ES2828923T3 - Prueba de metilación de ADN para detectar cáncer de próstata - Google Patents

Abstract

Método de determinación de cáncer de próstata de alto riesgo en un individuo, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 6 y calcular una puntuación de índice de metilación normalizado (IMN), en el que la presencia de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas y la puntuación de IMN calculada indica un cáncer de próstata de alto riesgo.

Description

DESCRIPCIÓN

Prueba de metilación de ADN para detectar cáncer de próstata

Campo técnico

La invención se refiere a la detección de un biomarcador en una muestra biológica para someter a prueba la presencia de cáncer de próstata. Específicamente, la invención se refiere a la detección de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica para distinguir la presencia de cáncer de próstata agresivo de cáncer de próstata no agresivo o ausencia de cáncer.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna no cutánea más habitual en hombres en el mundo occidental. Se estima que se diagnosticaron 1,1 millones de nuevos casos en 2012, lo que representa el 15% de todos los cánceres masculinos en todo el mundo. Irlanda está experimentando actualmente una de las mayores incidencias de CaP en Europa, con aproximadamente 3.000 nuevos casos diagnosticados al año, lo que representa el 30% de todos los cánceres invasivos en hombres. Con una población occidental que envejece y la difusión de la cultura occidental (en particular, la dieta), se predice que la incidencia mundial aumentará de manera espectacular; el Registro Nacional de Cáncer predice que la incidencia en Irlanda aumentará entre el 104-288% para 2040.

A menudo se dice que “la mayoría de los hombres mueren con y no debido a su cáncer de próstata”. Esto se explica por el hecho de que la mayoría de los tumores de próstata tienen una trayectoria natural lenta y larga, presentando una escasa probabilidad de manifestación clínica y se consideran por naturaleza de crecimiento lento; las tasas de supervivencia a los 10 años para CaP son cercanas al 100%. Sin embargo, una parte de los tumores de próstata son muy agresivos y están asociados con la forma letal de la enfermedad. Aunque el examen del antígeno prostático específico (PSA, por sus siglas en inglés) y las mejoras en los tratamientos han reducido la mortalidad por CaP, esta enfermedad representó aproximadamente 307.000 muertes en 2012, lo que la convierte en la quinta causa principal de muerte relacionada con cáncer masculino en todo el mundo. La identificación de correlaciones moleculares para discernir entre tumores agresivos y de crecimiento lento en un estadio temprano (mientras es potencialmente curable) es una de las mayores necesidades clínicas insatisfechas en este campo. Esto se volverá aún más urgente a medida que aumente el diferencial entre el número total de casos de CaP diagnosticados y el número de casos de CaP letales.

La detección y el diagnóstico precoces de CaP implica una combinación de un análisis de sangre de PSA, un tacto rectal (TR) y un examen histológico de cilindros tisulares obtenidos mediante biopsia transrectal ecodirigida (BTE), respectivamente. Varios problemas importantes confunden la detección precoz del CaP. Se estima que se realizan entre 25 y 45 millones de pruebas de PSA en todo el mundo cada año. Las pruebas de PSA generalizadas han aumentado significativamente la incidencia de CaP y han conducido a un tratamiento excesivo de la enfermedad de bajo riesgo con escasa probabilidad de manifestación clínica. Otro problema del PSA es su escasa especificidad tumoral; su alta tasa de falsos positivos significa que dos tercios de los hombres que se someten a una biopsia BTE invasiva no tienen un tumor diagnosticado. Se estima que se realizan 10 millones de biopsias de próstata en todo el mundo/año. Las biopsias BTE innecesarias crean una enorme carga para nuestro sistema de atención sanitaria y provocan ansiedad, traumatismos y comorbilidades significativas en los pacientes. Finalmente, las biopsias BTE son biopsias por punción que toman muestras de < el 5% de la próstata y, por tanto, pueden pasar por alto focos tumorales o, de hecho, no detectar tumores agresivos de alto grado. Los estudios que abordan la carga económica del cáncer en la UE han estimado los costes del diagnóstico y tratamiento del CaP durante los próximos 20 años por cada 100.000 hombres en 30.284.000 € ( población no examinada) y 60.695.000 € (población examinada), 23.669.000 € de los cuales pueden atribuirse a la sobredetección de cáncer.

Actualmente, no hay diagnósticos moleculares disponibles comercialmente para el CaP en la práctica clínica generalizada. Progensa® (Gen-Probe) es una un análisis de orina de la expresión del gen PCA3 realizado después del TR, con aprobación de la FDA para su uso en hombres que han tenido > 1 biopsias negativas previas y para los que se recomendaría una biopsia repetida basándose en la norma asistencial actual. El análisis se usa para orientar la decisión de realizar una biopsia repetida únicamente. Su valor pronóstico es objeto de debate y están realizándose esfuerzos de investigación que lo combinan con el transcrito de fusión TMPRSS2-ERG en un intento de abordar esto.

Prolaris® (Myriad Genetics) y el ensayo de cáncer de próstata oncotypeDX® (Genomic Health) son dos ejemplos de firmas de expresión génica de pronóstico (46 genes y 17 genes, respectivamente) que se analizan en tejidos de biopsia para ayudar a predecir la agresividad del CaP junto con otros parámetros clínicos (puntuación de Gleason, pSa ). Ambas pruebas proporcionan una evaluación de riesgos más individualizada de la biología subyacente del tumor del paciente y, por tanto, tienen como objetivo orientar la decisión entre la vigilancia activa y el tratamiento radical en hombres con diagnóstico de CaP.

El producto ConfirmMDx™ de MDxHealth es un ensayo basado en PCR, que mide la metilación de un panel de 3 genes (GSTP1, RARfi, APC) en cilindros tisulares obtenidos mediante biopsia. Está posicionado para distinguir a los pacientes con una biopsia de próstata verdadera negativa de aquellos con cáncer oculto y de manera similar a Progensa®, se usa para orientar la decisión de realizar una biopsia repetida. Este mismo panel de 3 genes (ProCaM™) también se ha investigado como análisis de orina para predecir los resultados de la biopsia de CaP, aunque estos estudios no tenían el poder estadístico adecuado.

Los documentos EP1918710, WO2013041731, EP2213749, Tugcu et al. (European Urology Supplements, vol. 6(3), pág. 191 (2007)) y US 2014/274767 describen marcadores de metilación y diferentes conjuntos de marcadores de metilación asociados con cáncer de próstata agresivo. Los documentos e P1918710, WO2013041731 y EP2213749 describen todos contenido similar sobre el uso de los biomarcadores GSTP1, APC y PTGS2; mientras que Tugcu et al. describen el uso de los biomarcadores IGFBP3 y GSTP1; y el documento US 2014/274767 describe el uso de los biomarcadores GSTP1, IGFBP3, APC y PTGS2; todos en la acción de predecir la recidiva o agresividad del cáncer de próstata.

Es un objeto de la presente invención superar al menos uno de los problemas mencionados anteriormente.

Declaraciones de la invención

En contraste con estas tecnologías de la técnica anterior, la prueba presentada en el presente documento (denominada prueba epigenética de cáncer de próstata en orina o epiCaPture, por sus siglas en inglés) es un ejemplo de una “primera en el campo” para el diagnóstico en orina de CaP de alto riesgo potencialmente mortal. El panel de genes abarca múltiples rutas desreguladas en el CaP, lo que es necesario para abordar la heterogeneidad de la enfermedad. Estas rutas incluyen la desintoxicación intracelular, el eje IGF, el eje Wnt y la inflamación. La prueba que se presenta en el presente documento aborda las necesidades clínicas no satisfechas que confunden la detección precoz del CaP. La prueba es una prueba de metilación de ADN no invasiva que se realiza usando orina o sedimento celular de orina. Comprende un panel de al menos 6 genes y un gen de control interno. La prueba descrita en el presente documento ofrece un potencial comercial significativo como una biopsia líquida para la detección precoz no invasiva de CaP de alto riesgo, potencialmente mortal. Los datos muestran que la prueba ofrece las ventajas únicas de i) una mejor especificidad tumoral que el PSA, y ii) la identificación selectiva del CaP de alto riesgo.

