WO2017013276A1 - Inmunoterapia para el cáncer con expresión de casr (p. ej. neuroblastoma) - Google Patents

Inmunoterapia para el cáncer con expresión de casr (p. ej. neuroblastoma) Download PDF

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Carmen DE TORRES GÓMEZ-PALLETE
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Hospital Sant Joan De Deu
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Definitions

  • the present invention relates to the field of cancer and, in particular, to immunotherapy of cancer.
  • the calcium-sensing receptor is a G-protein coupled receptor (GPCR) of the C family that detects minimal fluctuations in plasma calcium and regulates parathyroid hormone secretion accordingly in order to maintain the plasma concentrations of this cation within a very narrow range.
  • CaSR is also expressed in many organs and tissues not involved in calcium homeostasis.
  • This GPCR is capable of detecting variations of other ions, polyamines and L-amino acids, among other substances, and of coupling to several G proteins (G q / n, G1213, G ⁇ and G s ), thus activating different routes downstream signaling
  • This versatile mechanism allows CaSR to exercise a wide variety of functions specific to each cellular context, both in physiological and pathological conditions, including cancer.
  • CaSR activators can be divided into orthoteric ligands or direct agonists (also known as type 1 agonists or type I calcimimetics) and allosteric CaSR activators (also known as type 2 agonists or type II calcimimetics).
  • Type I calcimimetics such as Ca 2+ , Mg 2+ , Gd 3+ , neomycin and L-amino acids activate CaSR by direct interaction with their extracellular domain.
  • allosteric activators, including Cinacalcet do not activate the receptor by themselves but modify its three-dimensional structure so that it becomes more sensitive to calcium stimulation.
  • Cinacalcet was approved to treat severe hyperparathyroidism (HPT) of patients on dialysis for chronic kidney disease, hypercalcemia in the context of parathyroid carcinoma, and severe hypercalcemia in patients with primary HPT when surgical treatment is not possible.
  • HPT hyperparathyroidism
  • WO 2013144397 describes the use of Cinacalcet for the treatment of neuroblastic tumors.
  • Neuroblastic tumors encompass a heterogeneous set of developmental tumors that originate from precursor cells of the peripheral nervous system, and include neuroblastomas, ganglioneuroblastomas and ganglioneuromas. Although some of them return spontaneously and others progress only at the loco-regional level, about 50% present as metastatic neuroblastomas.
  • ch.14.18 immunotherapeutic agent a human-murine anti-GD2 chimeric monoclonal antibody
  • granulocyte and macrophage colony stimulating factor and interleukin-2 are associated with a significant improvement in the prognosis of affected patients.
  • high-risk neuroblastomas compared to standard therapy.
  • GD2 is also expressed in neurons, skin melanocytes and peripheral sensory nerve fibers. This pattern of expression contributes to the important toxic effects related to treatment by administering this regimen of immunotherapeutic agents, which include severe pain, hypotension, increased capillary permeability syndrome, and hypersensitivity reactions.
  • cancer therapies directed against molecular targets is the lack of markers to evaluate the tumor's response to the administered drug, and in particular, markers that can be detected by non-invasive techniques. Many of these drugs do not promote a striking decrease in tumor volume that can be monitored using imaging techniques, which makes it difficult to assess the effects of the drug unless serial biopsies are performed. Therefore, there is a need in the state of the art to increase the susceptibility of neoplastic cells to immunotherapeutic agents without affecting normal cells, to provide new therapies for cancer and to obtain subrogated markers that allow the evaluation of Response of a patient diagnosed with cancer to a therapy administered for the treatment of said cancer.
  • the present invention relates to a CaSR activating agent for use in increasing the susceptibility of a subject with a cancer with CaSR expression to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • the present invention relates to a CaSR activating agent in combination with a CTAs-based immunotherapeutic agent for use in the treatment of a cancer with CaSR expression.
  • the present invention relates to a kit comprising a CaSR activating agent and a CTAs-based immunotherapeutic agent as a combination for simultaneous, separate or successive administration.
  • the present invention relates to an in vitro method for evaluating the effectiveness of a therapy administered to a subject affected by a cancer with CaSR expression, which comprises the following steps:
  • the therapy administered comprises a CaSR activating agent and where the increase in the level of expression of the CTA gene after therapy with respect to the level of expression of said CTA gene before of therapy is indicative that the therapy is effective.
  • the present invention relates to a kit for evaluating the effectiveness of a therapy administered to a subject affected by a cancer with CaSR expression comprising the appropriate means to measure the level of expression of a family CTA gene. SSX and a CTA gene of the GAGE family, and a suitable container.
  • the present invention relates to the use of a CTA gene as a subrogated marker of the tumor response of a cancer with CaSR expression to treatment with a CaSR activating agent.
  • Figure 1 is a micrograph showing the morphological appearance of LA-N-1 cells exposed to 1 ⁇ Cinacalcet (C) or DMSO (vehicle (V)) for 3 days (3d) and 14 days (14d).
  • Figure 2 comprises graphs showing (A) Effect of Cinacalcet treatment on survival (%) in an in vivo model of neuroblastoma treated with Cinacalcet (triangles) or vehicle (circles) over time (days); (B) Plasma concentrations of ionic Ca 2+ (mmol / L) in mice that received
  • Cinacalcet (triangles) or vehicle (circles) over time (weeks).
  • Figure 3 and Figure 4 are a visual representation of the expression patterns of several genes (93 groups of probes in Fig. 3 and 34 in Fig. 4) of different specimens treated with Cinacalcet (C) or vehicle (V).
  • C Cinacalcet
  • V vehicle
  • overexpressed genes are represented in red, which in the gray scale tend to appear with darker shades.
  • the lighter shades of the gray scale tend to represent green on the heatmap (genes that are not overexpressed).
  • Figure 5 comprises graphs showing (A) The relative expression of the CTCFL mRNA determined by quantitative PCR (RT-qPCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reaior ⁇ ) in specimens that have been treated with Cinacalcet (C) or vehicle (V).
  • B The relative expression of the SSX4 / 4B mRNA (black), MAGE A3 (white), MAGE A2 (striped) in the same model.
  • C The relative expression of the NTRK3 mRNA in the same model.
  • D The relative expression of the ADCY8 mRNA (black), PRKCA (white), RYR2 (striped) in the same model.
  • the "cancer-testis” antigens constitute an extensive family of more than 240 antigens, details of which can be obtained at http://www.cta.lncc.br.
  • CTAs can be divided between those that are encoded by genes that are located on the X chromosome, the X-CTAs genes, and those that are not encoded by genes that are located on the X chromosome, the non-X-CTAs genes.
  • the X-CTAs genes encompass families of multiple genes that are organized into clusters along the X chromosome, and include, among others, the families of MAGE, GAGE, SSX and NY-ESO-1 genes.
  • Non-X-CTAs genes are distributed throughout the genome, are generally single copy genes and include, among others, the BORIS gene (CTCFL).
  • CTAs are expressed in tumors of different histogenesis, but not in normal tissues, except in testicles, fetal ovary and placenta, which are not accessible to the immune system.
  • CTAs show very high immunogenicity in vivo.
  • its pattern of expression restricted to tumor cells and its high immunogenicity makes CTAs ideal targets for different immunotherapeutic strategies specifically directed against tumor cells.
  • CTAs are immunogenic tumor antigens, the remarkable intra- and intra-tumor heterogeneity of their expression limits the eligibility of cancer patients for this treatment, and / or hinders the immunogenic recognition of neoplastic cells, which reduces the efficacy of CTA-based immunotherapies.
  • the inventors have developed a method to modulate the expression of CTAs in tumor cells.
  • a CaSR activating agent increases the expression of CTAs in vitro and in vivo, and, it is important to note that the majority of the overexpressed genes are X-CTAs, which are the most immunogenic.
  • the inventors provide a strategy to increase the expression of immunogenic targets, which are essentially tumor specific, making cancer cells more susceptible to CTA-based immunotherapeutic agents and increasing the efficacy of a CTA-based immunotherapeutic agent treatment.
  • CTA expression can be used as a surrogate marker of a tumor's response to a treatment with a CaSR activating agent.
  • increasing the expression of CTAs provides new uses, methods and products, which are the subject of the present invention.
  • Cinacalcet a CaSR activating agent
  • Cinacalcet a CaSR activating agent
  • CTAs are genes almost exclusively expressed in cancer and therefore increase their level of expression makes tumor cells, and therefore a subject with such cells, more susceptible to immunotherapeutic agents specifically directed against said CTAs.
  • the present invention relates to a CaSR activating agent for use in increasing the susceptibility of a subject with cancer with CaSR expression to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • the CaSR activating agent increases the expression level of at least one CTA gene
  • the first aspect of the invention also relates to the use of a CaSR activating agent for use in increasing the susceptibility of a subject with a Cancer with CaSR expression to an immunotherapeutic agent based on CTAs, where the CaSR activating agent increases the level of expression of at least one CTA gene.
  • the first aspect of the present invention also relates to the use of a CaSR activating agent to increase the susceptibility of a subject with a cancer with CaSR expression to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • the first aspect of the present invention also relates to the use of a CaSR activating agent as a potentiator of the susceptibility of a subject with cancer with CaSR expression to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • the first aspect of the present invention also relates to the method of increasing the susceptibility of a subject with a cancer with CaSR expression to a CTAs-based immunotherapeutic agent, which comprises the administration of a CaSR activating agent to the subject in order to Increase the expression of a CTA gene.
  • the term "CaSR activating agent” refers to direct CaSR agonists and allosteric CaSR activators.
  • the CaSR activating agent is an allosteric CaSR activator. There are multiple allosteric CaSR activators, including Cinacalcet,
  • the CaSR activating agent is selected from Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B and AC-265347 and combinations thereof, and in an even more preferred embodiment the CaSR activating agent is Cinacalcet.
  • Cinacalcet Amgen, Selleck Chemicals
  • NPS-R-568 NPS-R-568
  • CTAs-based immunotherapeutic agent refers to a specific immunotherapeutic agent for at least one CTA, that is, at least one CTA is the molecular target of the immunotherapeutic agent.
  • CTA refers to a CTA gene, a fragment thereof, a CTA protein, a fragment thereof (CTA peptide), or a combination thereof.
  • Immunotherapeutic agent refers to an agent capable of stimulating the immune response. This response results in the treatment, improvement and / or delay of the progression of a disease.
  • immunotherapeutic agents are, among others, vaccines that use peptides
  • CTAs as immunogenic agents, vaccines with dendritic cells previously pulsed with these peptides, and T cells expressing native or engineered receptors to recognize said peptides.
  • the term "susceptibility to a CTAs-based immunotherapeutic agent” refers to the sensitivity to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • a susceptibility enhancer to a CTAs-based immunotherapeutic agent refers to an agent that increases the susceptibility or sensitivity to a CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • cancer with CaSR expression refers to a cancer in which CaSR is expressed in the plasma membrane of tumor cells.
  • cancer with CaSR expression is selected from adenomas and parathyroid carcinomas, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, gliomas, cancer. of Leydig cells, ovarian cancer, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, bone metastases (particularly those of renal cell carcinoma, breast or prostate cancer) and combinations thereof.
  • a cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, and combinations thereof; and more preferably, the cancer with CaSR expression is neuroblastoma. As described in the literature, all these cancers are cancers with CaSR expression.
  • the level of expression of the CTAs of the SSX and GAGE families is increased after administration of Cinacalcet in vitro and in vivo, and is detected by microarrays and RT-qPCR.
