individuo que presenta cáncer de mama; y un tercer componente que predice el carácter metastásico del cáncer. Como será aparente para aquellos expertos en la técnica, el segundo componente por lo tanto, indica la probabilidad de incidencia de supervivencia de un paciente que presenta cáncer de mama y el tercer componente que indica la naturaleza agresiva de la enfermedad. En resumen, se ha identificado una pluralidad de firmas moleculares que tienen relevancia en determinar el pronóstico de un cáncer de mama dado. Cada firma molecular comprende una pluralidad de marcadores genéticos cuya expresión, ya sea alta o baja con respecto al tejido de un paciente con pronóstico moderado (véase posteriormente) , es indicativa de un resultado dado. Además de esto, se ha analizado cada firma molecular para identificar cuales marcadores genéticos son los mejores indicadores del resultado de una enfermedad dada, en otras palabras, aquellos que contribuyen más a la capacidad predictiva de la firma molecular. Esta subserie de marcadores es conocida, colectivamente, como la firma molecular refinada. Por ejemplo, se proporciona una primera firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares cuya alta expresión se correlaciona con baja relación de supervivencia; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más significantes estadísticamente, de la baja relación de supervivencia, estos son referidos en este documento, colectivamente, como la primera firma molecular primaria [Serie (A) :] AMF, ATF4, Cyrßl, ER, Matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, Nectina4, PARIA, Psoriason, Pttgl, Rho-C, Scotina, SDF1, SEMP1, SPF45, SST1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R, ZO-3; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, referidos en este documento, colectivamente, como la primera firma molecular secundaria [Serie (B) ] : Basigina, Beta-catenina, BMP1, BMP10, Calpaína grande, CD44, CX43, ciclinaD2, EHMS, FAK, FAP, GIRK, HAVRl, Isótopo3, JAK1, LOX12, NET-2, PAR1A2, PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VECAD, Vilip, Wave2. La referencia en este documento a lo anterior y en lo siguiente, los marcadores hacen referencia a una proteína nombrada cuya completa identidad es disponible en la base de datos www.NCBI.LM.NIH.gov o es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. La referencia en este documento a expresión alta o baja, es con respecto al nivel de expresión del mismo marcador, en pacientes quienes fueron considerados por tener un pronóstico moderado, es decir, pacientes con un índice de pronóstico estándar, índice de Pronóstico Nottingham (IPN) = 3.4-5.4, en donde el IPN = 0.2 x tamaño de tumor + grado de tumor + estado nodal, en donde IPN (bajo) es <3.4 y 86% de pacientes sobreviven 15 años IPN (moderado) es 3.4-5.4 y 42% de pacientes sobreviven 15 años IPN (alto) es >5.4 y 13% de pacientes sobreviven 15 años.

Además, se proporciona una segunda firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares cuya baja expresión se correlaciona con baja relación de supervivencia; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más estadísticamente significantes de baja relación de supervivencia, estos son referidos en este documento, colectivamente, como la segunda firma molecular primaria [Serie (C) ] : ARP2, Atf-3, HuR, MEN1, Paracelina, PTP-RK Radixina, Relación RH08/gdiG; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, referidos en este documento, colectivamente, como la segunda firma molecular secundaria [Serie (D) ] : aMOT, Atf-1, Claudina-1, IL22R, Rock 2 Vegl . Aún además se proporciona una tercera firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares, cuya alta expresión se correlaciona con una baja incidencia de supervivencia libre de cáncer; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más estadísticamente significantes de una baja incidencia de supervivencia libre de cáncer; estos son referidos en este documento, colectivamente, como la tercera firma molecular primaria [Serie (E) ] : AAPM, AMFR, Bmp8, BMP9, Beta-catenina, CAR, Crebl2, DRIM, EHMS, Endomuscina2, FAK, FAP, Isótopol, Kissl/ckl9, Notchl, PARIA, ParlA2, PLC-delta, Psoriasina, PTTG1, RhoC, Rockl, SDF1, SST1, ST15, TEM5, TEM7R; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, referidos en este documento, colectivamente, como la tercera firma molecular secundaria [Serie (F)]: Angiotensina2Rl, ATF4, BmplO, CASM, catepsinaS, CX43, Elastasa PMN, GIRK, HAVRl, HIN, Isótopo3, Kissl, LOX12, NOS3, PMSA, S100A4, SEMP1, TACC2, Ubiquitina, WISP2. Además se proporciona una cuarta firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares, cuya baja expresión se correlaciona con una baja incidencia de supervivencia libre de cáncer; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más estadísticamente significantes de una baja incidencia de supervivencia libre de cáncer, estos son referidos en este documento, colectivamente, como la cuarta firma molecular primaria [Serie (G) ] : Bmp3, IL22R, IL24, JAK1, PTP-RK, Rho8/GdiG, Snall, WASP; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares, referidos en este documento, colectivamente, como la cuarta firma molecular secundaria [Serie (H) ] : ATF3, Bmp4, BMPR1A, MEN1, Paracelina.