Según la invención, se proporciona, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, un método de determinación del riesgo de cáncer de próstata agresivo en un individuo al que se le ha diagnosticado cáncer de próstata, que comprende una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO a 1 a 6, y calcular una puntuación de índice de metilación normalizado (IMN), y correlacionar la presencia de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas y la puntuación de índice de metilación normalizado (IMN) calculada con el riesgo de cáncer de próstata agresivo. Las secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 16 corresponden a los genes GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6, respectivamente, y que correlacionan la presencia de la(s) secuencia(s) de ADN reguladora(s) metilada(s) de estos genes con un riesgo aumentado de cáncer de próstata agresivo. La presencia de la secuencia de ADN reguladora metilada puede detectarse directamente sometiendo a ensayo cuantitativamente para detectar la metilación de las secuencias reguladoras de ADN localizadas adyacentes al/a los gen(es) asociado(s).

En una realización, el método comprende además la etapa de someter a prueba para detectar la presencia del gen PSA además de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas correspondientes a los genes seleccionados del grupo que comprende GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, P tGs -2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6, en el que la presencia de PSA en combinación con la detección positiva de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas correspondientes a los genes seleccionados del grupo que comprende GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, m Tm R8, F3, CDH8 y GALNTL6, se correlaciona con un riesgo aumentado de cáncer de próstata agresivo en comparación con un individuo con cáncer de próstata que es positivo para la detección de PSA pero negativo para la detección de la al menos una secuencia de a Dn reguladora metilada.

En una realización preferida, el método implica someter a ensayo la metilación de una secuencia reguladora de ADN específica para el o cada gen seleccionado del grupo que comprende GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6. Preferiblemente, la secuencia reguladora de ADN es una o ambas SEQ ID NO 1 ó 3, que son específicas para los biomarcadores GSTP1 e IGFBP3, respectivamente. De manera específica, la secuencia reguladora de ADN es una o más seleccionadas de las SEQ ID n O: 1 a 16, y es específica para los biomarcadores seleccionados de GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6, respectivamente. De manera preferible, la secuencia reguladora de ADN sometida a ensayo son todas las SEQ ID NO: 1 a 16, y son específicas para los biomarcadores GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6, respectivamente. De manera ideal, la secuencia reguladora de ADN sometida a ensayo son todas las SEQ ID NO: 1 a 6, y son específicas para los biomarcadores GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC y PTGS-2, respectivamente. De manera preferible, someter a ensayo para detectar la metilación de la secuencia reguladora de ADN específica para el o cada biomarcador se combina con el ensayo de PSA (control interno, SEQ ID NO 18).

En una realización, el método comprende someter a ensayo al menos cuatro secuencias reguladoras de ADN específicas para sus genes correspondientes, al menos tres secuencias reguladoras de ADN seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, o variantes de las mismas, y al menos una seleccionada del grupo que comprende: SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 18. Preferiblemente, tanto SEQ ID NO 17 como SEQ ID NO 18 se determinan en el método. De esta manera, el método de la invención emplea al menos tres secuencias de ADN reguladoras “positivas” (es decir, una secuencia de ADN reguladora asociada con la presencia del cáncer) y al menos un biomarcador de “control” (es decir, un biomarcador asociado con ADN derivado de próstata). De manera ideal, las secuencias de ADN reguladoras “positivas” se seleccionan del grupo que comprende las SEQ ID NO 1 a 6.

Los dos controles pueden usarse en el método:

1) ACTB (SEQ ID NO 17): ACTB se mide mediante PCR cuantitativa (qPCR) y verifica y cuantifica la presencia de ADN modificado con bisulfito en cada muestra de prueba. La cantidad de ACTB se usa para calcular una puntuación de epiCaPture (una puntuación derivada del método de la invención). La cantidad de cada gen en el método debe normalizarse en relación con la cantidad de ADN modificado con bisulfito de entrada en cada muestra de prueba.

2) KLK3 (SEQ ID NO 18). La expresión del gen KLK3 (el gen que codifica para PSA, antígeno prostático específico) se mide mediante RT-PCR cuantitativa y se usa como control positivo para confirmar la presencia de ácidos nucleicos derivados de próstata en la muestra de prueba. Esto es importante de llevar a cabo, con el fin de demostrar que una muestra de prueba que parece negativa para el cáncer de próstata según se determina mediante el método de la invención, es de hecho verdaderamente negativa y no es simplemente una virtud de la ausencia de material derivado de próstata presente en la muestra biológica. La expresión del gen KLK3 se mide usando un ensayo mediante qPCR disponible comercialmente, tal como Integrated DNA Technologies (ID de ensayo Hs.PT.58.38546086).

En una realización, el método comprende someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO a 1 a 16, y correlacionar la presencia o ausencia de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas con el riesgo de cáncer de próstata agresivo.

En una realización, el método comprende someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO a 1 a 12 y 14, y correlacionar la presencia o ausencia de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas con el riesgo de cáncer de próstata agresivo.

En una realización, el método comprende una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de una secuencia de ADN reguladora metilada de al menos tres secuencias seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, en el que las secuencias reguladoras de ADN son específicas para los biomarcadores (genes) GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MtMR8, F3, CDH8 y GALNTL6. En una realización preferida, el método comprende una etapa de someter a ensayo una muestra biológica para detectar tres, cuatro, cinco o seis secuencias de ADN reguladoras seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, en el que las secuencias de ADN reguladoras son específicas para los biomarcadores (genes) GSTP1, SFRP2, iGf BP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6. En una realización particularmente preferida de la invención, el método comprende una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por el grupo que comprende, o que consiste esencialmente en, las SEQ ID NO 1 a 6, en el que las secuencias de a Dn reguladoras son específicas para los biomarcadores (genes) GSTP1, SFRP2, IGFBP3, iGf BP7, APC y PTGS-2. Preferiblemente, someter a ensayo para detectar la metilación de las secuencias de ADN reguladoras, en el que las secuencias de ADN reguladoras son específicas para los biomarcadores (genes) GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, se combina con el ensayo para detectar PSA.

Cuando se encuentra que un paciente es positivo para las secuencias de ADN reguladoras metiladas de las SEQ ID NO 1 a 6, esto se correlaciona con una identificación positiva de cáncer de próstata con una especificidad del 97,92% y una tasa de falsos positivos de 0,04 frente a una especificidad del 21% y una tasa de falsos positivos de 0,79 usando la detección de PSA (aplicando un umbral de 4 ng/ml).

Cuando se encuentra que un paciente es positivo para las seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6, esto se correlaciona con una identificación positiva de cáncer de próstata agresivo (de alto riesgo) con una sensibilidad del 79% y una especificidad del 82%. La combinación del resultado del ensayo de sólo dos de estas secuencias de ADN reguladoras metiladas, a saber, SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3 (correspondientes a los genes GSTP1 e IGFBP3, respectivamente) en el presente análisis se correlacionó con una detección positiva de cáncer de próstata agresivo (de alto riesgo o metastásico) con una puntuación de sensibilidad del 82% y una puntuación de especificidad del 82%.

