KR20200038045A - 방광암 수술치료법 결정을 위한 유전자 세트 - Google Patents

방광암 수술치료법 결정을 위한 유전자 세트 Download PDF

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김성수
조용화
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Abstract

본 발명은 40개 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물에 관한 발명이다. 또한, 상기 조성물을 포함하는 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트 및 상기 조성물을 이용한 방광암 환자의 수술방법 결정 또는 방광암 환자의 예후를 진단하기 위한 정보제공 방법에 관한 발명이다.
상기 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물은 각각의 방광암 환자마다 상기 유전자 세트의 발현 패턴을 확인하여 방광암 수술방법을 결정하는 데 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

방광암 수술치료법 결정을 위한 유전자 세트{Gene set for guiding surgical treatment in bladder cancer}
본 발명은 40개 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물에 관한 발명이다. 또한, 상기 조성물을 포함하는 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트 및 상기 조성물을 이용한 방광암 환자의 수술방법 결정 또는 방광암 환자의 예후를 진단하기 위한 정보제공 방법에 관한 발명이다.
방광암(Bladder Cancer: BC)은 일반적으로 요로에 발생하는 악성 종양으로, 전 세계적으로 상당한 사망자가 보고되는 질병이다. 2012년에는 전 세계적으로 약 430,000건의 신규 방광암 환자가 보고된 바 있으며, 이 중 151,189 건이 유럽에서 발병한 것이었다. 또한, 방광암은 여성보다 남성에서 약 4배 정도 더 흔하게 발병되는 것을 특징으로 한다.
방광암 환자는 뚜렷이 구별되는 임상적 증상 및 예후 등과 같은 표현형에 따라 2개의 그룹으로 나눌 수 있는 데, 표재성 방광암[비-근침윤성 방광암, non-muscle invasive BC(NMIBC): Tis, Ta, T1] 및 근침윤성 방광암[muscle invasive bladder cancer(MIBC): T2, T3, T4]으로 나눌 수 있다. 방광암 치료를 위한 수술방법과 관련해서 일반적으로 NMIBC 환자는 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT)을 실시하고, 국소 MIBC 환자는 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 것이 일반적이다.
다만, RC는 전체 방광뿐 아니라 방광 주위의 지방조직 및 림프절(골반내 림프절 포함)을 모두 제거하는 수술 방법으로, 삶의 질과 관련된 조직들이 수술로 모두 제거됨으로 인해 많은 불편이 있었는 바, 최근, MIBC 환자의 경우 수술 후의 삶의 질의 향상시키기 위해 TURBT을 실시하고 있고, 상기 TURBT 수술 후의 방광암의 재발을 막기 위해 면역 요법을 받는다. 그러나, 이러한 노력에도 불구하고, MIBC 환자의 임상적 관리는 20년 동안 실질적으로 개선되지 않았고, NMIBC 환자의 경우에도 방광암 재발율이 여전히 70% 정도 였다. 따라서, MIBC 환자뿐만 아니라 NMIBC 환자의 경우에 방광암 수술 방법으로 RC 및 TURBT 중 하나를 선택하는 데 도움을 줄 수 있는 바이오마커를 개발하는 것이 중요하다. 이와 관련하여, 연구자들은 방광암과 관련된 여러가지 요인(유전적 돌연변이, 유전적 변형 또는 후생적 변이)의 분석을 통해 우수한 바이오마커를 개발하기 위해 노력하였다. 예를 들어, FGFR3 및 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 낮은 등급의 방광암 환자를 진단하는 데 사용될 수 있고(Eur Urol. 2017;71:961-9.), TP53 유전자의 돌연변이 또는 RB1 유전자의 결실은 근침윤성 방광암을 진단하는 데 사용될 수 있다는(BMC Cancer. 2009;9:32.) 연구 결과가 있었다. 그러나, 상기 방광암 관련 인자들은 방광암 자체의 이질적 특성을 밝히는 것이 아니라, 각 인자만의 특이적 효과에 대해서만 보여주는 데에 한계가 있었다.
최근, 마이크로어레이 및 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequenceing: NGS)으로부터 획득한 유전자 발현 프로파일 및 종양성 신호전달 경로의 분석은 다양한 암에서 치료학적 표적의 발견, 예후 예측 및 진단과 관련된 유전자 신호를 개발하는데 매우 유용한 기술이다.
