WO2020008097A2 - Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global y la supervivencia libre de recaídas en el cáncer y composición capaz de modular la actividad de atf4 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global y la supervivencia libre de recaídas en el cáncer y composición capaz de modular la actividad de atf4 para el tratamiento del cáncer Download PDF

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cancer
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Sergio GRANADOS PRINCIPAL
Pedro SÁNCHEZ ROVIRA
César RAMÍREZ TORTOSA
María Angel GARCÍA CHÁVES
Juan Antonio Marchal Corrales
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Universidad De Granada
Servicio Andaluz De Salud
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is within the field of Molecular Biology and Clinical Medicine. Specifically, it refers to an in vitro method of obtaining useful data to predict or predict overall survival and relapse-free survival in cancer, preferably breast cancer.
  • the present invention relates to a composition capable of modulating the activity of ATF4 for the treatment of cancer, and more specifically for the treatment of breast cancer. It also refers to a method of selecting drugs useful in the treatment of cancer and a method for collecting data useful in the diagnosis of such diseases.
  • the negative biopsy rate is significantly high, especially in detected and non-palpable cancers that suggest that better molecular diagnostic techniques are needed to replace or complement current biopsy techniques.
  • Tissue characterization by pathologists for ER, PR and HER 2 / Neu status and axillary lymph node status are the most important prognostic factors and 90% of patients without nodal involvement do not have any more breast cancers detected in their lifetime.
  • TNBC triple negative breast cancer
  • TNBC Multiple-Negative Breast Cancer
  • TNBC Multiple-Negative Breast Cancer
  • ISR integrated stress response
  • Phosphorylation of elF2a is initiated by four different ElF2a kinases, called Protein kinase-like Endoplasmic Reticulum Kinase (PERK), General Control Nonderepressible 2 (GCN2), Protein Kinase doublestranded RNA-dependent (PKR) and Heme-Regulated Inhibitor (HRI) in ERS response, amino acid deprivation, viral infection and heme deficiency, respectively.
  • PERK Protein kinase-like Endoplasmic Reticulum Kinase
  • GCN2 General Control Nonderepressible 2
  • PSR Protein Kinase doublestranded RNA-dependent
  • HRI Heme-Regulated Inhibitor
  • FIG. 1 The expression of ATF4 correlates with poor patient survival and a dependent Smad TGFp pathway.
  • siRNA # 2 was the most efficient and was then used in SUM 159PT cells.
  • G Kaplan-Meier shows the OS of breast cancer patients when ATF4 coexpresses with Smad2, Smad3 or Smad4. HR: Hazard Ratio. *** P ⁇ 0.001.
  • ATF4 silencing inhibits the metastatic and proliferative properties of tumor cells and correlates with reduced EMT expression and pro-survival markers.
  • FIG. 3 The formation of mammals decreases after the fall of ATF4 and correlates with a lower expression of origin markers.
  • FIG. 4 Addressing ATF4 reduces liver and lung metastases in a PDX model of breast cancer.
  • B) Representative images and percentage of mice (n 5 / group) with metastases in liver and C) lungs, respectively, after treatment with siRNA # 2 for ATF4 and SCR (control) for 6 weeks.
  • Figure 5 Inhibition of ATF4 retards the growth of the PDX tumor, the population of cancer stem cells, tumor relapse and extends survival after treatment.
  • A) Volume of BCM-3887 tumors (n 8 / group) treated with SiRNA n. ° 2 for ATF4 and control (SCR) with and without docetaxel (20 mg / kg).
  • ATF4 acts downstream of mTORC2 under treatment with TGFp. Potential prognosis of a genetic signature based on mechanisms in breast cancer patients.
  • ATF4 correlates with a worse patient survival in different databases.
  • A) Kaplan-Meier shows that a high expression of ATF4 correlates with a worse relapse-free survival (RFS) in patients with estrogen receptor positive breast cancer (ER +, n 2061). The follow-up threshold was set at 10 years.
  • B) In "Esserman: database, ATF4 triple negative expression patients with breast cancer (TNBC) compared to non-TNBC (n 98) correlates with less global (OS) relapse-free survival (RFS) in breast cancer patients.
  • Supplementary figure 3 Supplement of non-canonical molecular pathways and OncoPrint analysis of the signature of eight genes.
  • ATF4 expression of ATF4 in initial screening with pharmacological inhibitors U0126 (MEK1 1 2), BKM120 (PI3K), SB203580 (p38-MAPK), (5Z) -7-Oxozeaenol (TAK1) in co-treated SUM 159PT and BT549 cells with TQRb1 for 24h.
  • PDK1 GSK2334470
  • GSK690693 pan-Akt
  • rapamycin mTOR
  • CHIR-99021 GSK3a / b
  • BI -D1870 pan-RSK
  • GSK650394 SGK1 1 2
  • ISRIB elF2B / ATF4, integrated stress response
  • F Percentage of alterations (amplification, deep deletion, up and down mRNA regulation) in the ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, EIF4EBP1, RICTOR and NDRG1 genes in a cohort of 2509 patients with OncoPrint breast cancer .
  • a first aspect of the invention relates to the use of ATF4 to predict or predict overall survival in an individual with cancer.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • Another aspect of the invention relates to the use of ATF4 to predict or predict relapse-free survival in an individual with cancer.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • ATF4 also called in the CREB2; TXREB; CREB-2; TAXREB67
  • the encoded protein was also isolated and characterized as the cAMP response element 2 binding protein (CREB-2).
  • the protein encoded by this gene belongs to a family of DNA binding proteins that includes the family of AP-1 transcription factors, cAMP response element binding (CREB) proteins and CREB type proteins. These transcription factors share a leucine zipper region that is involved in protein-protein interactions, located in C-terminal to a basic amino acid stretch that functions as a DNA binding domain. Two alternative transcripts encoding the same protein have been described. Two pseudogenes are located on the X chromosome at q28 in a region that contains a large inverted duplication.
  • CREB cAMP response element binding
  • ATF4 refers to both the gene and the human ATF4 protein.
  • ATF4 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the ATF4 protein coding sequence, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to degeneration of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the ATF4 protein.
  • SEQ ID NO: 2 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses
  • the authors of the present invention have employed the following probes for each of the gene signature component genes: 224793_s_at (TGFBR1), 235725_at (SMAD4), 204369_at (PIK3CA), 225715_at (RPTOR), 226312_at (RICTOR), 200632_s_at ( DRG1), 221539_at (EIF4EBP1), 200779_at (CREB-2) To compute the expression ranges, we start from the average expression of each probe / gene.
  • the average expression of said genes equal to or greater than 1838.62 correlates with a lower relapse-free survival in patients with ER- breast cancer (mean expression range of set of genes in these patients is 1183-5732).
  • another aspect of the invention relates to the use of TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, and / or ATF4, or any combination thereof to predict or predict relapse-free survival in an individual with Cancer.
  • the invention relates to the use of ATF4 and at least one of the genes selected from the group consisting of TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1.
  • the gene signature comprising TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 and ATF4 are used simultaneously.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • TGFBR1 also called AAT5; ALK5; ESS1; LDS1; MSSE; SKR4; TBRI; ALK-5; LDS1A; LDS2A; TBR-i; TGFR-1; ACVRLK4; tbetaR-l
  • a gene encodes a protein that forms a heteromeric complex with TGF-beta type II receptors when it binds to TGF-beta, transducing the TGF-beta signal from the cell surface to the cytoplasm.
  • the encoded protein is a serine / threonine protein kinase. Mutations in this gene have been associated with Loeys-Dietz aortic aneurysm syndrome (LDAS). Multiple transcription variants have been found that encode different isoforms for this gene.
  • LDAS Loeys-Dietz aortic aneurysm syndrome
  • TGFBR1 refers to both the gene and the human protein.
  • TGFBR1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which it constitutes the coding sequence of the "TGFBR1" protein, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, b) nucleic acid molecules whose chain complementary hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of T
  • Smad proteins are phosphorylated and activated by transmembrane serine-threonine receptor kinases in response to signaling transforming growth factor (TGF) -beta.
  • TGF transforming growth factor
  • the product of this gene forms homomeric complexes and heteromeric complexes with other activated Smad proteins, which then accumulate in the nucleus and regulate transcription of target genes.
  • This protein binds to DNA and recognizes an 8 bp palindromic sequence (GTCTAGAC) called Smad binding element (SBE).
  • GTCTAGAC 8 bp palindromic sequence
  • the protein acts as a tumor suppressor and inhibits the proliferation of epithelial cells. It can also have an inhibitory effect on tumors by reducing angiogenesis and increasing the hyperpermeability of blood vessels.
  • the encoded protein is a crucial component of the bone morphogenetic protein signaling pathway. Smad proteins are subject to complex regulation by posttranslational modifications. Mutations or deletions in this gene have been shown to result in pancreatic cancer, juvenile polyposis syndrome and hereditary hemorrhagic telangiectasia syndrome.
  • SMAD4 refers to both the gene and the human protein.
  • "SMAD4" is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the "SMAD4" protein, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98 % or 99% with SEQ ID NO: 6. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the SMAD4 protein
  • PIK3CA phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, also called in the literature MCM; CWS5; MCAP; PI3K; CLOVE; MCMTC; PI3K-alpha; p110-alpha
  • PIK3CA phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, also called in the literature MCM; CWS5; MCAP; PI3K; CLOVE; MCMTC; PI3K-alpha; p110-alpha
  • the protein encoded by this gene represents the catalytic subunit, which uses ATP to phosphorylate Ptdlns, Ptdlns4P and Ptdlns (4,5) P2. This gene has been found to be oncogenic and has been implicated in cervical cancers. A pseudogen of this gene has been defined on chromosome 22.
  • PIK3CA refers to both the gene and the human protein.
  • PIK3CA is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the "PIK3CA” protein, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due upon degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ ID NO: 8. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics
  • RPTOR regulatory associated protein of MTOR, complex 1, also called in the literature KOG1; Mip1
  • RPTOR regulatory associated protein of MTOR, complex 1, also called in the literature KOG1; Mip1
  • the encoded protein forms a stoichiometric complex with mTOR kinase and is also associated with eukaryotic factor 4E binding protein and ribosomal S6 kinase protein.
  • the protein positively regulates the S6 ribosomal effector protein downstream and negatively regulates mTOR kinase. Multiple transcription variants have been found that encode different isoforms for this gene.
  • RPTOR refers to both the gene and the human protein.
  • "RPTOR” is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the "RPTOR” protein coding sequence, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due upon degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ ID NO: 10. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the RPTOR protein.
  • RICTOR RPTOR independen t companion of MTOR complex 2, also called in the PIA literature; AV03; hAV03).
  • RICTOR and MTOR are components of a protein complex that integrates signals derived from nutrients and growth factors to regulate cell growth.
  • FUCTOR refers to both the gene and the human protein.
  • RICTOR is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the "RICTOR” protein coding sequence, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due upon degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ ID NO: 12. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the RICTOR protein, among other possible nucleotide sequences that encoded fican RICTOR is, without limitation, SEQ ID NO: 1 1.
  • NDRG1 N-myc downstream regulated 1, also called in the literature GC4; RTP; DRG1; NDR1; NMSL; TDD5; CAP43; CMT4D; DRG-1; HMSNL; RIT42; TARG1; PROXY1).
  • This gene is a member of the family of negatively regulated N-myc genes that belongs to the alpha / beta hydrolase superfamily.
  • the protein encoded by this gene is a cytoplasmic protein involved in stress responses, hormonal responses, cell growth and differentiation. The encoded protein is necessary for the activation and apoptosis of caspase mediated by p53. Mutations in this gene are a cause of Charcot-Marie-Tooth disease type 4D, and the expression of this gene may be a prognostic indicator for several types of cancer. Alternatively, transcript variants have been observed that encode multiple isoforms for this gene.
  • NDRG1 refers to both the gene and the human protein.
  • NDRG1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the "NDRG1" protein, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 14. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids It has the activity and structural characteristics of the NDRG1
  • EIF4EBP1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1, also called in the literature BP-1; 4EBP1; 4E-BP1; PHAS-I.
  • This gene encodes a member of a family of translation repressor proteins.
  • the protein interacts directly with the eukaryotic translation initiation factor 4E (elF4E), which is a limiting component of the multisubunit complex that recruits 40S ribosomal subunits at the 5 'end of mRNAs.
  • elF4E eukaryotic translation initiation factor 4E
  • This protein is phosphorylated in response to several signals that include UV irradiation and insulin signaling, resulting in its dissociation of elF4E and activation of mRNA translation.
  • EIF4EBP1 refers to both the gene and the human protein.
  • EIF4EBP1 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein "EIF4EBP1”, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due upon degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ ID NO: 16. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the
  • METHODS OF THE INVENTION Another aspect of the invention relates to an in vitro method of obtaining useful data to predict or predict overall survival in an individual with cancer, hereafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining a biological sample isolated from the individual, b) detecting the expression product of ATF4 Preferably the expression levels, either of the protein, or of the mRNA encoding it are detected.
  • the first method of the invention further comprises c) assigning said individual to the group of individuals with a lower overall survival when ATF4 has a superior expression, or overexpression, with respect to a reference sample.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict relapse-free survival in an individual with cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample of the individual, b) detect the expression product of ATF4
  • expression levels are detected, either from the protein, or from the mRNA that encodes it.
  • the first method of the invention further comprises: c) assign said individual to the group of individuals with a lower relapse-free survival when ATF4 presents a superior expression, or overexpression, with respect to a reference sample.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or predict relapse-free survival in an individual with cancer, hereinafter the third method of the invention, which comprises: a) obtaining an isolated biological sample of the individual, b) detect the expression product of ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 or any combination thereof; preferably of ATF4 and at least one of the TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1 genes, and more preferably all of them.
  • expression levels are detected, either from the protein, or from the mRNA that encodes it.
  • the first method of the invention further comprises: c) assigning said individual to the group of individuals with a lower relapse-free survival when ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 or any of its combinations; preferably of ATF4 and at least one of the TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1 genes, and more preferably all of them; they have a superior expression, or overexpression, with respect to a reference sample.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • reference sample or “reference value” is understood as the sample used to determine the variation in the expression levels of the proteins or nucleic acids of the present invention.
  • the reference value is obtained from the signal provided using a tissue sample obtained from an individual who does not have a tumor.
  • samples are taken from several individuals with and without cancer and combined, such that the reference value reflects the average value of said molecules in the population of individuals with and without cancer.
  • Reference value is the level of a protein of the invention or of the nucleic acids of the present invention in the reference sample.
  • the levels of gene expression will give a certain gene expression profile.
  • level level of expression
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes used as biological markers in the present invention, in a sample biological isolated.
  • the expression profile of the genes is preferably performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed by protocols known in the state of the art.
  • the level of mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention can be determined, for example, but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR, back transcription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE); DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with a specific probe; by nuclear magnetic resonance or any other diagnostic imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of detectable nanoparticles functionalized with antibodies or by any other means.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR poly
  • the gene expression profile could also be obtained by detecting and / or quantifying the proteins resulting from the translation of the mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention, for example, but not limited to, immunodetection by western blot.
  • Quantitative detection of the expression of the genes used as biological markers in the present invention can be performed more preferably by real-time PCR (RT-PCR or RTqPCR).
  • the real-time detection of products Amplified can be carried out by using fluorescent molecules that are intercalated in the double stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • the detection of protein levels or gene expression level can be done by any of the techniques known to the person skilled in the art.
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample are tumor cells, tumor tissue and / or liquid biopsy (blood, serum, plasma, urine, ).
  • the term “individual” in this report is synonymous with “patient”, and is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition.
  • drug refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • the disease is cancer, preferably breast cancer.
  • Steps (b) and / or (c) of the method described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the presence in step (b) or the computerized classification in step (c).
  • step (b) is performed by PCR, preferably RT-PCT.
  • the level or levels of proteins are detected, it can be done, as in the case of genes, by any of the techniques known to those skilled in the art.
  • the detection of expression levels is performed by an immunological technique.
  • the immunological techniques are based on precipitation reactions, based on agglutination reactions, immunostaining, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or any combination thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a method for predicting or predicting overall survival in an individual with cancer and / or for predicting or predicting relapse-free survival in an individual with cancer, which comprises steps (a) - (c) according to any of the methods of the invention, and further comprises: d) assign the individual presenting an expression of ATF4 equal to or greater than approximately the high quartile of expression to the group of individuals with a lower overall survival, and / or d1) assign the individual presenting an expression of ATF4 equal to or greater than approximately the high expression tertile to the group of individuals with a lower relapse-free survival, and / or d2) assign the individual with estrogen receptor positive (ER +) breast cancer that has an ATF4 expression equal to or greater than approximately the tertile high expression to the group of individuals with a lower relapse-free survival, and / or d3) assign the individual estrogen receptor-negative (ER-) breast cancer that has an ATF4 expression equal to or greater than approximately the high quartile of expression to the group
  • kits or devices hereinafter the first kit or device of the invention, comprising the elements necessary to detect the expression product of TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 , ATF4 or any combination thereof, preferably to detect the expression product of ATF4 and at least one of the TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1 genes, preferably to detect the expression product of all of them.