En una realización preferida de la invención, el método comprende una etapa de someter a ensayo una muestra biológica del individuo para detectar la presencia de secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por SEQ ID NO 1 (GSTP1) y SEQ ID NO 3 (IGFBP3), en combinación con dos o más secuencias de ADN reguladoras metiladas de genes seleccionados del grupo que comprende: SEQ ID NO 2 (SFRP2), SEQ ID NO 4 (IGFBP7), SEQ ID NO 5 (APC) y SEQ ID NO 6 (PTGS2). El método también puede comprender someter a ensayo una muestra biológica del individuo para detectar la presencia de secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por SEQ ID NO 1 (GSTP1) y SEQ ID NO 3 (IGFBP3), opcionalmente en combinación con una o más secuencias de ADN reguladoras metiladas de genes seleccionados del grupo que comprende: SEQ ID NO 2 (SFRP2), SEQ ID NO 4 (IGFBP7), SEQ ID NO 5 (APC), SEQ ID NO 6 (PTGS2), SEQ ID NO 7 (LXN), SEQ ID NO 8 (MAGPIE-1B), SEQ ID NO 9 (DNAH10), SEQ ID NO 10 (ZMIZ1), SEQ ID NO 11 (CENPV) y SEQ ID NO 12 (OR2L13). El método también puede comprender someter a ensayo una muestra biológica del individuo para detectar la presencia de secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por SEQ ID NO 1 (GSTP1) y SeQ ID NO 3 (I^g F^b P3), opcionalmente en combinación con una o más secuencias de ADN reguladoras metiladas de genes seleccionados del grupo que comprende: SEQ ID NO 2 (SFRP2), SEQ ID NO 4 (IGFBP7), SEQ ID NO 5 (APC) y SEQ ID NO 6 (PTGS2), SEQ ID NO 7 (LXN), SEQ ID NO 8 (MAGPIE-1B), SEQ ID NO 9 (DNAH10), SEQ ID NO 10 (ZMIZ1), SEQ ID NO 11 (CENPV) y SEQ ID NO 12 (OR2L13), SEQ ID NO 13 (MTMR8), SEQ ID NO 14 (F3), SEQ ID NO 15 (CDH8) y SEQ ID NO 16 (GALNTL6), o variantes del mismo.

El método también puede comprender someter a ensayo una muestra biológica del individuo para detectar la presencia de secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por SEQ ID NO 1 (GSTP1) y SeQ ID NO 3 (IGFBP3), opcionalmente en combinación con una o más secuencias de ADN reguladoras metiladas de genes seleccionados del grupo que comprende: SEQ ID NO 2 (SFRP2), SEQ ID NO 4 (IGFBP7), SEQ ID NO 5 (APC) y SEQ ID NO 6 (PTGS2), SEQ ID NO 7 (LXN), SEQ ID NO 8 (MAGPIE-1B), SEQ ID NO 9 (DNAH10), SEQ ID NO 10 (ZMIZ1), SEQ ID NO 11 (CENPV) y SEQ ID NO 12 (OR2L13) y SEQ ID NO 14 (F3).

Preferiblemente, la muestra biológica se somete a ensayo para detectar la presencia de PSA en combinación con las secuencias de ADN reguladoras metiladas de una cualquiera o todas las SEQ ID NO 1 a 6. Preferiblemente, la muestra biológica se somete a ensayo para detectar la presencia de PSA en combinación con las secuencias de ADN reguladoras metiladas de una cualquiera o todas las SEQ ID NO 7 a 12. Preferiblemente, la muestra biológica se somete a ensayo para detectar la presencia de PSA en combinación con las secuencias de ADN reguladoras metiladas de una cualquiera o todas las SEQ ID NO 7 a 12 y 14. Preferiblemente, la muestra biológica se somete a ensayo para detectar la presencia de PSA en combinación con las secuencias de ADN reguladoras metiladas de una cualquiera o todas las SEQ ID NO 13 a 16.

La invención también se refiere a un kit para evaluar el estado del cáncer de próstata en un individuo, que comprende componentes para detectar y/o medir el nivel de una secuencia de ADN reguladora metilada de al menos cuatro seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 6.

El kit comprende preferiblemente un par de cebadores de oligonucleótidos directo e inverso (SEQ ID NO 22 a 55) diseñados para hibridarse específicamente con secuencias de ADN hipermetiladas modificadas con bisulfito en las regiones reguladoras de cada gen específico definidas por las SEQ ID NO 1 a 6; una sonda de oligonucleótidos marcada de manera fluorescente diseñada para hibridarse específicamente con secuencias de ADN hipermetiladas modificadas con bisulfito en la región reguladora de cada gen específico (SEQ ID NO 56 a 72), un conjunto de cebadores de oligonucleótidos directo e inverso y una sonda marcada de manera fluorescente para hibridarse específicamente con ADN modificado con bisulfito contenido como parte del gen ACTB humano, independientemente de los patrones de metilación de ADN de este gen (control positivo 1), un ensayo de qRT-PCR para el gen KLK3 (control positivo 2) para controlar la presencia de ácidos nucleicos derivados de próstata en la muestra biológica, y fragmentos de un gen sintético gBlock® para la construcción de curvas patrón (sEq ID NO 19, 20 ó 21), necesarias para la cuantificación de los niveles de metilación en secuencias de ADN individuales contenidas dentro del panel.

Tal como se indicó anteriormente, los métodos, ensayos y kits de la invención emplean biomarcadores (secuencias de ADN reguladoras metiladas de genes específicos u oligonucleótidos específicos para esas secuencias de ADN reguladoras de esos genes) como un medio para evaluar el riesgo de un cáncer de próstata agresivo o metastásico en un individuo. En una realización preferida de la invención, los métodos, ensayos y kits pueden emplearse como una herramienta de examen clínico para ayudar en la identificación de individuos con una forma agresiva de o un cáncer de próstata metastásico de alto riesgo, especialmente individuos sintomáticos, que deben someterse a investigaciones más invasivas, tales como una biopsia de próstata. A este respecto, debe tenerse en cuenta que muchos pacientes que presentan síntomas de cáncer de próstata (es decir, necesidad de orinar con frecuencia, dificultad para comenzar a orinar, flujo de orina débil o interrumpido, dolor/ardor al orinar, sangre en la orina, etc.) puede resultar negativos para el cáncer de próstata, pero aun así tener que someterse a una biopsia de próstata para llegar a ese diagnóstico. A este respecto, la presente invención proporciona una herramienta útil para la toma de decisiones clínicas que puede ayudar a un médico clínico a identificar aquellos pacientes sintomáticos que corren el mayor riesgo de tener cáncer, reduciendo de ese modo potencialmente el número de pacientes que deben someterse a una biopsia de próstata innecesariamente.

Por tanto, en una realización, existe un método de determinación del estado del cáncer de próstata en un individuo, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica del individuo para detectar una combinación de secuencias reguladoras de ADN metiladas seleccionadas de las SEQ ID NO: 1 a 16, que son las secuencias reguladoras de ADN GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13, MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6, respectivamente, eligiéndose la combinación de secuencias reguladoras de ADN metiladas de tal manera que la detección de al menos una o más de las secuencias reguladoras de ADN metiladas en el individuo se correlacione con un riesgo de al menos el 50% de que el individuo sea positivo para cáncer de próstata agresivo o metastásico de alto riesgo. Normalmente, la combinación de secuencias reguladoras de ADN metiladas se elige de tal manera que la detección de al menos una o más de las secuencias reguladoras de ADN metiladas en el individuo se correlacione con un riesgo de al menos el 60% de que el individuo sea positivo para cáncer de próstata agresivo o metastásico de alto riesgo. De manera adecuada, la combinación de secuencias reguladoras de ADN metiladas se elige de tal manera que la detección de una o más de las secuencias reguladoras de ADN metiladas en el individuo se correlacione con un riesgo de al menos el 70% de que el individuo sea positivo para cáncer de próstata agresivo o metastásico de alto riesgo. De manera ideal, la combinación de secuencias reguladoras de ADN metiladas se elige de tal manera que la detección de una o más de las secuencias reguladoras de ADN metiladas en el individuo se correlacione con un riesgo de al menos el 80% de que el individuo sea positivo para cáncer de próstata agresivo o metastásico de alto riesgo. Preferiblemente, la detección de una o más secuencias reguladoras de ADN metiladas se combina con PSA.