  • the susceptibility to an immunotherapeutic agent based on CTAs of the SSX family is increased; in another embodiment, the susceptibility to an immunotherapeutic agent based on CTAs of the GAGE family is increased, and, in another embodiment, the susceptibility to an immunotherapeutic agent based on CTAs of the SSX family and the GAGE family is increased.
  • the SSX family CTA is selected from SSX 4 and / or SSX 4B; and the CTA of the GAGE family is selected from GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B,
  • the CTAs of the GAGE family are GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof.
  • susceptibility to specific immunotherapeutic agents for SSX 4 and / or SSX 4B, and GAGE 1 at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, 2D GAGE, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10 is increased , and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C,
  • the level of expression of CTAs of the MAGE family is also increased after administration of Cinacalcet.
  • the susceptibility to an immunotherapeutic agent based on CTAs of the MAGE family is increased.
  • the CTA of the MAGE family is MAGE A2 and / or MAGE A3, more preferably MAGE A2 and even more preferably MAGE A2 and MAGE A3.
  • susceptibility to an immunotherapeutic agent based on a non-X-CTA, preferably based on CTCFL, is increased.
  • susceptibility to specific immunotherapeutic agents for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E is increased , GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 and CTCFL.
  • the ideal immunotherapeutic agent should comprise immunotherapeutic agents directed against several CTAs simultaneously, as described in the previous paragraphs.
  • This type of approach using multiple targets has also been shown as ideal in the context of other immunotherapies, such as dendritic cell vaccines for the treatment of glioblastoma, in which the antigens also show a highly heterogeneous expression pattern both at the inter- and intra-tumor levels.
  • the present invention also relates to a CaSR activating agent and an immunotherapeutic agent directed against a CTA, as a combination therapy, for use in the treatment of a cancer with CaSR expression.
  • the present invention relates to a CaSR activating agent in combination with a CTAs-based immunotherapeutic agent for use in the treatment of a cancer with CaSR expression.
  • the second aspect of the second invention also relates to the use of a CaSR activating agent in combination with a CTAs-based immunotherapeutic agent for the preparation of a medicament for the treatment of a cancer with CaSR expression.
  • the CaSR activating agent is an allosteric CaSR activator, in a preferred embodiment the CaSR activating agent is selected from Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347 and combinations thereof, and more preferably the CaSR activating agent is Cinacalcet.
  • cancer with CaSR expression is selected from parathyroid adenomas and carcinomas, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, gliomas, Leydig cell cancer, ovarian cancer, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, bone metastases and combinations thereof.
  • cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas and combinations thereof, and more preferably it is neuroblastoma.
  • the term "in combination" does not limit the order in which the CaSR activating agent and the CTA-based immunotherapeutic agent are administered to a subject.
  • a CaSR activating agent can be administered to a subject before (for example, at least 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks before), simultaneously with, or after (for example, at least 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 8 weeks, or 12 weeks later) the administration of an agent CTA-based immunotherapeutic.
  • Administration of the CaSR activating agent and the CTA-based immunotherapeutic agent can be carried out by the same or different routes.
  • the CaSR activating agent is administered before, and / or simultaneously to the CTAs-based immunotherapeutic agent.
  • the CaSR activating agent is administered before the CTAs-based immunotherapeutic agent so that the expression of the CTAs is increased before the administration of the CTAs-based immunotherapeutic agent, and then the CTAs-based immunotherapeutic agent is administered.
  • the administration of the CaSR activating agent is maintained even after administration of the CTAs-based immunotherapeutic agent, so that the effects of the CaSR activating agent are maintained while the CTAs-based immunotherapeutic agent is administered.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises a specific immunotherapeutic agent for a CTA of the SSX family and / or a specific immunotherapeutic agent for a CTA. from the GAGE family.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises specific agents for: - A CTA of the SSX family selected from SSX 4 and / or SSX 4B, and / or
  • GAGE1 A CTA of the GAGE family selected from GAGE1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE
  • GAGE 1 At least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 and combinations thereof.
  • GAGE 1 at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises immunotherapeutic agents. specific for SSX 4 and / or SSX 4B; and GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof. And even more preferably, specific for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent also comprises a specific immunotherapeutic agent for a CTA of the MAGE family.
  • the CTA of the MAGE family is MAGE A2 and / or MAGE A3, more preferably MAGE A2, and even more preferably MAGE A2 and MAGE A3.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent also comprises a specific immunotherapeutic agent for a non-X-CTA, preferably comprises a specific immunotherapeutic agent for CTCFL.
  • the CaSR activating agent is Cinacalcet; Cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, and combinations thereof; and more preferably the cancer with CaSR expression is neuroblastoma; and the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises specific immunotherapeutic agents for:
  • a CTA of the GAGE family preferably selected from GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F,
  • non-X-CTA preferably CTCFL.
  • the CTA-based immunotherapeutic agent comprises immunotherapeutic agents specific for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE
  • the present invention relates to a kit comprising a CaSR activating agent and a CTAs-based immunotherapeutic agent as a combination for simultaneous, separate or successive administration thereof.
  • the CaSR activating agent and the CTA-based immunotherapeutic agent can be formulated as compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the kit comprises (1) a composition comprising a CaSR activating agent and (2) a composition comprising a CTAs-based immunotherapeutic agent, as a combination for simultaneous, separate or successive administration thereof. .
  • the kit of the third aspect of the invention is used for the treatment of a cancer with CaSR expression.
  • cancer with CaSR expression is selected from adenomas and parathyroid carcinomas, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, gliomas, Leydig cell cancer, ovarian cancer, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, bone metastases and combinations thereof.
  • cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas and combinations thereof, and more preferably it is neuroblastoma.
  • the CaSR activating agent is an allosteric CaSR activator.
  • the CaSR activating agent is selected from Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B and AC-265347, and combinations thereof, and in an even more preferred embodiment the CaSR activating agent is Cinacalcet.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises an immunotherapeutic agent specific for a CTA of the SSX family, and / or an immunotherapeutic agent specific for a CTA of the GAGE family.
  • CTAs-based immunotherapeutic agents comprise specific immunotherapeutic agents for:
  • a CTA of the GAGE family selected from GAGE1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J and GAGE 13, and combinations thereof.
  • GAGE1 GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J and GAGE 13, and combinations thereof.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22 of the previous GAGEs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13,
  • GAGE 1 More preferably specific for GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E , GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises immunotherapeutic agents specific for SSX 4 and / or SSX 4B; and for GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof. More preferably, specific for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE
  • GAGE 2A GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H and GAGE 12J.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises an immunotherapeutic agent specific for a CTA of the MAGE family.
  • the CTAs-based immunotherapeutic agent comprises an immunotherapeutic agent specific for a CTA of the MAGE family.
  • CTA of the MAGE family is MAGE A2 and / or MAGE A3, more preferably MAGE A2, and even more preferably MAGE A2 and MAGE A3.
  • the CTA-based immunotherapeutic agent comprises an agent.
  • immunotherapeutic specific for a non-X-CTA gene preferably comprises a specific agent for CTCFL.
  • GAGE 1 GAGE 1A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 and combinations thereof; more preferably GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof,
  • non-X-CTA preferably CTCFL.
  • the CTA-based immunotherapeutic agent comprises immunotherapeutic agents specific for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof, MAGE A2, MAGE A3 and CTCFL. And more preferably specific for SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B,
  • GAGE 12C GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 and CTCFL.
  • the inventors have found that the increase in expression of a CTA gene after administration of a CaSR activating agent to a subject affected by a cancer with CaSR expression serves as a biomarker of the effectiveness of treatment with said activating agent of CaSR
  • the best indication of a cancer's response to a particular treatment is the reduction of its tumor volume or tumor growth. This is how the response to chemotherapy, since the reduction in tumor volume and / or its stability indicates massive cell death and / or cell cycle exit and differentiation.
  • most of the so-called molecular or biologically directed therapies do not promote dramatic changes in tumor volume, thus making it necessary to use surrogate markers to assess the tumor response.
  • the increased expression of the said CTAs is observed in neuroblastoma models exposed to Cinacalcet both in vitro and in vivo and this does not occur in normal cells. Therefore, the increased expression of these genes after treatment with Cinacalcet supports the use of CTAs as markers of tumor response to treatment with a CaSR activating agent.
  • the analysis of these response markers can be performed directly on the tumor (biopsy) and also in biological fluids, including peripheral blood, since CTAs circulate in the blood both as proteins and as mRNAs.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the effectiveness of the treatment of a cancer that expresses
  • CaSR with a CaSR activating agent by quantifying the level of CTAs expression and using the CTAs as subrogated markers.
  • the present invention relates to an in vitro method for evaluating the effectiveness of therapy administered to a subject with a cancer with CaSR expression comprising the following steps:
  • the term "subject” refers to any member of the Mammalia class, including, without limitation, human and non-human primates such as chimpanzees and other species of apes and monkeys; farm animals such as cows, sheep, pigs, goats and horses; domestic mammals such as dogs and cats; Laboratory animals including rodents such as mice, rats and guinea pigs, and the like.
  • This term does not designate a particular age or sex. Thus, adult and newborn subjects, as well as fetuses, both male and female, are considered as included in this term.
  • the subject is preferably a human being.
  • Expression levels of a CTA gene in biological samples can be quantified based on the RNA resulting from the transcription of said gene (mRNA) or, alternatively, based on the complementary DNA (cDNA) of said gene.
  • the quantification of the expression levels of a CTA gene comprises the quantification of the mRNA of said CTA gene, a fragment of said mRNA, or cDNA of said CTA gene, a fragment of said cDNA, or combinations thereof.
  • the method of the invention may include performing an extraction step in order to extract the total RNA, which can be performed by conventional techniques.
  • mRNA levels can be quantified by the use of conventional methods, for example, methods comprising amplification and quantification of the product of said mRNA amplification, such as electrophoresis and staining, or alternatively by means Northern blot and the use of specific probes for the mRNA of the gene of interest (CTA) or its corresponding cDNA, mapping with nuclease S1, RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), hybridization, microarray, etc.
  • conventional methods for example, methods comprising amplification and quantification of the product of said mRNA amplification, such as electrophoresis and staining, or alternatively by means Northern blot and the use of specific probes for the mRNA of the gene of interest (CTA) or its corresponding cDNA, mapping with nuclease S1, RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), hybridization, microarray, etc.
  • the levels of the cDNA corresponding to the aforementioned mRNA encoded by the CTA gene can also be quantified by conventional techniques.
  • the method of the invention includes a step which is the synthesis of the corresponding cDNA by means of reverse transcription from the corresponding mRNA followed by the amplification and quantification of the product of said cDNA amplification.
  • a step which is the synthesis of the corresponding cDNA by means of reverse transcription from the corresponding mRNA followed by the amplification and quantification of the product of said cDNA amplification.
  • the expression levels of the CTA gene in biological samples can be quantified based on the protein encoded by said gene, that is, the CTA protein, or an amino acid sequence that is at least 90% identical to the protein encoded by the gene. CTA gene, and even more preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical with respect to said protein. Degree of similarity Between two amino acid sequences it can be determined by conventional methods, for example, sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as BLAST (AltschuI S. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 215 (3): 403-410).
  • the expression levels of the CTA protein can be quantified by means of conventional methods that allow the detection and quantification of said protein in the sample of a subject.
  • assays There is a wide variety of known assays that can be used in the present invention. These techniques include, for example, Western blot, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay or enzyme-mediated immunoabsorption assay), RIA (radioimmunoassay), competitive EIA
  • CTA competitive enzymatic immunoassay or competitive enzyme immunoassays
  • DAS-ELISA double antibody sandwich ELISA or ELISA in double antibody sandwich
  • immunocytochemical and immunohistochemical techniques techniques based on the use of protein or microarray biochips including specific antibodies or assays based on colloidal precipitation.