  • the first kit or device of the invention is suitable for amplifying nucleotide sequences, comprising probes and / or primers designed from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 15, as well as optionally all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the gene, and / or capable of hybridizing with the sequence of TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 , EIF4EBP1, ATF4 or any combination thereof, preferably from ATF4 and at least one gene selected from TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1, more preferably with all of them; for subsequent PCR amplification. More preferably the gene sequences are those referred to in the previous sequences.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope usually 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane.
  • the first kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting the expression product of ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 or any combination thereof; preferably of ATF4 and at least one of the TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1 genes, and more preferably all of them; and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 15;
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 15;
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 and / or SEQ ID NO: 16.
  • the kit or device of the invention comprises antibodies or fragments thereof specific against any of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 and / or SEQ ID NO: 16, or against amino acid sequences that have a degree of identity with said amino acid sequences of, at less than 85%, typically, at least 90%, preferably, at least 95%, more preferably, at least 98%, even more preferably, at least 99%.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • the number of spots is not limited in any way, there is a preferred embodiment in which the microarray is customized for the methods of the invention.
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or an mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the TGFBR1, SMAD4, P ⁇ K3CA, RPTOR genes, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 or any combination thereof, preferably from ATF4 and at least one gene selected from TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 and EIF4EBP1, more preferably with all of them.
  • sequences of TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 are the nucleotide sequences indicated above.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the first kit or device of the invention, for obtaining useful data to predict or predict overall survival and / or relapse-free survival in an individual with cancer.
  • the cancer is selected from the list consisting of: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, recipient breast cancer of estrogen negative and triple negative. More preferably it is breast cancer, and even more preferably it is estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • Another aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make a computer carry out the process according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be constituted by said cable or other device or means.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be incorporated into a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • a storage medium such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • the programs could be supported on a transmissible carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can implement the methods of the invention.
  • Such programs may have the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention .
  • Computer programs also cover cloud applications based on that procedure.
  • Another aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit degradation of the probe; or as junction points for detectable debris or screening debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -terc-butyl-benzyl-adenine, imidazole, Substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5- iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5- carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminoomethyl, beta-diylocylocylmethylomethyl, beta-diylaminoethyl, beta D- galactosylkeosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1- methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyl
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • the present invention means biologically active variant or fragment, those variants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. Such effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et ai, 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • the authors of the present invention have demonstrated, as evidenced in the examples of the invention, that the inhibition of ATF4 reduced migration and invasion, the efficiency of formation of mammals, proliferation, epithelio-mesenchymal transition , the likelihood of cancer and antiapoptotic markers.
  • silencing of ATF4 decreased metastasis, tumor growth and relapse after chemotherapy.
  • investigations showed that ATF4 is below TQRb / 8MA ⁇ 2 / 3/4, TQRb / RI3KLhT0R02 and regulates mTOR / Rac1-RhoA independently in stress. They show that the expression of ATF4 could modulate the aggressiveness of TNBC, and further influence the patient's outcome.
  • ATF4 regulates metastasis through EMT, RhoA and Rad, CSC and piuripotenciaiidad, proliferation and resistance to drugs, pathways that develop the aggressiveness of TNBC.
  • ATF4 operates on cellular stress, integrating and modulating the TGFp / Smad4 and TQRb / PI3K / mTORCI / 2 routes instead.
  • composition comprising an ATF4 activity modulating agent for use in the treatment of cancer.
  • the cancer is selected from the list consisting of pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, breast cancer estrogen receptor negative and triple negative. More preferably the cancer is breast cancer, and even more preferably estrogen receptor negative and triple negative breast cancer.
  • ATF4 also called in the CREB2; TXREB; CREB-2; TAXREB67
  • literature refers to a gene encoding a transcription factor that was originally identified as a widely expressed mammalian DNA binding protein that could bind. to a tax response enhancer element in the LTR of HTLV-1.
  • the encoded protein was also isolated and characterized as the cAMP response element 2 binding protein (CREB-2).
  • the protein encoded by this gene belongs to a family of DNA binding proteins that includes the family of AP-1 transcription factors, cAMP response element binding (CREB) proteins and CREB type proteins.
  • ATF4 refers to both the gene and the human ATF4 protein.
  • ATF4 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the ATF4 protein coding sequence, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, b) nucleic acid molecules whose complementary strand hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to degeneration of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the ATF4 protein.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • the activity of ATF4 can be modulated by the modification of the levels and / or activity of the ATF4 protein, or by the modification of the levels at which the ATF4 gene is transcribed such that the levels of activity of the ATF4 protein in The cell is modulated.
  • Modulating agents can also be agonists (substances that are capable of binding to a receptor and eliciting a response in the cell, specifically an increase in ATF4 activity), as antagonists (substances that not only do not activate the receptor, but also actually blocks its activation by agonists). In the context of the present invention, inhibition is the preferred form of modulation.
  • the modulating agents comprised in the composition of the invention are selected from a list comprising: a) an organic molecule, b) an RNA molecule, c) an antisense oligonucleotide, d) an antibody, or e) a ribozyme.
  • organic molecules that can specifically bind to ATF4 without binding to other polypeptides or proteins.
  • the organic molecules will preferably have a weight of 100 to 20,000 daltons, more preferably 500 to 15,000 daltons, and more preferably 1000 to 10,000 daltons. Bookstores of organic molecules are commercially available.
  • the route of administration may be, without limitation, intraperitoneal, intrathecal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal or dermal.
  • TGFBRI inhibitors eg Galunisertib or LY2157299
  • PI3K inhibitors eg LY294002, BKM120
  • mTOR inhibitors eg rapamycin
  • dual inhibitors of PI3K / mTORC1 / mTORC2 eg Omipalisib or GSK2126458
  • phosphorylation inhibitors of elF2a eg ISRIB
  • compounds such as the anthelmintic pyrvinium pamoate.
  • nucleotide sequences specifically complementary to a particular DNA or RNA sequence could form complexes and block transcription or translation.
  • interfering RNA interfering RNA
  • tools have been developed that allow specific inhibition of gene expression.
  • the inhibition of the expression of the ATF4 protein would therefore constitute the inhibition of its biological activity, and in particular, of the activity that is contributing to the aggravation of the tumor characteristics.
  • antisense polynucleotides are understood ribonucleotide chains or deoxyribonucleotides that can inhibit the production of the ATF4 protein by one of these three mechanisms:
  • ATF4 Interfering transcription by hybridizing in the structural gene or in a regulatory region of the gene encoding ATF4. Since transcription or expression is effectively blocked by hybridization of the antisense oligonucleotide with DNA, the production of ATF4 decreases.
  • Antisense oligonucleotides capable of modulating the activity of ATF4 are known in the state of the art. For example, and without limiting our, it could be a sequence of ribonucleotides or RNA that belongs to the so-called siRNA (small interfering RNA), small interfering RNA or silencing RNA, capable of inhibiting the genetic expression of the ATF4 protein.
  • siRNA small interfering RNA
  • small interfering RNA small interfering RNA
  • silencing RNA small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA or small interfering RNA
  • siRNA is understood to be a class of double stranded RNA 19 to 25 nucleotides long, and more preferably between 21 and 23 nucleotides, which is involved in the route of RNA interference, where siRNA interferes with the expression of a specific gene.
  • this specific gene is ATF4. It could also be any siRNA capable of hybridizing a nucleic acid molecule encoding the human ATF4 protein that is collected in SEQ ID NO: 2.
  • RNA constructs that contains at least any one of the possible nucleotide sequences of siRNA capable of inhibiting the expression of ATF4, and without prejudice to the addition of any of the RNA sequences and constructions of the invention described above that are subject to modifications, preferably chemical, leading to greater stability against the action of ribonucleases and thereby Greater efficiency Without these modifications involving the alteration of its mechanism of action, which is the specific binding to the RISC complex (RNA-induced silencing complex), activating it and manifesting a helicase activity that separates the two strands leaving only the antisense strand associated with the complex.
  • RISC complex RNA-induced silencing complex
  • RNA of ATF4 messenger RNA of ATF4, which is collected in SEQ ID NO: 1. If the complementarity is not perfect, RISC is associated with the messenger and the translation is attenuated. But if it is perfect, RISC acts as RNasa, cutting the messenger and being free to repeat the process.
  • siRNA sequence of the invention or of the RNA construct of the invention would be apparent to one skilled in the art, and could be carried out by chemical synthesis, which also allows the incorporation of chemical modifications in both different nucleotides of the product such as the incorporation of other chemical compounds at any of the ends.
  • the synthesis could also be carried out enzymatically using any of the available RNA polymerases. Enzymatic synthesis also allows some chemical modification of inhibitor products or RNAs.
  • the nucleotide sequence design of the siRNA of the invention would also be apparent to one skilled in the art. Thus, it could be done through a random design in which 19-25 bases of the target mRNA are selected without taking into account the sequence or positional information it has in the transcript.
  • Another non-limiting alternative of the present invention would be the conventional design by simple parameters developed by the pioneers of the art (Calipel, A. et al., 2003. J Biol Chem. 278 (43): 42409-42418) completed with an analysis BLAST nucleotide.
  • Another possibility could be a rational design, in which a computer procedure is used to identify the optimal siRNA targets in an mRNA.
  • a genetic DNA construct could also be part of the composition of the invention, which would direct the in vitro or intracellular transcription of the siRNA sequence or RNA construct of the invention, and comprising at least one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, comprising at least the sequence encoding the siRNA of the invention or the RNA construct of the invention for transcription, or, b) nucleotide sequence of DNA, preferably double stranded, corresponding to a gene expression system or vector comprising the sequence coding for the RNA sequence of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and its appropriate regulation in time and place, for example, start signals and termination, cutting sites, polyadenylation signal, origin of
  • compositions of the present invention allow the transfection of the siRNA of the invention into a cell, in vivo or in vitro. Transfection could be carried out, but not limited to, direct transfection or vectors that facilitate the access of siRNA into the cell.
  • vectors are, without limitation, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, Herpes simplex viruses, non-viral DNA plasmids, cationic liposomes and molecular conjugates.
  • the siRNAs of the present invention, as well as RNA or DNA precursors of these siRNAs can be conjugated with release peptides or other compounds to favor the transport of these siRNAs into the cell.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts with) the protein. ATF4. Examples of portions of immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ') 2 fragments that can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin. It can be a monoclonal or polyclonal antibody.
  • Antibodies capable of binding to the ATF4 protein can be used to inhibit the activity of said protein.
  • Such antibodies are commercially available (such as, but not limited to, antibodies.
  • Antibodies, or fragments thereof, might be able to inhibit the activity of the ATF4 protein that contributes to the acquisition of cancer characteristics.
  • the antibodies can be polyclonal (typically include different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the monoclonal antibody can be biochemically altered, by genetic manipulation, or it can be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in parts, of portions that are not necessary for the recognition of ATF4 and being replaced by others that communicate to the antibody additional advantageous properties.
  • the antibody can also be recombinant, chimeric, humanized, synthetic or a combination of any of the foregoing.
  • a "recombinant antibody or polypeptide” is one that has been produced in a host cell that has been transformed or transfected with the nucleic acid encoding the polypeptide, or produces the polypeptide as a result of homologous recombination.
  • rAc can be expressed and directed to specific cellular sub-compartments when the appropriate sequences for intracellular traffic are incorporated.
  • These antibodies are called intrabodies, and have proven effective not only to divert proteins from their usual compartment or block interactions between proteins involved in signaling pathways, but also to activate intracellular proteins.
  • DNA constructs capable of transcribing to a peptide, antibody or antibody fragment, for use in the treatment of diseases that occur with cancer.
  • Said genetic construction of DNA would direct the in vitro or intracellular transcription of the antibody sequence or fragment thereof, and comprises at least one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, which It comprises, at least, the coding sequence of the antibody of the invention or of the antibody fragment of the invention for in vitro, or intracellular, transcription, b) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, corresponding to a system or vector of gene expression comprising the sequence coding for the antibody sequence or antibody fragment of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, sites of cutting, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers),
  • ribozyme refers to a catalytic polynucleotide (typically RNA), which can be constructed to specifically recognize, by hybridization, an mRNA and fragment it or eliminate its expression. Ribozymes can be introduced into the cell as catalytic RNA molecules or as genetic constructs that are expressed to RNA catalytic molecules.
  • RNA a catalytic polynucleotide
  • Ribozymes can be introduced into the cell as catalytic RNA molecules or as genetic constructs that are expressed to RNA catalytic molecules.
  • composition of the invention is used for the treatment of a cancer that is selected from the list comprising: pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal cell carcinoma squamous, breast cancer, estrogen receptor breast cancer negative and triple negative.
  • the cancer is breast cancer, and even more preferably, the cancer is triple negative breast cancer.
  • composition of the invention comprises an antisense oligonucleotide and is used for the treatment of cancer.
  • the composition of the invention comprises an antisense oligonucleotide and is used for the treatment of triple negative breast cancer.
  • composition of the invention comprises an antibody and is used for the treatment of cancer.
  • composition of the invention comprises an antibody and is used for the treatment of triple negative breast cancer.
  • treatment refers to both therapeutic and prophylactic treatment or preventive measures. That is, treatment also refers to preventing, improving or treating the aforementioned alterations, preferably cancer, more preferably breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer Those necessary for treatment include those already associated with alterations as well as those in which the alteration is prevented.
  • a "alteration” is any condition that would benefit from treatment with the composition of the invention. , as described herein.
  • composition provided by this invention may be provided by any route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the ATF4 activity modulating agents of said compositions are in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of modulating agents (or genetic constructs that allow their intracellular expression) calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics typical of these agents (and constructions) and the therapeutic effect to be achieved.
  • Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • the invention provides methods for identifying compounds that can be used for the treatment of diseases related to ATF4, and in particular those that present with cancer. These methods allow the identification of candidates, compounds to be tested or agents (for example, peptides, peptidomimetics, organic molecules, antisense oligonucleotides or other molecules) that can bind ATF4 and / or have an activating or inhibiting effect of the biological activity of ATF4 or of its expression, and thus determine whether these compounds would have an effect on the diseases in which ATF4 is involved, and specifically those that present with cancer.
  • agents for example, peptides, peptidomimetics, organic molecules, antisense oligonucleotides or other molecules
  • Assays to identify these molecules, compounds or agents that modulate the activity of ATF4 may employ cells expressing ATF4, or in assays with isolated ATF4 (or with its variants, such as biologically active fragments or fusion proteins that include a portion or part of ATF4).
  • another aspect of the invention consists in a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) contacting the compound to be analyzed with the ATF4 polypeptide, b) detecting the binding of said compound to be analyzed with the ATF4 polypeptide.
  • the cancer is breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer.
  • these assays may involve the complete ATF4 polypeptide, a biologically active fragment thereof, or a fusion protein that involves all or a portion of the ATF4 polypeptide.
  • Determining the ability of a compound to modulate the activity of ATF4 can be performed, for example, by determining the ability of ATF4 to bind or interact with a target molecule of said compound, directly or indirectly. They can also be activity tests, directly or indirectly measuring the activity of ATF4. Too it can be an expression assay, directly or indirectly determining the expression of the ATF4 mRNA or the ATF4 protein.
  • These tests can also be combined with an in vivo test by measuring the effect of a test compound on the symptoms of diseases related to ATF4, and in particular cancer (for example, but not limited to, animal models or other model systems known in the art ).
  • the compounds to be tested used in the method of selection of therapeutic agents are not limited to low molecular weight organic molecules, proteins (including antibodies), peptides, oliogonucleotides, etc. They can be natural and / or synthetic.
  • antibodies capable of binding to an ATF4 epitope can also be used in immunohistochemical assays, such as Western blots, ELISAs, radioimmunoassays, immunoprecipitation assays, or other immunohistochemical assays known in The state of the art.
  • ATF4 can be used to immunize an animal, to obtain polyclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies can also be prepared by techniques that allow the production of antibodies by cultured cell lines, including, but not limited to, hybridomas, human B-cell hybridomas. Techniques for producing chimeric, humanized or synthetic antibodies are known.
  • the therapeutic agents identified by the selection method described herein can be used in an animal or other model to determine the mechanism of action of said agent. Moreover, the therapeutic agents selected by the method described herein would be used in the treatment of diseases that occur with the alteration of ATF4 and, in particular, cancer.
  • the cancer is breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer.
  • a method of selection of therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) determining the activity of ATF4 at an established concentration of the compound to be analyzed or in the absence of said compound, b) determining the ATF4 activity at a concentration of the compound to be analyzed different from that of a).
  • the cancer is breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer.
  • Another aspect of the invention consists in a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) contacting the compound to be analyzed with the polynucleotide ATF4, b) detecting the binding of said compound to be analyzed with the polynucleotide ATF4
  • the cancer is breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer.
  • ATF4 activity can be diagnostic, and in particular cancer, can be detected by measuring the amount of nucleic acids (DNA and / or RNA and / or mRNA) that code for ATF4, or the amount of ATF4 protein that is expressed, compared to normal cells.
  • the detection of oligonucleotides can be done by methods well known in the state of the art (such as, but not limited to, probes with labeled nucleotides, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR amplification using labeled nucleotides, RT- PCR). Methods for detecting ATF4 protein expression are also well known in the state of the art, such as poly or monoclonal antibodies, ELISA, radioimmunoassay (RIA), and FACS (fluorescence activated cell sorting).