Normalmente, la combinación comprenderá al menos una secuencia reguladora de ADN metilada, al menos dos secuencias reguladoras de ADN metiladas, al menos tres secuencias reguladoras de ADN metiladas, preferiblemente al menos cuatro secuencias reguladoras de ADN metiladas, más preferible serán al menos cinco secuencias reguladoras de ADN metiladas, más preferiblemente todavía al menos seis secuencias reguladoras de ADN metiladas, y de manera ideal entre al menos siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis secuencias reguladoras de ADN metiladas. Preferiblemente, las al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis secuencias reguladoras de ADN metiladas seleccionadas se combinan con PSA. Preferiblemente, las secuencias reguladoras de ADN metiladas se seleccionan de las SEQ ID NO: 1 a 16, o SEQ ID NO 1 a 12 y 14.

Normalmente, el líquido biológico es orina o un derivado de orina después de centrifugación o filtración, tal como sedimento celular de orina.

En un aspecto de la invención, se proporciona, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, un método de determinación del riesgo de cáncer de próstata agresivo en un individuo al que se le ha diagnosticado cáncer de próstata, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 6, y calcular una puntuación de índice de metilación normalizado (IMN) y correlacionar la presencia o ausencia de la secuencia de ADN reguladora metilada con cáncer de próstata agresivo.

En una realización, la detección de al menos tres, cuatro, cinco o seis secuencias de ADN reguladoras metiladas del grupo que comprende las SEQ ID NO 1 a 6, se correlaciona con la presencia de cáncer de próstata agresivo.

Preferiblemente, la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6, y que tienen una sensibilidad de al menos el 80% se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, el método comprende además detectar la presencia de PSA en la muestra biológica.

En una realización, la muestra es orina o un derivado de orina del individuo.

En una realización, se proporciona un método de identificación de un cáncer de próstata agresivo en un individuo, comprendiendo el método la etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de una secuencia de ADN reguladora metilada seleccionada del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 6, y al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO 17 y 18, y calcular una puntuación de índice de metilación normalizado (IMN), en el que la detección de al menos cuatro de las secuencias de ADN reguladoras metiladas de las SEQ ID NO 1 a 6, y una secuencia de las SEQ ID NO 17 y 18 en una muestra y la puntuación de IMN calculada es indicativa de la presencia de un cáncer de próstata agresivo, y en el que la sensibilidad del ensayo para detectar las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas de las SEQ ID NO 1 a 6 es de al menos el 80%.

En una realización, la detección de al menos seis secuencias reguladoras de ADN metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 12 y 14 se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo, con alto riesgo de metástasis. Preferiblemente, la detección de al menos seis secuencias reguladoras de ADN metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 12 y 14, y que tiene una sensibilidad de al menos el 80%, se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, la al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO 17 y 18 es la SEQ ID NO: 18, antígeno prostático específico (PSA).

Preferiblemente, la detección de al menos seis secuencias reguladoras de ADN metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6, y que tienen una sensibilidad de al menos el 80% se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, se proporciona un kit para detectar la presencia de cáncer de próstata en una muestra de un individuo, comprendiendo el kit un oligonucleótido de control definido por SEQ ID NO 19, 20 ó 21, o una variante de las mismas, y un conjunto de oligonucleótidos para detectar las SEQ ID NO 1 a 6, en elc que la detección de al menos cuatro secuencias de SEQ ID NO 1 a 6 en la muestra es indicativa de la presencia de cáncer de próstata, y en el que la sensibilidad del ensayo para detectar las al menos cuatro secuencias de las SEQ ID NO 1 a 6 es de al menos el 80%.

En una realización, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, el kit comprende además un oligonucleótido para detectar la presencia de PSA.

En una realización, el conjunto de oligonucleótidos se define mediante las SEQ ID NO 22 a 72.

En una realización, el kit comprende además un soporte que tiene al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo de las SEQ ID NO 1 a 16 anclado en el mismo.

En una realización, el kit comprende un soporte que tiene tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis oligonucleótidos anclados en el mismo seleccionados de las SEQ ID NO 1 a 16.

En una realización, el kit comprende un soporte que tiene tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece oligonucleótidos anclados en el mismo seleccionados de las SEQ ID NO 1 a 12 y 14.

En una realización, existe un método de determinación del riesgo de cáncer de próstata agresivo en un individuo, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos una secuencia de ADN reguladora metilada seleccionada del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, o variantes de la misma, y correlacionar la presencia o ausencia de la secuencia de ADN reguladora metilada con cáncer de próstata agresivo.

Preferiblemente, la detección de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 3, o variantes de las mismas, junto con al menos una secuencia adicional seleccionada de las SEQ ID NO 2, 4, 5 y 6, o variantes de las mismas, se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, la detección de al menos cuatro, cinco o seis secuencias de ADN reguladoras metiladas del grupo que comprende las SEQ ID NO 1 a 16, o variantes de las mismas, se correlaciona con la presencia de cáncer de próstata agresivo.

Preferiblemente, la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6, o variantes de las mismas, y que tienen una sensibilidad de al menos el 80% se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, existe un método de detección de la presencia de cáncer de próstata en un individuo, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos una secuencia de ADN reguladora metilada seleccionada del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, o variantes de las mismas, y correlacionar la presencia o ausencia de la secuencia de ADN reguladora metilada con un marcador de abundancia de referencia indicativo de cáncer de próstata.

En una realización, existe un método de determinación de si un individuo requiere una biopsia transrectal invasiva para confirmar el diagnóstico de cáncer de próstata mediante la revisión histológica de una muestra de biopsia, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos una secuencia de ADN reguladora metilada seleccionada del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 16, o variantes de las mismas, y en el que la presencia de la secuencia de ADN reguladora metilada determina que el individuo requiere una biopsia transrectal invasiva para confirmar el diagnóstico de cáncer de próstata mediante la revisión histológica de una muestra de biopsia.

En una realización, la muestra biológica es orina o un derivado de orina del individuo.

En una realización, el método comprende la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 12 y 14 se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo. Preferiblemente, la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 12 y 14, y que tienen una sensibilidad de al menos el 80%, se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, el ensayo comprende la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 12 y 14, y que tienen una sensibilidad de al menos el 80%, se correlaciona con la presencia de un cáncer de próstata agresivo.

En una realización, los métodos y ensayos descritos anteriormente comprenden además la etapa de aplicar un umbral de IMN de 0,73 para discriminar muestras positivas de biopsia de muestras negativas de biopsia. En una realización, los métodos y ensayos descritos anteriormente comprenden además la etapa de aplicar un umbral de IMN de 1,25 para detectar cáncer de próstata de alto riesgo o alto grado (agresivo) a partir de las muestras que están sometiéndose a ensayo. La ecuación de IMN normaliza la cantidad de ADN modificado con bisulfito de entrada presente en la muestra y calcula la proporción de la secuencia diana que está metilada en relación con una secuencia de ADN completamente metilada al 100%.

En esta memoria descriptiva, el término “muestra biológica” o “ líquido biológico” puede ser una muestra obtenida de un individuo tal como, por ejemplo, orina o sedimento celular de orina, sangre o una muestra de tejido de próstata de una biopsia o prostatectomía radical. En muchos casos, el individuo será una persona sospechosa de tener cáncer de próstata, o predispuesta a desarrollar cáncer de próstata según se determina mediante otros rasgos fenotípicos, genotípicos o hereditarios.