이에 본 발명자들은 방광암 환자의 수술방법을 결정할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 노력한 결과, 방광암 수술 후 예후에 따라 발현 패턴이 상이한 40개의 유전자 세트를 개발하였고, 이를 이용하여 방광암 환자의 수술 후 재발율 또는 생존기간 등에 유리한 수술방법을 결정하는 정보제공 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 예후를 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물 을 제공한다.
본 발명의 40개의 유전자는 (a) 유전자 세트 또는 (b) 유전자 세트로 나눌 수 있다. 상기 (a) 유전자 세트는 ACCN2(Acid sensing ion channel subunit1; EntrezID 41), CRYAB(Crystallin alpha B; EntrezID 1410), CSPG4(Chondroitin sulfate proteoglycan 4; EntrezID 1464), DOCK8(Dedicator of cytokinesis 8; EntrezID 81704), DPYSL2(Dihydropyrimidinase like 2; EntrezID 1808), ECM1(Extracellular matrix protein 1; EntrezID 1893), FADS1(Fatty acid desaturase 1; EntrezID 3992), GHR(Growth hormone receptor; EntrezID 2690), KIF21B(Kinesin family member 21B; EntrezID 23046), LAMA2(laminin subunit alpha 2; EntrezID 3908), OAS1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1; EntrezID 4938), OSBPL10(Oxysterol binding protein like 10; EntrezID 114884), PCSK5(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5; EntrezID 5125), PPP2R3A(Protein phosphatase 2 regulatory subunit B''alpha; EntrezID 5523), RBP1(Retinol binding protein 1; EntrezID 5947), SLC30A4 (Solute carrier family 30 member 4; EntrezID 7782), SSFA2(Sperm specific antigen 2; EntrezID 6744) 및 TPST1(Tyrosylprotein sulfotransferase 1; EntrezID 8460) 유전자로 구성될 수 있고, 상기 (b) 유전자 세트는 AGER(Advanced glycosylation end-product specific receptor; EntrezID 177), BATF(Basic leucine zipper ATF-like transcription factor; EntrezID 10538), CDK3(Cyclin dependent kinase 3; EntrezID 1018), CTP1B(Carnitine palmitoyltransferase 1B; EntrezID 1375), CSAD(Cysteine sulfinic acid decarboxylase; EntrezID 51380), CTSE(Cathepsin E; EntrezID 1510), CTSH(Cathepsin H; EntrezID 1512), CYP4F12(Cytochrome P450 family 4 subfamily F member 12; EntrezID 66002), ELF3(E74 like ETS transcription factor 3; EntrezID 1999), FAAH(Fatty acid amide hydrolase; EntrezID 2166), FBP1(Fructose-bisphosphatase 1; EntrezID 2203), FXYD3(FXYD domain containing ion transport regulator 3; EntrezID 5349), HES1(Hes family bHLH transcription factor 1; EntrezID 3280), HSD17B2(Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 2; EntrezID 3294), ID1(Inhibitor of DNA binding 1, HLH protein; EntrezID 3397), IDUA(iduronidase, alpha-L-; EntrezID 3425), KCNJ15(Potassium voltage-gated channel subfamily J member 15; EntrezID 3772), PPFIBP2(PPFIA binding protein 2; EntrezID 8495), PTPRR(Protein tyrosine phosphatase, receptor type R; EntrezID 5801), SPINK1(Serine peptidase inhibitor, Kazal type 1; EntrezID 6690), TTLL3(Tubulin tyrosine ligase like 3; EntrezID 26140) 및 ZNF43(Zinc finger protein 43; EntrezID 7594) 유전자로 구성될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 40개의 유전자의 정보, 염기서열 및 이로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열의 정보는 NCBI 등 공지된 데이터 베이스에 공지되어 있다.