  • a method for collecting data useful in the diagnosis and / or prognosis of cancer comprising: a) determining the expression of ATF4 in a sample taken from a mammal, b) comparing the ATF4 expression values obtained in a) with standard values in healthy or diseased mammals.
  • the cancer is selected from the list comprising pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal squamous cell carcinoma, breast cancer, estrogen receptor negative and triple negative breast cancer . More preferably the cancer is breast cancer, and even more preferably, triple negative breast cancer.
  • the present invention refers to the following aspects:
  • a composition comprising an agent modulating the activity of ATF4 for use in the treatment of cancer.
  • the modulating agent is an inhibitor of the activity of ATF4.
  • composition according to any of aspects 1-2 in which the modulating agent is selected from the list consisting of: a) a small molecule, b) an RNA molecule, c) an antisense oligonucleotide, d) an antibody, or e) a ribozyme, or any combination thereof.
  • a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) contacting the compound to be analyzed with the ATF4 polypeptide, b) detecting the binding of said compound to be analyzed with the ATF4 polypeptide, where the Compounds that bind to the ATF4 polypeptide would be identified as potential therapeutic agents against the disease as described in any of aspects 1-7.
  • a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) determine the activity of ATF4 at a certain concentration of the compound to be analyzed or in the absence of said compound, b) determine the activity of ATF4 at a concentration of the compound to be analyzed different from that of a), where the compounds that give rise to a different activity of ATF4 would be identified as potential therapeutic agents against the disease as described in any of aspects 1-7.
  • a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) determining the activity of ATF4 at a certain concentration of the compound to be analyzed, b) determining the activity of ATF4 in the presence of a known compound which modulates the activity of ATF4, where the compounds that give rise to a different activity of ATF4 would be identified as potential therapeutic agents against the disease as described in any of aspects 1-7.
  • a method of selecting therapeutic agents useful in the treatment of cancer comprising: a) contacting the compound to be analyzed with the polynucleotide ATF4, b) detecting the binding of said compound to be analyzed with the polynucleotide ATF4. where compounds that bind to the ATF4 polynucleotide would be identified as potential therapeutic agents against the disease as described in any of the aspects.
  • a method for collecting useful data in the diagnosis and / or prognosis of cancer comprising: a) determining the expression of ATF4 in a sample taken from a mammal, b) comparing the values of the expression of ATF4 obtained in a) with the standard values in healthy or sick mammals.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • the Kaplan-Meier tracer (http://kmplot.com/analysis/) can assess the effect of 54,675 genes on survival using 5,143 samples of breast cancer patients with a mean follow-up of 69 months.
  • Gene expression data, relapse-free and general survival (RFS and OS, respectively) are downloaded from GEO (Gene Expression Omnibus), EGA (European Genome-Phenome Archive) and TOGA (The Cancer Genome Atlas) (Gyórffy B, Lanczky A, Eklund AC, Denkert C, Budczies J, Li Q, et al.
  • An online survival analysis tool to rapidly assess the effect of 22,277 genes on breast cancer prognosis using microarray data of 1, 809 patients.
  • the cBio cancer genomics portal an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discov. 2012 ; 2: 401-4, Gao J, Aksoy BA, Dogrusoz U, Dresdner G, Gross B, Sumer SO, et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 2013; 6: pl1) .
  • SiRNA-mediated knockdown siRNA for ATF4 50 nM
  • Smad2 / 3, Smad4, PERK, PKR, GCN2, HRI, elF2a, Raptor, Rictor, TAK1 and Ras 100 nM
  • Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen
  • the TNBC MDA-MB-231 and BT549 cell lines were purchased from the American Type Culture Collection, and SUM159PT from Asterand.
  • the SBE (SMAD Binding Element) reporter-HEK293 (SBE-HEK293) cell lines were obtained from BPS Bioscience. All cell lines were maintained in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Scientific) and 1% antibiotic-antifungal (Gibco).
  • SBE-HEK293 cells were cultured under selection with 400 pg / mi of Geneticin (Sigma) following the manufacturer's instructions.
  • MSFE mammospheres
  • SBE-HEK293 cells were transfected with SiRNA for ATF4 and treated with T ⁇ Rb1 for 24 h. SBE activity was performed with the ONE-Step Luciferase Assay System (BPS Bioscience) following the manufacturer's instructions.
  • the cells were then seeded in a BME-coated transwell chamber (1X) at a density of 50,000 cells / ml in 50 pl of medium without FBS and supplemented with T conRb1 (10 ng / ml). In the bottom well, growth medium with 10% FBS was added as chemoattractant. Medium without FBS was also used as a negative control. After 16 h, the number of invasive cells was quantified using Calcein AM at 485 nm excitation and 520 nm emission compared to a standard curve.
  • RNA-Seq readings were assembled, analyzed with the hg19 reference notation (UCSC genome navigator) and quantified using the 2.2.2 twins suite to obtain FPKM (Fragments per Kilobase per million).
  • the PDXs were transplanted to the cleared breast fat pad of NOD.Cg-Prkdcf cid ll2rg tm1Wil / SzJ (NSG) mice (Jackson Laboratory) kept in standard conditions, as we published (Dave B, Granados-Principal S, Zhu R, Benz S , Rabizadeh S, Soon-Shiong P, et al. Targeting RPL39 and MLF2 reduce tumor initiation and metastasis in breast cancer by inhibiting nitric oxide synthase signaling. Proc Nati Acad Sci US A. 2014; 111: 8838-43).
  • SCR Non-coding or encoded SiRNA
  • SiRNA # 2 SiRNA for ATF4
  • SiRNA # 2 SCR plus docetaxel
  • SiRNA n. 2 plus docetaxel chemotherapy + SiRNA # 2, 20 mg / kg.
  • the siRNAs were injected twice a week for 6 weeks at a dose of 5 pg / mouse, and docetaxel was administered once a week on days 1, 14 and 28. Tumor volume and body weights were recorded every 2 days.
  • the BCX-3887 PDX model has been reported to metastasize to mouse lungs, and was also used to develop a highly metastatic model (3887-LM) by serially transplanting a metastatic nodule of the lungs as follows.
  • a fragment of BCM-3887 tumor tissue was transplanted into the breast fat pad of NSG mice. When the tumors reached 200-250 mm3, they were removed and the mice were kept alive until the mice showed signs of morbidity or loss of body weight. After euthanasia, the lungs were removed and any metastatic nodule was resected, placed in RPMI supplemented with 10% SFB and serially transplanted to the breast fat pad of the new NSG mice 4 to 5 weeks old.
  • IHC immunohistochemistry
  • SiRNA for ATF4 (siATF4) and control (siSCR) for in vivo delivery were incorporated into DOPC liposomes as previously described (34).
  • SiRNA was mixed with DOPC with excess tertiary butanol (1: 10 ratio, w / w) and the subsequent addition of Tween 20. The mixture was frozen in a dry acetone / ice bath and lyophilized. Before administration in vivo, the lyophilized preparation was hydrated with PBS at a concentration of 25 pg / ml (each mouse received 5 pg of SiRNA in 200 pl / intraperitoneal injection).
  • ATF4 The high expression of ATF4 correlates with reduced patient survival and is below Smad4.
  • the importance of ATF4 as a prognostic biomarker in breast cancer was determined by Kaplan-Meier analysis in different databases.
  • TNBC microenvironment is often enriched in TQRb ligands
  • ATF4 is influenced by TQRb signaling in TNBC and find greater expression of ATF4 in BT549 and SUM159PT cells treated with TQRb1, which was inhibited by the inhibitor of the TQRbBI kinase LY2157299, which suggests that ATF4 is a downstream target ( Figure 1B).
  • ATF4 suppresses the aggressiveness of TNBC cell lines.
  • ATF4 was silenced in three TNBC cell lines treated with TQRb1.
  • the depletion of ATF4 led to reduced wound healing capacity ( Figure 2A and complementary Figure 2B) and invasion with and without chemoattractant ( Figure 2B).
  • EMT epithelio-mesenchymal transition
  • N-Cadherin was also reduced in BT549 and SUM159PT, but was not detected in MDA-MB-231 (Fig. 2C).
  • Cell proliferation decreased after ATF4 cancellation (Fig. 2D), followed by lower expression of Bcl2 and Mcl1 in the three cell lines (Fig. 1 E).
  • TNBC cells The self-renewal and pluripotential properties of TNBC cells are suppressed after ATF4 depletion.
  • Pluripotent tumor cells contribute to metastasis, tumor growth and resistance to treatment.
  • CSC Pluripotent tumor cells
  • MS mammals
  • Protein levels increased in terms of time and generation of DM ( Figure 3A and Figure 2C complementary). Accordingly, we investigated whether ATF4 depletion could lead to a decrease in MSFE. Our results show reduction of MSFE in all cell lines after ATF4 depletion (Fig. 3B).
  • ATF4 is positively regulated by oxidative stress in suspension cultures (12).
  • ATF4 reduces metastasis, tumor growth and relapse in PDX mouse models.
  • mice were treated with SiRNA # 2 ATF4 conjugated with DOPC and negative control (SCR) twice a week for 6 weeks. Animals treated with SiRNA n. 2 exhibited less obvious metastatic nodules in the liver ( Figure 4B) and lungs ( Figure 4C). Metastatic lesions were microscopically confirmed by Ki67 IHC (Fig. 4D).
  • Chemo + SCR tumors reached the minimum volume (124 mm3) on day 24 and began to grow again on day 28 (128 mm3), showing an increase of 2.4 times on day 38.
  • the tumor volume in Chemo + siRNA # 2 was 63 mm3 on day 24, and began to grow back on day 28 (78 mm3), showing an increase of 1, 4 times on day 38.
  • the tumor volume in Chemo + SCR was 2083 mm3 and 548 mm3 in chemo + siRNA n.
  • ATF4 is downstream of mTORC2 and regulates mTOR / Rac1-RhoA regardless of stress.
  • ATF4 is activated by phosphorylation of elF2a as the core nucleus of ISR.
  • TQRb stimulates ATF4 depending on ISR
  • PERK PKR
  • GCN2 hRI
  • elF2a elF2a
  • a second PI3K inhibitor was also tested to rule out any unwanted inhibitor-dependent effects on ATF4 (Supplementary Figure 3C).
  • Rapamycin inhibits mTORCI and mTORC2 in a dose and time dependent manner and SGK1, which is activated with mTORC2.
  • ATF4 is downstream of mTORCI and / or mTORC2 in active T ⁇ Rb
  • three TNBC cell lines were transfected with Raptor and Rictor siRNA with TQRb1.
  • a constant decrease in ATF4 was found after Rictor depletion in the three cell lines (Fig. 6B).
  • the TAK1 pathway was ruled out since no reduction was observed after its fall in SUM159PT ( Figure 6B). Because our results show that Snail is very repressed after the fall of ATF4, it was used as a substitute control for the inhibition of ATF4.
  • Snail decreased after silencing Rictor with TQRb1 in all three cell lines (Fig. 6C), which supports the idea that ATF4 is downstream of mTORC2.
  • ATF4 The mTOR signaling activity is modulated by several loops, and it was questioned whether ATF4 could feedback on mTORC1 / 2.
  • ATF4 siRNA inhibited downstream targets of mTORC2 (p-Ndrg1, RhoA, Rac1) and mTORCI pathway (p-Akt, p-p70S6K) in SUM159PT and BT549 cells (Fig. 6E).
  • RhoA and Rac1 were consistently reduced after treatment with TQRb1 in three cell lines, and inhibition of Rac1 with TQRb1 was maintained at different time points in three cell lines (Fig. 6E and Fig. 3E complementary).
  • ATF4 is integrated and regulates both the canonical, Smad4 and non-canonical signaling pathways, PI3K / mTORC2 / RhoA-Rac1, TQRb to modulate the metastasis, pluripotentiality and survival of tumor cells (Fig. 6F ).
  • the signature of the invention predicts an RFS 27 times poorer compared to ATF4 (this is the first individual candidate after the signature that significantly reduces RFS-relapse-free survival).
  • the signature of the invention predicts an RFS 53 times more poor compared to NDRG1 (this is the first individual candidate after signing that significantly decreases the RFS) (Fig. 6G).
  • LOOCV demonstrated that the lowest RFS in ER + and TNBC patients depended on the expression of NDRG1, although RFS was not determined for this gene in TNBC (Supplementary Table S2).
  • Inhibitors LY2157299 (5 mM, T ⁇ RbRI kinase inhibitor), U0126 (10 pM, MEK1 / 2 inhibitor), SB203580 (10 pM, p38-MAPK inhibitor), BKM120 (5 pM, PI3K inhibitor, catalytic isoforms r110a / b / d / y), LY294002 (10 pM, PI3K inhibitor, catalytic isoforms r110a / b / d), GSK690693 (10 pM, pan-Akt inhibitor), rapamycin (10 pM, mTOR inhibitor), GSK2334470 (10 pM, PDK1 inhibitor), BI -D1870 (10 pM, pan-RSK inhibitor), GSK650394 (10 pM, SGK1 / 2 inhibitor), CHIR-99021 (10 pM, GSK3a / b inhibitor), ISRIB (5 pM, integrated stress response, or ISR, inhibitor )
  • T ⁇ Rb1 Human recombinant transforming growth factor b1 (T ⁇ Rb1) was obtained from Preprotech.
  • Trilencer-27 Human siRNAs were obtained for ATF4 and encoded control (SCR) from Origene.
  • the siRNAs for Smad2 / 3, Smad4, PERK, PKR, GCN2, HRI, elF2a, Raptor, Rictor and Tak1 were purchased from Santa Cruz Biotechnology. Ras siRNA was from Sigma.
  • SiRNA n. 2 for ATF4 and the SCR control (Origene sequences) were synthesized by Sigma.
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine
  • Docetaxel was obtained from the Houston Cincinnati Hospital pharmacy.
  • Antibodies for ATF4 (CREB-2, C-20 and B-3), Smad4 (B-8), Twistl (Twist2C1a), Bcl2 (C-2), Mcl1 (22), CD44 (HCAM, DF1485), Sox2 ( E-4), HRI (D12), Raptor (10E10), Rictor (H-1 1), Tak1 (H-5) and RhoA (26C4) were from Santa Cruz.
  • phospho-Smad2 (Ser465 / 467) / 3 (Ser423 / 425) (D27F4), Smad2 / 3, N-Cadherin (D4R1 H), Zeb1 (D80D3), Snail (C15D3), Slug (C19G7), Nanog (D73G4), Split Notchl (Val ⁇ 744) (D3B8), Oct4, PERK (C33E10), PKR, GCN2, elF2a, phospho-Akt (Ser473), phospho-p70S6K (Thr389), phospho-NDRG1 (Thr346), Ras they were from Cell Signaling and Rac1 (102) from BD Biosciences.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global y la supervivencia libre de recaídas en el cáncer, preferiblemente cáncer de mama. Además, la presente invención se refiere a una composición capaz de modular la actividad de la ATF4 para el tratamiento del cáncer.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA PREDECIR O PRONOSTICAR LA SUPERVIVENCIA GLOBAL Y LA SUPERVIVENCIA LIBRE DE RECAÍDAS EN EL CÁNCER Y COMPOSICIÓN CAPAZ DE MODULAR LA ACTIVIDAD DE ATF4 PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina Clínica. Específicamente, se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global y la supervivencia libre de recaídas en el cáncer, preferiblemente cáncer de mama. Además, la presente invención se refiere a una composición capaz de modular la actividad de la ATF4 para el tratamiento del cáncer, y más específicamente para el tratamiento del cáncer de mama. También se refiere a un método de selección de fármacos útiles en el tratamiento de cáncer y a un método para la recolección de datos útiles en el diagnóstico de dichas enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de mama es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en el mundo para las mujeres. Es el tumor más frecuente en las mujeres occidentales, y en España se diagnostican alrededor de 25.000 nuevos cánceres de mama al año. La detección temprana y el tratamiento mejoran el pronóstico y la tasa de supervivencia, lo que motiva la necesidad de descubrir nuevos métodos no invasivos para el diagnóstico precoz de esta enfermedad. En la actualidad, la biopsia que confirma el diagnóstico y los diferentes grados de cáncer, al tratarse de un método invasivo, lleva mucho tiempo y, a menudo, es incómodo para el paciente.
Además, la tasa de biopsia negativa es significativamente alta, especialmente en cánceres detectados y no palpables que sugieren que se necesitan mejores técnicas de diagnóstico molecular para reemplazar o complementar las técnicas actuales de biopsia. La caracterización tisular por los patólogos para ER, PR y el estado HER 2/ Neu y el estado de los ganglios linfáticos axilares son los factores pronósticos más importantes y el 90% de los pacientes sin compromiso ganglionar no tienen más cánceres de mama detectados en su vida.
Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevos biomarcadores para el diagnóstico precoz y preciso y el pronóstico en el cáncer de mama, evitando que la mayoría de los pacientes se sometan a una disección axilar. Dichas firmas moleculares también pueden conducir a un buen pronóstico y ayudar a desarrollar nuevos tratamientos dirigidos. Además, este enfoque puede identificar con precisión los subgrupos de pacientes que realmente se beneficiarán de la quimioterapia citotóxica con sus efectos secundarios debilitantes. Por otro lado, el cáncer de mama es el cáncer más diagnosticado y se asocia con una incidencia y una tasa de mortalidad elevadas en mujeres. El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es una forma muy agresiva de cáncer de mama que es negativo para los receptores de estrógeno (ER), progesterona (PR) y HER2, con una tasa de supervivencia baja dentro de los tres años posteriores a la cirugía. TNBC ( Triple-Negative Breast Cáncer) se caracteriza por ser altamente proliferativo, heterogéneo, metastásico y resistente a los fármacos, lo que aumenta la incidencia de recaídas, y tiene enriquecidas las vías de señalización relacionadas con la agresividad como TGFp, mTOR o Wnt. Aunque se están estudiando muchos medicamentos, no existe una terapia dirigida aprobada para el tratamiento de TNBC.
Bajo condiciones de estrés que incluyen hipoxia, privación de nutrientes, infección viral o estrés del retículo endoplásmico (ERS), las células activan la respuesta de estrés integrada (ISR) para preservar la homeostasis. La activación del ISR conduce a una síntesis de proteína global reducida mediante la fosforilación del eukaryotic translation initiation factor 2 alpha (elF2a), que dirige la expresión del Activating Transcription Factor 4 (ATF4) para regular el destino celular. La fosforilación de elF2a es iniciada por cuatro elF2a quinasas diferentes, denominadas Protein kinase-like Endoplasmic Reticulum Kinase (PERK), General Control Nonderepressible 2 (GCN2), Protein Kinase doublestranded RNA-dependent (PKR) y Heme-Regulated Inhibitor (HRI) en respuesta a ERS, privación de aminoácidos, infección viral y deficiencia de hemo, respectivamente.
En conjunto, estos factores describen la necesidad de terapias dirigidas nuevas o mejoradas, para estratificar los tumores en subgrupos moleculares o que responden al tratamiento con nuevos biomarcadores de pronóstico, y para describir nuevas dianas terapéuticas con las que garantizar una terapia personalizada efectiva.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. La expresión de ATF4 se correlaciona con una pobre supervivencia del paciente y una ruta de TGFp Smad dependiente. A) Kaplan-Meier muestra que una alta expresión de ATF4 se correlaciona con una peor supervivencia general (OS) en todos los pacientes con cáncer de mama (n=1402) y supervivencia libre de recaída (RFS) en todos (todos BC, n=3951), receptores de estrógenos negativos (ER-, n=801 ) y pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC, n=255). El umbral de seguimiento se estableció en 10 años. B) RT-PCR y Western Blot de ATF4 en células BT549 y SUM159PT tratadas con TGFpi (10 ng/ml), LY2157299 (5 mM) y combinación durante 72 h. El inhibidor se añadió 1 h antes que TGFpi . C) Western Blot de ATF4 en células BT549 y SUM159PT transfectadas con siRNA para Smad2/3 y Smad4. TGFpi se añadió 48 horas antes de la transfección y durante 72 horas después de la transfección. D) Ensayo del informador SBE (Elemento de unión a SMAD) en células SBE-HEK293 después de la desactivación de ATF4 con/sin TQRb1 durante 24 h. RLU: unidades de luz relativa. E) Efecto de la desactivación de ATF4 y el tratamiento con TQRb1 durante 24 h y 72 h en Smad2/3 y Smad4, respectivamente. Dos siRNA dirigidos para ATF4 (siRNA#1 y siRNA#2) se usaron en BT549. siRNA#2 fue el más eficiente y luego se utilizó en células SUM 159PT. F) Cambios en la OS de pacientes con cáncer de mama cuando ATF4 (n=1402), Smad2 (n=626), Smad3 (n=1402), Smad4 (n=626) y TGFBR1 (n=626) se expresan solos o coexpresados. Survival Fold Change se probó mediante la corrección de múltiples pruebas (* P <0.0038). G) Kaplan-Meier muestra la OS de pacientes con cáncer de mama cuando ATF4 se coexpresa con Smad2, Smad3 o Smad4. HR: Hazard Ratio. *** P <0.001.
Figura 2. El silenciamiento de ATF4 inhibe las propiedades metastáticas y proliferativas de las células tumorales y se correlaciona con una menor expresión de EMT y marcadores pro-supervivencia. A) Migración y B) invasión de células BT549, SUM159PT y MDA-MB-231 después de la caída de ATF4 con/sin TQRb1. C) Cambios en la expresión de proteínas de los marcadores de EMT (N-cadherina, Zeb1 , Snail, Slug, Twistl) después del silenciamiento de ATF4 en células BT549, SUM159PT y MDA-MB-231 con y sin TGF 'l durante 24 h. D) Proliferación después de la caída de ATF4 con/sin TQRb1 durante 24 h (MDA-MB-231 se trataron durante 72 h). E) Análisis de Western Blot de proteínas pro-supervivencia (Bcl2 y Mcl1) después de la transfección con siRNA#2 para ATF4 y 72 h con TQRb1.
Figura 3. La formación de mamoesferas disminuye después de la caída de ATF4 y se correlaciona con una menor expresión de marcadores de origen. A) Aumento de la expresión de la proteína ATF4 en generaciones primarias y secundarias de mamoesferas (MS) en comparación con las células unidas (Att). B) Eficiencia de formación de mamesfera (MSFE) en tres líneas celulares de TNBC después de la inhibición de ATF4 y TQRb1 durante 24 h. C) Expresión de ARNm de Nanog, Sox2, Oct4, Notchl y Cxcl10 tras la caída de ATF4 con TQRb1 durante 72 h. D) Western blot de marcadores de pluripotencialidad después del silenciamiento de ATF4 y el tratamiento con TGF 'l durante 24 h (BT549, MDA-MB-231) y 72 h (SUM159PT).
Figura 4. El direccionamiento de ATF4 reduce las metástasis a hígado y pulmones en un modelo PDX de cáncer de mama. A) Niveles de ARNm de ATF4 en 20 modelos diferentes de PDX de TNBC mediante secuenciación de ARN. B) Imágenes representativas y porcentaje de ratones (n=5/grupo) con metástasis en hígado y C) pulmones, respectivamente, después del tratamiento con siRNA#2 para ATF4 y SCR (control) durante 6 semanas. D) Evaluación inmunohistoquímica de metástasis a hígado y pulmones por Ki67.
Figura 5. La inhibición de ATF4 retrasa el crecimiento del tumor PDX, la población de células madre cancerígenas, la recaída tumoral y amplía la supervivencia después del tratamiento. A) Volumen de tumores BCM-3887 (n = 8 / grupo) tratados con SiRNA n. ° 2 para ATF4 y control (SCR) con y sin docetaxel (20 mg / kg). B) Análisis de citometría de flujo de la población de células positivas para Aldefluor después de la caída de ATF4 con / sin docetaxel en tejido BCM-3387 PDX. C) Volumen de tumores BCM-4664 (n = 8 / grupo) tratados con siRNA n. ° 2 y SCR. El co-tratamiento de siRNAs con docetaxel (33mg / kg) durante 6 semanas se utilizó para estudiar la recaída tumoral después de los tratamientos. D) Población de células positivas a Aldefluor después de la caída de ATF4 en tumores BCM-4664 PDX. E) Curva de Kaplan-Meier de supervivencia media post-tratamiento de ratones portadores de tumores BCM-4664 PDX después de la caída de ATF4 en combinación con docetaxel (33 mg / kg), P = 0,0001. F) Western blot y análisis densitométrico que muestran la eficacia de knockdown de ATF4 en los tejidos tumorales BCM-3387 y BCM-4664. * P <0.05, ** P <0.01 , *** P <0.001.
Figura 6. ATF4 actúa cadena abajo de mTORC2 bajo tratamiento con TGFp. Potencial pronóstico de una firma genética basada en mecanismos en pacientes con cáncer de mama. A) Transferencia de Western de ATF4 en células transfectadas (24 h) con SiRNA para mediadores típicos de respuesta de estrés integrado (ISR) y tratadas con TGF \ beta 1 durante 72 h. B) Niveles de proteína ATF4 después de la precipitación de Raptor y Rictor tratados con TGFP1 durante 72 h (SUM159PT, BT549) o 24 h (MDA-MB-231). ARNsi para TAK1 también se probó en SUM159PT. C) Cambio en la expresión de Snail por siRNAs para Raptor y Rictor en tres líneas celulares tratadas con TGFpi durante 24 h. D) La correlación de Pearson de la expresión del ARNm de ATF4 (niveles de intensidad logarítmica) con los componentes de la señalización de mTORC2 y mTORCI en una cohorte de 2509 pacientes con cáncer de mama. E) Transferencia de Western de dianas aguas abajo de mTORC2 y mTORCI en células transfectadas con SiRNA para ATF4 y tratadas con TGFpi durante 72 h (se realizó un tratamiento de 24 horas en SUM159PT para analizar los dianas mTORCI). F) Esquema que muestra las rutas de señalización que activan ATF4 tras la activación de TGFp y las retroalimentaciones positivas detectadas. G) Valor pronóstico (cambio de pliegues de RFS) de la firma de ocho genes frente a cada gen único en todos (todos los BC) y pacientes con ER- con cáncer de mama. Survival Fold Change se probó mediante la corrección de múltiples pruebas (* P <0,005) y la validación cruzada de dejar salir. H) Impacto de la firma de ocho genes en la supervivencia de pacientes con cáncer de mama con alteraciones en el ADN (amplificación, deleción) y ARN (expresión) de cada gen. Cada gen fue probado valiéndose de validación cruzada.
Figura suplementaria 1. La alta expresión de ATF4 se correlaciona con una peor supervivencia del paciente en diferentes bases de datos. A) Kaplan-Meier muestra que una alta expresión de ATF4 se correlaciona con una peor supervivencia libre de recaída (RFS) en pacientes con cáncer de mama positivo para receptores de estrógenos (ER +, n = 2061). El umbral de seguimiento se estableció en 10 años. B) En "Esserman: base de datos, ATF4 expresión triple negativo pacientes con cáncer de mama (TNBC) en comparación con no TNBC (n = 98) se correlaciona con menos global (OS) supervivencia libre de recaída (RFS) en pacientes con cáncer de mama. C) La expresión de ATF4 en TNBC se correlaciona con una pobre supervivencia libre de metástasis en "Minn 2" (n = 81) y "Hatzis" (n = 497) frente a no TNBC. El umbral de seguimiento se estableció en 6 años en "Minn 2".
Figura suplementaria 2. Eficacia objetivo del SiRNA de ATF4, migración después de la desactivación de ATF4 y expresión de ATF4 en mammosferas. A) Eficiencia de dos secuencias de SiRNA en los niveles de ARNm de ATF4 en células SUM159PT y BT549 durante 48 horas tratadas o no con TQRb1 durante 24 h. B) Imágenes representativas del "ensayo de cicatrización de heridas" después de la depleción de ATF4 en células SUM159PT, BT549 y MDA- MB-231. C) Niveles de proteína ATF4 en mammosferas en comparación con células unidas a las 24, 48, 72 y 96 horas en células SUM159PT y MDA-MB-231.
Figura suplementaria 3. Suplemento de vías moleculares no canónicas y análisis OncoPrint de la firma de ocho genes. A) Expresión de ATF4 en el cribado inicial con inhibidores farmacológicos U0126 (MEK1 1 2), BKM120 (PI3K), SB203580 (p38-MAPK), (5Z) -7-Oxozeaenol (TAK1) en células SUM 159PT y BT549 co-tratadas con TQRb1 por 24h. B) Niveles de ATF4 en una exploración más profunda de la vía de señalización de PI3K con inhibidores farmacológicos BKM 120, GSK2334470 (PDK1), GSK690693 (pan-Akt), rapamicina (mTOR), CHIR-99021 (GSK3a / b), BI-D1870 (pan-RSK ), GSK650394 (SGK1 1 2), ISRIB (elF2B / ATF4, respuesta de estrés integrada) en células SUM159PT, BT549 y MDA-MB-231 co-tratadas con TΰRb1 durante 24 y 72 h. C) Disminución de los niveles de ATF4 en SUM159PT, BT549 y MDA-MB-231 tratados con LY294002 (inhibidor de PI3K) con TΰRb1 durante 24 y 72 h. D) Western blot que muestra la expresión de ATF4 en células SUM159PT y BT549 después de la destrucción de Ras durante 48 h con / sin TΰRb1 durante 72 h. E) Niveles de proteína de RhoA y Rac1 en SUM159PT, BT549 y MDA-MB-231 después de la inhibición de ATF4 con / sin TΰRb1 en diferentes puntos de tiempo. F) Porcentaje de alteraciones (amplificación, deleción profunda, regulación hacia arriba y hacia abajo del ARNm) en los genes ATF4, TGFBR1 , SMAD4, PIK3CA, RPTOR, EIF4EBP1 , RICTOR y NDRG1 en una cohorte de 2509 pacientes con cáncer de mama de OncoPrint.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
USO DEL MARCADOR ATF4 PARA PREDECIR O PRONOSTICAR LA SUPERVIVENCIA DE PACIENTES CON CANCER DE MAMA
Los autores de la presente invención han demostrado que aquellos pacientes con cáncer de mama que presentan una expresión de ATF4 igual o mayor de 7321 , que se corresponde aproximadamente con el cuartil alto de expresión (rango de expresión de la sonda/gen 200779_at en estos pacientes es de aproximadamente 2601 - 13519), presentan una menor supervivencia global. También han visto que en términos de supervivencia libre de recaídas, todos aquellos pacientes con cáncer de mama, sin distinción de subtipos, que presenten una expresión de ATF4 igual o mayor de 7025, que se corresponde aproximadamente con el tertil alto de expresión (rango de expresión de la sonda/gen 200779_at en estos pacientes es de aproximadamente 1033 - 25273), presentan una menor supervivencia libre de recaídas.
A su vez han demostrado que, si estratificamos por subtipos, aquellos pacientes con cáncer de mama positivo para receptor de estrógeno (ER+) que presenten una expresión de ATF4 igual o mayor de 6733 (se corresponde con aproximadamente el tertil alto de expresión. Rango de expresión de la sonda/gen 200779_at en estos pacientes es de aproximadamente 1403 - 17883), cáncer de mama negativo para receptor de estrógenos (ER-) que presenten una expresión de ATF4 igual o mayor de 8282 (se corresponde con aproximadamente el cuartil alto de expresión. Rango de expresión de la sonda/gen 200779_at en estos pacientes es de aproximadamente 1592 - 25273), y cáncer de mama triple negativo que presenten una expresión de ATF4 igual o mayor de 8346 (se corresponde con aproximadamente el cuartil alto de expresión. Rango de expresión de la sonda/gen 200779_at en estos pacientes es de aproximadamente 2601 - 13519), presentan una menor supervivencia libre de recaídas.
Sin embargo, la expresión de ATF4 en pacientes con cáncer de mama HER2 (rango de expresión de la sonda/gen 200779_at: 1592 - 17543) no se correlaciona con una menor supervivencia libre de recaídas.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de ATF4 para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de ATF4 para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaídas en un individuo con cáncer.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. El término "ATF4" (también llamado en la literatura CREB2; TXREB; CREB-2; TAXREB67) se refiere a un el gen codifica un factor de transcripción que se identificó originalmente como una proteína de unión a ADN de mamífero ampliamente expresada que podría unirse a un elemento potenciador de respuesta tributaria en el LTR de HTLV-1. La proteína codificada también se aisló y caracterizó como la proteína 2 de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB-2). La proteína codificada por este gen pertenece a una familia de proteínas de unión al ADN que incluye la familia de factores de transcripción AP-1 , proteínas de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB) y proteínas de tipo CREB. Estos factores de transcripción comparten una región de cremallera de leucina que está involucrada en las interacciones proteína-proteína, localizada en C-terminal a un tramo de aminoácidos básicos que funciona como un dominio de unión de ADN. Se han descrito dos transcripciones alternativas que codifican la misma proteína. Dos pseudogenes están ubicados en el cromosoma X a q28 en una región que contiene una gran duplicación invertida.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "ATF4", se refiere tanto al gen como a la proteína ATF4 humana. En el contexto de la presente invención, ATF4 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína ATF4, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ATF4. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican ATF4 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 1
USO DE LA FIRMA DE EXPRESION GÉNICA COMPUESTA POR TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 y/o ATF4 PARA PREDECIR O PRONOSTICAR LA SUPERVIVENCIA DE PACIENTES CON CANCER DE MAMA
Los autores de la presente invención han empleado las siguientes sondas para cada uno de los genes componentes de la firma génica: 224793_s_at ( TGFBR1 ), 235725_at ( SMAD4 ), 204369_at ( PIK3CA ), 225715_at (RPTOR), 226312_at (RICTOR), 200632_s_at (DRG1), 221539_at (EIF4EBP1), 200779_at (CREB-2) Para computar los rangos de expresión, se parte de la expresión media de cada sonda/gen.