En esta memoria descriptiva, el término “estado del cáncer de próstata” cuando se usa con referencia a un individuo se refiere principalmente al riesgo de que el individuo tenga el cáncer. Dependiendo del número de biomarcadores detectados en el individuo, el ensayo y los métodos de la invención ayudarán al médico clínico a determinar el riesgo de que el individuo sea positivo para cáncer de próstata. Por tanto, en una realización, los métodos, ensayos y kits de la invención proporcionan un medio para examinar pacientes masculinos para identificar aquellos pacientes que deben someterse a procedimientos de investigación adicionales, tales como una biopsia. Sin embargo, el término también abarca la evaluación de pronóstico del cáncer, la identificación de la predisposición a desarrollar el cáncer, la estadificación del cáncer y la evaluación o monitorización del avance del cáncer en el individuo. Esta última evaluación se emplea normalmente como un medio para monitorizar la efectividad de un tratamiento para el cáncer.

Una “variante” de una de las SEQ ID NO 1 a 16 se considerará que significa una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90% y de manera ideal una identidad de secuencia de al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia nativa.

La expresión de ARNm del gen KLK3 (control positivo 2 - SEQ ID NO 18) puede medirse mediante cualquier método adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, una transferencia de tipo Northern o detección mediante hibridación con una sonda de oligonucleótidos. Se encuentran disponibles una variedad de ensayos de hibridación que usan una variedad de tecnologías para la hibridación y detección. Por ejemplo, se utiliza un ensayo TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.962.233 y 5.538.848). El ensayo se realiza durante una reacción de PCR. El ensayo TaqMan aprovecha la actividad exonucleasa 5'-3' de la ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD. En la reacción de p Cr se incluye una sonda que consiste en un oligonucleótido con un colorante indicador en 5' (por ejemplo, un colorante fluorescente) y un colorante extintor en 3'. Durante la PCR, si la sonda se une a su diana, la actividad nucleolítica 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el indicador y el colorante extintor. La separación del colorante indicador del colorante extintor da como resultado un aumento de la fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorómetro.

La metilación del ADN puede medirse mediante cualquier método adecuado, tal como PCR cuantitativa específica para metilación (PMID: 10734209).

En otras realizaciones, se usa la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la expresión de ARN en la que el ARN se convierte enzimáticamente en ADN complementario o “ADNc” usando una enzima transcriptasa inversa. El ADNc se usa luego como molde para una reacción de PCR. Los productos de PCR pueden detectarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, electroforesis en gel y tinción con una tinción específica para ADN o hibridación con una sonda marcada. En algunas realizaciones, se utiliza el método de p Cr con transcriptasa inversa cuantitativa con mezclas normalizadas de moldes competitivos descrito en las patentes estadounidenses n.os 5.639.606, 5.643.765 y 5.876.978.

En la memoria descriptiva, el término “cáncer de próstata de alto riesgo”, “enfermedad de alto riesgo” o “cáncer de próstata agresivo” o “cáncer de próstata metastásico” debe entenderse que significa un cáncer de próstata que se clasifica según los criterios de estratificación de riesgo de D'Amico. Los criterios de D'Amico se usan para definir el cáncer de próstata de riesgo bajo, intermedio y alto. Por ejemplo, (i) riesgo bajo: tener un PSA menor de o igual a 10, una puntuación de Gleason menor de o igual a 6, o estar en el estadio clínico T1-2a; (ii) riesgo intermedio: tener un PSA de entre 10 y 20, una puntuación de Gleason de 7 o estar en el estadio clínico T2b; y (iii) riesgo alto: tener un PSA mayor de 20, una puntuación de Gleason igual a o mayor de 8, o estar en el estadio clínico T2c-3a. Los términos de alto riesgo, agresivo y metastásico pueden usarse indistintamente. Los términos de alto riesgo y agresivo describen un cáncer de alto grado tumoral (según la escala de Gleason, >= 8) y una alta probabilidad de metastatizar.

En la memoria descriptiva, el término “gBlock®” debe entenderse que significa una molécula de ADN bicatenario de 125-2000 pb de longitud. En este caso, gBlock® está definido por SEQ ID NO 19 y contiene secuencias para (A) un ACTB de control interno y los genes (B) GSTP1 (C), SFRP2, (D) IGFBP3, (E) IGFBP7, (F) APC y (G) PTGS2. El gBlock® definido por SEQ ID NO: 20 se diseñó para contener las secuencias de nucleótidos de la secuencia de control interno completamente metilada convertida con bisulfito (ACTB) y siete secuencias reguladoras de ADN (LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPVy OR2L13). gBlock® definido por SEQ ID NO 21 se diseñó para contener las secuencias de nucleótidos de la secuencia de control interno completamente metilada convertida con bisulfito (ACTB) y cuatro secuencias reguladoras de ADN (MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6).

Algunos de los usos de la invención incluyen:

• Someter a prueba para detectar la presencia de cáncer de próstata.

• Usarla como prueba de examen novedosa para cualquier hombre en riesgo de tener cáncer de próstata. • Usarla como prueba no invasiva usando orina para determinar qué hombre requiere una biopsia transrectal invasiva para confirmar un diagnóstico de cáncer de próstata mediante la revisión histológica de una muestra de biopsia.

• La prueba puede realizarse con cualquier muestra biológica que albergue ADN prostático, incluyendo plasma/suero sanguíneo, tejido de próstata y lesiones metastásicas, ya sean viscerales u óseas.

Algunas de las ventajas de la invención son:

• Reducir/eliminar biopsias invasivas innecesarias en hombres que no las necesitan;

• Identificar qué hombres necesitan una biopsia de próstata transrectal.

• Aliviar el tratamiento excesivo de la enfermedad de bajo riesgo;

• Informar al médico clínico sobre la biología molecular de la enfermedad; y

• Ayudar a la estratificación del riesgo para la selección de tratamientos/vigilancia activa posteriores.

Breve descripción de las figuras

La invención se entenderá más claramente a partir de la siguiente descripción de una realización de la misma, facilitada únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 ilustra los datos del estudio de viabilidad (n = 156). Resultados en un panel de 156 muestras de orina previas a la biopsia, mostradas según el resultado de la biopsia. Los hombres con biopsia positiva se clasifican adicionalmente en grupos de riesgo bajo (LR, low risk), intermedio (IR, intermedíate risk) y alto (Hr , high risk) usando la puntuación de CAPRA. Cada fila representa un gen, cada columna representa un paciente. La metilación se mide como una variable continua de 0 a 1000 (índice de metilación normalizado, IMN). Los cuadrados negros indican una alta metilación con un índice de metilación normalizado (IMN)> 1, los cuadrados blancos indican IMN = 0 y los tonos de gris indican IMN intermedio.

La figura 2 ilustra los resultados reducidos a resultados categóricos: hombres con metilación de al menos un gen y hombres con un IMN> 1 en cualquier gen.

La figura 3 ilustra las curvas ROC para (A) PSA solo, (B) -(C) usando la invención y (D) la prueba de la invención y PSA> 4 ng/ml, que logran un AUC de 0,54, 0,87 (promedio) y 0,96, respectivamente.

La figura 4 ilustra el valor predictivo positivo de la invención que indica su utilidad para reducir el número de biopsias innecesarias mediante la detección selectiva de CaP agresivo.

La figura 5 ilustra curvas patrón construidas a lo largo de un intervalo de 6 log usando 5 mediciones de qMSP independientes de un fragmento gBlock® que contiene secuencias para (A) control interno, (B) GSTP1 (C), SFRP2, (D) IGFBP3, (E) IGFBP7, (F) APC y (G) PTGS2 (SEQ ID NO 19). Cada ensayo de qMSP tiene una pendiente de -3,3 (+/- 10%) y una R2 > 0,99, lo que indica una eficacia de PCR cercana al 100%.