본 발명에서는 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 및 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 통해 방광암 환자의 수술방법을 결정할 수 있으며, 구체적으로, (a) 유전자 세트를 구성하는 18개의 유전자 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 22개의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 통해 방광암 환자의 수술방법을 결정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자 세트는 하나 이상의 유전자를 포함하고, 유전자의 발현 양상을 통해 방광암 환자를 저위험군 또는 고위험군으로 분류할 수 있는 유전자의 조합을 의미하며, (a) 및 (b) 유전자 세트는 고위험군 또는 저위험군 환자에서 서로 반대되는 발현 양상을 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서는, 고위험군 환자에서 (a) 세트 유전자가 상향조절되고, (b) 세트 유전자가 하향조절되는 반면, 저위험군 환자에서는 그 반대의 경향을 나타내는 것을 확인하여, 본 발명의 (a) 및 (b) 유전자 세트를 이용할 경우, 방광암 환자를 저위험군 또는 고위험군으로 구분할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자는 모두 저위험군과 고위험군에서 반대의 발현양상을 나타내므로, 각 세트 당 하나 이상, 구체적으로, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 보다 구체적으로, (a) 세트의 18개의 유전자 및 (b) 세트의 22개 유전자의 발현 양상으로부터 방광암 환자를 저위험군 또는 고위험군으로 구별할 수 있으며, 또한 서로 반대 양상을 나타내는 유전자로서, 저위험군과 고위험군 환자의 구분이 가능한 이상, 유전자의 조합이나 개수는 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자의 증폭에 사용되는 프라이머로서 상기 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocketimmunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머"란, 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자로부터 발현되는 단백질에 대하여 사용될 수 있다. 상기 단백질에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 용어 "방광암(Bladder Cancer: BC)"이란, 방광에 발생하는 악성 종양으로서, 방광암의 종류는 점막이나 점막 하층에만 국한되어 발생하는 것으로서 전체 방광암 중 약 70~80%를 차지하는 표재성 방광암(non-muscle invasive bladder cancer: NMIBC)과, 근육층을 침범한 근침윤성 방광암(muscle invasive bladder cancer: MIBC)으로 크게 2가지로 구분할 수 있다.
상기 방광암은 TNM 병기 분류에 따라 진행 정도를 나눌 수 있는데, 보통 진행 정도가 약한 Ta, TCIS(carcinoma in situ) 및 T1기의 방광암은 표재성 방광암에 해당되고, 이보다 진행된 T2, T3 및 T4기는 근침윤성 방광암에 해당된다.
구체적으로 본 발명의 방광암 환자는 근침윤성 방광암 환자일 수 있고, 상기 근침윤성 방광암 환자는 T2기 또는 T3기의 병기를 갖는 환자일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 방광암 치료방법은 방광암의 유형 및 병기에 따라 적절한 방법을 선택하여 치료할 수 있다. 방광암 치료방법에는 종양을 절제하는 단순 절제술, 열이나 레이저로 암세포를 태우는 방법인 방전요법 및 요도를 통해 관을 방광내로 삽입하여 여러 항암요법제를 직접 투여하는 방광내 치료법 등이 있다. 방광암 수술방법으로서 단순 절제술은 경요도 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT) 및 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)이 있다.
상기 경요도 방광종양 절제술은 일반적으로 표재성 방광암에 적용되는 수술방법으로서, 방광내의 국한된 종양만을 완전 절제하는 수술방법이고, 근치방광절제술은 근침윤성 방광암에 적용되는 수술방법으로서, 전체 방광뿐 아니라 방광 주위의 지방조직 및 림프절(골반내 림프절 포함)을 모두 제거하는 수술 방법이다.
본 발명에서는 구체적으로, 1) 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술 실시; 2) 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술 실시 후 재발, 전이, 질병의 악화와 같이 예후가 좋지 않은 경우 근치방광절제술 실시 또는 3) 처음부터 근치방광절제술 실시 중 하나의 수술방법을 결정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 방광암 환자의 수술방법은 방광암의 병기 및 고위험군 또는 저위험군의 위험도에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로, 1) T2기의 환자로, 본 발명의 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 이용하여 저위험군 환자로 판별된 경우, 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술을 실시하고; 2) T2기의 환자로, 본 발명의 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 이용하여, 고위험군 환자로 판별되거나, T3기의 환자로 저위험군 환자로 판별된 경우, 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술 실시 후 재발, 전이, 질병의 악화와 같이 예후가 좋지 않은 경우 근치방광절제술을 실시하고; 3) T3기의 환자로서 고위험군 환자로 판별된 경우, 처음부터 근치방광절제술을 실시하도록 결정할 수 있다.
보다 구체적으로, 1) T2기 환자로 (a) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 상향조절되고 (b) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 하향조절되는 경우, 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술을 실시하고; 2) T2기의 환자로 (a) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 하향조절되고 (b) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 상향조절되거나, T3기 환자로 (a) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 상향조절되는 경우 (b) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 하향조절되는 경우, 화학요법을 동반한 경요도 방광종양 절제술 실시 후 재발, 전이, 질병의 악화와 같이 예후가 좋지 않은 경우 근치방광절제술을 실시하고; 3) T3기의 환자로 (a) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 하향조절되고 (b) 유전자 세트의 유전자가 하나 이상 상향조절되는 경우, 처음부터 근치방광절제술을 실시하도록 결정할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트; 및
(b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, CLF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 칩을 제공한다.