Los autores han visto que, en términos de supervivencia libre de recaídas, todos aquellos pacientes con cáncer de mama, sin distinción de subtipos, que presenten una expresión media del conjunto de dichas sondas igual o mayor de 1546.75, que se corresponde aproximadamente con el cuartil bajo de expresión (rango de expresión media del conjunto de sondas en estos pacientes es 725 - 6631), presentan una menor supervivencia libre de recaídas.
Por otro lado, la expresión media de dichos genes igual o mayor a 1838.62 (que se corresponde aproximadamente con el tertil bajo de expresión) se correlaciona con una menor supervivencia libre de recaídas en pacientes con cáncer de mama ER- (rango de expresión media del conjunto de genes en estos pacientes es 1183 - 5732).
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, y/o ATF4, o cualquiera de sus combinaciones para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaídas en un individuo con cáncer.
Preferentemente, la invención se refiere al uso de ATF4 y al menos uno de los genes seleccionados del grupo que consiste en TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1.
En una realización preferida se emplean la firma génica que comprende TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 y ATF4 simultáneamente.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
El término "TGFBR1" (también llamado en la literatura AAT5; ALK5; ESS1 ; LDS1 ; MSSE; SKR4; TBRI; ALK-5; LDS1A; LDS2A; TBR-i; TGFR-1 ; ACVRLK4; tbetaR-l) se refiere a un el gen codifica una proteína que forma un complejo heteromérico con receptores de TGF-beta tipo II cuando se une a TGF-beta, transduciendo la señal de TGF-beta desde la superficie de la célula al citoplasma. La proteína codificada es una serina/treonina proteína quinasa. Las mutaciones en este gen se han asociado con el síndrome de aneurisma aórtico Loeys-Dietz (LDAS). Se han encontrado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “TGFBR1”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“TGFBR1” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “TGFBR1”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 4, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína TGFBR1. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican TGFBR1 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 3.
Gene ID: 7046. Localización del gen: 9q22.33
El término " SMAD4" (también llamado en la literatura JIP; DPC4; MADH4; MYHRS) se refiere a un gen que codifica un miembro de la familia Smad de proteínas de transducción de señales. Las proteínas Smad se fosforilan y activan mediante transmembrana serina-treonina quinasas receptoras en respuesta a la señalización del factor de crecimiento transformante (TGF)-beta. El producto de este gen forma complejos homoméricos y complejos heteroméricos con otras proteínas Smad activadas, que luego se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana. Esta proteína se une al ADN y reconoce una secuencia palindrómica de 8 pb (GTCTAGAC) llamada elemento de unión Smad (SBE). La proteína actúa como un supresor tumoral e inhibe la proliferación de células epiteliales. También puede tener un efecto inhibitorio sobre los tumores al reducir la angiogénesis y aumentar la hiperpermeabilidad de los vasos sanguíneos. La proteína codificada es un componente crucial de la vía de señalización de la proteína morfogenética ósea. Las proteínas Smad están sujetas a una regulación compleja mediante modificaciones postraduccionales. Se ha demostrado que las mutaciones o deleciones en este gen dan como resultado cáncer de páncreas, síndrome de poliposis juvenil y síndrome de telangiectasia hemorrágica hereditaria.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “SMAD4”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“SMAD4” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “SMAD4”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SMAD4. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican SMAD4 se encuentra, sin limitarse, la SEQ ID NO: 5.
Gene ID: 4089 Localización del gen: 18q21.2
El término " PIK3CA" ( phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, también llamado en la literatura MCM; CWS5; MCAP; PI3K; CLOVE; MCMTC; PI3K-alpha; p110- alpha) se refiere a una proteína, la fosfatidilinositol 3-quinasa, que está compuesta por una subunidad reguladora de 85 kDa y una subunidad catalítica de 1 10 kDa. La proteína codificada por este gen representa la subunidad catalítica, que usa ATP para fosforilar Ptdlns, Ptdlns4P y Ptdlns (4,5) P2. Se ha encontrado que este gen es oncogénico y ha sido implicado en cánceres de cuello uterino. Un pseudogen de este gen se ha definido en el cromosoma 22.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “PIK3CA”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“PIK3CA” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “PIK3CA”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 8, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PIK3CA. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican PIK3CA se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 7.
Gene ID: 5290. Localización del gen: 3q26.32
El término "RPTOR" (regulatory associated protein of MTOR, complex 1, también llamado en la literatura KOG1 ; Mip1) es un gen que codifica un componente de una ruta de señalización que regula el crecimiento celular en respuesta a los niveles de nutrientes e insulina. La proteína codificada forma un complejo estequiométrico con la mTOR quinasa y también se asocia con la proteína de unión al factor 4E eucariótico y la proteína S6 quinasa ribosómica. La proteína regula positivamente la proteína S6 quinasa ribosómica efector corriente abajo y regula negativamente la mTOR quinasa. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “RPTOR”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“RPTOR” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “RPTOR”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 10, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína RPTOR. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican RPTOR se encuentra, sin limitarse, la SEQ ID NO: 9.
Gene ID: 57521 Localización del gen: 17q25.3
El término "RICTOR" ( RPTOR independen t companion of MTOR complex 2, también llamado en la literatura PIA; AV03; hAV03). RICTOR y MTOR (FRAP1 ; MIM 601231) son componentes de un complejo proteico que integra señales derivadas de nutrientes y factores de crecimiento para regular el crecimiento celular. A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “FUCTOR”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“RICTOR” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “RICTOR", y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 12, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 12. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína RICTOR. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican RICTOR se encuentra, sin limitarse, la SEQ ID NO: 1 1.
Gene ID: 253260. Location: 5p13.1
El término " NDRG1 " ( N-myc downstream regulated 1, también llamado en la literatura GC4; RTP; DRG1 ; NDR1 ; NMSL; TDD5; CAP43; CMT4D; DRG-1 ; HMSNL; RIT42; TARG1 ; PROXY1). Este gen es un miembro de la familia de genes regulados negativamente N-myc que pertenece a la superfamilia alfa / beta hidrolasa. La proteína codificada por este gen es una proteína citoplasmática involucrada en respuestas de estrés, respuestas hormonales, crecimiento celular y diferenciación. La proteína codificada es necesaria para la activación y apoptosis de la caspasa mediada por p53. Las mutaciones en este gen son una causa de la enfermedad de Charcot- Marie-Tooth tipo 4D, y la expresión de este gen puede ser un indicador de pronóstico para varios tipos de cáncer. Alternativamente se han observado variantes de transcrito que codifican múltiples isoformas para este gen.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “NDRG1”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“NDRG1” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “NDRG1”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 14, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 14. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína NDRG1. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican NDRG1 se encuentra, sin limitarse, la SEQ ID NO: 13.
Gene ID: 10397. Location: 8q24.22
El término "EIF4EBP1" ( eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1, también llamado en la literatura BP-1 ; 4EBP1 ; 4E-BP1 ; PHAS-I). Este gen codifica un miembro de una familia de proteínas represoras de la traducción. La proteína interactúa directamente con el factor de iniciación de traducción eucariótico 4E (elF4E), que es un componente limitante del complejo multisubunidad que recluta subunidades ribosómicas 40S al extremo 5 'de los ARNm. La interacción de esta proteína con elF4E inhibe el ensamblaje complejo y reprime la traducción. Esta proteína se fosforila en respuesta a varias señales que incluyen irradiación UV y señalización de insulina, lo que resulta en su disociación de elF4E y la activación de la traducción de ARNm.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término “EIF4EBP1”, se refiere tanto al gen como a la proteína humana. En el contexto de la presente invención,“EIF4EBP1” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína“EIF4EBP1”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 16, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 16. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína EIF4EBP1. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican EIF4EBP1 se encuentra, sin limitarse, la SEQ ID NO: 15.
Gene ID: 1978. Location: 8p11.23
MÉTODOS DE LA INVENCIÓN Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) detectar el producto de expresión de ATF4 Preferiblemente se detectan los niveles de expresión, bien de la proteína, o bien del ARNm que lo codifica.
En una realización preferida de este aspecto el primer método de la invención además comprende c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia global cuando ATF4 presenta una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) detectar el producto de expresión de ATF4
Preferiblemente se detectan los niveles de expresión, bien de la proteína, o bien del ARNm que lo codifica.
En una realización preferida de este aspecto el primer método de la invención además comprende: c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas cuando ATF4 presenta una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) detectar el producto de expresión de ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 o cualquiera de sus combinaciones; preferentemente de ATF4 y al menos uno de los genes TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, y más preferentemente el de todos ellos.
Preferiblemente se detectan los niveles de expresión, bien de la proteína, o bien del ARNm que lo codifica.
En una realización preferida de este aspecto el primer método de la invención además comprende: c) asignar a dicho individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas cuando ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 o cualquiera de sus combinaciones; preferentemente de ATF4 y al menos uno de los genes TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, y más preferentemente el de todos ellos; presentan una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia.
Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
En el contexto de la presente invención, se entiende "muestra de referencia" o "valor de referencia" como la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de las proteínas o ácidos nucleicos de la presente invención. En una realización de la invención, el valor de referencia se obtiene a partir de la señal proporcionada usando una muestra de tejido obtenida de un individuo que no presenta un tumor. Preferiblemente, las muestras se toman de varios individuos con y sin cáncer y se combinan, de tal manera que el valor de referencia refleja el valor promedio de dichas moléculas en la población de individuos con y sin cáncer. "Valor de referencia" es el nivel de una proteína de la invención o de los ácidos nucleicos de la presente invención en la muestra de referencia.
Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel", "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT- PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT- LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR o RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.
Así pues, la detección de los niveles de proteínas o del nivel de expresión de los genes puede hacerse por cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia.
Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada son células tumorales, tejido tumoral y/o biopsia líquida (sangre, suero, plasma, orina, ... ).
El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término “individuo” en esta memoria, es sinónimo de“paciente”, y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
El término“fármaco”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es cáncer, preferiblemente cáncer de mama.
Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección del paso (b) se realiza mediante PCR, preferiblemente RT-PCT.
En el caso de que se detecte el nivel o los niveles de proteínas puede hacerse, al igual que en el caso de los genes, por cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia. Así, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de los niveles de expresión se realiza por una técnica inmunológica. En una realización más preferida, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones.
Otro aspecto de la invención se refiere a método para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, que comprende os pasos (a) - (c) según cualquiera de los métodos de la invención, y además comprende: d) asignar al individuo que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia global, y/o d1) asignar al individuo que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el tertil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o d2) asignar al individuo con cáncer de mama positivo para receptor de estrógeno (ER+) que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el tertil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o d3) asignar al individuo cáncer de mama negativo para receptor de estrógenos (ER-) que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o d4) asignar al individuo cáncer de mama negativo para receptor de estrógenos (ER-) que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas
KIT DE LA INVENCIÓN Y USOS
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante primer kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar el producto de expresión de TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 o cualquiera de sus combinaciones, preferentemente para detectar el producto de expresión de ATF4 y al menos uno de los genes TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente para detectar el producto de expresión de todos ellos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer kit o dispositivo de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleotídicas, que comprenden sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:1 1 , SEQ ID NO: 13y/o SEQ ID NO: 15, así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm del gen, y/o capaces de hibridar con la secuencia de TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 o cualquiera de sus combinaciones, preferentemente de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, más preferentemente con la de todos ellos; para posterior amplificación por PCR. Más preferiblemente las secuencias de los genes son las referidas en las secuencias anteriores. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
Así pues, el primer kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar el producto de expresión de ATF4, TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1 o cualquiera de sus combinaciones; preferentemente de ATF4 y al menos uno de los genes TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, y más preferentemente el de todos ellos; y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:1 1 , SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 15;
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13y/o SEQ ID NO: 15;
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 16.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 16, o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes TGFBR1, SMAD4, PÍK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 o cualquiera de sus combinaciones, preferentemente de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 yEIF4EBP1, más preferentemente con todos ellos.
Más preferiblemente, las secuencias de TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1, EIF4EBP1, ATF4 son las secuencias nucleotídicas indicadas anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del primer kit o dispositivo de la invención, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global y/o la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer. Preferiblemente el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente es cáncer de mama, y aún más preferiblemente es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil- adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), áster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN o DNA).
Los términos“secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y“proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et ai, 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Adicionalmente, los autores de la presente invención han demostrado, como se pone de manifiesto en los ejemplos de la invención, que la inhibición de ATF4 redujo la migración y la invasión, la eficiencia de formación de mamoesferas, la proliferación, la transición epitelio- mesenquimal, la verosimilitud del cáncer y los marcadores antiapoptóticos. En los modelos de ratón PDX, el silenciamiento de ATF4 disminuyó la metástasis, el crecimiento tumoral y la recaída después de la quimioterapia. Además, las investigaciones mostraron que ATF4 está abajo de TQRb/8MAϋ2/3/4, TQRb/RI3KLhT0R02 y regula mTOR / Rac1-RhoA independientemente en el estrés. Demuestran que la expresión de ATF4 podría modular la agresividad de TNBC, e influir aún más en el resultado del paciente. Además, ATF4 regula la metástasis a través de EMT, RhoA y Rad , CSC y piuripotenciaiidad, proliferación y resistencia a ios fármacos, vías que desarrollan la agresividad de TNBC. ATF4 opera en el estrés celular, integrando y modulando las rutas TGFp / Smad4 y TQRb / PI3K / mTORCI / 2 en su lugar.
USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un agente modulador de la actividad de ATF4 para su uso en el tratamiento del cáncer.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
El término "ATF4" (también llamado en la literatura CREB2; TXREB; CREB-2; TAXREB67) se refiere a un el gen codifica un factor de transcripción que se identificó originalmente como una proteína de unión a ADN de mamífero ampliamente expresada que podría unirse a un elemento potenciador de respuesta tributaria en el LTR de HTLV-1. La proteína codificada también se aisló y caracterizó como la proteína 2 de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB-2). La proteína codificada por este gen pertenece a una familia de proteínas de unión al ADN que incluye la familia de factores de transcripción AP-1 , proteínas de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB) y proteínas de tipo CREB. Estos factores de transcripción comparten una región de cremallera de leucina que está involucrada en las interacciones proteína-proteína, localizada en C-terminal a un tramo de aminoácidos básicos que funciona como un dominio de unión de ADN. Se han descrito dos transcripciones alternativas que codifican la misma proteína. Dos pseudogenes están ubicados en el cromosoma X a q28 en una región que contiene una gran duplicación invertida. A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "ATF4", se refiere tanto al gen como a la proteína ATF4 humana. En el contexto de la presente invención, ATF4 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína ATF4, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ATF4. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican ATF4 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 1
El término "que modula la actividad" como se usa aquí, se refiere tanto a que inhibe (disminuye) o estimula (incrementa) el nivel de actividad de la proteína ATF4 en una célula. La actividad de ATF4 puede ser modulada por la modificación de los niveles y/o de la actividad de la proteína ATF4, o por la modificación de los niveles a los que se transcribe el gen ATF4 tal que los niveles de actividad de la proteína ATF4 en la célula es modulada. Los agentes moduladores pueden ser también agonistas (sustancias que son capaces de unirse a un receptor y provocar una respuesta en la célula, en concreto un aumento de la actividad de ATF4), como antagonistas (sustancias que no solamente no activan el receptor, sino que en realidad bloquea su activación por los agonistas). En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, los agentes moduladores comprendidos en la composición de la invención se seleccionan de una lista que comprende: a) una molécula orgánica, b) una molécula de ARN, c) un oligonucleótido antisentido, d) un anticuerpo, o e) una ribozima.
Un experto en la materia podría preparar moléculas orgánicas que pueden unirse específicamente a la ATF4 sin unirse a otros polipéptidos o proteínas. Las moléculas orgánicas tendrán preferiblemente un peso de 100 a 20.000 daltons, más preferiblemente 500 a 15.000 daltons, y más preferiblemente 1000 a 10.000 daltons. Librerías de moléculas orgánicas se encuentran disponibles comercialmente. La vía de administración puede ser, sin limitarse a estas, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmica. Entre las moléculas orgánicas moduladoras de la actividad de ATF4 se encuentran, pero sin limitarnos, inhibidores de TGFBRI (ej. Galunisertib o LY2157299), inhibidores de PI3K (ej. LY294002, BKM120), inhibidores de mTOR (ej. rapamicina), inhibidores duales de PI3K/mTORC1/mTORC2 (ej. Omipalisib o GSK2126458), inhibidores de la fosforilación de elF2a (ej. ISRIB) o compuestos como el antihelmíntico pirvinio pamoato.
Recientemente, con el desarrollo de la tecnología antisentido, secuencias de nucleótidos específicamente complementarios a una determinada secuencia de ADN o ARN, podrían formar complejos y bloquear la transcripción o traducción. Así, con el progreso del silenciamiento génico post-transcripcional, y en particular del ARN de interferencia (RNA interferente o RNAi), se han desarrollado herramientas que permiten la inhibición específica de la expresión de un gen. La inhibición de la expresión de la proteína ATF4 constituiría por ende la inhibición de su actividad biológica, y en concreto, de la actividad que está contribuyendo al agravamiento de las características tumorales.