Aún además se proporciona una quinta firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares, cuya alta expresión se correlaciona con cáncer metastásico; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más estadísticamente significantes de un cáncer metastásico, estos son referidos en este documento, colectivamente, como la quinta firma molecular primaria [Serie (I)]: BAF57, BNDF, CARI, CASM, Catepsina-L, Crebl/2, CXCR10, DRIM, HERG, IL7R, IL-11, Jissl, MKK1, PMN-elastasa, PTTP1, SDF5, TACC2, Ubiquitina, VIPR1, VUDP; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares referidos en este documento, colectivamente, como la quinta firma molecular secundaria [Serie (J)]: Angiomotina, BMP7, ciclinaDl, ligasa-1 de ADN, IGFBP7, LYVE1, NET2, RH08, SRBC, Stath4, TGAse-3, Vinculina, WAVE2. Finalmente, se proporciona una sexta firma molecular, la cual comprende dos series de marcadores moleculares, cuya expresión se correlaciona con cáncer metastásico; la primera serie comprende aquellos marcadores moleculares que son los indicadores más estadísticamente significantes de un cáncer metastásico, estos son referidos en este documento, colectivamente, como la sexta firma molecular primaria [Serie (K) ] : Paracelina; y la segunda serie comprende lo anterior más al menos uno de los siguientes marcadores moleculares referidos en este documento, colectivamente, como la sexta firma molecular secundaria [Serie (L) ] : ALCAM, Eplina, ERbeta, Glypic3, JAK1, MAGI-1, PEDF, PKC-eta, Estatlina, WWOX. Por lo tanto, se han determinado, al menos, seis firmas moleculares, que comprenden doce series de marcadores moleculares (seis primarios y seis secundarios) , los cuales tienen uso en el pronóstico de cáncer de mama. La elucidación de estas firmas ha involucrado más de una década de trabajo, durante tal tiempo, se han examinado sistemáticamente y cuidadosamente cientos de muestras de tejido de cáncer de mama y muchos cientos más de marcadores moleculares genéticos. Sin embargo, habiendo completado esta tarea ardua, se ha encontrado, de manera sorprendente que, de hecho, muy pocos genes necesitan ser examinados para proporcionar un pronóstico exacto por una muestra dada de tejido de cáncer de mama. Aún más sorprendentemente, se ha podido además, reducir este número identificando aquellos marcadores moleculares que contribuyen más al resultado predictivo de las firmas moleculares, así por ejemplo, en el caso de firma molecular que se refiere a cáncer metastásico, solamente necesitan ser examinados 20/21 genes. Esto significa que esta metodología tiene aplicación inmediata y podría ser realizada rápidamente y rutinariamente en un contexto clínico. En efecto, se sugiere que esta metodología forma parte del régimen de tratamiento estándar de un paciente con cáncer de mama, de manera que el oncologista relevante puede, en una etapa temprana, determinar el resultado de una enfermedad particular y así, igualar por consiguiente, el tratamiento. De este modo, por ejemplo, en el caso de un individuo quien se presenta con una firma indicativa de baja supervivencia o metástasis de nodo (es decir, el cáncer está probablemente esparcido) , podría ser prescrita una forma inmediata y agresiva de terapia. De manera similar, en donde un individuo se presenta con una firma indicativa de baja supervivencia libre de enfermedad, y por lo tanto, es más probable que tenga una recurrencia de la enfermedad, se podrían requerir pruebas y visitas de seguimiento más frecuentes. Contrariamente, si un individuo tiene una firma indicativa de no metástasis, el oncologista puede prescribir tratamiento menos invasivo y agresivo, con ello, ahorrando al paciente de un estrés innecesario y efectos colaterales indeseados. Este método por lo tanto, no solamente sirve para asegurar que individuos reciben tratamiento ajustado a su confección genética, sino también, puede mejorar la calidad de vida del paciente durante el tratamiento, asegurando que la terapia agresiva es solamente prescrita en aquellos casos en donde sea necesaria .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, en un aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de mamífero, en el cual, el método comprende: (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama a partir de un individuo, para determinar el nivel de expresión de genes, de conformidad con los marcadores moleculares en la Serie (A) , y; (b) en donde se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo a partir de quien se ha tomado la muestra de tejido, tiene una baja probabilidad de supervivencia. En aún una modalidad preferida adicional de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos, un marcador molecular en la Serie (B) , para determinar si estos genes tienen un alto nivel de expresión; y/o el nivel de expresión de genes que codifican los marcadores moleculares en la Serie (C) , para determinar si estos genes son bajo expresados; y/o determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos, un marcador molecular en la Etapa (D) , para determinar si estos genes son bajo expresados y, si se identifican los patrones de expresión anteriores, concluir que el individuo tiene una baja probabilidad de supervivencia . En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama en mamífero, en el cual, el método comprende : (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama a partir de un individuo, para determinar el nivel de expresión de genes, de conformidad con los marcadores moleculares en la Serie (C) , y; (b) en donde se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo a partir de quien se ha tomado la muestra de tejido, tiene una baja probabilidad de supervivencia. En aún una modalidad preferida adicional de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente o alternativamente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos, un marcador molecular en la Serie (D) , para determinar si estos genes son bajo expresados, y si así son, concluir que el individuo tiene una baja probabilidad de supervivencia. En aún una modalidad preferida adicional de este aspecto de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes en la Serie (A) y/o al menos un gen en la Serie (B) para determinar si estos genes son sobre expresados y, si así son, concluir que el individuo tiene una baja probabilidad de supervivencia. En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama en mamífero, en el cual el método comprende: (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama de un individuo, para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los marcadores moleculares en la Serie (E) , y: (b) en donde se determina un alto nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo a partir de quien se ha tomado la muestra de tejido, tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. La referencia en este documento a recurrencia de cáncer, incluye la referencia a la recurrencia de cáncer localmente, en la mama, o en un sitio remoto o referencia a metástasis . En aún una modalidad preferida de la invención, la metodología adicionalmente comprende, en la parte (a) de la misma, determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos un marcador molecular en la Serie (F) , para determinar si estos genes tienen un alto nivel de expresión; y/o determinar el nivel de expresión de genes que codifican los marcadores moleculares en la Serie (G) , para determinar si estos genes son bajo expresados; y/o determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos un marcador molecular en la Serie (H) , para determinar si estos genes son bajo expresados, y si se identifican los patrones de expresión anterior, concluir que el individuo tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de mamífero, en el cual, el método comprende : (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama a partir de un individuo para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los marcadores