상기 방광암 환자의 수술방법 결정용 칩은 DNA 칩 또는 단백질 칩일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 칩은 본 발명의 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 기판 상에 고정시키고, (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 하나 이상의 유전자 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 상기 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물을 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아 졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 방광암 환자의 수술방법 결정용 칩 또는 키트를 이용하여 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 하나 이상의 유전자의 발현량을 측정하고, 이로부터 방광암 환자의 수술방법을 결정할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, CLF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정을 위한 정보제공방법을 제공한다.
제1단계는 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 및 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 의미하고, 구체적으로, (a) 유전자 세트를 구성하는 18개의 유전자 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 22개의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 의미한다.
한편, 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 항체 및 앱타머에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 방광암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
제2단계는 제1단계에서 측정된 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자 의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 의미한다.
본 발명의 용어 "정상 대조군"이란, 방광암이 발병되지 않거나, 발병이 의심되지 않는 개체를 의미한다.
본 발명의 용어 "시료"란, 방광암이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 세포, 혈액, 혈청, 소변 또는 머리카락일 수 있으나, 개체의 DNA를 확보할 수 있고 그로부터 (a) 및 (b) 유전자 세트를 구성하는 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 정보제공 방법은 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 발현 수준보다 높고, 상기 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 고위험군으로 판단하는 단계(제3단계)를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 상기와 같이 고위험군일 때, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T2기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT) 실시 후 예후가 좋지 않을 경우, 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 수술방법을 결정할 수 있고, 또는 상기 개체가 근침윤성 방광암 T3기인 경우 상기 수술방법은 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 수술방법을 결정할 수 있는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 정보제공 방법은 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 발현 수준보다 낮고, 상기 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우 저위험군으로 판단하는 단계(제3단계)를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 상기와 같이 저위험군일 때, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T2기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT)을 실시하는 방법으로 수술방법을 결정할 수 있고, 또는 상기 개체가 근침윤성 방광암 T3기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT) 실시 후 예후가 좋지 않을 경우, 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 수술방법을 결정할 수 있는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 40개의 유전자 세트의 신호 및 종양 병기에 따라, 개별적인 3개의 환자 그룹으로 세분화하였고, 각각의 그룹에서 다른 외과 수술을 적용하는 것이 생존 가능성을 높이는 것으로 나타났다. 구체적으로, 제1 그룹에서는 항암치료와 함께 TURBT를 병용하는 것이 좋은 예후와 생존률을 나타내고, 제2 그룹에서는 제1 그룹과 동일한 치료 방법 또한 적용 가능하지만, TURBT 치료가 실패한 후에는 RC가 권고될 수 있으며, 제3 그룹에서는 RC가 가장 효과적으로 재발을 방지하고 생존 가능성을 높일 수 있음을 확인하였는바(실험예 4), 본 발명의 (a) 및 (b) 유전자 세트의 발현량을 통해서, 각각의 방광암 환자 마다 가장 적합한 수술방법을 결정할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및 (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, CLF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 예후를 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계 및 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "예후"란 암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명에서는 방광암의 수술 후의 예후를 예측하는 것일 수 있으며, 구체적으로 수술 후 생존기간, 재발 여부 등을 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 구체적으로 방광암 환자의 수술 후 예후 상태를 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 40개의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물은 각각의 방광암 환자마다 상기 유전자 세트의 발현 패턴을 확인하여 방광암 수술방법을 결정하는 데 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 유전자 발현 프로파일하는 과정을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 훈련 데이터 세트로서 TCGA RNA seq 데이터의 생존 분석에 관한 것으로서, A는 중앙값 중심의 40개의 유전자 발현 프로파일에 대한 히트맵이고(상대적으로 낮은 발현- 녹색; 상대적으로 높은 발현-적색), B는 훈련 데이터 세트에서의 2개의 하위 그룹의 전체 생존기간에 대한 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 훈련 데이터 세트에서의 2개의 하위 그룹의 무재발 생존기간에 대한 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 TCGA, GSE1827, GSE13507, GSE32894, GSE48276 및 E-TAB-1803으로부터 수집한 모든 데이터 세트에서의 2개의 하위 그룹의 전체 생존기간에 대한 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. 모든 분석에서의 p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타내고, RFS는 무재발 생존기간을 나타낸다.