La figura 6 ilustra gráficos que muestran datos de PCR cuantitativa específica para metilación para las SEQ ID NO 7­ 16 en una cohorte de prostatectomía radical que revelan niveles cuantitativamente mayores de metilación del ADN en tumores agresivos (CP-A) en comparación con tumores significativos (CP-S) y de crecimiento lento (CP-CL) y tejido benigno.

La figura 7 ilustra gráficos que muestran datos estadísticos descriptivos de la cohorte de estudio usada en el análisis mediante epiCaPture con un tamaño de cohorte aumentado de 156 hombres a 283 hombres. Los datos presentados incluyen la cohorte original de pacientes. A) Edad, B) niveles de PSA de los hombres (los bigotes indican los niveles mínimo y máximo y la media se indica mediante una línea horizontal) y datos estadísticos de la cohorte de biopsia positiva usada en el análisis mediante epiCaPture. Los pacientes se estratificaron según C) grupo de riesgo de D'Amico y D) grado tumoral (puntuación de Gleason, GS, Gleason score).

La figura 8 ilustra un mapa de calor de las puntuaciones de IMN mediante epiCaPture para una cohorte aumentada de 283 hombres. Los hombres con biopsia positiva se clasifican adicionalmente mediante la puntuación de Gleason.

Cada fila representa un gen, cada columna representa un paciente. La metilación se mide como una variable continua de 0 a 1000 (índice de metilación normalizado, IMN). Los cuadrados blancos representan la ausencia de metilación (IMN = 0), representando los tonos crecientes de gris y negro cantidades cuantitativamente mayores de metilación para un gen.

La figura 9 es un gráfico que ilustra el rendimiento de epiCaPture frente al predicado en la detección no invasiva de cáncer de próstata de alto riesgo.

La figura 10 son gráficos que ilustran la metilación de GSTP1 detectada en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical (A) una cohorte de 44 hombres estudiados mediante chip de perlas de metilación Infinium HM450k (tabla 11); (B) cohorte de 125 hombres estudiados mediante PCR cuantitativa (tabla 12); y (C) cohorte de 178 hombres extraídos de The Cancer Genome Atlas, para los que están disponibles públicamente chips de perlas de metilación Infinium HM450k (tabla 13). El panel (D) muestra los valores de metilación detectados en las muestras de orina de hombres que se someten a biopsia BTE (n = 283). En todas las cohortes, se detectan niveles de metilación significativamente mayores en la enfermedad de alto riesgo y alto grado.

La figura 11 son gráficos que ilustran la metilación de SFRP2 detectada en A) tejidos de próstata y B) muestras de orina de hombres que se someten a biopsia BTE. En ambas cohortes, se detectan niveles de metilación significativamente mayores en la enfermedad de alto riesgo y alto grado.

La figura 12 son gráficos que ilustran la metilación de IGFBP3 detectada en (A) tejidos de próstata de hombres que se someten a prostatectomía radical (Perry et al, British Journal of Cancer, 2007). Abreviaturas: NIPAG: neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, HB: histológicamente benigna y HPB: hiperplasia prostática benigna. (B) muestras de orina de hombres que se someten a biopsia BTE, n = 283. Tanto en el tejido de próstata como en la orina, se detectan niveles significativamente mayores de metilación en los pacientes con enfermedad de alto riesgo y alto grado.

La figura 13 son gráficos que ilustran la metilación de IGFBP7 detectada en (A) tejidos de próstata de hombres que se someten a prostatectomía radical (Sullivan et al, Journal of Urology, 2012). Abreviaturas: NIPAG: neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, HB: histológicamente benigno y HPB: hiperplasia prostática benigna. (B) muestras de orina de hombres que se someten a biopsia BTE, n = 283. Tanto en el tejido de próstata como en la orina, se detectan niveles significativamente mayores de metilación en los pacientes con enfermedad de alto riesgo y alto grado.

La figura 14 son gráficos que ilustran la metilación de APC detectada en (A) tejidos de próstata de hombres que se someten a prostatectomía radical (Murphy et al, Epigenetic Diagnosis and Therapy, 2015). Abreviaturas: NIPAG: neoplasia intraepitelial prostática de alto grado, TA: tumor asociado benigno. (B) muestras de orina de hombres que se someten a biopsia BTE, n = 283. Tanto en el tejido de próstata como en la orina, se detectan niveles significativamente mayores de metilación en los pacientes con enfermedad de alto riesgo y alto grado.

La figura 15 son gráficos que ilustran datos de respaldo para LXN. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical (tablas 11 a 13) y, en cada caso, es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 16 son gráficos que ilustran datos de respaldo para MAGPIE-1B. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical (tablas 11 a 13) y, en cada caso, es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 17 son gráficos que ilustran datos de respaldo para DNAH10. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical (tablas 11 a 13) y, en cada caso, es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 18 son gráficos que ilustran datos de respaldo para ZMIZ1. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical, y en cada caso es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 19 son gráficos que ilustran datos de respaldo para CENPV. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical, y en cada caso es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 20 son gráficos que ilustran datos de respaldo para OR2L13. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical, y en cada caso es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo.

La figura 21 son gráficos que ilustran datos de respaldo para (A-C) F3. Se midió la metilación del ADN en tres cohortes independientes de muestras de prostatectomía radical, y en cada caso es significativamente mayor en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo en comparación con tejido de próstata benigno y/o cáncer de próstata de bajo riesgo o de crecimiento lento. Se usaron dos metodologías para medir cuantitativamente la metilación del ADN: chip de perlas Infinium HM450k (A y C) y PCR cuantitativa (B). Para simplificar, sólo se muestran los valores de significación para comparaciones con cáncer de próstata agresivo (de alto riesgo)

Descripción detallada

Materiales y métodos

Métodos estadísticos:

La regresión logística es un método convencional para modelar la relación entre una variable binaria, en este caso cáncer de próstata de alto riesgo o de bajo riesgo, y un conjunto de variables continuas o categóricas. Para este análisis, las variables usadas para la predicción consisten en los valores de metilación de genes, así como las variables de edad y PSA del paciente. Matemáticamente esta relación se expresa como

donde pi es la probabilidad de que el paciente de orden n sea de alto riesgo en función de su perfil de metilación y características clínicas, que están representadas por las Xmi. Los coeficientes fim proporcionan el efecto que tiene cada cambio incremental en la metilación, la edad o el PSA sobre las probabilidades logarítmicas de que el paciente tenga un alto riesgo de metástasis en próstata.

Debido al coste de recogida de biomarcadores y al principio general de que los modelos más simples conducen a predicciones más robustas, un objetivo del análisis es elegir el menor número de variables de factor de predicción, las Xm, que producirán el modelo de predicción con mejor rendimiento.

Se ajustaron a los datos una regresión logística LASSO1 (comentada a continuación), junto con una regresión logística convencional que incorpora seis genes. También se ajustaron modelos de regresión logística para cada uno de los genes independientes para la comparación. Se entrenaron todos los modelos usando una validación cruzada repetida de 5 veces con remuestreo con reposición (boostrap resampling). Luego se eligió el valor de punto de corte óptimo para la predicción usando todo el conjunto de datos.

Un problema común con la construcción de un modelo de predicción con todo el conjunto de datos es que el modelo tenderá a sobreajustarse al conjunto de datos actual y luego tendrá un rendimiento inferior cuando se predigan nuevos datos a partir del modelo. En general, los modelos más complejos tenderán a adaptarse a los datos de entrenamiento y no se generalizarán tan bien a los nuevos datos. Por tanto, se prefieren modelos más dispersos.