  • Other methods for detecting and quantifying said CTA protein include affinity chromatography, ligand binding assays, etc.
  • the levels of the protein encoded by the CTA gene are quantified by Western blotting, immunohistochemistry or ELISA.
  • step a) the level of expression is quantified by any method of those selected from:
  • step a) the level of expression is quantified by the detection of the CTA gene mRNA, preferably by RT-qPCR or by microarrays.
  • Practicing the method of the invention comprises obtaining a biological sample of the subject under study.
  • CTAs are expressed in samples of tumor tissue and can also be detected in the biological fluids of subjects diagnosed with cancer. Therefore, in a particular embodiment, the biological sample is a sample of tumor tissue or a biological fluid; and in one embodiment Even more particular, it is a biological fluid, so that the method is less invasive than what would be required to analyze a sample of the tumor obtained by biopsy.
  • the biological sample is a biological fluid selected from blood, serum, plasma, peritoneal fluid, pericardial fluid, pleural fluid, cerebrospinal fluid and intra-articular fluid, preferably the biological fluid is selected from blood, serum and plasma, and more preferably the biological sample is blood.
  • the CaSR activating agent is an allosteric CaSR activator, in a preferred embodiment the CaSR activating agent is selected from Cinacalcet, NPS- R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347 and combinations thereof, and more preferably the CaSR activating agent is Cinacalcet.
  • cancer with CaSR expression is selected from parathyroid adenomas and carcinomas, colon cancer, breast cancer, cancer. of prostate gliomas, Leydig cell cancer, ovarian cancer, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, bone metastases and combinations thereof.
  • cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas and combinations thereof, and more preferably it is neuroblastoma.
  • step a) comprises quantifying the expression levels of a CTA of the SSX family, and / or a CTA of the GAGE family.
  • the CTA of the SSX family is selected from SSX 4 and / or SSX 4B, more preferably they are SSX4 and SSX4B, and the CTA of the GAGE family is selected from GAGE1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, 2D GAGE, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 and combinations thereof. In particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22 of the previous GAGEs . More preferably, the CTAs of the GAGE family are GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof,
  • step a) comprises quantifying the expression levels of CTAs of the SSX family and the GAGE family as described above in this paragraph and, more preferably comprising quantifying the Expression level of SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H and GAGE 12J.
  • step a) also comprises quantifying the level of expression of a CTA of the MAGE family, preferably MAGE A2 and / or MAGE A3, more preferably MAGE A2, and more preferably MAGE A2 and MAGE A3.
  • step a) also comprises quantifying the level of expression of a non-X-CTA, preferably CTCFL.
  • step a) comprises quantifying the expression of the following CTAs: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof , GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof, MAGE A2, MAGE A3 and CTCFL. And more preferably, SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C,
  • the present invention relates to a kit for carrying out the method according to any of the embodiments of the fourth aspect of the invention, which comprises adequate means for measuring the expression levels of CTAs genes, and A suitable container.
  • the term "container" refers to containment and packaging before sale with the primary purpose of facilitating the purchase and use of a product.
  • the kit comprises suitable means for measuring the level of expression of a CTA of the SSX family and a CTA of the GAGE family.
  • the kit comprises suitable means for measuring the expression level of a CTA of the SSX family selected from SSX 4 and / or SSX 4B, and a CTA of the GAGE family selected from GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C , 2D GAGE, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 and combinations thereof.
  • GAGE 1 At least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G , GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof.
  • the kit of the fifth aspect comprises suitable means for measuring the expression levels of the CTAs: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, 2D GAGE, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof, and more preferably SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10,
  • GAGE 12B GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H and GAGE 12J.
  • the kit comprises suitable means for quantifying the level of expression of a CTA gene of the MAGE family.
  • a CTA gene of the MAGE family Preferably the CTA of the family
  • the kit comprises suitable means for quantifying the level of expression of a non-X-CTA gene, preferably CTCFL.
  • the kit comprises suitable means for measuring the expression levels of CTAs: SSX
  • GAGE 1 at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10
  • GAGE 12B at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof, MAGE A2, MAGE A3 and CTCFL.
  • SSX 4B GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE
  • Suitable means for quantifying gene expression such as oligonucleotides, probes and antibodies specific for CTAs, are commercially available or generated by means widely known to those skilled in the art.
  • Suitable media are, among others, those described in Table 1, especially the oligonucleotides of the sequences SEQ ID No. 1- SEQ ID No. 20, which are specific to the CTAs indicated in said Table 1.
  • SEQ ID No. 1- SEQ ID No. 20 which are specific to the CTAs indicated in said Table 1.
  • over-expression of CTAs was detected in neuroblastoma models after treatment with Cinacalcet. Overexpression of other molecules was also found (for example, NTRK3, PRKCA and RYR2, see Examples 1 and 3).
  • the present invention relates to the use of a CTA, or to the use of the level of expression of a CTA, as a surrogate marker of the tumor response of a cancer with expression of
  • the CaSR activating agent is an allosteric CaSR activator, in a preferred embodiment the CaSR activating agent is selected from Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B , AC-265347 and combinations thereof, and more preferably the CaSR activating agent is Cinacalcet.
  • cancer with CaSR expression is selected from adenomas and parathyroid carcinomas, colon cancer, breast cancer, prostate cancer. , gliomas, Leydig cell cancer, ovarian cancer, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, bone metastases and combinations thereof.
  • the cancer with CaSR expression is selected from neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas and combinations thereof, and more preferably it is neuroblastoma.
  • the CTA used is a CTA of the SSX family, preferably SSX 4 and / or SSX 4B; and / or a CTA of the GAGE family preferably selected from GAGE 1, GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B , GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 and combinations thereof.
  • the CTAs of the GAGE family are GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and at least one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof.
  • the CTAs used are: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1, at least one of GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof, GAGE 10, and al minus one of GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J and combinations thereof.
  • GAGE 1 GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E and combinations thereof.
  • a family CTA is also used.
  • MAGE preferably MAGE A2 and / or MAGE A3, more preferably MAGE A2 and even more preferably MAGE A2 and MAGE A3; and / or a CTA of the non-X family, preferably CTCFL.
  • Cinacalcet induces cytodifferentiation and overexpression of CTAs in in vitro models of neuroblastoma
  • LA-N-1 Three neuroblastoma cell lines were used for this purpose: LA-N-1, SK-N-LP and SH-SY5Y.
  • LA-N-1 cells show endogenous CaSR expression, although at reduced levels, while the CaSR gene is silenced by epigenetic mechanisms in SK-N-LP cells (Casalá C, et al.
  • the calcium- sensing receptor gene is silenced by genetic and epigenetic mechanisms in unfavorable neuroblastomas and its reactivation induces ERK1 / 2-dependent apoptosis.
  • SH-SY5Y cells also do not show detectable CaSR expression. Therefore, stable transfections of SK-N-LP and SH-SY5Y were performed with pCMV-CaSR-GFP or pCMV-GFP.
  • Table 1 Assays on Demand and oligonucleotides used for expression analysis using RT-qPCR. (*) All mRNA variants are detected unless otherwise specified.
  • GAGE P1 Homo sapiens G antigen (GAGE): 12B, 2B, 12D, 12E, 12C, 12G, 12C, 2C, 1 (transcribed variant X1), 12J, 1 (transcribed variant 3, non-coding RNA), 1 (transcribed variant 2), 2A, 2E, 12H, 2D, 10.
  • GAGE P2 Homo sapiens antigen G (GAGE): 12B, 2B, 2A, 12D, 12E, 12C, 12H, 12G, 2C, 1 (transcribed variant X1), 12J, 1 (transcribed variant 3, non-coding RNA), 1 (transcribed variant 2).
  • GAGE P3 Homo sapiens antigen G (GAGE): 12B, 2B, 2A, 12D, 12E, 12C, 12H, 12G, 1 (transcribed variant X1), 12J, 1 (transcribed variant 3, non-coding RNA), 1 (transcribed variant 2), 2E, 2D, 10.
  • Cinacalcet inhibits the growth of neuroblastoma in vivo
  • mice An in vivo model of neuroblastoma was generated in Nude-Foxnl nulnu nude female mice 4-6 weeks old (Charles River) subcutaneously inoculating LA-N-1 cells (10 7 ). Tumor growth was allowed until dimensions of 7x7 mm were reached. At that time, the mice were randomized to receive vehicle (described below) or Cinacalcet 10 mg / kg / day orally (gavage)
  • Cinacalcet was prepared from Mimpara® (Amgen). Mimpara® capsules were homogenized in a mortar and the resulting powder was reconstituted with 0.5% Tween 20 (20%, v / v) and carboxymethylcellulose (0.25%, w / v) to a final concentration of 20 mg / mL Each dose administered contained 5 ⁇ _ of this mixture per gram of mouse weight. The dimensions of the tumors were measured 3 times per week with king's foot. Tumor volume was calculated as L xW 2 ⁇ where "L" indicates length in mm and "W" indicates width in mm.
  • each mouse was sacrificed when its xenoimplant reached the predetermined final volume, 2 cm 3 ), it was The tumors were removed and half of each was frozen in liquid nitrogen for molecular analysis while the other half was set at 10% formalin.
  • SLE event-free survival analysis
  • An event was defined as a tumor that exceeded 2 cm 3 .
  • the log-rank statistic was used to compare the SLE probabilities between groups. A P ⁇ 0.05 was considered significant.
  • the mRNA expression analyzes were performed using two techniques: microarrays (Example 3) and RT-qPCR (Example 4).
  • Pangenomic expression analyzes were performed using Affymetrix Human and Mouse Gene Array 2. 1 ST (Affymetrix reference 902136 for the array of human genes and reference 902120 for the array of murine genes) according to the manufacturer's instructions. After hybridization, the procedures for analyzing the results included: Quality control of the arrays (after this step, sample C6 was excluded from subsequent analyzes); filtering and normalization; differentially expressed gene selection; simple comparison (treated versus control); list of differentially expressed genes sorted by significance; Volcano plots to show the most differentially expressed genes; heatmaps for show grouping of expression profiles; and analysis of biological significance through enrichment analysis using Gene Ontologies, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) and Ingenuity pathways.
  • the initial pangenomic expression analysis identified a group of 13 probes corresponding to potentially over-expressed genes (log fold change> 1) in tumors treated with Cinacalcet (C4, C5, C7-C1 1) compared to controls (V5- V12). It was interesting to note that 1 1 of these 13 probes hybridized with CTAs (Table 3, bold). However, these expression differences were not statistically significant (P-adjusted value> 0.05). However, in the corresponding heatmap of Figure 3, it was notorious that a group of genes seemed specifically modulated in the 3 tumors that had been treated with Cinacalcet for the longest period of time. This was confirmed in a second analysis in which the differentially expressed genes in these 3 tumors (C9-C11) were examined with respect to the 8 tumors of the mice that received vehicle (V5-V12) ( Figure 4).
  • Table 3 Overexpressed genes in xenoimplants treated with Cinacalcet versus vehicle treated xenoimplants (log fold change> 1).
  • This second analysis identified a group of significantly modulated genes in specimens treated with Cinacalcet.
  • This genetic signature (or set of differentially expressed genes) was composed of 34 probes that hybridize with significantly over-expressed genes (log fold change> 1, P-adjusted value> 0.05, Table 4). Among these 34 probes, 11 (32%) hybridized with CTAs (bold). These were CTAs encoded by genes that are located on the X chromosome (GAGE and SSX 4 / 4B families). The GAGE family had already been detected as over-expressed in the first analysis (Table 3).