도 3은 독립적인 유효 데이터 세트의 생존 분석에 관한 것으로서, A는 GSE1827 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 GSE135007 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 GSE32894 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 GSE48276 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. E는 E-MTAB-1803 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. 모든 분석에서의 p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타낸다.
도 4는 종양 병기와 40개의 유전자 신호와의 연관성에 관한 것으로서, A는 NMIBC에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 MIBC에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 TCGA 의 T2기에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 TCGA 의 T3기에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. E는 수집된 데이터 세트의 T2기에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. F는 수집된 데이터 세트의 T3기에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위 그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타낸다.
도 5는 종양 분화도(Tumor grade)에 따른 생존율 분석에 관한 것으로서, A는 수집된 모든 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 종양 분화도의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 낮은 종양 분화도에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 높은 종양 분화도에서 전체 생존기간에 대한 2개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타낸다.
도 6은 임상적 분류와 결합된 40개의 유전자 신호에 의한 그룹화와 생존율과의 연관성에 관한 것으로서, A는 TCGA에서 전체 생존기간에 대한 3개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 TCGA에서 무재발 생존기간에 대한 3개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 수집된 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 3개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 5개의 유효성 세트 에서 무재발 생존기간에 대한 3개의 하위그룹의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. 모든 분석에서의 p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타내고, RFS는 무재발 생존기간을 나타낸다.
도 7은 수술 치료법의 생존율 분석에 관한 것으로서, A는 모든 수집된 데이터 세트에서 전체 생존기간에 대한 수술 치료법의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 T2기 및 T3기에서 전체 생존기간에 대한 수술 치료법의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 T2기 및 T3기에서 전체 생존 기간에 대한 RC 치료법의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 T2기 및 T3기에서 전체 생존기간에 대한 TURBT 치료법의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. 모든 분석에서의 p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. OS는 전체 생존기간을 나타내고, TURBT는 경요도 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors)을 나타내고, RC는 근치방광절제술(radical cystectomy)을 나타낸다.
도 8은 임상 분류와 결합된 40개의 유전자 신호에 의한 그룹화와 수술과의 연관성에 관한 것으로서, A는 그룹 1에서 2개의 외과수술의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, B는 그룹 2에서 2개의 외과수술의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, C는 그룹 3에서 2개의 외과수술의 Kaplan-Meier 플랏을 나타내고, D는 12개월 후의 그룹 3에서 2개의 외과수술의 Kaplan-Meier 플랏을 나타낸다. 모든 분석에서의 p value는 로그-랭크 테스트로부터 얻었다. TURBT는 경요도 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors)을 나타내고, RC는 근치방광절제술(radical cystectomy)을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목표는, T2기 및 T3기의 방광암 환자의 수술방법을 결정할 수 있게 하는 유전자 마커를 개발하는 데에 있다. 본 발명에서는 4개의 집단(RNAseq 데이터가 있는 TCGA 집단 1개 및 마이크로 어레이 데이터가 있는 집단 3개)을 사용하였다.
실시예 1: 환자 정보 및 RNA 발현 데이터의 수득
유전자 발현 데이터세트 및 RNAseq 데이터는 Gene Expression Omnibus Database(GEOD)와 The Cancer Genome Atlas(TCGA)에서 얻었다. GEOD 및 TCGA의 유전자 발현 프로파일 데이터는 Illumina plat form과 Illumina Hiseq를 사용하여 각각 생성되었다(표 1).
Figure pat00001
또한, 환자의 임상 정보는 GEOD 및 TCGA 데이터베이스에서 검색하였다. 임상 정보를 이용할 수 없는 환자를 제외한, 총 830명의 방광암 환자의 데이터를 사용하였다. TCGA 집단(n=349)은 훈련 데이터 세트로 사용하였다. 또한, GSE13507 (n=165), GSE32894 (n=224) 및 GSE48276 (n=73)는 유효성 확인 데이터 세트로 사용하였다. 상세한 임상 정보는 하기 표 2에 기재하였다.
Figure pat00002
실시예 2: 예후 프로브 세트 신호 및 위험 예측의 개발
예후의 위험을 예측하는 유전자 신호는 TCGA 훈련 데이터 세트로부터 개발하였다. 구체적으로, 생존 분류에 기반한 유전자-프로파일을 만들기 위해 유전자 세트와 전체 생존기간(Overall survival: OS)을 조합하였다. 7,390개의 유전자 세트를 동일한 수준의 유전자 발현을 의미하는 log2 스케일에서 최소 2.5배의 배수 변화에 기반하여 필터링하였다. 단변량 COX 비례 위험 회귀(p<0.001)를 사용하여 훈련 데이터 세트로부터 전체 생존기간-관련 프로브 신호를 확인하였다.