Por "polinucleótidos antisentido" se entienden cadenas de ribonucleótidos o desoxirribonucleóitidos que pueden inhibir la producción de la proteína ATF4 por uno de estos tres mecanismos:
1- Interfiriendo la transcripción, al hibridar en el gen estructural o en una región regulatoria del gen que codifica para ATF4. Puesto que la transcripción o expresión es bloqueada de manera efectiva por la hibridación del oligonucleótido antisentido con el ADN, disminuye la producción de ATF4.
2- La unión del oligonucleótido antisentido en el citoplasma con el ARNm, interfiriendo con la formación de la construcción de traducción propiamente dicha, inhibiendo la traducción de ARNm a la proteína.
3- La formación de un ARNm - antisentido dúplex que permite una rápida degradación del ARNm dúplex por ARNasas (como ARNasa H). Esto da lugar a una menor producción de ATF4.
Oligonucleótidos antisentido capaces de modular la actividad de la ATF4 son conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, y sin limitarnos, podría ser una secuencia de ribonucleótidos o ARN que pertenece al denominado siRNA (small interferíng RNA), ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento, capaz de inhibir la expresión genética de la proteína ATF4. En el contexto de la presente memoria se entiende como "siRNA" (small interferíng RNA ó ARN pequeño de interferencia) una clase de ARN de doble cadena de 19 a 25 nucleótidos de largo, y más preferentemente entre 21 y 23 nucleótidos, que está involucrado en la ruta de la interferencia de ARN, donde el siRNA interfiere la expresión de un gen específico. En la presente invención, este gen específico es el ATF4. También podría ser cualquier siRNA capaz de hibridar una molécula de ácido nucleico que codifique la proteína ATF4 humana que se recoge en la SEQ ID NO: 2. También podrían ser una construcción de ARN que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleótidos posibles de siRNA capaces de inhibir la expresión de ATF4, y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de la presente invención cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de la invención anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente químicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a la acción de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan la alteración de su mecanismo de acción, que es la unión específica al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoprotéico resultante se une al mRNA diana (ARN mensajero del ATF4, que se recoge en la SEQ ID NO: 1). Si la complementariedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa la traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso.
Adicionalmente resulta evidente para un experto en la materia que una gran cantidad de polinucleótidos de mARN pueden traducirse a ATF4 como consecuencia, por ejemplo, de que el código genético es degenerado. Cualquier siRNA capaz de inhibir la traducción de estos mARN también forma parte de la invención.
La preparación de la secuencia de siRNA de la invención o de la construcción de RNA de la invención sería evidente para un experto en la materia, y se podría llevar a cabo por síntesis química, lo cual permite además la incorporación de modificaciones químicas tanto en los distintos nucleótidos del producto como la incorporación de otros compuestos químicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, la síntesis también podría realizarse enzimáticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La síntesis enzimática también permite alguna modificación química de los productos o RNAs inhibidores.
El diseño de la secuencia de nucleótidos del siRNA de la invención también sería evidente para un experto en la materia. Así, se podría realizar mediante un diseño aleatorio en el que se seleccionen 19-25 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia o la información posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa de la presente invención sería el diseño convencional mediante parámetros simples desarrollados por los pioneros de la técnica (Calipel, A. et al. , 2003. J Biol Chem. 278(43): 42409-42418) completados con un análisis BLAST de nucleótidos. Otra posibilidad podría ser un diseño racional, en el que se emplee un procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas de siRNA en un ARNm. Las secuencias diana se analizan en grupos de 19 nucleótidos a la vez y se identifican las que tienen mejores características en función de un algoritmo que incorpora un gran número de parámetros termodinámicos y de secuencia. También podría formar parte de la composición de la invención una construcción genética de ADN, la cual dirigiría la transcripción in vitro o intracelular de la secuencia siRNA o construcción de ARN de la invención, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante del siRNA de la invención o de la construcción de ARN de la invención para su transcripción, o, b) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ARN de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. para su uso en aquellos contextos patológicos en los que ATF4 está contribuyendo al agravamiento de las características tumorales de las células cancerosas y/o a la aparición de cáncer. Múltiples de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook et al. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Las composiciones de la presente invención permiten la transfección del siRNA de la invención al interior de una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfección directa o vectores que faciliten el acceso del siRNA al interior de la célula. Así, ejemplos de estos vectores son, sin limitarse a, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del Herpes simplex, plásmidos de DNA no virales, liposomas catiónicos y conjugados moleculares. Así, por ejemplo, los siRNA de la presente invención, así como ARN o ADN precursores de estos siRNA, pueden conjugarse con péptidos de liberación u otros compuestos para favorecer el transporte de estos siRNA al interior de la célula.
El término "anticuerpo" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) la proteína ATF4. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal.
Los anticuerpos capaces de unirse a la proteína ATF4 pueden ser empleados para inhibir la actividad de dicha proteína. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente (como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, los anticuerpos. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, podrían ser capaces de inhibir la actividad de la proteína ATF4 que contribuye a la adquisición de las características propias cáncer. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, por manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de la ATF4 y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores.
Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es uno que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de la recombinación homóloga.
Estos rAc se pueden expresar y dirigir hacia subcompartimentos celulares específicos cuando se les incorpora las secuencias apropiadas para el tráfico intracelular. Estos anticuerpos se denominan intrabodies, y han demostrado su eficacia no sólo para desviar proteínas de su compartimento habitual o bloquear interacciones entre proteínas implicadas en vías de señalización, sino también para activar proteínas intracelulares.
También forman parte de la invención las construcciones genéticas de DNA capaces de transcribirse a un péptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para su uso en el tratamiento de enfermedades que cursan con cáncer. Dicha construcción genética de DNA dirigiría la transcripción in vitro o intracelular de la secuencia del anticuerpo o fragmento del mismo, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante del anticuerpo de la invención o del fragmento de anticuerpo de la invención para su transcripción in vitro, o intracelular, b) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. para su uso en aquellos contextos patológicos que transcurren con cáncer.
Un "ribozima" tal y como se entiende en la presente invención, se refiere a un polinucleótido catalítico (típicamente RNA), que puede construirse para reconocer específicamente, por hibridación, un mRNA y fragmentarlo o eliminar su expresión. Las ribozimas pueden introducirse en la célula como moléculas de RNA catalíticas o como construcciones genéticas que se expresan a moléculas catalíticas de RNA.
En otra realización preferida de este aspecto, la composición de la invención se usa para el tratamiento de un cáncer que se selecciona de la lista que comprende: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
Preferiblemente, el cáncer es el cáncer de mama, y aún más preferiblemente, el cáncer es el cáncer de mama triple negativo.
En esta memoria se entiende por cáncer de mama triple negativo a la forma de cáncer de mama que se caracteriza por la ausencia de expresión de receptores de estrógenos, progesterona y HER2 (human epidermal growth factor receptor 2), su elevada heterogeneidad y agresividad relacionada con la aparición de recaídas y metástasis en los tres primeros años tras el tratamiento inicial, resistencia a las terapias convencionales y ausencia de otras terapias aprobadas en la actualidad para su tratamiento.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende un oligonucleótido antisentido y se usa para el tratamiento del cáncer. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende un oligonucleótido antisentido y se usa para el tratamiento del cáncer de mama triple negativo.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende un anticuerpo y se usa para el tratamiento del cáncer. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende un anticuerpo y se usa para el tratamiento del cáncer de mama triple negativo.
En esta memoria“tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas. Es decir, tratamiento se refiere también a prevenir, mejorar o tratar las alteraciones referidas, preferiblemente el cáncer, más preferiblemente el cáncer de mama, y aún más preferiblemente, el cáncer de mama triple negativo. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.
La composición proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. Los agentes moduladores de la actividad de ATF4 de dichas composiciones se encuentran en una cantidad terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agentes moduladores (o construcciones genéticas que permitan su expresión intracelular) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
MÉTODOS DE SCREENING DE FÁRMACOS DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona métodos para identificar compuestos que pueden ser usados para el tratamiento de enfermedades relacionadas con ATF4, y en concreto aquellas que cursan con cáncer. Estos métodos permiten la identificación de candidatos, compuestos a ensayar o agentes (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas orgánicas, oligonucleótidos antisentido u otras moléculas) que pueden unirse a ATF4 y/o tener un efecto activador o inhibidor de la actividad biológica de ATF4 o de su expresión, y así determinar si esos compuestos tendrían un efecto sobre las enfermedades en las que ATF4 está implicado, y en concreto aquellas que cursan con cáncer.
Los ensayos para identificar estas moléculas, compuestos o agentes que modulan la actividad de ATF4 pueden emplear células que expresan ATF4, o en ensayos con ATF4 aislado (o con sus variantes, como fragmentos biológicamente activos o proteínas de fusión que incluyen una porción o parte de ATF4).
Así, otro aspecto de la invención consiste en un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polipéptido ATF4, b) detectar la unión de dicho compuesto a analizar con el polipéptido ATF4.
Los compuestos que se unen al polipéptido ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente al cáncer.
En una realización preferida el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente, cáncer de mama triple negativo.
Como se ha dicho, estos ensayos pueden implicar el polipéptido completo ATF4, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una proteína de fusión que implique toda o una porción del polipéptido ATF4. Determinar la capacidad de un compuesto para modular la actividad de ATF4 puede realizarse, por ejemplo, determinando la capacidad de ATF4 de unirse o interaccionar con una molécula diana de dicho compuesto, de manera directa o indirecta. Pueden ser también ensayos de actividad, midiendo de manera directa o indirecta la actividad de ATF4. También puede ser un ensayo de expresión, determinando de manera directa o indirecta la expresión del mARN de ATF4 o de la proteína ATF4. Estos ensayos también pueden combinarse con un ensayo in vivo midiendo el efecto de un compuesto test sobre los síntomas de enfermedades relacionadas con ATF4, y en concreto el cáncer (por ejemplo, pero sin limitarse, sobre modelos animales u otros sistemas modelo conocidos en la técnica).
Los compuestos a testar empleados en el método de selección de agentes terapéuticos no se limitan a moléculas orgánicas de bajo peso molecular, proteínas (incluyendo anticuerpos), péptidos, oliogonucleótidos, etc. Pueden ser naturales y/o sintéticos.
Por ejemplo, anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ATF4 , que pueden ser empleados terapéuticamente, como se ha expuesto anteriormente, pueden emplearse también en ensayos inmunohistoquímicos, como Western blots, ELISAs, radioinmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, u otros ensayos inmunohistoquímicos conocidos en el estado de la técnica. ATF4 puede emplearse para inmunizar a un animal, para obtener anticuerpos policlonales. También se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas que permiten la producción de anticuerpos por líneas celulares en cultivo, entre las que se incluyen, pero sin limitarse, hibridomas, hibridomas de células B humanas. Técnicas para producir anticuerpos quiméricos, humanizados o sintéticos son conocidas.
Los agentes terapéuticos identificados por el método de selección aquí descrito pueden ser usados en un modelo animal o de otro tipo para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Más aún, los agentes terapéuticos seleccionados por el método aquí descrito se emplearían en el tratamiento de enfermedades que cursen con la alteración de ATF4 y, en concreto, cáncer. Preferiblemente el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente, cáncer de mama triple negativo.
En otro aspecto de la invención se describe un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) determinar la actividad de ATF4 a una concentración establecida del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar la actividad de ATF4 a una concentración del compuesto a analizar diferente de la de a).
Compuestos que den lugar a una actividad diferente de ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente al cáncer.
En una realización preferida el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente, cáncer de mama triple negativo. Otro aspecto de la invención consiste en un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polinucleótido ATF4, b) detectar la unión de dicho compuesto a analizar con el polinucleótido ATF4
Los compuestos que se unen al polinucleótido ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente al cáncer.
En una realización preferida el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente, cáncer de mama triple negativo.
DIAGNÓSTICO
Las enfermedades en las que la alteración de la actividad de ATF4 puede ser diagnóstica, y en concreto el cáncer, pueden ser detectadas midiendo la cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o mARN) que codifican para ATF4, o la cantidad de proteína ATF4 que se expresa, en comparación con células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, la RT-PCR). Procedimientos para detectar la expresión de la proteína ATF4 también son bien conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA), y FACS (fluorescence activated cell sorting).
Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe un método para la recolección de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer que comprende: a) determinar la expresión de ATF4 en una muestra extraída de un mamífero, b) comparar los valores de la expresión de ATF4 obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
En una realización preferida, el cáncer se selecciona de la lista que comprende cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo. Más preferiblemente el cáncer es cáncer de mama, y aún más preferiblemente, cáncer de mama triple negativo.
Por lo tanto, de forma preferida, la presente invención hace referencia a los siguientes aspectos:
1.- Una composición que comprende un agente modulador de la actividad de ATF4 para su uso en el tratamiento del cáncer. 2.- La composición según el aspecto 1 , en la que el agente modulador es un inhibidor de la actividad de ATF4.
3.- La composición según cualquiera de los aspectos 1-2, en la que el agente modulador se selecciona de la lista que consiste en: a) una molécula pequeña, b) una molécula de RNA, c) un oligonucleótido antisentido, d) un anticuerpo, o e) una ribozima, o cualquiera de sus combinaciones.
4 - La composición según cualquiera de los aspectos 1-3, en la que los agentes moduladores se seleccionan de la lista que consiste en: Galunisertib, LY294002, BKM120, rapamicina, Omipalisib, ISRIB o el antihelmíntico pirvinio pamoato.
5. La composición según cualquiera de los aspectos 1-4, donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
6.- La composición según cualquiera de los aspectos 1-5, donde el cáncer es cáncer de mama.
7.- La composición según cualquiera de los aspectos 1-6, donde el cáncer es cáncer de mama triple negativo.
8.- Un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polipéptido ATF4, b) detectar la unión de dicho compuesto a analizar con el polipéptido ATF4, donde los compuestos que se unen al polipéptido ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a la enfermedad según se describe en cualquiera de los aspectos 1-7.
9.- Un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) determinar la actividad de ATF4 a una determinada concentración del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar la actividad de ATF4 a una concentración del compuesto a analizar diferente de la de a), donde los compuestos que dan lugar a una actividad diferente de ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a la enfermedad según se describe en cualquiera de los aspectos 1-7.
10.- Un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) determinar la actividad de ATF4 a una determinada concentración del compuesto a analizar, b) determinar la actividad de ATF4 en presencia de un compuesto que se conoce que modula la actividad de ATF4, donde los compuestos que dan lugar a una actividad diferente de ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a la enfermedad según se describe en cualquiera de los aspectos 1-7.
1 1.- Un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del cáncer que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polinucleótido ATF4, b) detectar la unión de dicho compuesto a analizar con el polinucleótido ATF4. donde los compuestos que se unen al polinucleótido ATF4 se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a la enfermedad según se describe en cualquiera de los aspectos.
12.- Un método para la recolección de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer que comprende: a) determinar la expresión de ATF4 en una muestra extraída de un mamífero, b) comparar los valores de la expresión de ATF4 obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
13.- El método según cualquiera de los aspectos 8-12, donde el cáncer es el cáncer de mama.
14.- El método según cualquiera de los aspectos 8-12, donde el cáncer es el cáncer de mama triple negativo. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN Análisis bioinformático
El trazador de Kaplan-Meier (http://kmplot.com/analysis/) puede evaluar el efecto de 54.675 genes sobre la supervivencia utilizando 5.143 muestras de pacientes con cáncer de mama con un seguimiento medio de 69 meses. Los datos de expresión génica, la supervivencia libre de recaída y general (RFS y OS, respectivamente) se descargan de GEO (Gene Expression Omnibus), EGA (European Genome-phenome Archive) y TOGA (The Cáncer Genome Atlas) (Gyórffy B, Lanczky A, Eklund AC, Denkert C, Budczies J, Li Q, et al. An online survival analysis tool to rapidly assess the effect of 22,277 genes on breast cáncer prognosis using microarray data of 1 ,809 patients. Breast Cáncer Res Treat. 2010;123:725-31). Las bases de datos "Esserman" (Esserman LJ, Berry DA, Cheang MCU, Yau C, Perou CM, Carey L, et al. Chemotherapy response and recurrence-free survival in neoadjuvant breast cáncer depends on biomarker profiles: results from the l-SPY 1 TRIAL (CALGB 150007/150012; ACRIN 6657). Breast Cáncer Res Treat. 2012; 132:1049-62), "Hatzis" (Hatzis C, Pusztai L, Valero V, Booser DJ, Esserman L, Lluch A, et al. A genomic predictor of response and survival following taxane- anthracycline chemotherapy for invasive breast cáncer. JAMA. 2011 ;305: 1873-81) y "Minn 2" (Minn AJ, Gupta GP, Siegel PM, Bos PD, Shu W, Giri DD, et al. Genes that medíate breast cáncer metástasis to lung. Nature. 2005;436:518-24) se descargaron de la base de datos Oncomine Cáncer Microarray (Rhodes DR, Kalyana-Sundaram S, Mahavisno V, Varambally R, Yu J, Briggs BB, et al. Oncomine 3.0: genes, pathways, and networks in a collection of 18,000 cáncer gene expression profiles. Neoplasia. 2007;9: 166-80). El análisis de Kaplan-Meier se realizó tal como se describe en (Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Oían W, et al. Inhibition of ¡NOS as a novel effective targeted therapy against triple-negative breast cáncer. Breast Cáncer Res. 2015; 17:25). Los análisis de correlación, alteraciones genómicas y transcriptómicas (amplificación, deleción profunda, regulación positiva del ARNm y regulación negativa del ARN ) y su impacto sobre la supervivencia del paciente se estudiaron con OncoPrint y Kaplan-Meier en una base de datos de 2509 pacientes con cáncer de mama (Pereira B, Chin S-F, Rueda OM, Vollan H-KM, Provenzano E, Bardwell HA, et al. The somatic mutation profiles of 2,433 breast cancers refines their genomic and transcriptomic landscapes. Nat Commun. 2016;7: 1 1479) utilizando la base de datos cBioPortal (Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA, et al. The cBio cáncer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cáncer genomics data. Cáncer Discov. 2012;2:401-4, Gao J, Aksoy BA, Dogrusoz U, Dresdner G, Gross B, Sumer SO, et al. Integrative analysis of complex cáncer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 2013;6:pl1).