  • CTCFL also called BORIS
  • NTRK3 is a Trk family receptor that is over-expressed in tumors Benign neuroblastics, with a good prognosis.

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Abstract

La presente invención se refiere al campo del cáncer. En concreto, se refiere a métodos para incrementar la susceptibilidad de las células tumorales a agentes inmunoterapéuticos y métodos para evaluar la efectividad de un tratamiento para el cáncer.

Description

INMUNOTERAPIA PARA EL CÁNCER CON EXPRESIÓN DE CASR (P. EJ.
NEUROBLASTOMA)
DESCRIPCION Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del cáncer y, en particular, a la inmunoterapia del cáncer.
Antecedentes de la invención
El receptor sensor del calcio (calcium-sensing receptor, CaSR) es un receptor acoplado a proteínas G (G-protein coupled receptor, GPCR) de la familia C que detecta mínimas fluctuaciones del calcio plasmático y regula de manera acorde la secreción de hormona paratiroidea con el fin de mantener las concentraciones plasmáticas de este catión dentro de un rango muy estrecho. CaSR se halla expresado también en muchos órganos y tejidos no implicados en la homeostasis del calcio. Este GPCR es capaz de detectar variaciones de otros iones, poliaminas y L- aminoácidos, entre otras sustancias, y de acoplarse a varias proteínas G (Gq/n , G1213, G¡ y Gs), activando, por tanto, diferentes rutas de señalización downstream. Este versátil mecanismo permite a CaSR ejercer una gran variedad de funciones específicas de cada contexto celular, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, incluido el cáncer.
Los activadores de CaSR pueden dividirse en ligandos ortostéricos o agonistas directos (también conocidos como agonistas de tipo 1 o calcimiméticos de tipo I) y activadores alostéricos de CaSR (también conocidos como agonistas de tipo 2 o calcimiméticos de tipo II). Los calcimiméticos de tipo I como el Ca2+, Mg2+, Gd3+, neomicina y los L-aminoácidos activan a CaSR mediante interacción directa con su dominio extracelular. En cambio, los activadores alostéricos, entre ellos Cinacalcet, no activan al receptor por sí mismos sino que modifican su estructura tridimensional de manera que se torna más sensible al estímulo del calcio. Cinacalcet fue aprobado para tratar el hiperparatiroidismo (HPT) severo de pacientes en diálisis por enfermedad renal crónica, la hipercalcemia en el contexto de carcinoma de paratiroides, y la hipercalcemia severa en pacientes con HPT primario cuando no es posible el tratamiento quirúrgico. Además, WO 2013144397 describe el uso de Cinacalcet para el tratamiento de los tumores neuroblásticos. Los tumores neuroblásticos engloban un conjunto heterogéneo de tumores del desarrollo que se originan de células precursoras del sistema nervioso periférico, e incluyen a los neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas. Aunque algunos de ellos regresan espontáneamente y otros progresan sólo a nivel loco- regional, alrededor del 50% se presentan como neuroblastomas metastásicos. El pronóstico de la mayoría de los pacientes dentro de los dos primeros grupos es excelente, incluso sin recibir terapia citotóxica. Por el contrario, los índices de supervivencia global de los pacientes diagnosticados de enfermedad metastásica permanecen estancados por debajo del 40% a pesar del actual abordaje multimodal que incluye quimioterapia, cirugía, radioterapia, trasplante autólogo de médula ósea, agentes inductores de diferenciación e inmunoterapia. Más aún, aproximadamente el 60% de los pacientes de más de 18 meses de edad afectos de neuroblastomas metastásicos recaen y, a día de hoy, no existe ningún tratamiento curativo para ellos. Un agente inmunoterapéutico dirigido contra un antígeno asociado a tumores, el disialogangliósido GD2, ha pasado a formar parte de la terapia estándar de los neuroblastomas de alto riesgo (casos metastásicos y tumores loco-regionales refractarios). Se ha reportado que la combinación del agente inmunoterapéutico ch.14.18 (un anticuerpo monoclonal quimérico humano-murino anti-GD2), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos e interleukina-2 se asocia con una mejora significativa del pronóstico de los pacientes afectos de neuroblastomas de alto riesgo, en comparación con la terapia estándar. Sin embargo, GD2 se halla expresado también en neuronas, melanocitos de la piel y fibras nerviosas sensitivas periféricas. Este patrón de expresión contribuye a los importantes efectos tóxicos relacionados con el tratamiento al administrar este régimen de agentes inmunoterapéuticos, que incluyen dolor intenso, hipotensión, síndrome de incremento de permeabilidad capilar, y reacciones de hipersensibilidad.
Por otra parte, una de las limitaciones de las terapias para el cáncer dirigidas contra dianas moleculares es la falta de marcadores para evaluar la respuesta del tumor al fármaco administrado, y en particular, marcadores que puedan ser detectados mediante técnicas no invasivas. Muchos de estos fármacos no promueven una disminución llamativa del volumen tumoral que pueda ser monitorizada mediante técnicas de imagen, lo cual dificulta la valoración de los efectos del fármaco a menos que se realicen biopsias seriadas. Por todo ello, existe en el estado de la técnica una necesidad de incrementar la susceptibilidad de las células neoplásicas a los agentes inmunoterapéuticos sin afectar a las células normales, de proporcionar nuevas terapias para el cáncer y de conseguir marcadores subrogados que permitan la evaluación de la respuesta de un paciente diagnosticado de cáncer a una terapia administrada para el tratamiento de dicho cáncer.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente activador de CaSR para su uso en incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un agente activador de CaSR en combinación con un agente inmunoterapéutico basado en CTAs para uso en el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende un agente activador de CaSR y un agente inmunoterapéutico basado en CTAs como combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la efectividad de una terapia administrada a un sujeto afecto de un cáncer con expresión de CaSR, que comprende las siguientes etapas:
a) Cuantificar el nivel de expresión de un gen CTA en una muestra biológica del citado sujeto antes y después de la terapia, y
b) comparar el nivel de expresión del gen CTA en las muestras biológicas, donde la terapia administrada comprende un agente activador de CaSR y donde el incremento del nivel de expresión del gen CTA tras la terapia con respecto al nivel de expresión del citado gen CTA antes de la terapia es indicativo de que la terapia es efectiva.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para evaluar la efectividad de una terapia administrada a un sujeto afecto de un cáncer con expresión de CaSR que comprende los medios apropiados para medir el nivel de expresión de un gen CTA de la familia SSX y un gen CTA de la familia GAGE, y un envase adecuado. En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un gen CTA como marcador subrogado de la respuesta tumoral de un cáncer con expresión de CaSR al tratamiento con un agente activador de CaSR.
Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud serán evidentes para el experto en la materia a partir de la descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una micrografía que muestra el aspecto morfológico de células LA-N- 1 expuestas a 1 μΜ Cinacalcet (C) o DMSO (vehículo (V)) durante 3 días (3d) y 14 días (14d).
La Figura 2 comprende gráficos que muestran (A) Efecto del tratamiento con Cinacalcet sobre la supervivencia (%) en un modelo in vivo de neuroblastoma tratado con Cinacalcet (triángulos) o vehículo (círculos) a lo largo del tiempo (días); (B) Concentraciones plasmáticas de Ca2+ iónico (mmol/L) en ratones que recibieron
Cinacalcet (triángulos) o vehículo (círculos) a lo largo del tiempo (semanas).
Las Figura 3 y Figura 4 son una representación visual de los patrones de expresión de varios genes (93 grupos de sondas en Fig. 3 y 34 en Fig. 4) de diferentes especímenes tratados con Cinacalcet (C) o vehículo (V). En los heatmaps, los genes sobre-expresados se representan en rojo, que en la escala de grises tienden a aparecer con tonalidades más oscuras. Las tonalidades más claras de la escala de grises tienden a representar el verde en el heatmap (genes que no están sobre- expresados).
La Figura 5 comprende gráficos que muestran (A) La expresión relativa del mRNA de CTCFL determinada mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reactiorí) en especímenes que han recibido tratamiento con Cinacalcet (C) o vehículo (V). (B) La expresión relativa del mRNA de SSX4/4B (negro), MAGE A3 (blanco), MAGE A2 (rayado) en el mismo modelo. (C) La expresión relativa del mRNA de NTRK3 en el mismo modelo. (D) La expresión relativa del mRNA de ADCY8 (negro), PRKCA (blanco), RYR2 (rayado) en el mismo modelo.
Descripción detallada de la invención Se debe tener en consideración que, en la presente solicitud, las formas en singular "un" y "el" incluyen sus correspondientes plurales, a menos que el contexto claramente indique lo contrario.
Los retos actuales para aplicar la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer incluyen la identificación de antígenos tumorales adecuados. Las dianas ideales para la inmunoterapia serían aquellos antígenos que son inmunogénicos y que se hallan expresados específicamente en las células tumorales.
Los antígenos "cáncer-testículos" (canee r-testis antigens, CTAs) constituyen una extensa familia de más de 240 antígenos, detalles de la cual se pueden obtener en http://www.cta.lncc.br. Los CTAs se pueden dividir entre los que son codificados por genes que se localizan en el cromosoma X, los genes X-CTAs, y los que no son codificados por genes que se localizan en el cromosoma X, los genes no-X-CTAs. Los genes X-CTAs engloban familias de múltiples genes que se organizan en agrupaciones (clusters) a lo largo del cromosoma X, e incluyen, entre otros, las familias de genes MAGE, GAGE, SSXy NY-ESO-1. Los genes no-X-CTAs se hallan distribuidos a lo largo del genoma, son en general genes de copia única e incluyen, entre otros, el gen BORIS (CTCFL).
Los CTAs se hallan expresados en tumores de diferente histogénesis, pero no en los tejidos normales, excepto en testículos, ovario fetal y placenta, que no son accesibles al sistema inmunitario. Además, los CTAs muestran una inmunogenicidad muy elevada in vivo. Así pues, su patrón de expresión restringido a las células tumorales y su alta inmunogenicidad convierte a los CTAs en dianas ideales para distintas estrategias inmunoterápicas específicamente dirigidas contra células tumorales. Aunque los CTAs son antígenos tumorales inmunogénicos, la notable heterogeneidad ínter- e intra-tumoral de su expresión limita la elegibilidad de los pacientes afectos de cáncer para este tratamiento, y/o dificulta el reconocimiento inmunogénico de las células neoplásicas, lo cual reduce la eficacia de las inmunoterapias basadas en CTAs.
Sorprendentemente, los inventores han desarrollado un método para modular la expresión de los CTAs en las células tumorales. En particular, los inventores han encontrado que un agente activador de CaSR incrementa la expresión de los CTAs in vitro e in vivo, y, es importante remarcar que la mayoría de los genes sobre- expresados son X-CTAs, que son los más inmunogénicos. Así pues, los inventores proporcionan una estrategia para incrementar la expresión de dianas inmunogénicas, que son esencialmente específicas de tumor, haciendo a las células cancerosas más susceptibles a agentes inmunoterapéuticos basados en CTAs e incrementando la eficacia de un tratamiento con agentes inmunoterapéuticos basados en CTAs. Sorprendentemente, los inventores también han encontrado que este incremento de la expresión de los CTAs puede ser utilizado como marcador subrogado de la respuesta de un tumor a un tratamiento con un agente activador de CaSR. Así pues, el incremento de la expresión de los CTAs proporciona nuevos usos, métodos y productos, los cuales son el objeto de la presente invención.