또한, 예후에 대한 잠재적인 예측 유용성을 확인하기 위해, 생존 신호로부터 확인한 유전자를 생존 위험 예측 분석에 적용했다. 상기 방법은 훈련 데이터 세트의 주요 구성요소를 사용하여 각 환자에 대한 예후 지수를 산출했다. 예후 지수는 다음 공식에 의해 계산되었다:
Σi ω i x i + 0.003654
상기 ωi와 xi는 각각 i-번째 유전자에 대한 가중치와 프로브 발현 로그값을 나타낸다. 중간 예후 지수의 중간값인 0.03026에 근거하여 환자들을 두 그룹으로 나눴다. 예후 지수가 중간값보다 큰 경우는 고위험군으로 분류하고, 예후 지수가 중간값보다 작거나 같은 경우는 저위험군으로 분류하였다(도 1).
실시예 3: 예후 신호의 검증
생존 프로브 신호의 검증은 독립 데이터 세트 및 결합 데이터 세트 모두에서 수행하였다. 각 데이터 세트는 모든 환자에서 중간 표현값을 제거하여 개별적으로 조정되었다. 상기 모델을 개선하고 예측된 결과를 하위-계층화하기 위해, 컴파운드 공산량 예측변수(CCP: compound covariate predictor)를 클래스 예측 알고리즘과 함께 사용했다. 확실성은 훈련 세트에서 리브-원-아웃(leave-one-out) 교차검증에서의 오분류 비율로 평가되었다. 환자를 2개의 위험군으로 분류한 후, Kaplan-Meier 생존 분석을 수행하였다. 로그-랭크 테스트(log-rank test)는 예측된 두 하위 집단 간의 생존 위험을 평가하는 데 사용되었다. 생존과 관련된 독립적인 예후 인자를 평가하기 위해, 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 이용하였다. 프로브 신호, 종양 등급, 종양 병기, 병리학적 특징을 공변량으로 사용하였다.
실시예 4: 통계적 분석
마이크로어레이 데이터 및 히트맵은 BRB-Array Tools 4.3버전을 사용하여 분석하였다. 다른 모든 통계 분석은 R 언어 환경 및 SPSS (Statistical Package for Social Science) 소프트웨어에서 수행하였다. 클러스터 분석은 Cluster and Tree View를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p <0.05로 정의되었다.
상기 실시예 실험에 따른 결과는 하기 실험예와 같이 분석하였다.
실험예 1: 방광암 고위험군 및 저위험군 환자의 구분을 위한 유전자 세트 발굴
전체 생존기간 데이터와 관련하여 분석된 유전자 발현 프로파일을 통해 TGCA 데이터베이스로부터 RNAseq 데이터를 얻었다(도 1). 이를 통해 방광암의 예후 신호에 관련된 상향-조절되거나, 하향-조절된 유전자 세트를 얻었다(표 3).
Figure pat00003
환자를 예후 지표에 따라, 저위험군(n=170) 및 고위험군 (n=179)으로 분류하였다. 저위험군에서는 22개의 상향조절된 유전자 및 18개의 하향조절된 유전자가 발견되었으며, 고위험군에서는 저위험군과 반대의 유전자 발현 패턴이 히트맵에서 발견되었다(도 2의 A). 저위험군과 고위험군 간의 생존률 차이는 전체 생존기간(OS, p=2.27e-05; 도 2의 B) 및 무재발 생존기간(recurrence-free survival: RFS, p=0.00393; 도 2의 C)에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 통해 추정하였다(도 2의 C).
또한, 40개의 유전자 세트의 신호의 확실성을 확인하기 위해, 5개의 다른 방광암 환자 집단으로부터 얻은 독립적인 데이터 세트를 이용하여 검증하였다. 그 결과, 병합된 6개의 집단은 유의한 차이를 보였다(OS, p=8.78e -12; 도 2의 D). 각 검증 집단 및 결합 검증은 GSE1827(p=0.111), GSE48276(p=0.261) 및 E-MTAB-1803(p=0.651)을 제외하고는 큰 차이가 있었다[GSE13507(p=0.00962), GSE32894(p=0.32e-07)](도 3). GSE1827, GSE48276 및 E-MTAB-1803의 경우에는 소수의 환자로 구성되었기 때문에 큰 차이가 없었다. 다변수 cox 회귀 분석에서 40개 유전자 세트의 신호 및 병기는 생존 결과와 관련이 있었다. 그러나, 성별 및 흡연 여부는 관련이 없었다(표 4).