En un caso ideal, se ajusta un modelo a algunos datos de entrenamiento y luego se estima su rendimiento en un conjunto de prueba independiente. Puede seleccionarse un modelo eligiendo el modelo que mejor rendimiento tenga con el conjunto de datos de prueba que consiste en nuevas observaciones no vistas. Para conjuntos de datos pequeños, no es posible a menudo una única división de los datos en conjuntos de prueba y entrenamiento.

La validación cruzada es un método para realizar múltiples divisiones aleatorias de prueba de entrenamiento de un conjunto de datos. El proceso es el siguiente:

1. Dividir los datos en K partes de igual tamaño (habitualmente se elige K para que sea de entre 5 y 10);

2. Dejar aparte una de las K partes y entrenar el/los modelo(s) en todas las K-1 partes restantes conjuntamente;

3. Someter a prueba el rendimiento del/de los modelo(s) en la parte de los datos que se apartó en la etapa 2; y

4. Repetir iterativamente dejando fuera cada una de las K partes sucesivamente.

Este método proporciona una evaluación más precisa del rendimiento de predicción fuera de la muestra de los modelos que simplemente ajustar el modelo a todo el conjunto de datos. Para tener más en cuenta la incertidumbre en el proceso de validación cruzada, se somete el conjunto de datos a reposición, es decir, se vuelve a muestrear el conjunto de datos completo con reemplazo y se realiza una validación cruzada en cada iteración con reposición. Para el análisis en este caso, se usaron K = 5 y 2000 iteraciones con resposición.

Todos los datos se usan en las etapas de construcción del modelo y evaluación. El proceso de construcción del modelo usado tiene como objetivo mitigar cualquier sesgo optimista. Debido al número relativamente pequeño de casos de alto riesgo, dividir los datos no es una opción eficiente. De manera ideal, debe usarse un conjunto de datos de prueba o de reserva que no se usaron en la etapa de entrenamiento para someter a prueba el rendimiento. Esto debe realizarse en una etapa posterior usando un conjunto de datos de prueba recopilados de manera independiente.

LASSO es un método de regresión penalizado para construir modelos de predicción que mitiga el sobreajuste en un conjunto de datos. LASSO es un método tanto para la selección de modelos como para la estimación. En la regresión logística convencional, se ajustan los parámetros del modelo usando la máxima verosimilitud iterativa. Esta estima los parámetros que mejor se ajustan a los datos y, como tal, pueden sobreajustarse a los datos de entrenamiento. Los métodos de regresión penalizados añaden un término de penalización a la ecuación de estimación que penaliza los valores grandes de los coeficientes. Esta es una forma de contracción que puede producir resultados más robustos. En el caso de LASSO, el término de penalización reduce algunos coeficientes a cero, actuando como una forma de selección de variables.

La fuerza de la penalización está determinada por un parámetro, X. El valor de lambda óptimo se halla ejecutando una iteración de validación cruzada adicional dentro de cada iteración del bucle de validación cruzada externo.

Para la evaluación final del modelo LASSO, se buscaron los modelos elegidos en las iteraciones de remuestreo y validación cruzada y se seleccionaron como modelo final, el modelo que se produce con mayor frecuencia. Las evaluaciones de rendimiento y los parámetros del modelo se basaron luego en las iteraciones en las que se produjo este modelo. Luego se obtuvieron los coeficientes de regresión promediando estas iteraciones.

Muestras

La prueba epiCaPture (método descrito en el presente documento) se realiza con orina o sedimento celular de orina. El sedimento celular de orina se obtiene mediante centrifugación (10.000 * g durante 10 minutos) de una muestra de orina de la primera micción (hasta 50 ml) después de un tacto rectal (TR). El TR consiste en tres compresiones por lóbulo de la glándula prostática. Se aplica suficiente presión a la próstata para deprimir la superficie aproximadamente 1 cm, desde la base del dedo del pie hasta el ápice y desde la línea lateral a la media para cada lóbulo. El ácido nucleico total se extrae del sedimento celular usando un protocolo de extracción convencional basado en membrana de sílice (usando un kit de aislamiento de ácido nucleico total Qiagen o un producto similar disponible comercialmente). El ADN purificado (100 ng) se somete a conversión con bisulfito (usando un kit Epitect de Qiagen o un producto similar disponible comercialmente).

La expresión del gen KLK3 se mide mediante qRT-PCR usando un ensayo de cebador y sonda disponible comercialmente (ID de ensayo Hs.PT.58.38546086 disponible de Integrated DNA Technologies). La expresión positiva del gen KLK3 en relación con un gen de mantenimiento (ACTB) indica la presencia de células prostáticas en el sedimento de orina y la validez de la muestra de orina para el análisis mediante epiCaPture.

Se diseñó una secuencia de ADN de gBlock® sintético de 648 pb (IDT — SEQ ID NO: 19) para contener las secuencias de nucleótidos de la secuencia de control interno completamente metilada convertida con bisulfito (ACTB) y seis secuencias reguladoras de ADN (GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS2):

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Se diseñó una secuencia de ADN de gBlock® sintético de 885 pb (IDT — SEQ ID NO: 20) para contener las secuencias de nucleótidos de la secuencia de control interno completamente metilada convertida con bisulfito (ACTB) y seis secuencias reguladoras de ADN (LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPVy OR2L13):

A A A G GT GG AG G T AGTT AGGGTTT ATTT GT A T ATT G ATTT G A G ATT AGTT G A AT A A A AGTGTATATTTTAAAAATGAGGTTAAGTGTGATTTTGTGGTGTGGAAATGGGTTATT TTGGTTT A ACG GG ATT AGTAGT AGAGCGTCGTTCGTTTTGTTTGTTGTTGGGTTCGG TTGTCGAGGCGGAAAAGTCGTAAGAAATTTGTTTTTGGTTTTTGTAGGCGTTTGGGT T GTTTT ATTT G A G AGTTGCGT AGGGCGGTTT GGCGGT GGTT GTT GTTT AT AT A ATT C G A A AC GTCG AGGTGTT GT G ATTTTC GTTT CGTT A ATTTTTT AGTTTT AGTTTT ATTT G TAAGGTGGGCGGGTTGTTTGTAAATCGGTCGGCGTGGGGTGGGGTCGTATTTTCGG TTGTAGCGGTTAAAGGGTTTCGTCGTCGTTTTCGTTCGGAGGTTGGAGTGTTGTTCG TCGGGTCGTGCGTTCGTTCGGTAGCGGCGTGTATTAGTATTATAAACGTTGGGACGT ATTT GTTTGTTT AGTTTCGT AGGT AGAGGGGTT GCGTTTGGGTTT ACGTTCGCGAT A TTT A G A ATTT ATTCGT ATTT GCG A A G G C G A A A A T ACGTTTTTGTCGGTCGTTT AGTTT TTTGTAGGTGTAAGGGCGGATGTTTTAGCGATTACGGGAGTCGGGTTGGGGAGGTT GGT G G GG G G CG G G GG G AGTTTT A AATTT AGGTTCGTTTAGTT AT AGGCGTTT AGGTT T AG T CG G A AATTGTC G G AG G AC GC GTT GTT G CG A G ATT AGT CGCGGCGTTTTT GGT

AGT AGTGGGCGTGTTTGCGGGTTTAGGAGGGTTTTTTTTTCGCGATCGTCGATT AC G AT G AG AG CG T G A A G A T T T T T T C G A A A G G A A A A

Se diseñó una secuencia de ADN de gBlock® sintético de 643 pb (IDT — SEQ ID NO: 21) para contener las secuencias de nucleótidos de la secuencia de control interno completamente metilada convertida con bisulfito (ACTB) y cuatro secuencias reguladoras de ADN (MTMR8, F3, CDH8 y GALNTL6):