Como se muestra en los Ejemplos, Cinacalcet, un agente activador de CaSR, es capaz de incrementar la expresión de los CTAs en células de neuroblastoma in vitro e in vivo. Los CTAs son genes casi exclusivamente expresados en cáncer y por tanto incrementar su nivel de expresión torna a las células tumorales, y por tanto a un sujeto con tales células, más susceptibles a los agentes inmunoterapéuticos específicamente dirigidos contra dichos CTAs. Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente activador de CaSR para su uso en incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
El agente activador de CaSR incrementa el nivel de expresión de al menos un gen CTA, por lo que, el primer aspecto de la invención se refiere también al uso de un agente activador de CaSR para su uso en incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs, donde el agente activador de CaSR incrementa el nivel de expresión de al menos un gen CTA.
El primer aspecto de la presente invención también se refiere al uso de un agente activador de CaSR para incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
El primer aspecto de la presente invención también se refiere al uso de un agente activador de CaSR como potenciador de la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
El primer aspecto de la presente invención se refiere además al método para incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs, que comprende la administración de un agente activador de CaSR al sujeto con el fin de incrementar la expresión de un gen CTA. En el contexto de la presente invención, el término "agente activador de CaSR" se refiere a agonistas directos de CaSR y a activadores alostéricos de CaSR. En una realización preferente del primer aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores, el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR. Existen múltiples activadores alostéricos de CaSR, entre ellos Cinacalcet,
NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B y AC-265347. Así, en una realización más preferente, el agente activador de CaSR es seleccionado entre Cinacalcet, NPS- R568, Calindol, Calcimimetic B y AC-265347 y combinaciones de ellos, y en una realización todavía más preferente el agente activador de CaSR es Cinacalcet. Estos compuestos son ampliamente conocidos por el experto en la materia y pueden sintetizarse utilizando técnicas estándar, como por ejemplo las descritas en EP 1913941 A1 , Nemeth et al. (Calcimimetics with potent and selective activity on the parathyroid calcium receptor". Proc Nati Acad Sci USA. 1998 31 ;95(7):4040-5). Además, estos compuestos están disponibles comercialmente, por ejemplo, en las siguientes casa comerciales: Cinacalcet (Amgen , Selleck Chemicals), NPS-R-568
(NPS Pharmaceuticals/Shire), Calcimimetic B (Amgen), AC-265347 (ACADIA Pharmaceuticals, Sigma-Aldrich), Calindol (Toronto Research Chemicals).
En el contexto de la presente invención, "agente inmunoterapéutico basado en CTAs" se refiere a un agente inmunoterapéutico específico para al menos un CTA, es decir, al menos un CTA es la diana molecular del agente inmunoterapéutico. CTA se refiere a un gen CTA, a un fragmento de este, a una proteína CTA, a un fragmento de esta (péptido CTA), o a una combinación de los mismos. Agente inmunoterapéutico se refiere a un agente capaz de estimular la respuesta inmune. Dicha respuesta resulta en el tratamiento, mejora y/o retraso de la progresión de una enfermedad. En concreto, agentes inmunoterapéuticos son, entre otros, vacunas que utilizan péptidos
CTAs como agentes inmunogénicos, vacunas con células dendríticas previamente pulsadas con estos péptidos, y células T que expresan receptores nativos o modificados mediante ingeniería para reconocer a dichos péptidos.
En el contexto de la presente invención, el término "susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs" se refiere a la sensibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs. Al incrementar la susceptibilidad o sensibilidad de las células tumorales con expresión de CaSR al agente inmunoterapéutico basado en CTAs se espera una mejora de la eficacia del tratamiento de un sujeto afecto de un cáncer con expresión de CaSR con dicho agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
El término "como potenciador de la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs" se refiere a un agente que incrementa la susceptibilidad o sensibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
El término "cáncer con expresión de CaSR" se refiere a un cáncer en el cual CaSR se encuentra expresado en la membrana plasmática de las células tumorales. En una realización particular del primer aspecto de la invención de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos anteriores, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas (particularmente las de carcinoma de células renales, cáncer de mama o de próstata) y combinaciones de los mismos. En una realización preferente, un cáncer con expresión de CaSR es seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, y combinaciones de los mismos; y más preferentemente, el cáncer con expresión de CaSR es neuroblastoma. Como se halla descrito en la literatura, todos estos cánceres son cánceres con expresión de CaSR.
Como se muestra en los Ejemplos 1 , 3 y 4, el nivel de expresión de los CTAs de las familias SSX y GAGE se incrementa tras la administración de Cinacalcet in vitro e in vivo, y se detecta mediante microarrays y RT-qPCR. Así pues, en una realización particular del primer aspecto de la invención de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos anteriores, se incrementa la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs de la familia SSX; en otra realización, se incrementa la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs de la familia GAGE, y, en otra realización, se incrementa la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs de la familia SSX y de la familia GAGE. En una realización preferida, el CTA de la familia SSX es seleccionado de SSX 4 y/o SSX 4B; y el CTA de la familia GAGE es seleccionado de GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B,
GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13, y combinaciones de los mismos. Preferentemente los CTA de la familia GAGE son GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, se incrementa la susceptibilidad a agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4 y/o SSX 4B, y GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C,
GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismo. Y más preferentemente aún, se incrementa la susceptibilidad a agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H y GAGE 12J.
Como se muestra en el Ejemplo 4, el nivel de expresión de los CTAs de la familia MAGE también se incrementa tras la administración de Cinacalcet. Así, en otra realización preferente del primer aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del párrafo anterior, se incrementa la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs de la familia MAGE. Preferiblemente, el CTA de la familia MAGE es MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2 e incluso más preferentemente MAGE A2 y MAGE A3.
En otra realización preferente del primer aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de los dos párrafos anteriores, se incrementa la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en un no-X-CTA, preferiblemente basado en CTCFL.
Más preferentemente, se incrementa la susceptibilidad a agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL.
Teniendo en cuenta que se ha descrito que los CTAs muestran una notable heterogeneidad de expresión ínter- e intra-tumoral (es decir, que diferentes tumores muestran diferentes patrones de expresión de CTAs, y que distintas células dentro de un mismo tumor presentan diferentes patrones de expresión de estos antígenos), el agente inmunoterapéutico ideal deberá comprender agentes inmunoterapéuticos dirigidos contra varios CTAs simultáneamente, tal y como los que se describen en los párrafos anteriores. Este tipo de abordaje utilizando múltiples dianas se ha mostrado también como ideal en el contexto de otras inmunoterapias, como es el caso de las vacunas con células dendríticas para el tratamiento del glioblastoma, en el que los antígenos también muestran un patrón de expresión altamente heterogéneo tanto a nivel ínter- como intra-tumoral.
Dado que un agente activador de CaSR incrementa el nivel de expresión de al menos un CTA en las células tumorales con expresión de CaSR, convirtiendo a dichas células en más sensibles a al menos un agente inmunoterapéutico basado en dicho CTA, la presente invención se refiere también a un agente activador de CaSR y a un agente inmunoterapéutico dirigido contra un CTA, como terapia combinada, para su uso en el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR. Así, en un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un agente activador de CaSR en combinación con un agente inmunoterapéutico basado en CTAs para el uso en el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR. El segundo aspecto de la segunda invención también se refiere al uso de un agente activador de CaSR en combinación con un agente inmunoterapéutico basado en CTAs para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR.
En una realización particular del segundo aspecto de la invención, el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, en una realización preferente el agente activador de CaSR es seleccionado de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347 y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
En otra realización particular del segundo aspecto de la invención tal como se define en cualquiera de los párrafos anteriores, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos. En una realización particular, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona entre neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas y combinaciones de los mismos, y más preferentemente es neuroblastoma.
Tal y como se utiliza aquí, el término "en combinación" no limita el orden en el cual se administran a un sujeto el agente activador de CaSR y el agente inmunoterapéutico basado en CTAs. Un agente activador de CaSR puede ser administrado a un sujeto antes de (por ejemplo, por lo menos 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), simultáneamente con, o a continuación de (por ejemplo, por lo menos 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un agente inmunoterapéutico basado en CTAs. La administración del agente activador de CaSR y el agente inmunoterapéutico basado en CTAs puede realizarse por la misma o diferentes rutas.
En una realización particular del segundo aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores, el agente activador de CaSR se administra antes de, y/o simultáneamente al agente inmunoterapéutico basado en CTAs. Preferentemente, el agente activador de CaSR es administrado antes del agente inmunoterapéutico basado en CTAs de manera que la expresión de los CTAs se vea incrementada antes de la administración del agente inmunoterapéutico basado en CTAs, y a continuación se administra el agente inmunoterapéutico basado en CTAs. Preferentemente la administración del agente activador de CaSR se mantiene incluso tras la administración del agente inmunoterapéutico basado en CTAs, de manera que los efectos del agente activador de CaSR se mantienen mientras se administra el agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
En una realización particular del segundo aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de los párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia SSX y/o un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia GAGE.
En una realización preferente del segundo aspecto de acuerdo con el párrafo anterior, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes específicos para: - Un CTA de la familia SSX seleccionado de SSX 4 y/o SSX 4B, y/o
- Un CTA de la familia GAGE seleccionado de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE
2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos. En particular 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 de los GAGEs anteriores. Preferentemente GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE
2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. En una realización aún más preferente, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4 y/o SSX 4B; y GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. E incluso más preferentemente, específico para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE
2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H y GAGE 12J.
Teniendo en cuenta que se incrementan también los niveles de expresión de genes CTAs de la familia MAGE (ver Ejemplos 1 y 4), en una realización particular del segundo aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de los dos párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs también comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia MAGE. Preferiblemente, el CTA de la familia MAGE es MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2, e incluso más preferentemente MAGE A2 y MAGE A3. Como se muestra en los Ejemplos 1 , 3 y 4, se detecta también un incremento en el nivel de expresión de un gen CTA del grupo de los no-X-CTAs, por lo que, en otra realización particular del segundo aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los tres párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs también comprende un agente inmunoterapéutico específico para un no-X-CTA, preferentemente comprende un agente inmunoterapéutico específico para CTCFL.
En una realización preferente del segundo aspecto de la presente invención, el agente activador de CaSR es Cinacalcet; el cáncer con expresión de CaSR es seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, y combinaciones de los mismos; y más preferentemente el cáncer con expresión de CaSR es neuroblastoma; y el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para:
- un CTA de la familia SSX, preferiblemente SSX 4 y/o SSX 4B; y
- un CTA de la familia GAGE, preferiblemente seleccionado entre GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F,
GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos; más preferiblemente específico para GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos,
y opcionalmente:
- un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGE A3, y/o
- un no-X-CTA, preferentemente CTCFL.
En una realización aún más preferente del segundo aspecto de la invención, de acuerdo con el párrafo anterior, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE
A3 y CTCFL.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende un agente activador de CaSR y un agente inmunoterapéutico basado en CTAs como combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva de los mismos.
El agente activador de CaSR y el agente inmunoterapéutico basado en CTAs pueden formularse como composiciones que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Así, en una realización particular, el kit comprende (1) una composición que comprende un agente activador de CaSR y (2) una composición que comprende un agente inmunoterapéutico basado en CTAs, como combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva de las mismas.
El kit del tercer aspecto de la invención se usa para el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR. En una realización particular, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos. En una realización particular, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona entre neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas y combinaciones de los mismos, y más preferentemente es neuroblastoma.
En una realización particular del kit del tercer aspecto de la invención, el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR. En una realización preferente, el agente activador de CaSR se selecciona de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B y AC-265347, y combinaciones de los mismos, y en una realización aún más preferente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
En una realización particular del kit de acuerdo con los párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia SSX, y/o un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia GAGE.