moleculares en la Serie (G) ; y (b) en donde se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que los individuos a partir de quienes se ha tomado la muestra de tejido tienen una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. En aún una modalidad preferida adicional de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente o alternativamente comprende, determinar el nivel de expresión de genes en la Serie (H) , para determinar si estos genes son bajo expresados, y si así son, concluir que el individuo tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. En aún una modalidad preferida de este aspecto de la invención, dicha metodología, en la parte (a) de la misma, adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes en la Serie (E) y/o al menos un gen en la Serie (F) para determinar si estos genes son sobre expresados, y si así son, concluir que el individuo tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de mamífero, en el cual, el método comprende : (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama a partir de un individuo para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los marcadores moleculares en la Serie (I); y (b) en donde se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que los individuos a partir de quienes se ha tomado la muestra de tejido tienen un forma metastásica de cáncer. En aún una modalidad preferida adicional de la invención, la metodología adicionalmente comprende, en la parte (a) de la misma, determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos un marcador molecular en la Serie ( J) , para determinar si estos genes tienen un alto nivel de expresión; y/o determinar el nivel de expresión del gen que codifica el marcador molecular en la Serie (K) , para determinar si este gen es bajo expresado; y/o determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos, un marcador molecular en la Serie (L) , para determinar si estos genes son bajo expresados, y si se identifican los patrones de expresión anterior, concluir que el individuo tiene una forma metastásica de cáncer. En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de mamífero, en el cual, el método comprende : (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama de un individuo, para determinar el nivel de expresión de genes que codifican el marcador molecular en la Serie (K) , y; (b) en donde se determina un bajo nivel de expresión para este marcador; (c) concluir que el individuo a partir de quién se ha tomado la muestra de tejido, tiene una forma metastásica de cáncer. En aún una modalidad preferida de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente o alternativamente, comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos, un marcador molecular en la Serie (L) , para determinar si estos genes son bajo expresados y, si así son, concluir que el individuo tiene una forma metastásica de cáncer. En aún una modalidad preferida adicional de este aspecto de la invención, dicha metodología en la parte (a) de la misma, adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes en la Serie (I) y/o al menos un marcador molecular en la Serie ( J) , para determinar si estos genes son sobre expresados, y si así son, concluir que el individuo tiene una forma metastásica de cáncer. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona cualquier combinación seleccionada de todos los métodos mencionados anteriormente. En cada uno de los métodos anteriores de la invención, el ensayo es, idealmente, emprendido para tejido de cáncer de mama humano, y más preferiblemente todavía, tejido de cáncer de mama humano femenino. En cada uno de los métodos anteriores de la invención, idealmente, la muestra de tejido es examinada y ensayada para determinar la presencia de ARN, preferiblemente, ARN total, y más preferiblemente todavía, la cantidad de ARNm. Será aparente para aquellos expertos en el arte, que técnicas disponibles para medir el contenido de ARN son bien conocidas y, sin embargo, rutinariamente practicadas por aquellos en el campo de diagnósticos clínicos. En una modalidad alternativa de la invención, el método involucra ensayar para la proteína codificada por cada uno de los marcadores moleculares y así, típicamente, pero no exclusivamente, involucrar el uso de agentes que se enlazan a proteínas relevantes y así identificar las mismas. Los agentes comunes son anticuerpos, y más idealmente, anticuerpos monoclonales los cuales, ventajosamente, han sido etiquetados con una etiqueta adecuada por medio de la cual, la existencia del anticuerpo unido se puede determinar. Las técnicas de ensayo para identificar proteínas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y sin embargo, usadas cada día por trabajadores en el campo de diagnósticos clínicos. Adicionalmente, la metodología de la invención puede involucrar la amplificación de un marcador seleccionado, antes de la identificación del mismo y en este caso, típicamente, la amplificación será emprendida usando una reacción de PCR, en donde se usan las sondas de oligonucleótidos específicas para el marcador molecular de interés, para amplificar las mismas, antes de determinar la presencia y, habiendo considerado el grado de amplificación, la cantidad de la misma. En métodos preferidos adicionales para trabajar la invención, el nivel de expresión de un marcador molecular dado, se determina habiendo considerado una muestra de control, en donde la muestra de control es una muestra de tejido de mama, la cual está libre o es de un paciente con un pronóstico moderado como se define en este documento. Más idealmente, todavía, esta muestra de tejido de mama se toma de un individuo quien no se presenta con la enfermedad. Alternativamente todavía, el control es un estándar reconocido para la expresión de cada gen relevante en un individuo saludable. El nivel de expresión de gen se puede medir por PCR cuantitativa de tiempo real, usando un método descrito en Jiang et al., 2003a o Parr and Jiang 2004. La probabilidad de supervivencia significa la probabilidad de que el paciente será aliviado por los siguientes 10 años. La probabilidad de recurrencia significa la probabilidad de que el cáncer recurrirá dentro de 10 años. Una forma metastásica de cáncer significa que el cáncer se esparcirá del órgano o tejido de origen a otra parte del cuerpo. De conformidad con aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit para realizar cualquiera o más de los métodos mencionados anteriormente, en donde dicho kit comprende: (a) una pluralidad de sondas para detectar al menos, una Serie de los marcadores moleculares especificados en los métodos mencionados anteriormente; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que pertenecen al uso de dichas sondas. En aún un aspecto preferido adicional de la invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico de cáncer de mama en mamíferos, el cual comprende : (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos, un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (A), y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. En aún una modalidad adicional de la invención, dicho kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (C) , y/o al menos un transcripto por al menos uno de los genes en la Serie (B) o (D), y: (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan o muestran como determinar el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. En aún un aspecto preferido adicional de la invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico de cáncer de mama de mamífero el cual comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (E), y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. En aún un aspecto preferido adicional de la invención, dicho kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (G) y/o al menos un transcripto por al menos uno de los genes en la Serie (F), o (H) , y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes.