Figure pat00004
상기 결과를 통해, 40개의 유전자 세트의 발현 신호를 이용하여 방광암 환자를 분류할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2: 임상 분류 시스템에서 예측 유전자 신호의 확인
방광암 환자의 병기를 나누기 위해 현재 가장 널리 사용되는 방법으로서, 종양, 결절 및 전이(TNM: Tumor Node Metastasis)법이 있다.
본 발명에서는 근침윤성 방광암(muscle invasive bladder cancer: MIBC), 특히 원발성 T2 및 T3기에 초점을 두었다. T2기의 암은 이미 근육 침습 상태에 들어갔으나, 방광주위의 조직까지는 아직 침습하지 않은 상태이고, T3기의 암은 방광 전체에 진행되는 공격적인 상태로서, 방광주위의 조직까지 침습된 상태의 암이다.
모든 집단에서, NMIBC 및 MIBC에 40개의 유전자 세트를 적용한 결과, NMIBC는 유전자 신호와 관련이 없었지만, MIBC는 관련이 있음을 확인하였다(p=0.586 및 p=0.00041, 각각; 도 4의 A 및 B). TCGA 집단에서, T2 및 T3기의 고위험군은 저위험군보다 OS가 유의미하게 낮았다(p=0.0205 및 p=0.05, 각각; 도 4의 C 및 D). 또한, 모든 집단에서의 T2 및 T3의 고위험군은 나쁜 예후의 OS를 보였다(p=0.00561 및 p=0.073, 각각; 도 4의 E 및 F).
또한, TCGA 집단에서 T2기의 고위험군 환자의 OS와 T3기의 저위험군 환자의 OS은 유사한 예후를 보였고, 모든 집단의 경우에도 TCGA 집단에서와 마찬가지로, T2기의 고위험군 환자의 OS와 T3기의 저위험군 환자의 OS은 유사한 예후를 보였다.
또한, 상기와 같은 방법 외에, 종양 분화도 시스템(Grading system)은 현미경 상으로 얼마나 많은 암세포가 건강한 세포처럼 보이는지 표현하는 시스템으로, 방광암의 임상 분류에 유용하게 사용된다. 이러한 종양 분화도 시스템을 사용하여, 40개의 유전자 신호를 확인한 결과, 높은 종양 분화도(tumor grade)의 방광암에서는 나쁜 예후를 보이며(p=4.44e-16; 도 5의 A), 40개의 유전자 신호는 높은 종양 분화도의 방광암에서 보다 낮은 종양 분화도의 방광암에서는 좋은 진단 효능을 나타내는 것을 확인하였다(p=0.00318 및 p=0.488, 각각; 도 5의 B 및 C).
실험예 3: 임상 분류에서 40 유전자 세트 및 예후의 유의미한 연관성 확인
40개의 유전자 세트의 신호 및 종양 병기에 따라 환자를 재분류 하였다: 1) 그룹 1은 T2기의 저위험군 신호를 나타냄, 2) 그룹 2는 T2기의 고위험군 신호 및 T3기의 저위험군 신호를 나타냄, 및 3) 그룹 3은 T3기의 고위험군을 나타냄. 생존 분석을 통해, 상기 그룹들 간의 OS 및 RFS 값의 차이가 유의적으로 나타남을 확인하였다(OS, p=1.3e-05; RFS, p=0.00297; 도 6의 A 및 B). 모든 집단, 특히 유효성이 입증된 집단에서, 상기 그룹들 간의 OS 값의 차이가 유의적으로 나타남을 확인하였다(p=5.3e-08, p=0.00346; 도 6의 C 및 D)
실험예 4: 40개의 유전자 세트의 신호에 의한 그룹화와 수술 후 예후의 연관성 확인
경요도 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT)은 T2기 및 T3기로 분류되는 많은 환자에게 시행한다. 병리 진단 또는 영상 검사를 통해, T2기 또는 T3기로 진단되는 경우, 환자의 예후를 결정하는데, 다음 치료 단계에 대해 올바른 결정을 하는 것은 매우 중요하다. 따라서, T2기 및 T3기 치료를 위해, TURBT 와 RC 사이에 어떠한 외과 수술을 할지 결정하는 것은 어렵다. 또한, 어떤 유형의 수술이 좋은 예후를 가지는 지도 불분명하다. 이에 따라, 본 발명에서는 상기 40개의 유전자 세트의 신호가 방광암 환자의 수술방법을 결정하기 위한 정보를 제공할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, T2기 또는 T3기였던 환자에게 외과적 효과를 분석하였다. 그 결과, T2기 및 T3기 모두에서 TURBT 및 RC 간의 차이는 확인되지 않았고(p=0.174 및 p=0.532, 각각; 도 7의 A 및 B), 40개의 유전자 신호는 각각의 외과적 수술에서 환자의 생존과 관련되어 있음을 확인하였다(p=0.0968 및 p=0.000987, 각각; 도 7의 C 및 D).