En una realización preferente del kit de acuerdo con el párrafo anterior, los agentes inmunoterapéuticos basados en CTAs comprenden agentes inmunoterapéuticos específicos para:
- Un CTA de la familia SSX seleccionado entre SSX 4 y/o SSX 4B, y/o
- Un CTA de la familia GAGE seleccionado entre GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J y GAGE 13, y combinaciones de los mismos. En particular 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 de los GAGEs anteriores. Más preferentemente específico para GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. En una realización más preferente aún, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4 y/o SSX 4B; y para GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE
2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H y GAGE 12J.
En una realización particular del kit de acuerdo con cualquiera de los dos párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia MAGE. Preferiblemente, el
CTA de la familia MAGE es MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2, y aún más preferentemente MAGE A2 y MAGE A3.
En otra realización particular del kit de acuerdo con cualquiera de los tres párrafos anteriores, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un gen no-X-CTA, preferiblemente comprende un agente específico para CTCFL.
Una realización preferente del tercer aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende Cinacalcet y un agente inmunoterapéutico basado en CTAs que comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para:
- un CTA de la familia SSX, preferiblemente SSX 4 y/o SSX 4B; y
- un CTA de la familia GAGE, preferiblemente seleccionado entre GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos; más preferiblemente GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos,
y opcionalmente:
- un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGE A3, y/o
- un no-X-CTA, preferentemente CTCFL.
En una realización aún más preferente del tercer aspecto de la invención, de acuerdo con el párrafo anterior, el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL. Y más preferentemente específicos para SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B,
GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL.
Además, sorprendentemente, los inventores han encontrado que el incremento de expresión de un gen CTA tras la administración de un agente activador de CaSR a un sujeto afecto de un cáncer con expresión de CaSR sirve como biomarcador de la efectividad del tratamiento con dicho agente activador de CaSR. La mejor indicación de la respuesta de un cáncer a un tratamiento en particular es la reducción de su volumen tumoral o de su crecimiento tumoral. Así se evalúa habitualmente la respuesta a la quimioterapia, ya que la reducción del volumen tumoral y/o su estabilidad indica muerte celular masiva y/o salida de ciclo celular y entrada en diferenciación. Sin embargo, la mayoría de las terapias llamadas moleculares o biológicamente dirigidas no promueven cambios dramáticos del volumen tumoral, haciendo, por tanto, necesario utilizar marcadores subrogados para evaluar la respuesta tumoral. Tal como se muestra en los Ejemplos, el incremento de expresión de los mencionados CTAs se observa en modelos de neuroblastoma expuestos a Cinacalcet tanto in vitro como in vivo y esto no ocurre en las células normales. Por tanto, el incremento de expresión de estos genes tras el tratamiento con Cinacalcet apoya el uso de los CTAs como marcadores de respuesta del tumor al tratamiento con un agente activador de CaSR. El análisis de estos marcadores de respuesta se puede realizar directamente en el tumor (biopsia) y también en líquidos biológicos, incluyendo sangre periférica, ya que los CTAs circulan en sangre tanto como proteínas como en forma de mRNAs. Así, la presente invención también se refiere a un método para evaluar la efectividad del tratamiento de un cáncer que expresa
CaSR con un agente activador de CaSR mediante la cuantificación del nivel de expresión de CTAs y al uso de los CTAs como marcadores subrogados.
Así, en un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la efectividad de la terapia administrada a un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR que comprende las siguientes etapas:
a) Cuantificar el nivel de expresión de un gen CTA en una muestra biológica de dicho sujeto antes y después de la terapia, y
b) Comparar el nivel de expresión del gen CTA en las muestras biológicas, donde la terapia administrada comprende un agente activador de CaSR y donde un incremento del nivel de expresión del CTA tras la terapia con respecto al nivel de expresión antes de la terapia es indicativo de que la terapia es efectiva.
En el contexto de la presente invención, el término "sujeto" se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, incluyendo, sin limitación, humanos y primates no humanos como los chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja como vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores como los ratones, ratas y cobayas, y similares. Este término no designa una edad o sexo en particular. Así, sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, tanto machos como hembras, son considerados como incluidos en este término. El sujeto es preferiblemente un ser humano.
Los niveles de expresión de un gen CTA en las muestras biológicas pueden ser cuantificados en base al RNA resultante de la transcripción del mencionado gen (mRNA) o, alternativamente, en base al DNA complementario (cDNA) del mencionado gen. Así pues, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de expresión de un gen CTA comprende la cuantificación del mRNA del citado gen CTA, un fragmento del citado mRNA, o cDNA del mencionado gen CTA, un fragmento de dicho cDNA, o combinaciones de los mismos. Adicionalmente, el método de la invención puede incluir realizar un paso de extracción con el fin de extraer el RNA total, lo cual puede realizarse por técnicas convencionales.
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado en el marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de mRNA codificados por el gen CTA o su correspondiente cDNA. A modo de ilustración no limitante, los niveles de mRNA pueden ser cuantificados por medio del uso de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación y cuantificación del producto de dicha amplificación de mRNA, como la electroforesis y tinción, o alternativamente por medio de Northern blot y el uso de sondas específicas para el mRNA del gen de interés (CTA) o su correspondiente cDNA, mapeo con nucleasa S1 , RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), hibridación, microarrays, etc. De igual modo, los niveles del cDNA correspondiente al mencionado mRNA codificado por el gen CTA pueden ser cuantificados también por medio de técnicas convencionales. En este caso, el método de la invención incluye un paso que es la síntesis del cDNA correspondiente por medio de la transcripción reversa a partir del correspondiente mRNA seguida de la amplificación y cuantificación del producto de dicha amplificación del cDNA. Se pueden encontrar métodos convencionales para la cuantificación de los niveles de expresión en, por ejemplo, Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual', 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.
Los niveles de expresión del gen CTA en las muestras biológicas pueden ser cuantificados en base a la proteína codificada por dicho gen, es decir, la proteína CTA, o una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 90% idéntica a la proteína codificada por el gen CTA, y aún más preferentemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con respecto a la citada proteína. El grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado por métodos convencionales, por ejemplo, algoritmos de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (AltschuI S. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990. 215(3):403-410).
Los niveles de expresión de la proteína CTA pueden ser cuantificados por medio de métodos convencionales que permiten la detección y cuantificación de dicha proteína en la muestra de un sujeto. Existe una gran variedad de ensayos conocidos que pueden ser utilizados en la presente invención. Esta técnicas incluyen, por ejemplo, Western blot, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay o ensayo de inmunoabsorción mediado por enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo
(competitive enzymatic immunoassay o inmunoensayos enzimático competitivo), DAS-ELISA (double antibody sandwich ELISA o ELISA en sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de proteínas o microarrays incluyendo anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal. Otros métodos para detectar y cuantificar la citada proteína CTA incluyen la cromatografía de afinidad, los ensayos de unión a ligando, etc. En una realización particular, los niveles de la proteína codificada por el gen CTA son cuantificados mediante Western blot, inmunohistoquímica o ELISA.
En una realización particular del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, en la etapa a) se cuantifica el nivel de expresión mediante cualquier método de los seleccionados entre:
a) Detectar el mRNA de un gen CTA;
b) Detectar la proteína codificada por el gen CTA; y
c) Detectar una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la proteína codificada por dicho gen CTA.
En una realización preferente, en la etapa a) se cuantifica el nivel de expresión mediante la detección del mRNA del gen CTA, preferentemente mediante RT-qPCR o mediante microarrays.
Poner en práctica el método de la invención comprende obtener una muestra biológica del sujeto en estudio. Los CTAs se hallan expresados en muestras del tejido tumoral y pueden ser detectados también en los fluidos biológicos de los sujetos diagnosticados con cáncer. Por tanto, en una realización particular, la muestra biológica es una muestra de tejido tumoral o un fluido biológico; y en una realización aún más particular, es un fluido biológico, de manera que el método es menos invasivo que el que requeriría analizar una muestra del tumor obtenida mediante biopsia. En una realización preferente, la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado de sangre, suero, plasma, líquido peritoneal, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido cefalo-raquídeo y líquido intra-articular, preferentemente el fluido biológico es seleccionado de sangre, suero y plasma, y más preferentemente la muestra biológica es sangre.
En una realización particular del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención definida en los párrafos anteriores, el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, en una realización preferente el agente activador de CaSR es seleccionado de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC- 265347 y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
En otra realización particular del método de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención tal como se define en cualquiera de los párrafos anteriores, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos. En una realización particular, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona entre neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas y combinaciones de los mismos, y más preferentemente es neuroblastoma.
Una de las limitaciones de las inmunoterapias basadas en CTAs es el notable grado de heterogeneidad ínter- e intra-tumoral de la expresión de los CTAs. Por ello, es razonable analizar simultáneamente distintos marcadores de esta familia de genes/antígenos. En los datos descritos en los Ejemplos, los marcadores más consistentemente sobre-expresados son los de las familias GAGE y SSX. Así pues, en una realización particular del método del cuarto aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los párrafos anteriores, la etapa a) comprende la cuantificación de los niveles de expresión de un CTA de la familia SSX, y/o un CTA de la familia GAGE. Preferiblemente, el CTA de la familia SSX se selecciona de SSX 4 y/o SSX 4B, más preferiblemente son SSX4 y SSX4B, y el CTA de la familia GAGE se selecciona de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos. En particular 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 de los GAGEs anteriores. Más preferentemente los CTA de la familia GAGE son GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos,
GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, en el método del cuarto aspecto, la etapa a) comprende la cuantificación de los niveles de expresión de CTAs de la familia SSX y de la familia GAGE como se describe más arriba en este en el párrafo y, más preferentemente comprende cuantificar el nivel de expresión de SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H y GAGE 12J.
La cuantificación de una combinación de CTAs produciría los resultados más robustos teniendo en cuenta el patrón de expresión tan heterogéneo que se halla en los tumores antes de la terapia, y por tanto también, probablemente, tras un tratamiento con agentes activadores de CaSR. Así, en otra realización preferente del cuarto aspecto de la invención de acuerdo con el párrafo anterior, la etapa a) también comprende cuantificar el nivel de expresión de un CTA de la familia MAGE, preferiblemente MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2, y más preferentemente MAGE A2 y MAGE A3.
En otra realización preferente del cuarto aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los dos párrafos anteriores, la etapa a) también comprende cuantificar el nivel de expresión de un no-X-CTA, preferiblemente CTCFL.
En una realización preferente, la etapa a) comprende cuantificar la expresión de los siguientes CTAs: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL. Y más preferentemente, SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C,
GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL. En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del cuarto aspecto de la invención, que comprende los medios adecuados para medir los niveles de expresión de los genes CTAs, y un envase adecuado. El término "envase" se refiere a la contención y embalaje antes de la venta con el fin primario de facilitar la compra y el uso de un producto.
En una realización particular del quinto aspecto, el kit comprende medios adecuados para medir el nivel de expresión de un CTA de la familia SSX y un CTA de la familia GAGE. Preferentemente, el kit comprende medios adecuados para medir el nivel de expresión de un CTA de la familia SSX seleccionado de SSX 4 y/o SSX 4B, y un CTA de la familia GAGE seleccionado de GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos. En particular 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 de los GAGEs anteriores. Más preferentemente GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. En una realización aún más preferente, el kit del quinto aspecto comprende medios adecuados para medir los niveles de expresión de los CTAs: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos, y más preferentemente SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10,
GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H y GAGE 12J.