En aún un aspecto preferido adicional de la invención, se proporciona un kit para determinar el pronóstico del cáncer de mama de mamífero, el cual comprende : (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (I), y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. En aún un aspecto preferido adicional de la invención, dicho kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar: al menos un transcripto de cada uno de los genes en la Serie (K) , y/o al menos un transcripto por al menos uno de los genes en la Serie ( J) o (L) , y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit que comprende cualquier combinación seleccionada de las series antes mencionadas de sondas para identificar las series antes mencionadas de marcadores moleculares . De conformidad con aún a un aspecto adicional de la invención, se proporciona un microarreglo que comprende cualquiera de una o más de las series antes mencionadas de sondas para identificar el nivel de expresión de cualquiera o más de las series antes mencionadas de marcadores moleculares. En otro aspecto de la invención, se proporciona un kit para determinar la probabilidad de supervivencia y/o recurrencia de cáncer de mama y/o naturaleza metastásica de un cáncer en un paciente, dicho kit comprende: (a) al menos un microarreglo que comprende, una pluralidad de sondas para identificar al menos, una serie de marcadores moleculares descritos en los métodos anteriores; y, opcionalmente, (b) un segundo microarreglo que comprende, una pluralidad de sondas para identificar la misma serie de los marcadores moleculares en un estándar interno que representa el nivel normal de expresión de dichos marcadores . La invención también proporciona un microarreglo o serie de sondas como se describe anteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención ahora se describirá por medio de los siguientes ejemplos con referencia a las Tablas 3-3 y Figuras 1-4, en donde: La figura 1 muestra una curva de supervivencia Kaplan-Meier para todos los marcadores en la Tabla 1. La figura 2 muestra una curva de supervivencia Kaplan-Meier para marcadores indicados con un * en la Tabla 1. La figura 3 muestra una curva de supervivencia Kaplan-Meier para todos los marcadores en la Tabla 2. La figura 4 muestra una cuerva de supervivencia para marcadores indicados con un * en la Tabla 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tejidos y Células Se colectaron tejidos del tumor de mama y tejidos normales asociados inmediatamente después de la cirugía y se congelaron hasta el uso. Esto fue bajo la aprobación de un comité ético local y tomó lugar principalmente entre 1991-1994, con un número limitado colectado entre 1995- 1996. El análisis actual se basó en una media después de 10 años hasta Junio de 2004. El estudio actual ha usado tejidos de cáncer de mama (n=120) y tejidos de antecedentes normales (n=32) . Se adquirieron líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA MB 231, líneas celulares de fibroblasto humano MRC-5 de la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Inglaterra) . Se adquirieron células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) de TCS Biologicals (Oxford, Inglaterra) . Se obtuvieron información en la patología, información clínica durante y después de la cirugía, resultados clínicos del paciente, tan pronto después de la cirugía o en el tiempo del seguimiento.