또한, 상기에 언급한 바와 같이, 40개의 유전자 세트의 신호 및 종양 병기에 따라, 환자를 (1) 저위험군 유전자 신호를 가진 T2기 환자, (2) 고위험군 유전자 신호를 가진 T2기 환자 및 저위험군 유전자 신호를 가진 T3기 환자, 및 (3) 고위험군 유전자 신호를 가진 T3기 환자, 3개의 그룹으로 세분화하였다. 그 결과, 제1 그룹에서는 항암치료와 함께 TURBT를 병용하는 것이 좋은 예후와 생존률을 나타냄을 확인하였고(p=0.216; 도 8의 A), 제2 그룹에서는 제1 그룹과 동일한 치료 방법 또한 적용 가능하지만, TURBT 치료가 실패한 후에는 RC가 권고될 수 있음을 확인하였고(p=0.556; 도 8의 B), 제3 그룹에서는 RC가 가장 효과적으로 재발을 방지하고 생존 가능성을 높일 수 있으므로, 우선적인 치료법으로 고려되어야 함을 확인하였다(p=0.417; 도 8의 C). 특히, 제3 그룹에서는 RC로 치료할 경우, 약 12개월 후에, 환자의 생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다(p=0.0238; 도 8의 D). 이를 통해, 본 발명의 (a) 및 (b) 유전자 세트의 발현량을 통해서, 방광암 환자 마다 적합한 수술방법을 결정할 수 있음을 확인하였다.
상기 실시예 및 실험예를 통해, 본 발명자들은 40개 유전자 세트를 이용하여 방광암 환자의 고위험군 또는 저위험군으로의 분류가 가능하며, 더 나아가 효과적인 수술방법까지 결정할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및
    (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물.
  2. (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트; 및
    (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 세트의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 프라이머를 포함하는 것인, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 세트로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방광암 환자는 근침윤성 방광암(muscle invasive bladder cancer: MIBC) T2기 또는 T3기인, 방광암 환자의 수술방법 결정용 조성물.
  6. (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트; 및
    (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 칩.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 방광암 환자의 수술방법 결정용 키트.
  9. 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및
    (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43 유전자로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및
    상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 수술방법 결정을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 발현 수준보다 높고, 상기 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 고위험군으로 판단하는 단계(제3단계)를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T2기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT) 실시 후 예후가 좋지 않을 경우, 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 결정하는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것인 정보제공방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T3기인 경우 상기 수술방법은 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 결정하는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것인 정보제공방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 (a) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 발현 수준보다 낮고, 상기 (b) 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우 저위험군으로 판단하는 단계(제3단계)를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T2기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT)을 실시하는 방법으로 결정하는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 개체가 근침윤성 방광암 T3기인 경우 상기 수술방법은 화학 요법을 동반한 경요도 방광 종양 절제술(transurethral resection of bladder tumors: TURBT) 실시 후 예후가 좋지 않을 경우, 근치방광절제술(radical cystectomy: RC)을 실시하는 방법으로 결정하는 단계(제4단계)를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.
  16. 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서, (a) ACCN2, CRYAB, CSPG4, DOCK8, DPYSL2, ECM1, FADS1, GHR, KIF21B, LAMA2, OAS1, OSBPL10, PCSK5, PPP2R3A, RBP1, SLC30A4, SSFA2 및 TPST1로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자; 및
    (b) AGER, BATF, CDK3, CTP1B, CSAD, CTSE, CTSH, CYP4F12, ELF3, FAAH, FBP1, FXYD3, HES1, HSD17B2, ID1, IDUA, KCNJ15, PPFIBP2, PTRRR, SPINK1, TTLL3 및 ZNF43로 구성된 유전자 세트로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및
    상기 측정된 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 방광암 환자의 예후를 진단하기 위한 정보제공방법.
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