En otra realización preferente del quinto aspecto de la invención de acuerdo con el párrafo anterior, el kit comprende medios adecuados para cuantificar el nivel de expresión de un gen CTA de la familia MAGE. Preferiblemente el CTA de la familia
MAGE es MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2 y más preferentemente aún MAGE A2 y MAGE A3. En otra realización preferente del quinto aspecto de la invención de acuerdo con cualquiera de los dos párrafos anteriores, el kit comprende los medios adecuados para cuantificar el nivel de expresión de un gen no-X-CTA, preferiblemente CTCFL. En una realización más preferente del quinto aspecto de la invención, el kit comprende medios adecuados para medir los niveles de expresión de los CTAs: SSX
4, SSX 4B, GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL. Y más preferentemente, SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE
2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL.
Medios adecuados para cuantificar expresión de genes, como oligonucleótidos, sondas y anticuerpos específicos para CTAs, están disponibles comercialmente o se generan por medios ampliamente conocidos por el experto en la materia. Medios adecuados son, entre otros, los descritos en la Tabla 1 , especialmente los oligonucleótidos de las secuencias SEC ID N° 1- SEC ID N° 20, que son específicos para los CTAs indicados en dicha Tabla 1. Como se muestra en los Ejemplos, tanto in vitro como in vivo, y utilizando dos técnicas independientes, se detectó sobre-expresión de los CTAs en los modelos de neuroblastoma tras el tratamiento con Cinacalcet. También se halló sobre-expresión de otras moléculas (por ejemplo, NTRK3, PRKCA y RYR2, ver Ejemplos 1 y 3). Sin embargo, estos genes se hallan expresados también en tejidos normales, mientras que los CTAs se hallan expresados casi exclusivamente en los tumores. Esto hace que los CTAs sean los marcadores más preferibles para evaluar la respuesta tumoral al tratamiento con un agente activador de CaSR de entre todos los genes sobre- expresados en estos modelos de cáncer. Así, en un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un CTA, o al uso del nivel de expresión de un CTA, como marcador subrogado de la respuesta tumoral de un cáncer con expresión de
CaSR al tratamiento con un agente activador de CaSR. El incremento de los niveles de estos marcadores subrogados indicará que el agente activador de CaSR está realizando su acción sobre las células del tumor con expresión de CaSR a pesar de que no se produzcan cambios notables o rápidos del volumen tumoral. En una realización particular del uso de acuerdo con el sexto aspecto de la invención, el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, en una realización preferente el agente activador de CaSR se selecciona de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347 y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
En otra realización particular del uso de acuerdo con el sexto aspecto de la invención tal como se define en los párrafos anteriores, el cáncer con expresión de CaSR se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos. En una realización preferente, el cáncer con expresión de CaSR es seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas y combinaciones de los mismos, y más preferentemente es neuroblastoma.
Una realización preferente del sexto aspecto de la presente invención, el CTA utilizado es un CTA de la familia SSX, preferiblemente SSX 4 y/o SSX 4B; y/o un CTA de la familia GAGE preferentemente seleccionado de GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos. En particular 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 de los GAGEs anteriores. Más prefereriblemente los CTAs de la familia GAGE son GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. En una realización aún más preferente, los CTAs usados son: SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , al menos uno de GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E y combinaciones de los mismos, GAGE 10, y al menos uno de GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J y combinaciones de los mismos. Y más preferentemente, SSX 4, SSX 4B, GAGE 1 , GAGE 2A, GAGE
2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 12J, MAGE A2, MAGE A3 y CTCFL. En una realización aún más preferente de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en el párrafo anterior, se utilizan también un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGE A3, más preferentemente MAGE A2 y más preferentemente aún MAGE A2 y MAGE A3; y/o un CTA de la familia no-X, preferentemente CTCFL.
Los Ejemplos siguientes sirven para ilustrar la invención y proporcionar al experto en la materia una demostración y descripción completas de cómo se llevan a cabo estos usos y métodos, sin intención de limitar el ámbito de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Cinacalcet induce citodiferenciación y sobre-expresión de CTAs en modelos in vitro de neuroblastoma
Se utilizaron tres líneas celulares de neuroblastoma para este objetivo: LA-N-1 , SK- N-LP y SH-SY5Y. Hemos publicado previamente que las células LA-N-1 muestran expresión endógena de CaSR, aunque en niveles reducidos, mientras que el gen CaSR se halla silenciado mediante mecanismos epigenéticos en células SK-N-LP (Casalá C, et al. The calcium-sensing receptor gene is silenced by genetic and epigenetic mechanisms in unfavorable neuroblastomas and its reactivation induces ERK1/2-dependent apoptosis. Carcinogenesis 2013; 34:268-76). Las células SH- SY5Y tampoco muestran expresión de CaSR detectable. Por tanto, se realizaron trasfecciones estables de SK-N-LP y de SH-SY5Y con pCMV-CaSR-GFP o pCMV- GFP.
Se sembraron las líneas celulares en placas P100 y se trataron con 1 μΜ Cinacalcet (Selleck Chemicals, S1260) o DMSO durante 21 días. Se evaluó la morfología de las células diariamente. Se extrajo RNA total en los días 1 , 3, 5, 7, 10, 14 y 21. Se analizó la expresión de distintos marcadores mediante RT-qPCR utilizando SYBRgreen y oligonucleótidos específicos o bien tecnología Taqman y Assays on Demand (Applied Biosystems) (Tabla 1).
Tabla 1 : Assays on Demand y oligonucleótidos utilizados para los análisis de expresión mediante RT-qPCR.
Figure imgf000026_0001
(*) Se detectan todas las variantes del mRNA a menos que se especifique lo contrario.
GAGE P1 : Homo sapiens antígeno G (GAGE): 12B, 2B, 12D, 12E, 12C, 12G, 12C, 2C, 1 (transcrito variante X1), 12J, 1 (transcrito variante 3, RNA no codificante), 1 (transcrito variante 2), 2A, 2E, 12H, 2D, 10.
GAGE P2: Homo sapiens antigeno G (GAGE): 12B, 2B, 2A, 12D, 12E, 12C, 12H, 12G, 2C, 1 (transcrito variante X1), 12J, 1 (transcrito variante 3, RNA no codificante), 1 (transcrito variante 2).
GAGE P3: Homo sapiens antigeno G (GAGE): 12B, 2B, 2A, 12D, 12E, 12C, 12H, 12G, 1 (transcrito variante X1), 12J, 1 (transcrito variante 3, RNA no codificante), 1 (transcrito variante 2), 2E, 2D, 10.
Se detectaron características morfológicas indicativas de citodiferenciación como sobre-crecimiento de las neuritas a partir del día 3. Estos cambios alcanzaron su máxima expresión entre los días 7 y 14 (Figura 1). El análisis de expresión de mRNAs mediante RT-qPCR mostró el incremento de expresión de genes asociados con citodiferenciación y de diversos CTAs (Tabla 2). La citodiferenciación en neuroblastoma es una indicación de que el tumor se vuelve más benigno, menos proliferante. Por tanto, la sobre-expresión de genes asociados a diferenciación muestra que Cinacalcet ejerce efectos anti-tumorales en el contexto de neuroblastoma. Más aún, el incremento de expresión de estos genes asociados a diferenciación y de los CTAs tanto in vitro como in vivo (ver Ejemplos 2-4) valida el modelo in vitro propuesto (dosis administradas, tiempo de exposición, etc.) como un buen modelo para evaluar la respuesta del neuroblastoma al tratamiento con Cinacalcet.
Tabla 2. Genes sobre-expresados en modelos in vitro de neuroblastoma tras el tratamiento con Cinacalcet.
I Δ M 1 SK-N-LP SH-SY5Y
LM-IM- I
CaSR/GFP CaSR/GFP
Gen Incremento
Diferenciación NTRK1 3,2 3,6 2,9
NTRK3 2,4 2,6 4,7
NFL ns 7,2 2,3
TUBB3 ns 2,8 1 ,7
SWO-β 6,9 72,3 2,2
CTAs CTCFL 1 ,2 no expresión no expresión
SSX4/4B 3,8 69 3,45
GAGE-P1 2,7 4,1 1 ,4
GAGE-P2 7,6 5,7 7,9
GAGE-P3 5,1 6,3 2,5
MAGEA2 2,9 36,6 2,4
MAGEA3 1 ,4 155,4 14,6 ns.- no significativo Ejemplo 2. Cinacalcet inhibe el crecimiento de neuroblastoma in vivo
Se generó un modelo in vivo de neuroblastoma en ratones hembra atímicos Nude- Foxnl nulnu de 4-6 semanas de vida (Charles River) inoculando subcutáneamente células LA-N-1 (107). Se permitió el crecimiento tumoral hasta que se alcanzaron dimensiones de 7x7 mm. En ese momento, los ratones fueron randomizados para recibir vehículo (descrito más abajo) o Cinacalcet 10 mg/kg/día por vía oral (gavage)
6 días por semana hasta que el volumen tumoral alcanzó los 2 cm3. Cinacalcet se preparó a partir de Mimpara® (Amgen). Se homogeneizaron en un mortero las cápsulas de Mimpara® y el polvo resultante fue reconstituido con 0,5% Tween 20 (20%, v/v) y carboximetilcelulosa (0,25%, w/v) hasta una concentración final de 20 mg/mL. Cada dosis administrada contenía 5 μΙ_ de esta mezcla por gramo de peso del ratón. Se midieron las dimensiones de los tumores 3 veces por semana con pie de rey. El volumen tumoral se calculó como L xW2^ donde "L" indica longitud en mm y "W" indica anchura en mm. Al terminar el experimento (cada ratón fue sacrificado cuando su xenoimplante alcanzó el volumen final predeterminado, 2 cm3), se extirparon los tumores y la mitad de cada uno fue congelada en nitrógeno líquido para análisis moleculares mientras que la otra mitad fue fijada en 10% formalina. Para los análisis de supervivencia libre de eventos (SLE), un evento fue definido como un tumor que excedió los 2 cm3. Se utilizó el estadístico log-rank para comparar las probabilidades SLE entre grupos. Se consideró significativa una P < 0,05.
Como se muestra en la Figura 2A, se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral en los animales tratados con Cinacalcet con respecto a los controles (P=0,034). Se documentó una moderada hipocalcemia en los animales tratados con Cinacalcet (Figura 2B). Este es el resultado esperable como resultado de la acción de Cinacalcet sobre las paratiroides y el riñon, y por tanto una buena indicación de que el fármaco está siendo administrado y absorbido correctamente. No se detectaron signos de toxicidad: los animales se alimentaron y crecieron correctamente, por lo que toleraban bien la hipocalcemia.
En conjunto, este modelo murino mostró que la exposición prolongada a Cinacalcet reduce el crecimiento tumoral de los neuroblastomas in vivo, y que este efecto anti- tumoral se consigue a dosis bien toleradas.
Ejemplo 3. Sobre-expresión de CTAs en neuroblastoma tras el tratamiento in vivo con Cinacalcet: Análisis mediante microarrays
Se extrajo RNA total de 8 xenoimplantes obtenidos de ratones tratados con
Cinacalcet (C) y 8 xenoimplantes de ratones que recibieron vehículo (V). Estos fueron los últimos 8 tumores extirpados en cada grupo, de manera que los xenoimplantes analizados fueran los que habían recibido el tratamiento durante el periodo de tiempo más prolongado (V5-V12 y C4-C11). Los análisis de expresión de mRNA se realizaron mediante dos técnicas: microarrays (Ejemplo 3) y RT-qPCR (Ejemplo 4).