Procesamiento de Tejidos Los tejidos de mamarios se seccionaron congelados. Las secciones se dividieron en las tres partes siguientes: una porción para histología de rutina, una porción para inmunohistoquímica y la otra porción fue para preparación de ARN.

Extracción de ARN de células y tejidos y sintesis de ADNc Secciones congeladas de tejidos se cortaron a un espesor de 5-10 µm, y se mantuvieron para inmunohistoquímica e histología de rutina (Jiang et al 2003a) . Unas 15-20 secciones adicionales se homogenizaron usando un homogenizador portátil, en solución de extracción de ARN enfriada en hielo. La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro de UV. La transcripción inversa se llevó a cabo usando un kit RT con un cebador oligo-dt anclado proporcionado por AbGene™, usando 1 µg de ARN total en placas de 96 cavidades. La calidad de ADNc se verificó usando cebadores de ß-actina. El kit de extracción de ARN y el kit de RT se obtuvieron de AbGene Ltd, Surrey, Inglaterra, RU . Los cebadores de PCR se diseñaron usando Beacon Designer (California, USA) y sintetizaron por Invitrogen™ Ltd. (Paisley, Escocia, RU) . Agarosa de grado biológico molecular y secuencias de ADN son de Invitrogen. La mezcla principal para la PCR de rutina y PCR cuantitativa son de AbGene.