Knockdown mediada por siRNA siRNA para ATF4 (50 nM), Smad2/3, Smad4, PERK, PKR, GCN2, HRI, elF2a, Raptor, Rictor, TAK1 y Ras (100 nM) se transfectaron transitoriamente con Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen). Se añadió TΰRb1 (10 ng/ml) 48 h después de la transfección durante 24 h o 72 h, dependiendo del experimento.
Cultivo de células
Las líneas celulares TNBC MDA-MB-231 y BT549 se compraron de la American Type Culture Collection, y SUM159PT de Asterand. Las líneas celulares SBE (SMAD Binding Element) reporter-HEK293 (SBE-HEK293) se obtuvieron de BPS Bioscience. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Thermo Scientific) y 1 % de antibiótico-antimicótico (Gibco). Las células SBE-HEK293 se cultivaron bajo selección con 400 pg / mi de Geneticin (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. La eficiencia de formación de mamoesferas (MSFE) se realizó como publicamos previamente (Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Qian W, et al. Inhibition of ¡NOS as a novel effective targeted therapy against triple-negative breast cáncer. Breast Cáncer Res. 2015; 17:25). Brevemente, las células se transfectaron con siRNA para ATF4 y TΰRb1 se añadió durante 24 h. Seguidamente, las células se trataron con tripsina, se clocaron en placa con medio de mamoesfera y se contaron después de 72 horas con un contador de colonias GelCount.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total se extrajo utilizando el kit EZNA MicroElute Total RNA (Omega Bio-tek) y la transcripción reversa se realizó con el kit de síntesis de cDNA de qScript (Quantabio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando ¡Taq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) en un QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Los cebadores utilizados fueron: ATF4_Fw: CCTTCACCTTCTTACAACCT y Rv: GTAGTCTGGCTTCCTATCTC (agelkerke A, Bussink J, Mujcic H, Wouters BG, Lehmann S, Sweep FCGJ, et al. Hypoxia stimulates migration of breast cáncer cells vía the PERK/ATF4/LAMP3-arm of the unfolded protein response. Breast Cáncer Res. 2013; 15:R2), GADPH_Fw: AT CACCAT CTTCCAGGAGC y Rv: CATGGTT CACACCCAT G AC . La expresión de Sox2, Oct4, Notchl , Nanog y Cxcl10 se determinó con ensayos TaqMan.
Western blot
El análisis de Western blot se realizó como se publicó en(Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Qian W, et al. Inhibition of ¡NOS as a novel effective targeted therapy against triple-negative breast cáncer. Breast Cáncer Res. 2015; 17:25). Las bandas de proteínas se detectaron con la cámara digital ImageQuant LAS 4000. Los anticuerpos se enumeran en la Información Complementaria.
Ensayo reportador del elemento de unión SMAD (SBE)
Las células SBE-HEK293 se transfectaron con SiRNA para ATF4 y se trataron con TΰRb1 durante 24 h. La actividad de SBE se realizó con el sistema de ensayo de luciferasa ONE-Step (BPS Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayo de proliferación celular
Las células se transfectaron y se trataron con TΰRb1 durante 24 h (las células MDA-MB-231 se trataron durante 72 h) en una placa de 96 pocilios. La proliferación celular se ensayó como se publicó (Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Qian W, et al. Inhibition of ¡NOS as a novel effective targeted therapy against triple-negative breast cáncer. Breast Cáncer Res. 2015; 17:25).
Migración e Invasión.
La migración se analizó mediante el ensayo de "cicatrización de heridas" tal como se publicó previamente (Granados-Principal S, Liu Y, Guevara ML, Blanco E, Choi DS, Qian W, et al. Inhibition of ¡NOS as a novel effective targeted therapy against triple-negative breast cáncer. Breast Cáncer Res. 2015;17:25) en células transfectadas con SiRNA de ATF4 y más tarde con TΰRb1 durante 24 h. La invasión celular se analizó con el kit de ensayo de invasión celular Cultrex BME (Trevigen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se trataron con TΰRb1 durante 24 h (las células MDA-MB-231 se trataron durante 72 h). Después, las células se sembraron en una cámara transwell recubierta con BME (1X) a una densidad de 50.000 células / mi en 50 pl de medio sin FBS y se suplementaron con TΰRb1 (10 ng / mi). En el pozo del fondo, se añadió medio de crecimiento con FBS al 10% como quimioatrayente. Medio sin FBS también se usó como control negativo. Después de 16 h, se cuantificó el número de células invasoras usando Calceína AM a 485 nm de excitación y 520 nm de emisión en comparación con una curva estándar.
Experimentos animales
RNA-Seq
La alineación de las lecturas secuenciadas en bruto con el genoma de referencia humano (Versión hg19 de UCSC) se realizó con el software Aligner Transcripts Alignment to Reference (STAR) (versión 2.4.2). Se ensamblaron las lecturas de RNA-Seq alineadas, se analizaron con la notación de referencia hg19 (navegador del genoma UCSC) y se cuantificaron usando la suite de gemelos versión 2.2.1 para obtener FPKM (Fragments per Kilobase per million).
Modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Oficina de Revisión de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Metodista del Hospital. Los experimentos se llevaron a cabo en dos diferentes humanos PDBC TNBC, BCM-4664 y BCM-3887 (Zhang X, Claerhout S, Prat A, Dobrolecki LE, Petrovic I, Lai Q, et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cáncer xenograft models. Cáncer Res. 2013;73:4885-97]). Los PDX se trasplantaron a la almohadilla adiposa mamaria aclarada de NOD.Cg-Prkdcfcidll2rgtm1Wil/SzJ (NSG) ratones (Jackson Laboratory) mantenidos en condiciones estándar, como publicamos (Dave B, Granados-Principal S, Zhu R, Benz S, Rabizadeh S, Soon-Shiong P, et al. Targeting RPL39 and MLF2 reduces tumor initiation and metástasis in breast cáncer by inhibiting nitric oxide synthase signaling. Proc Nati Acad Sci U S A. 2014; 111 :8838-43). Cuando los tumores eran 150-200 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos de tratamiento (n = 8 / grupo): 1) SiRNA no codificante o codificado (SCR), 2) SiRNA para ATF4 (SiRNA n. ° 2), 3) SCR más docetaxel (Chemo + SCR, 20 mg / kg) y 4) SiRNA n. ° 2 más docetaxel (quimioterapia + SiRNA n. ° 2, 20 mg / kg). Los siRNAs se inyectaron dos veces a la semana durante 6 semanas a una dosis de 5 pg / ratón, y docetaxel se administró una vez a la semana los días 1 , 14 y 28. El volumen del tumor y los pesos corporales se registraron cada 2 días. Los tumores se calipraron y el volumen se calculó según publicamos (Choi DS, Blanco E, Kim Y-S, Rodríguez AA, Zhao H, Huang TH-M, et al. Chloroquine eliminates cáncer stem cells through deregulation of Jak2 and DNMT1. Stem Cells. 2014;32:2309-23). Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la última inyección y los tumores se recogieron para análisis adicionales. Para la recaída tumoral, se administró docetaxel a una dosis de 33 mg / kg a ratones que portaban BCM-4664, y se registró el volumen tumoral hasta aparición de morbilidad, pérdida del 20% del peso corporal o cuando los tumores alcanzaron 2 cm3 de tamaño. Validación de ATF4 como objetivo en un modelo PDX de TNBC metastásico
Se ha informado que el modelo de PDX BCM-3887 hace metástasis a pulmones de ratón, y también se usó para desarrollar un modelo altamente metastásico (3887-LM) mediante el trasplante en serie de un nodulo metastásico de pulmones de la siguiente manera. Se trasplantó un fragmento de tejido tumoral BCM-3887 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG. Cuando los tumores alcanzaron 200-250 mm3, se eliminaron y los ratones se mantuvieron vivos hasta que los ratones mostraron signos de morbilidad o pérdida de peso corporal. Después de la eutanasia, se extrajeron los pulmones y se resecó cualquier nodulo metastásico, se colocó en RPMI suplementado con 10% de SFB y se trasplantó en serie a la almohadilla de grasa mamaria de los nuevos ratones NSG de 4 a 5 semanas de edad. Este proceso se repitió hasta la segunda generación, llamada 3887-LM, y se usó para nuestros estudios. Brevemente, se trasplantó un fragmento de tejido en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NSG (n = 10); cuando los tumores eran de 150-200 mm3, los eliminamos y se permitió a los ratones una recuperación de una semana desde la cirugía antes de los tratamientos. Los ratones se asignaron al azar a dos grupos de tratamiento (n = 5 / grupo): 1) SCR y 2) siRNA # 2. Cada SiRNA se administró por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 6 semanas a una dosis de 5 pg / ratón. Los ratones se sacrificaron por signos de morbilidad metastásica o pérdida de peso corporal. Los pulmones y los hígados se evaluaron macroscópicamente para metástasis y se conservaron en formalina para inmunohistoquímica adicional (IHC).
Preparación de nanopartículas liposómicas
ARNsi para ATF4 (siATF4) y control (siSCR) para el suministro in vivo se incorporaron en liposomas DOPC como se describió previamente (34). Se mezcló siRNA con DOPC con exceso de butanol terciario (relación de 1 :10, p / p) y la posterior adición de Tween 20. La mezcla se congeló en un baño de acetona / hielo seco y se liofilizó. Antes de la administración in vivo, la preparación liofilizada se hidrataba con PBS a una concentración de 25 pg / mi (cada ratón recibía 5 pg de SiRNA en 200 pl / inyección por vía intraperitoneal).
Citometría de flujo
Los cambios en la población con Aldefluor positivo (ALDF +) (StemCell Technologies) se analizaron mediante citometría de flujo como se describió previamente (33) en células individuales aisladas del tejido tumoral PDX después del corte y la lisis de los glóbulos rojos. Las células se analizaron en un citómetro de flujo LSR Fortessa (BD Biosciences).
Inmunohistoquímica
La evaluación de metástasis a pulmones e hígados se realizó por análisis inmunohistoquímico de Ki67 (Dako, M7240) (dilución 1 : 100) como se describió previamente (Dave B, Granados- Principal S, Zhu R, Benz S, Rabizadeh S, Soon-Shiong P, et al. Targeting RPL39 and MLF2 reduces tumor initiation and metástasis in breast cáncer by inhibiting nitric oxide synthase signaling. Proc Nati Acad Sci U S A. 2014;1 11 :8838-43).
Análisis estadístico
La significación estadística entre dos grupos se analizó mediante la prueba t de Student de dos colas. Se analizaron comparaciones múltiples con ANOVA de una vía y la prueba post hoc de Bonferroni. El volumen del tumor se evaluó mediante ANOVA de dos vías y prueba post hoc de Bonferroni. La mediana de supervivencia post-tratamiento se analizó utilizando la prueba Log- rank (Mantel-Cox). La correlación de la expresión génica alta con la mediana de supervivencia (RFS y OS) en pacientes con cáncer de mama se analizó mediante el plotter de supervivencia Kaplan-Meier, y se calculó la relación de riesgo con intervalos de confianza del 95% y valor P de log-rank. Los pacientes se dividieron mediante el cálculo de todos los percentiles de expresión entre los cuartiles inferior y superior, y el umbral de mejor rendimiento se utilizó como punto de corte en el análisis de regresión de Cox como se describió anteriormente (Mihály Z, Kormos M, Lánczky A, Dank M, Budczies J, Szász MA, et al. A meta-analysis of gene expression-based biomarkers predicting outcome after tamoxifen treatment in breast cáncer. Breast Cáncer Res Treat. 2013; 140:219-32). Para el análisis de genes múltiples, utilizamos el clasificador de multigene y la expresión media de los genes. La supervivencia mediana de la cohorte de expresión de genes altos se normalizó a la cohorte de expresión de genes bajos como porcentaje. Se calculó el cambio en el pliegue de supervivencia: FC (%) = Supervivencia de la cohorte "Alta expresión" - 100 (línea de base). Se realizó una corrección de prueba múltiple usando un método de incremento (http://www.kmplot.com/multipletesting/) como se describió anteriormente (Mihály Z, Kormos M, Lánczky A, Dank M, Budczies J, Szász MA, et al. A meta- analysis of gene expression-based biomarkers predicting outcome after tamoxifen treatment in breast cáncer. Breast Cáncer Res Treat. 2013; 140:219-32). El rendimiento de nuestra firma de ocho genes y para el análisis de múltiples genes se evaluó mediante el método de validación cruzada de dejar salir uno (LOOCV) como se describió anteriormente (Komisarof J, McCall M, Newman L, Bshara W, Mohler JL, Morrison C, et al. A four gene signature predictive of recurrent prostate cáncer. Oncotarget. 2017;8:3430-40, Fjeldbo CS, Julin CH, Lando M, Forsberg MF, Aarnes E-K, Alsner J, et al. Integrative Analysis of DCE-MRI and Gene Expression Profiles in Construction of a Gene Classifier for Assessment of Hypoxia-Related Risk of Chemoradiotherapy Failure in Cervical Cáncer. Clin Cáncer Res. 2016;22:4067-76). Los análisis de correlación se realizaron usando la correlación de Person. A P <0.05 se consideró significativo.
RESULTADOS
La expresión alta de ATF4 se correlaciona con una menor supervivencia del paciente y está abajo de Smad4. La importancia de ATF4 como biomarcador pronóstico en el cáncer de mama se determinó mediante el análisis de Kaplan-Meier en diferentes bases de datos. En la base de datos del trazador Kaplan-Meier (KM), la cohorte de pacientes con alta expresión de ATF4 se correlacionó con peor sistema operativo (n = 1402, P = 0.0095) y RFS (n = 3951 , P = 8.4e-6) en todos los casos de cáncer de mama (Todos BC), y RFS en ER (n = 801 , P = 0.0058) y ER+ (n = 2061 , P = 0.0011) (Fig. 1A y Fig. 1A complementaria). ATF4 está sobreexpresado en pacientes TNBC; en las bases de datos TNBC, nuestros datos muestran que la sobreexpresión de ATF4 fue pronóstico de menos OS en "Esserman" (n = 98, P = 0,0034) (Figura 1 B complementaria), RFS en KM plotter (n = 255, P = 0,016) y "Esserman" (P = 0,0038) (Fig. 1A y Fig. 1 B complementaria) y supervivencia libre de metástasis en "Minn 2" (n = 81 , P = 0,0056) y "Hatzis" (n = 497, P <0,0001 ) (Fig. 1C suplementaria).
Debido a que el microambiente de TNBC a menudo está enriquecido en ligandos de TQRb, nos preguntamos si ATF4 está influenciado por la señalización de TQRb en TNBC y encontramos mayor expresión de ATF4 en células BT549 y SUM159PT tratadas con TQRb1 , que fue inhibida por el inhibidor de la cinasa de TQRbBI LY2157299, lo que sugiere que ATF4 es un objetivo corriente abajo (figura 1 B).
Mediante knockdown de genes, confirmamos que ATF4 está regulado por Smad4 (Fig. 1 C). Para determinar la importancia de ATF4 en la ruta de TQRb, inhibimos ATF4 con SiRNA y se probó la actividad de SBE. La secuencia de SiRNA más eficaz seleccionada, SiRNA N° 2 (Fig. 2A complementaria), provocó una disminución de la actividad de SBE en células HEK-293 (Fig. 1 D) y niveles de proteína de p-Smad2/3, Smad2/3 y Smad4 en células BT549 y SUM159PT (Fig. 1 E), lo que sugiere una retroalimentación positiva sobre TQRb. De hecho, la coexpresión de ATF4 y los miembros de la vía canónica TQRb se correlacionan con una OS significativamente peor (P = 0,0038) en el plotter KM (Fig. 1 F), con un cambio de supervivencia positiva a negativa en co expresión con Smad4 o Smad3 en todos los BC (Fig. 1 G). LOOCV demostró que ATF4 era determinante para mantener un sistema operativo significativamente menor (Tabla S1 complementaria).
La inhibición de ATF4 suprime la agresividad de las líneas celulares TNBC.