Los análisis de expresión pangenómicos se realizaron utilizando Affymetrix Human and Mouse Gene Array 2. 1 ST (Affymetrix referencia 902136 para el array de genes humanos y referencia 902120 para el array de genes murinos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la hibridación, los procedimientos para analizar los resultados incluyeron: Control de calidad de los arrays (tras este paso, se excluyó la muestra C6 de los análisis subsiguientes); filtrado y normalización; selección de genes diferencialmente expresados; comparación simple (tratados versus control); lista de genes diferencialmente expresados ordenados por significación; Volcano plots para mostrar los genes más diferencialmente expresados; heatmaps para mostrar agrupación de perfiles de expresión; y análisis de la significación biológica a través de análisis de enriquecimiento mediante Gene Ontologies, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e Ingenuity pathways.
El análisis de expresión pangenómico inicial identificó un grupo de 13 sondas correspondientes a genes potencialmente sobre-expresados (log fold change >1) en los tumores tratados con Cinacalcet (C4, C5, C7-C1 1) en comparación con los controles (V5-V12). Fue interesante observar que 1 1 de estas 13 sondas hibridaban con CTAs (Tabla 3, negrita). Sin embargo, estas diferencias de expresión no eran estadísticamente significativas (P-valor ajustado > 0,05). De todos modos, en el heatmap correspondiente de la Figura 3, era notorio que un grupo de genes parecían específicamente modulados en los 3 tumores que habían recibido tratamiento con Cinacalcet durante el periodo de tiempo más prolongado. Esto se confirmó en un segundo análisis en el cual se examinaron los genes diferencialmente expresados en estos 3 tumores (C9-C11) con respecto a los 8 tumores de los ratones que recibieron vehículo (V5-V12) (Figura 4).
Tabla 3: Genes sobre-expresados en los xenoimplantes tratados con Cinacalcet versus los xenoimplantes tratados con vehículo (log fold change > 1).
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Este segundo análisis identificó un grupo de genes significativamente modulados en los especímenes tratados con Cinacalcet. Esta firma genética (o conjunto de genes diferencialmente expresados) se hallaba compuesta por 34 sondas que hibridan con genes significativamente sobre-expresados (log fold change >1 , P-valor ajustado > 0,05, Tabla 4). Entre estas 34 sondas, 11 (32%) hibridaban con CTAs (negrita). Se trataba de CTAs codificados por genes que se localizan en el cromosoma X (familias GAGE y SSX 4/4B). La familia GAGE ya se había detectado como sobre-expresada en el primer análisis (Tabla 3).
Otros genes significativamente sobre-expresados (log fold change >1 , P-valor ajustado > 0,05) en este análisis incluían PRKCA, RYR2 y GABRA3. Los dos primeros codifican proteínas que son importantes en las vías de señalización activadas por CaSR, mientras que los receptores GABA se hallan sobre-expresados en tumores neuroblásticos de buen pronóstico.
En este segundo análisis, se halló también sobre-expresión de otros dos genes relevantes (CTCFL y NTRK3), aunque el P-valor ajustado se hallaba justo por debajo del punto de corte (0,0514678 para ambos CTCFL y NTRK3). CTCFL (también llamado BORIS) es un no-X-CTA del que se ha descrito que es capaz de regular la expresión de otros CTAs en algunos contextos, y que NTRK3 es un receptor de la familia Trk que se halla sobre-expresado en tumores neuroblásticos benignos, de buen pronóstico.
En conclusión, este segundo análisis de los datos de los microarrays mostró que los neuroblastomas expuestos a Cinacalcet durante periodos de tiempo prolongados se tornan más benignos, diferenciados, e identificó un efecto sorprendente, totalmente inesperado, del agente activador de CaSR: la sobre-expresión significativa de CTAs en las células del neuroblastoma tras la exposición a este fármaco.
Tabla 4: Genes sobre-expresados en los 3 xenoimplantes tratados con Cinacalcet durante más tiempo versus los xenoimplantes tratados con vehículo.
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Ejemplo 4. Sobre-expresión de CTAs en neuroblastoma tras el tratamiento in vivo con Cinacalcet: Análisis mediante RT-qPCR
La validación de los resultados de los microarrays se realizó mediante RT-qPCR. Esta técnica se llevó a cabo utilizando SYBRgreen y oligonucleótidos específicos o bien tecnología Taqman y Assays on Demand (Applied Biosystems) (Tabla 1).
Esta técnica también se utilizó para analizar con más detalle la expresión de otros CTAs (miembros de la familia MAGE y CTCFL), genes asociados a diferenciación y otros involucrados en las vías de señalización de CaSR. El incremento de expresión de CTCFL (Figura 5A) MAGE A2, MAGE A3 y SSX 4/4B (Figura 5B), NTRK3 (Figura
5C), ADCY8, PRKCA y RYR2 (Figura 5D) se detectó principalmente en los dos especímenes expuestos a Cinacalcet durante más tiempo (C10-C1 1).
Las diferencias de expresión se analizaron también en la cohorte entera de animales incluidos en el experimento, y se halló un incremento de expresión relativa de los GAGE mRNA de hasta 100 veces en el espécimen que recibió el tratamiento más prolongado con Cinacalcet (C11) (datos no mostrados).
Ejemplo 5. Cinacalcet no induce sobre-expresión de CTAs en los tejidos normales circundantes
Con el fin de evaluar si la sobre-expresión de los CTAs era un efecto específico en las células del tumor o se producía en los tejidos adyacentes normales también, se llevó a cabo un análisis de expresión pangenómico mediante microarrays utilizando un chip para detectar genes murinos diferencialmente expresados en los mismos RNAs analizados mediante el array e genes humanos. Tal y como se muestra en la Tabla 5, se halló sobre-expresión de muy pocos genes (log fold change >1), ninguno de ellos de manera estadísticamente significativa (P-valor ajustado > 0,05), y los CTAs no se hallaban entre estos genes con expresión incrementada, ni siquiera cuando se analizaron los 3 últimos especímenes C9-C1 1. Así, de manera interesante, Cinacalcet induce sobre-expresión de los CTAs en los tumores, pero no en los tejidos normales circundantes, proporcionando dianas adecuadas para un agente inmunoterapéutico. Tabla 5: Análisis de expresión de genes de Mus musculus mediante microarrays: Genes sobre-expresados.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. - Agente activador de CaSR para su uso en incrementar la susceptibilidad de un sujeto con un cáncer con expresión de CaSR a un agente inmunoterapéutico basado en CTAs.
2. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, preferentemente seleccionado de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347, y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
3. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el cáncer se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos; preferentemente seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas; y más preferentemente es neuroblastoma.
4. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en incrementar la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en un CTA de la familia SSX y/o a un agente inmunoterapéutico basado en un CTA de la familia GAGE.
5. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, para su uso en incrementar la susceptibilidad a un agente inmunoterapéutico basado en un CTA de la familia MAGE y/o a un agente inmunoterapéutico basado en un CTA de la familia no-X.
6. - Agente activador de CaSR en combinación con un agente inmunoterapéutico basado en CTAs para su uso en el tratamiento de un cáncer con expresión de CaSR.
7. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, preferentemente seleccionado de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347, y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
8. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, donde el cáncer se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos; preferentemente seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas; y más preferentemente es neuroblastoma.
9. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para:
- un CTA de la familia SSX, preferentemente seleccionado de SSX 4 y/o SSX 4B, y/o
- un CTA de la familia GAGE, preferentemente seleccionado de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13, y combinaciones de los mismos.
10. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGE A3.
1 1. - Agente activador de CaSR para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10 donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un no-X-CTA, preferentemente CTCFL.
12. - Kit que comprende un agente activador de CaSR y un agente inmunoterapéutico basado en CTAs como combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva.
13. - Kit de acuerdo con la reivindicación 12, donde el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, preferentemente seleccionado de Cinacalcet, NPS- R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347, y combinaciones de los mismos, y más preferentemente el agente activador de CaSR es Cinacalcet.
14. - Kit de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende agentes inmunoterapéuticos específicos para:
- un CTA de la familia SSX, preferentemente SSX y/o SSX 4B, y/o
- un CTA de la familia GAGE, preferiblemente seleccionado de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13, y combinaciones de los mismos.
15. - Kit de acuerdo con la reivindicación 14, donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGEA3.
16. - Kit de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 15, donde el agente inmunoterapéutico basado en CTAs comprende un agente inmunoterapéutico específico para un no-X-CTA, preferentemente CTCFL.
17. - Un método in vitro para evaluar la efectividad de una terapia administrada a un sujeto afecto de un cáncer con expresión de CaSR que comprende las siguientes etapas:
a) cuantificar el nivel de expresión de un gen CTA en una muestra biológica del citado sujeto antes y después de la terapia, y
b) comparar el nivel de expresión del gen CTA en las muestras biológicas, donde la terapia administrada comprende un agente activador de CaSR y donde el incremento de expresión del gen CTA después de la terapia con respecto al nivel de expresión del citado gen CTA antes de la terapia es indicativo de que la terapia es efectiva.
18. - Método de acuerdo con la reivindicación 17, donde el nivel de expresión es cuantificado por cualquier método seleccionado de:
a) detectar el mRNA de un gen CTA;
b) detectar la proteína codificada por el gen CTA; y
c) detectar una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la de la proteína codificada por el gen CTA.
19.- Método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, donde la muestra biológica es una muestra de un tejido tumoral o un fluido biológico, preferiblemente un fluido biológico.
20. - Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, donde el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, preferiblemente seleccionado de Cinacalcet, NPS-R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347, y combinaciones de los mismos; y más preferentemente es Cinacalcet.
21. - Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde el cáncer se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos; preferentemente seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas; y más preferentemente es neuroblastoma.
22.- Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-21 , donde la etapa a) comprende cuantificar el nivel de expresión de:
- un CTA de la familia SSX; preferentemente SSX 4 y/o SSX 4B, y/o
- un CTA de la familia GAGE; preferentemente seleccionado de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F,
GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos.
23. - Método de acuerdo con la reivindicación 22, donde la etapa a) comprende cuantificar el nivel de expresión de un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGE A3.
24. - Método de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, donde la etapa a) comprende la cuantificación del nivel de expresión de un no-X-CTA, preferiblemente CTCFL.
25. - Kit para llevar a cabo el método definido en una cualquiera de las reivindicaciones 22-24, que comprende los medios adecuados para la cuantificación de:
- un CTA de la familia SSX; preferentemente SSX 4 y/o SSX 4B, y
- un CTA de la familia GAGE; preferentemente seleccionado de GAGE1 , GAGE 2A, GAGE 2B, GAGE 2C, GAGE 2D, GAGE 2E, GAGE 4, GAGE 5, GAGE 6, GAGE 7, GAGE 8, GAGE 10, GAGE 12B, GAGE 12C, GAGE 12D, GAGE 12E, GAGE 12F, GAGE 12G, GAGE 12H, GAGE 121, GAGE 12J, GAGE 13 y combinaciones de los mismos,
y opcionalmente:
- un CTA de la familia MAGE, preferentemente MAGE A2 y/o MAGEA3, y/o
- un no-X-CTA, preferentemente CTCFL,
y un envase adecuado.
26. - Uso de un gen CTA como marcador subrogado de la respuesta tumoral de un cáncer con expresión de CaSR al tratamiento con un agente activador de CaSR.
27. - Uso de acuerdo con la reivindicación 26, donde el agente activador de CaSR es un activador alostérico de CaSR, preferentemente seleccionado de Cinacalcet, NPS- R568, Calindol, Calcimimetic B, AC-265347, y combinaciones de los mismos, y más preferentemente es Cinacalcet.
28.- Uso de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, donde el cáncer se selecciona de adenomas y carcinomas de paratiroides, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas, cáncer de células de Leydig, cáncer de ovario, neuroblastomas, ganglioneuroblastomas, ganglioneuromas, metástasis óseas y combinaciones de los mismos; preferentemente seleccionado de neuroblastomas, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas; y más preferentemente es neuroblastoma.
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