Análisis cuantitativo de marcadores genéticos El nivel de transcripción de los miembros de la familia CCN del ADNc preparado anteriormente, se determinó usando una PCR cuantitativa de tiempo real, basado en la tecnología Amplifuor™ (Nazarenko et al 1997), modificado de un método previamente reportado (Jiang et al 2003a y 2003b) . Brevemente, un par de cebadores de PCR se diseñaron usando el software Beacon Designer (versión 2, California, USA) . Para uno de los cebadores (rutinariamente al cebador antisentido en nuestro laboratorio) , se agregó una secuencia adicional, conocida como la secuencia Z (5' actgaacctgaccgtaca' 3) la cual es complementaria a la sonda Z universal (Nazarenko et al 1997) (Intergen Inc., Inglaterra, RU) . Se adquirió un kit de detección Taqman™ para ß-actina de Perkin-Elmer™. La reacción se llevó a cabo usando lo siguiente: mezcla principal Q caliente de inicio (Abgene) , lOpmol de cebador delantero específico, 1 pmol de cebador inverso el cual tiene la secuencia Z, lOpmol de sonda FAM etiquetada (Intergen Inc.) y ADNc de aproximadamente 50 ng de ARN (calculado del ARN de partida en la reacción RT) . La reacción se llevó a cabo usando IcyclerlQ™ (Bio-Rad™) el cual se equipó con una unidad óptica que permite la detección en tiempo real de 96 reacciones, usando la siguiente condición: 94°C por 12 minutos, 50 ciclos de 94°C por 15 segundos, 55°C por 40 segundos y 72°C por 20 segundos (Jiang et al 2003b, 2003c, Parr y Jiang 2004). Los niveles de los transcriptos se generaron de un estándar interno (Jiang et al 2003a) que simultáneamente se amplificó con las muestras. Los resultados se muestran aquí en dos formas: niveles de transcriptos a base de cantidades iguales de ARN, o como una relación de objetivo/CK19.

Teñido inmunohistoquimico de las moléculas en donde sea apropiado Secciones congeladas del tumor de mama y tejido de antecedente se cortaron a un espesor de 6 µm usando un crioestato (Jiang et al 2003c) . Las secciones se montaron en laminillas de microscopio más super frost, se secaron con aire y después se fijaron en una mezcla de 50% de acetona y 50% de metanol. Las secciones después se colocaron en amortiguador de lavado "Optimax" por 5-10 minutos para rehidratarlas . Las secciones se incubaron por 20 minutos en una solución bloqueadora BSA al 0.6% y se sondearon con un anticuerpo primario. Después de lavados excesivos, las secciones se incubaron por 30 minutos en un anticuerpo biotinilado secundario (inmunoglobulina de cerdo anti-cabra/ratón/conejo Multiunión, Dako Inc.). Después de los lavados, entonces se aplicaron Complejos de Avidina Biotina (Vector Laboratories) a las secciones seguidas por lavados extensivos. Después se agregó cromógeno de diaminobenzidina (Vector Labs) a las secciones las cuales se incubaron en la oscuridad por 5 minutos. Las secciones fueron entonces teñidas en un contador en Hematoxilina de Gilí y se deshidrataron en grados ascendentes de metanol antes de limpiarlas en xileno y montarlas bajo un cubre objetos. El teñido citoplásmico de las proteínas respectivas se cuantificó usando software Óptimas 6.0 como previamente se describe (Davies et al 2000, King et al 2004) y se muestra aquí como intensidad de manchado relativa.

Análisis Estadistico Se llevó a cabo el análisis estadístico usando la prueba Mann-Whitney U y la prueba Kruskal-Wallis . El análisis de supervivencia se llevó a cabo usando una curva de supervivencia Kaplan-Meier y análisis Univariante (SPSS11) .

RESULTADOS Moléculas seleccionadas Se cuantificaron 453 moléculas contra la información clínica completa que incluye un seguimiento de 10 años. Después del análisis en relación de supervivencia e incidencia de recurrencia de la enfermedad, se desarrollaron tres firmas, la firma molecular de supervivencia y la firma molecular de predicción de incidencia y la firma molecular metastásica.