Para confirmar si ATF4 podría influir en el potencial metastásico y el crecimiento celular, ATF4 se silenció en tres líneas celulares TNBC tratadas con TQRb1. La depleción de ATF4 condujo a reducir la capacidad de curación de la herida (figura 2A y la figura 2B complementaria) y la invasión con y sin quimioatrayente (figura 2B). Estos resultados se correlacionaron con una regulación a la baja de los factores de transcripción relacionados con la transición epitelio- mesenquimal (EMT) (Zeb1 , Twistl , Snail y Slug), que fue uniforme en las tres líneas celulares solo después del tratamiento con TQRb. N-Cadherin también se redujo en BT549 y SUM159PT, pero no se detectó en MDA-MB-231 (Fig. 2C). La proliferación celular disminuyó después de la anulación de ATF4 (Fig. 2D), seguido por una menor expresión de Bcl2 y Mcl1 en las tres líneas celulares (Fig. 1 E).
Las propiedades de autorrenovación y pluripotencialidad de las células TNBC se suprimen después de la depleción de ATF4.
Las células pluripotentes tumorales (CSC) contribuyen a la metástasis, el crecimiento tumoral y la resistencia al tratamiento. Para determinar si la función de ATF4 en la agresividad de TNCB podría verse influenciada por un efecto sobre CSC, primero evaluamos la expresión de ATF4 en mamosferas (MS) como marcador sustituto de CSC frente a células unidas. Los niveles de proteína se incrementaron en términos de tiempo y generación de MS (figura 3A y figura 2C complementaria). En consecuencia, investigamos si la depleción de ATF4 podría conducir a una disminución de MSFE. Nuestros resultados muestran reducción de MSFE en todas las líneas celulares después de la depleción de ATF4 (Fig. 3B). ATF4 está regulado positivamente por estrés oxidativo en cultivos en suspensión (12). Para evaluar si nuestros resultados en MS y MSFE se debieron a una modulación de las propiedades del pluripotencialidad o una consecuencia de la separación, se midieron los niveles de ARNm de los stemness marcadores después de la inhibición de ATF4. Encontramos la subexpresión de Nanog, Sox2, Oct4 y Cxcl10 en células BT549 y SUM 159PT (Fig. 3C). Estos resultados se confirmaron a niveles de proteína, aunque no se detectó Cxcl10 (Fig. 3D). De forma importante, se suprimieron Notchl y Oct4 escindidos consistentemente en las tres líneas celulares probadas, y se acompañaron de una clara inhibición de CD44 (Fig. 3D).
ATF4 reduce la metástasis, el crecimiento tumoral y la recaída en modelos de ratón PDX.
Para los estudios in vivo, se seleccionaron los BCM-3887 metastásicos y los modelos altamente agresivos BCM-4664 PDX con expresión de ARNm ATF4 alta y media por ARN-Seq, respectivamente (figura 4A).
Para demostrar si el silenciamiento de ATF4 podría inhibir la metástasis del tumor de mama, utilizamos un modelo de PDX altamente metastásico (3887-LM) en ratones. Después de la eliminación del tumor primario, los ratones se trataron con SiRNA # 2 ATF4 conjugado con DOPC y control negativo (SCR) dos veces a la semana durante 6 semanas. Los animales tratados con SiRNA n. ° 2 exhibieron nodulos metastásicos menos evidentes en hígado (figura 4B) y pulmones (figura 4C). Las lesiones metastásicas se confirmaron microscópicamente por IHC de Ki67 (Fig. 4D).
Para abordar si ATF4 podría representar un objetivo terapéutico atractivo en TNBC, evaluamos el crecimiento tumoral, la población CSC y la recaída tumoral después del tratamiento con ATF4 siRNA y / o docetaxel. El direccionamiento in vivo de ATF4 redujo significativamente el crecimiento tumoral solo (P <0,01) o en combinación con docetaxel (P <0,05) (figura 5A) y la población de ALDF + en BCM-3887 (figura 5B). En el modelo BCM-4664, la inhibición de ATF4 restringió significativamente el crecimiento tumoral (P <0,001) (figura 5C) y la población de ALDF + (figura 5D). Para investigar la recidiva tumoral después de la quimioterapia, se coadministraron ATF4 siARN y docetaxel (33 mg / kg) dos veces a la semana durante 6 semanas a los ratones con tumores BCM-4664. Los tumores Chemo+SCR alcanzaron el volumen mínimo (124 mm3) el día 24 y comenzaron a volver a crecer el día 28 (128 mm3), mostrando un aumento de 2.4 veces el día 38. Por el contrario, el volumen tumoral en Chemo + siRNA # 2 fue de 63 mm3 en el día 24, y comenzaron a volver a crecer en el día 28 (78 mm3), mostrando un aumento de 1 ,4 veces en el día 38. En el día 56, el volumen del tumor en Chemo + SCR fue 2083 mm3 y 548 mm3 en quimio + siRNA n. ° 2 (p <0,001) (figura 5C). La mediana del postratamiento de supervivencia fue de 28 días en Chemo + siRNA # 2 y 19 días en Chemo + SCR (P <0,0001) (Fig. 5E). Para confirmar que ATF4 fue dirigido de manera eficiente, se midió su expresión por Western blot en BCM-3887 (Fig. 5F) y tumores BCM-4664 (Fig. 5G).
ATF4 está aguas abajo de mTORC2 y regula mTOR/Rac1-RhoA independientemente del estrés.
Tras el estrés celular, ATF4 se activa mediante la fosforilación de elF2a como el núcleo central de ISR. Para probar si TQRb estimula ATF4 dependiendo del ISR, inhibimos PERK, PKR, GCN2,hRI y elF2a, en tres líneas celulares TNBC en presencia de TΰRb1. Colectivamente, su inhibición no regula negativamente ATF4 de forma consistente a través de las líneas celulares (Fig. 6A). Dado que el ISR no está implicado en la actividad de ATF4 inducida por TΰRb, dirigimos las rutas de TΰRb no canónicas MEK/ERK, PI3K, TAK1 y p38 con inhibidores farmacológicos y TΰRb1 en SUM 159PT y BT549 durante 24h. La expresión de ATF4 disminuyó después de la inhibición de PI3K y TAK1 (Fig. 3A suplementaria). Un cribado más profundo de la señalización de PI3K en las tres líneas celulares con inhibidores en el co-tratamiento con TΰRb1 mostró que PI3K, mTOR y SGK1/2 son independientes de Akt y PDK1. El inhibidor de ATF4 ISRIB se usó como control (Fig. 3B suplementaria). También se probó un segundo inhibidor de PI3K para descartar cualquier efecto indeseado dependiente de inhibidor en ATF4 (Figura 3C complementaria). Para comprobar si la comunicación cruzada entre TΰRb y Ras upstream PI3K es la señal principal en ATF4, transfectamos las células BT549 y SUM159PT con Ras siRNA con y sin TΰRb1. La inhibición de Ras no pudo reprimir los niveles de proteína ATF4 independientemente de la fosforilación de Akt (Fig. 3D Suplementaria).
La rapamicina inhibe mTORCI y mTORC2 de una manera dependiente de la dosis y del tiempo y SGK1 , que se activa con mTORC2. Para aclarar si ATF4 está aguas abajo de mTORCI y/o mTORC2 en TΰRb activo, se transfectaron tres líneas celulares TNBC con siRNA Raptor y Rictor con TQRb1. Se encontró una disminución constante de ATF4 tras el agotamiento de Rictor en las tres líneas celulares (Fig. 6B). La vía TAK1 se descartó ya que no se observó reducción después de su caída en SUM159PT (figura 6B). Debido a que nuestros resultados muestran que Snail está muy reprimido después de la caída de ATF4, se usó como control sustituto de la inhibición de ATF4. Snail disminuyó después de silenciar Rictor con TQRb1 en las tres líneas celulares (Fig. 6C), lo que respalda la idea de que ATF4 está aguas abajo de mTORC2.
La actividad de señalización de mTOR está modulada por varios bucles, y se cuestionó si ATF4 podría retroal i mentar sobre mTORC1/2. La expresión de ATF4 se correlacionó con la expresión de mTORCI (elF4E, R = 0.463; RPS6, R = 0.380) y dianas mTORC2 (Ndrgl , R = 0.213; RhoA, R = 0.320) (P <0.0001) en una cohorte de 2509 pacientes con cáncer de mama (Fig. 6D), lo que reforzó nuestra hipótesis. La retroalimentación positiva sobre mTORCI y mTORC2 se confirmó posteriormente. ATF4 siRNA inhibió aguas abajo objetivos de mTORC2 (p-Ndrg1 , RhoA, Rac1) y mTORCI vía (p-Akt, p-p70S6K) en células SUM159PT y BT549 (Fig. 6E). Curiosamente, RhoA y Rac1 se redujeron consistentemente después del tratamiento con TQRb1 en tres líneas celulares, y la inhibición de Rac1 con TQRb1 se mantuvo en diferentes puntos de tiempo en tres líneas celulares (Fig. 6E y Fig. 3E complementaria).
Colectivamente, nuestros datos sugieren que ATF4 está integrado y regula tanto las vías de señalización canónicas, Smad4 y no canónicas, PI3K/mTORC2/RhoA-Rac1 , TQRb para modular la metástasis, la pluripotencialidad y la supervivencia de las células tumorales (Fig. 6F).
Potencial pronóstico de una firma genética basada en mecanismos en pacientes con cáncer de mama.
En base a nuestras investigaciones sobre las vías de señalización en las que participa el ATF4, cuestionamos si este conocimiento podría ayudar a mejorar el pronóstico y la toma de decisiones sobre el tratamiento en pacientes con cáncer de mama. Usando la base de datos KM plotter, estudiamos el impacto de diferentes miembros de las rutas TQRb/8h^/ATR4 y PI3K/mTOR/ATF4, en el RFS de pacientes con cáncer de mama (Tabla S2 complementaria). Los p-valores falsos positivos de P derivados de KM plotter se filtraron usando un análisis multivariable de incremento. LOOCV se realizó para identificar cualquier efecto dependiente de un solo gen en la supervivencia. Con base en este enfoque, se diseñó una firma de ocho genes (ATF4, TGFBR1 , SMAD4, PIK3CA, RPTOR, EIF4EBP1 , RICTOR, NDRG1) que predicen un RFS más deficiente en la cohorte de expresión alta frente a la cohorte de baja expresión de pacientes con cáncer de mama cáncer (todas BC, disminución del cambio de 61 veces n = 1764, P <0,005) y cáncer de mama ER (disminución del cambio de 81 veces n = 347, P <0,005) (Fig. 6G). En todas BC, la firma de la invención predice un RFS 27 veces más pobre en comparación con ATF4 (este es el primer candidato individual después de la firma que reduce significativamente el RFS- supervivencia libre de recaída-). En ER-, la firma de la invención predice un RFS 53 veces más pobre en comparación con NDRG1 (este es el primer candidato individual después de la firma que disminuye significativamente el RFS) (Fig. 6G). LOOCV demostró que el menor RFS en pacientes ER + y TNBC dependía de la expresión de NDRG1 , aunque RFS no se determinó para este gen en TNBC (Tabla Suplementaria S2).
Un análisis adicional de esta firma genética con OncoPrint en una cohorte de 2509 pacientes con cáncer de mama mostró que está alterada en 1 138 pacientes (45%) (Figura 3). El porcentaje de alteraciones varió de 4% a 25% para genes individuales (ATF4, 4%; TGFBR1 , 4%; SMAD4, 7%; PIK3CA, 7%; RPTOR, 8%; EIF4EBP1 , 16%; RICTOR, 6%; NDRG1 , 25%). Más importante aún, el análisis de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con alteraciones (n = 1055) en esta firma genética tienen peor supervivencia (143 meses) en comparación con los pacientes sin alteraciones (n = 925) (173 meses) (P = 0.00005) (Fig. 6H). El rendimiento de la firma alterada en el análisis de Kaplan-Meier fue validado por LOOCV.
MATERIALES COMPLEMENTARIOS
Reactivos
Inhibidores LY2157299 (5 mM, inhibidor de TΰRbRI quinasa), U0126 (10 pM, inhibidor MEK1 / 2), SB203580 (10 pM, inhibidor p38-MAPK), BKM120 (5 pM, inhibidor PI3K, isoformas catalíticas r110a / b / d / y), LY294002 ( 10 pM, inhibidor PI3K, isoformas catalíticas r110a / b / d), GSK690693 (10 pM, inhibidor pan-Akt), rapamicina (10 pM, inhibidor mTOR), GSK2334470 (10 pM, inhibidor PDK1), BI-D1870 (10 pM, inhibidor pan-RSK ), GSK650394 (10 pM, inhibidor SGK1 / 2), CHIR-99021 (10 pM, inhibidor GSK3a / b), ISRIB (5 pM, respuesta de estrés integrada, o ISR, inhibidor) se compraron de MedChem Express y (5Z) -7-Oxozeaenol de (1 pM, inhibidor de Tak1) Sigma. El factor de crecimiento transformante recombinante humano b1 (TΰRb1) se obtuvo de Preprotech. Trilencer-27 Se obtuvieron siRNAs humanos para ATF4 y control codificado (SCR) de Origene. Los siRNAs para Smad2 / 3, Smad4, PERK, PKR, GCN2, HRI, elF2a, Raptor, Rictor y Tak1 se compraron de Santa Cruz Biotechnology. Ras siRNA era de Sigma. Para estudios in vivo, el SiRNA n. ° 2 para ATF4 y el control SCR (secuencias de Origene) se sintetizaron por Sigma. DOPC (1 ,2 -dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster). Docetaxel se obtuvo de la farmacia del Houston Methodist Hospital.
Anticuerpos para ATF4 (CREB-2, C-20 y B-3), Smad4 (B-8), Twistl (Twist2C1a), Bcl2 (C-2), Mcl1 (22), CD44 (HCAM, DF1485), Sox2 ( E-4), HRI (D12), Raptor (10E10), Rictor (H-1 1), Tak1 (H-5) y RhoA (26C4) eran de Santa Cruz. b-Actina, fosfo-Smad2 (Ser465 / 467) / 3 (Ser423 / 425) (D27F4), Smad2 / 3, N-Cadherina (D4R1 H), Zeb1 (D80D3), Caracol (C15D3), Slug (C19G7), Nanog (D73G4), Notchl escindido (Valí 744) (D3B8), Oct4, PERK (C33E10), PKR, GCN2, elF2a, fosfo-Akt (Ser473), fosfo-p70S6K (Thr389), fosfo-NDRG1 (Thr346), Ras eran de Cell Signaling y Rac1 (102) de BD Biosciences.
Figure imgf000048_0001
Tabla Suplementaria SL Supervivencia gbbal en cohortes de baja y afta expresión.
Figure imgf000049_0001
labia Suplementaria S2. Supervivencia líbre e recaí as de ía firma genética y genes únicos.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de ATF4 para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaídas en un individuo con cáncer.
2.- Uso de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR,
RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente todos ellos, para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaídas en un individuo con cáncer.
3.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en: cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama, cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
4 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el cáncer es cáncer de mama.
5.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el cáncer es cáncer de mama receptor de estrógenos negativo y triple negativo.
6.- Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, que comprende a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) detectar el producto de expresión de ATF4
7.- Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, que comprende a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) detectar el producto de expresión de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente el de todos ellos.
8.- Un método para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, que comprende os pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, y además comprende: c) asignar al individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia global cuando ATF4 presenta una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia, y/o d) asignar al individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas cuando ATF4 presenta una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia, y/o c2) asignar al individuo al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas cuando ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP'\ , preferentemente todos ellos, presentan una expresión superior, o sobreexpresión, respecto a una muestra de referencia.
9.- Un método para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer, que comprende os pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, y además comprende: c) asignar al individuo que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia global, y/o c1) asignar al individuo que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el tertil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o c2) asignar al individuo con cáncer de mama positivo para receptor de estrógeno (ER+) que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el tertil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o c3) asignar al individuo cáncer de mama negativo para receptor de estrógenos (ER-) que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas, y/o c4) asignar al individuo cáncer de mama triple negativo que presenta una expresión de ATF4 igual o mayor a aproximadamente el cuartil alto de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas. c5) asignar al individuo con cáncer de mama (sin distinción de subtipos) que presenta una expresión media del conjunto de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente el conjunto formado por todos ellos, igual o mayor que el cuartil bajo de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas. c6) asignar al individuo con cáncer de mama ER- que presenta una expresión media del conjunto de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP'\ , preferentemente la expresión media del conjunto formado por todos ellos, igual o mayor que el tertil bajo de expresión al grupo de individuos con una menor supervivencia libre de recaídas.
10.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9 donde la muestra son células o tejidos tumorales, o biopsia líquida.
1 1.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9 donde la detección del producto de expresión se realiza mediante RT-PCR.
12.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para detectar el producto de expresión de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente todos ellos.
13.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar el producto de expresión de ATF4 y al menos un gen seleccionado de entre TGFBR1, SMAD4, PIK3CA, RPTOR, RICTOR, NDRG1 y EIF4EBP1, preferentemente de todos ellos, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:1 1 , SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 15;
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13 y/o SEQ ID NO: 15;
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 y/o SEQ ID NO: 16.
14.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados.
15.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 12 - 14, que además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento RT-PCR.
16.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en las reivindicaciones 12-15, para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la supervivencia global en un individuo con cáncer y/o para predecir o pronosticar la supervivencia libre de recaída en un individuo con cáncer.
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