La firma molecular de supervivencia Como se muestra en la Tabla 1, se encontraron 51 moléculas por tener una correlación positiva con baja supervivencia y 14 inversamente correlacionadas con baja supervivencia. La figura 1 muestra que 92.2% de individuos que tienen lo que es llamado como una "buena firma" (esto es, no tiene una expresión alta de las moléculas en la columna izquierda de la Tabla 1, y no tiene baja expresión de las moléculas en la columna derecha de la Tabla 1) , se predice la supervivencia por hasta 148.9 meses, mientras únicamente 8.3% de los individuos que tienen lo que es llamado aquí como una "mala firma" (esto es, que tienen una alta expresión de las moléculas en la columna izquierda de la Tabla 1, y baja expresión de las moléculas de la columna derecha de la Tabla 1) , se predice supervivencia de hasta 40 meses. Este resultado es estadísticamente significante, con un valor p < 0.00001. Usando la curva de supervivencia Kaplan-Meier y análisis univariante, se refino la firma molecular identificando aquellas moléculas que contribuyen más a exactitud estadística (identificada por * en la Tabla 1) . Se encontró que 33 marcadores moleculares primarios, 25 de los cuales tienen una correlación positiva con baja supervivencia y 8 de los cuales tiene una correlación negativa con baja supervivencia, cuentan para la mayoría de la significancia estadístico. La figura 2 muestra la curva de supervivencia predicha usando la primera y segunda firma molecular primaria, con 93.2% de los individuos que tienen una buena firma predicha por sobrevivir por hasta 149.69 meses, y solamente 14-4% de individuos que tienen una mala firma predicha por sobrevivir por hasta 52.3 meses (p < 0.000001) .

La firma molecular de predicción libre de incidencia Como se muestra en la Tabla 2, se encontraron 48 moléculas por tener una correlación positiva con ocurrencia de incidencia (recurrencia y metástasis) y 13 inversamente correlacionadas con ocurrencia de incidencia. La figura 3 muestra que 94.5% de individuos que tienen una buena firma (esto es, que no tienen una alta expresión de las moléculas en la columna izquierda de la Tabla 2, y que no tienen baja expresión de las moléculas en la columna derecha de la Tabla 2), se predicen por no tener recurrencia de la enfermedad (es decir, supervivencia libre de enfermedad) por hasta 150.4 meses, mientras únicamente 34.5% de individuos que tienen un mala firma (esto es, que tienen una alta expresión de las moléculas en la columna izquierda de la Tabla 2, y baja expresión de las moléculas en la columna derecha de la Tabla 2) , se predicen por vivir libre de enfermedad por hasta 72.4 meses (p < 0.00001). Como con la anterior firma de supervivencia, también se refino esta firma, y se encontró que 36 marcadores moleculares primarios (indicados por * en la Tabla 2), 28 de los cuales tienen una correlación positiva con recurrencia, y 8 de los cuales tienen una correlación negativa con recurrencia, cuentan por la mayoría de la significancia estadística. La figura 4 muestra la curva de supervivencia predicha usando la primera y cuarta firma molecular primaria, con 91.7% de los individuos que tienen una firma buena predicha por no tener recurrencia de la enfermedad por hasta 148.4 meses, y únicamente 5.88% de los individuos que tienen una mala firma predicha para sobrevivir, sin alguna recurrencia de la enfermedad, por hasta 44.2 meses (p < 0.000001).

La firma molecular de metástasis del nodo Como se muestra en la Tabla 3, se encontraron 37 moléculas por tener una correlación positiva con metástasis nodal y 10 inversamente correlacionadas con metástasis del nodo. La combinación de estas 37 moléculas muestra que 91% de los tumores con una mala firma (esto es, que tienen una alta expresión de moléculas en la columna izquierda de la Tabla 3, y baja expresión de las moléculas en la columna derecha de la Tabla 3), desarrollaron metástasis del nodo. Además, 88.9% de los tumores con una buena firma (esto es, que no tienen una alta expresión de las moléculas en la columna izquierda de la Tabla 3, y que no tienen baja expresión de las moléculas en la columna derecha de la Tabla 3), no tienen metástasis del nodo (p = 0.00024). Como anteriormente, se modificó esta firma refinando la combinación, y se encontró que una combinación de 21 genes primarios, 20 de los cuales son positivamente correlacionados con metástasis del nodo y 1 de los cuales es negativamente correlacionado con metástasis del nodo (indicado por * en la Tabla 3), también se predicen bien. 98.1% de los tumores con una mala firma, tienen metástasis del nodo y 86.8% de tumores con una buena firma no tienen metástasis del nodo (p = 0.0000205).

REFERENCIAS Davies et al 2000: Davies G, Jiang WG, Masón MD. Cell-cell adhesión and signaling intermediates in human prostate cáncer. Journal of Urology, 2000, 163, 985-992. Jiang et al 2003a: Jiang WG, Watkins G, Lañe J, Douglas-Jones A, Cunnick GH, Mokbel M, Mansel RE. Prognostic valué of Rho family and rho-GDIs in breast cáncer. Clinical Cáncer Research, 2003, 9 (17), 6432-6440. Jiang et al 2003b: Jiang WG, Douglas-Jones A, and Mansel RE. Level of expression of PPAR-gamma and its co-activator (PPAR-GCA) in human breast cáncer. International Journal of Cáncer, 2003, 106, 752-757. Jiang et al 2003c: Jiang WG, Grimshaw D, Lañe J, Martin TAI Parr C, Davies G, Laterra J, and Mansel RE. Retroviral hammerhead transgenes to cMET and HGF/SF inhibited growth of breast tumour, induced by fibroblasts. Clinical Cáncer Research, 2003, 9, 4274-4281. King et al 2004: King JAC, Ofori-Acquah AF, Stevens T, Al-Mehdi AB, Fodstad O, Jiang WG. Prognostic valué of ALCAM in human breast cáncer. Breast Cáncer Research, 2004, R478-487 Nazarenko et al 1997: Nazarenko IA, Bhatnagar SK, Hohman RJ. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acids Res 1997; 25: 2516-21 Parr and Jiang 2004: Parr C and Jiang WG. The Notch receptors, Notch-1 and Notch-2, in human breast cancers. International Journal of Molecular Medicine, 2004 Nov; 14 (5) : 779-786.

TABLA 1. Firma molecular para supervivencia completa Tabla 2 : Firma molecular para supervivencia libre de incidencia en cáncer de mama humano Kit original, genes = 61 Kit modificado, genes = 36 Tabla 3. Firma molecular para metástasis del nodo pronosticado

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque el método comprende: (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama de un individuo para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los siguientes marcadores moleculares: AMF, ATF4, Cyrßl, ER, Matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, Nectina4, PARIA, Psoriason, Pttgl, Rho-C, Scotina, SDF1, SEMP1, SPF45, SST1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R y ZO-3; y (b) en donde un nivel alto de expresión se determinó para estos marcadores; (c) concluir que el individuo de de quién ha sido tomada la muestra de tejido, tiene una baja probabilidad baja de supervivencia. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: Basigina, Beta-catenina, BMP1, BMP10, Calpaina grande, CD44, CX43, ciclinaD2, EHMS, FAK, FAP, GIRK, HAVRl, Isótopo3, JAK1, L0X12, NET-2, PAR1A2, PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VECAD, Vilip, ave2. 3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican los siguientes marcadores moleculares: ARP2, Atf-3, HuR, MEN1, Paracelina, Radixina PTP-RK y Relación RH08-gdiG; y (b) en donde se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo de quién se ha tomado la muestra de tejido tiene una baja probabilidad de supervivencia . 4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: aMOT, Atf-1, Claudina-1, IL22R, Rock2, Vegl . 5. Un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque el método comprende: (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama de un individuo, para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los siguientes marcadores moleculares: AAMP, AMFR, Bmp8, BMP9, Beta-catenina, CAR, Crebl2, DRIM, EHMS, Endomuscina2, FAK, FAP, Isótopol, Kissl/ckl9, Notchl, PARIA, ParlA2, PLC-delta, Psoriasina, PTTG1, RhoC, Rockl, SDF1, SST1, ST15, TEM6 y TEM7R; y (b) en donde se determina un nivel alto de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo de quién se ha tomado la muestra de tejido, tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. 6. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión del gen que codifica al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: Angiotensina2Rl, ATF4, BmplO, CASM, catepsinas, CX43, Elastasa PMN, GIRK, HAVRl, HIN, Isótopo3, Kissl, LOX12, NOS3, PMSA, S100A4, SEMP1, TACC2, Ubiquitina, ISP2. 7. Un método de conformidad con la reivindicación 5 o reivindicación 6, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican los siguientes marcadores moleculares: Bmp3, IL22R, IL24, JAK1, PTP-RK, Rho8/GdiG, Snail y WASP, y; (b) en donde se determina un bajo nivel de expresión para estos marcadores: (c) concluir que el individuo de quién se ha tomado la muestra de tejido, tiene una alta probabilidad de recurrencia de cáncer. 8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: AFT3, BMP4, BMPR1A, MENl, Paracelina. 9. Un método para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque el método comprende: (a) examinar una muestra de tejido de cáncer de mama de un individuo para determinar el nivel de expresión de genes que codifican los siguientes marcadores moleculares: BAF57, BNDF, CARI, CASM, Catepsina-L, Crebl/2, CXCR10, DRIM, HERG, IL7R, IL11, Kissl, MKK1, PMN-elastasa, PTTP1, SDF5, TACC2, Ubiquitina, VIPRl y VUDP; y (b) en donde se determina un nivel alto de expresión para estos marcadores; (c) concluir que el individuo de quién se ha tomado la muestra de tejido, tiene una forma metastásica de cáncer. 10. Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: Angiomotina, BMP7, ciclinaDl, ADN ligasa 1, IGFBP7, LYVEl, NET2, RH08, SRBC, Stath4, TGAase-3, AVE2. 11. Un método de conformidad con la reivindicación 9 o reivindicación 10, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión del gen que codifica el marcador molecular: Paracelina; y (b) en donde se determina el bajo nivel de expresión para este marcador; (c) concluir que el individuo de quién se ha tomado la muestra de tejido, tiene una forma metastásica de cáncer. 12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la parte (a) adicionalmente comprende determinar el nivel de expresión de genes que codifican al menos uno de los siguientes marcadores moleculares: ALCAM, Eplin, ERbeta, Glipic3, JAK1, MAGI-1, PEDF, PKC-eta, Estatlina, OX. 13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tejido canceroso es de un humano. 1 . Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tejido canceroso es de una mujer. 15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el nivel de expresión se determina analizándolo para la presencia de ARN o ARNm. 16. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el nivel de expresión se determina analizándolo para la(s) proteína (s) codificadas por los marcadores moleculares. 17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el método involucra el uso de agentes que se enlazan a las proteínas relevantes y así identificar las mismas. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los agentes son anticuerpos . 19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque antes de realizar la parte (a) , se amplifica el marcador seleccionado . 20. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el marcador se amplifica por PCR. 21. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el nivel de expresión de un marcador molecular dado, se determina habiendo considerado una muestra control, en donde la muestra control es cualquiera de las siguientes: una muestra de tejido de mama el cual está libre de cáncer, una muestra de tejido de mama tomada de un individuo quién no está presentándose con cáncer, o un estándar reconocido para expresión de cada marcador molecular relevante en un individuo saludable. 22. Un kit para realizar un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque dicho kit comprende: (a) una pluralidad de sondas para detectar al menos una Serie de marcadores moleculares especificados en el método de las reivindicaciones 1-21; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que pertenecen al uso de dichas sondas. 23. Un kit para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque comprende : (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de cada uno de los genes en la siguiente serie de marcadores: AMF, ATF4, Cyr61, ER, Matriptasa2, MET, MLN64, MMP7, Nectina4, PARIA, Psoriason, Pttgl, Rho-C, Scotina, SDF1, SEMP1, SPF45, SST1, ST15, TACC2, TBD10, TCF2, TEM6, TEM7R y ZO-3; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de los genes. 24. Un kit de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas capaces de identificar al menos un transcripto de al menos uno de los genes en la siguiente serie de marcadores: Basigina, Beta-catenina, BMP1, BMP10, Calpaina grande, CD44, CX43, ciclinaD2, EHMS, FAK, FAP, GIRK, HAVRl, Isótopo3, JAK1, LOX12, NET-2, PAR1A2, PTHrP, Rho-G, S100A4, SPARC, TCF3, VEDAC, Vilip, Wave2, y/o al menos un transcripto de cada uno de los genes en la siguiente serie de marcadores ARP2, Atf-3, HuR, MEN1, Paracelina, PTP-RK Radixina y relación RH08/gdiG y/o al menos un transcripto de al menos uno de las siguientes series de marcadores: aMOT, Atf-1, Claudina-1, IL22R, Rock 2 y; (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan el nivel de expresión de cada uno de los genes. 25. Un kit para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de cada uno de los genes en la siguiente serie de marcadores: AMFR, AAMP, Beta-catenina, Bmp8, BMP9, CAR, Crebl2, DRIM, EHMS, Endomuscina2, FAK, FAP, Isótopol, Kissl/ckl9, Notchl, PARIA, ParlA2, PLC-delta, Psoriasina, PTTG1, RhoC, Rockl, SDF1, ST15, SST1, TEM6 y TEM7R; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de dichos genes. 26. Un kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de al menos uno de los genes en la siguiente serie de marcadores: Angiotensina2Rl, ATF4, BmplO, CASM, catepsinas, CX43, Elastasa PMN, GIRK, HAVRlm HIN, Isótopo3, Kissl, LOX12, NOS3, PMSA, S100A4, SEMP1, TACC2, Ubiquitina, ISP2 y/o al menos un transcripto de cada uno de los genes de la siguiente serie de marcadores: Bmp3, IL22R, IL24, JAK1, PTP-RK, Rho8/GdiG, Snail y WASP, y/o al menos un transcripto de al menos uno de los siguientes marcadores: ATF3, Bmp4, BMPR1A, MEN1, Paracelina; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar el nivel de expresión de cada uno de los genes. 27. Un kit para determinar el pronóstico de cáncer de mama de un mamífero, caracterizado porque comprende : (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de cada uno de los genes en las siguientes series de marcadores: BAF57, BNDF, CARI, CASM, Catepsina-L, Crebl/2, CXCR10, DRIM, HERG, IL7R, IL-11, Kissl, MKK1, PMN-elastasa, PTTP1, SDF5, TACC2, VIPR1, VUDP y Ubiqutina; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de los genes. 28. Un kit de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el kit adicionalmente comprende: (a) una pluralidad de sondas para identificar al menos un transcripto de al menos uno de los genes en la siguiente serie de marcadores: Argiomotina, BMP7, ciclinaDl, ADN ligasa-1, IGFBP7, LYVE1, NET2, RH08, SRBC, Stat4, TGAse-3, Vinculina, WAVE2, y/o la siguiente serie de marcadores: Paracelina y/o al menos un transcripto de al menos una de las siguientes series de marcadores: ALCAM, Eplin, ERbeta, Glipic3, JAK1, MAGI-1, PEDF, PKC-eta, Statlina, WWOX; y (b) opcionalmente, reactivos e instrucciones que determinan, o muestran como determinar, el nivel de expresión de cada uno de los genes. 29. Un microarreglo, caracterizado porque comprende al menos una serie de sondas para identificar las series de marcadores moleculares que comprenden las firmas moleculares descritas en las reivindicaciones 22-28. 30. Un kit para determinar la probabilidad de supervivencia y/o recurrencia de cáncer de mama y/o la naturaleza metastásica de un cáncer en un paciente, caracterizado porque dicho kit comprende: (a) al menos un microarreglo que comprende al menos una serie de sondas para identificar las series de marcadores moleculares que comprenden las firmas moleculares descritas en las reivindicaciones 1-21; y opcionalmente, (b) un microarreglo secundario que comprende una pluralidad de sondas para identificar la misma serie de marcadores moleculares en un estándar interno que representa el nivel de expresión de dichos marcadores en ya sea un individuo libre de cáncer, o un paciente con un pronóstico moderado. 31. Un microarreglo, caracterizado porque está de conformidad con la reivindicación 30. 32. Una serie de sondas, caracterizadas porque están de conformidad con las reivindicaciones 22-28. 33. Un método, kit o partes de los mismos, caracterizado porque son sustancialmente como se describen en este documento.