AAAGGGCGGTTTTGGTTTAAATTTTCGTTATTTGATTTTCGGCGAAAGTTTTTATCGC GAT ATTTTGA T CG T A G T CG T 'rr 1 C G T T A A A A A AGGTGGAGGTAGTTAGGGTTTATTT GT ATATTGATTTGAGATTAGTTGAATAAAAGTGT AT AT T T T A AAAA TGAGGTTAAGT

G AC G ATC G AGACGGTGAGGGCGGTT ATCGTTGGGGAGGGAGGTTCGGGTTT AGGTT

1G G A A G J AA A A C G 1G 1G G T T T G T T A T A TCGTCGGTTGTATTGGATTAGGAT1ATTTT TT AT G A AGGTT'rGTTTTGTTAGT ACGTAGT AGGTTTT AGTTTTT ACGTCGTTTCGA AT ATTTCGTAGAAATACGGGGTATGTATAACGAAACGGATTTCGTTTATGTTTTTCGGA GTT AT AGGGTTT GGT G CG G AG ACGTAG G G CG G GC GC GTTGGGTTTT GGGT G I" ICGI A ATTT A A AGTGT AGTTGGT GT A A AC G GGTCGTTTTT ATTTTTCGT AGT CGTCGCGTTT CGGTTCGTCGCGTTTTCGTCGGTATTATGGAGGAAT1TTTGGGATAATCGTTTGTAG TCG G CG ATTG G GAAA

Tabla 1: Se usó gBlock® (SEQ ID NO 19) para construir diluciones en serie duplicadas a lo largo de un intervalo de concentración de molde de 6 log para determinar el rango dinámico y eficiencia de PCR de cada ensayo epiCaPture:

Se realiza una PCR cuantitativa específica para metilación (qMSP), tal como se describió previamente ^3-5. La eficacia de la PCR de cada uno de los ensayos (control interno y 6 dianas) se evaluó rigurosamente realizando 5 réplicas independientes (cada una con 3 réplicas técnicas) a lo largo de un intervalo de concentración de molde de 6 log (figura 5). El ADN tratado con bisulfito se amplifica en reacciones de PCR TaqMan® paralelas realizadas con oligonucleótidos específicos para cada una de las secuencias reguladoras de ADN metiladas diana (SEQ ID NO 1 a 6) y el gen de control endógeno ACTB (SEQ ID NO 17). Las muestras se consideran amplificadas positivamente cuando se detecta un ciclo de umbral comparativo (C^t ) de <50 en al menos dos de cada tres réplicas. Se calculó un índice de metilación normalizado (IMN), tal como se describió previamente ⁶ , para determinar la razón entre la cantidad normalizada de diana metilada y la cantidad normalizada de ACTB en cualquier muestra dada, aplicando la fórmula:

IMN = [(DIANA^muestra/DIANA^MC)/(ACTB^muestra/ACTB^MC)] * 1000 (2)

donde DIANA^muestra es la cantidad de copias completamente metiladas de cada una de las secuencias que se muestrean en cualquier muestra individual, DIANA^{m c} es la cantidad de copias completamente metiladas de cada una de las secuencias que se muestrean en una muestra de ADN humano convertido con bisulfito completamente metilado disponible comercialmente (número de producto Qiagen 59655), ACTB^muestra es la cantidad de moldes modificados con bisulfito en cualquier muestra individual y ACTB ^mc es la cantidad de moldes modificados con bisulfito en el ADN de control universalmente metilado.

Todas las secuencias genómicas de GSTP1, SFRP2, IGFBP3, IGFBP7, APC, PTGS-2, LXN, MAGPIE-1B, DNAH10, ZMIZ1, CENPV, OR2L13 y F3 se obtuvieron del navegador del genoma humano de UCSC (http://genomeeuro.ucsc.edu).

Resultados

Los resultados del estudio con 156 hombres (figuras 3 (A) a 3 (D)) demuestran que la invención puede discriminar de manera no invasiva el CaP de alto riesgo (metastásico) de la enfermedad de bajo riesgo (menos posibilidades de metástasis) y la hiperplasia benigna de la próstata (AUC = 0,86). En esta cohorte, una puntuación alta (IMN> 1) tuvo una especificidad del 100% para el CaP y superó en gran medida al PSA, lo que produjo una especificidad de CaP de sólo el 11,63%.

La tabla 2 son datos relacionados con la cohorte de 156 pacientes sometidos a biopsia BTE. Los criterios de exclusión para la cohorte fueron (1) metástasis en una resonancia magnética y/o una gammagrafía ósea y (2) no posterior a TR.

Detección en orina de cáncer de próstata

Para distinguir de manera no invasiva hombres que tienen cáncer de próstata de aquellos que no lo tienen (o en términos más estrictos, hombres con una biopsia positiva de hombres con una biopsia negativa), la mejor combinación de biomarcadores es GSTP1 usado junto con PSA. Esto se calcula usando un modelo LASSO (tabla 3, figura 3A). Esto logró un valor predictivo positivo (VPP) del 92%, con un valor predictivo negativo (VPN) del 52%, con una sensibilidad y especificidad para el cáncer de próstata del 81% y el 77%, respectivamente. La combinación de seis secuencias reguladoras de ADN metiladas (definidas por las SEQ ID NO 1 a 6) en el método descrito en el presente documento también tiene buen rendimiento en la detección no invasiva del cáncer de próstata: VPP = 92%, VPN = 51%, sensibilidad = 60% y especificidad = 89%.

Detección en orina de cáncer de próstata de alto riesgo

Sin embargo, tal como se afirmó ya, el dilema para la detección del cáncer de próstata no está en la capacidad para detectar todo el espectro de la enfermedad, para lo cual ya lo está haciendo el PSA adecuadamente, sino en detectar específicamente la enfermedad de alto riesgo con alta probabilidad de metastatizar. Para predecir el cáncer de próstata de alto riesgo según los criterios de D'Amico2, LASSO, que es el método de selección usado en este caso, determina que GSTP1 e IGFBP3 son los que mejor se ajustan (tabla 4, figura 3B). Esta combinación proporciona un VPP del 56% y un VPN del 94% para la enfermedad de alto riesgo, con una sensibilidad y una especificidad ambas del 82%. La combinación de los 6 genes tiene un rendimiento algo peor, suministrando una sensibilidad del 52% y una especificidad del 92%, para enfermedades de alto riesgo. El método descrito en el presente documento (y sus derivaciones) supera a la práctica clínica actual (PSA), que se halló en esta cohorte que tenía una sensibilidad del 100% y una especificidad de sólo el 21% (en el punto de corte de 4 ng/ml) para enfermedad de alto riesgo.

Detección en orina de cáncer de próstata de alto grado.

El sistema de clasificación de Gleason es el indicador de pronóstico más fuerte para el cáncer de próstata. Es un sistema de clasificación histológico basado en el patrón glandular del tumor. La puntuación de Gleason se obtiene sumando los grados primarios y secundarios. La presencia de grado 4 de Gleason o mayor, o una puntuación de Gleason de 7 o mayor predice un mal pronóstico.

Para predecir tumores con una puntuación de Gleason alta (>= 8), la combinación de los 6 biomarcadores descritos anteriormente supera a todos los biomarcadores evaluados individualmente (tabla 5, figura 3C), con un VPP del 48%, un VPN del 96% y un sensibilidad y especificidad del 76% y el 87%, respectivamente. La combinación de los seis marcadores con PSA proporciona cierta mejora de nuevo, con una sensibilidad y especificidad del 86% y el 82%.

Datos complementarios

Se aumentó el tamaño de la cohorte de 156 hombres a 283 hombres.

La tabla 6 son datos relacionados con la cohorte de 283 pacientes sometidos a biopsia BTE. Los criterios de exclusión para la cohorte fueron (1) metástasis en una IRM y/o una gammagrafía ósea y (2) no posterior a TR.

La epiCaPture se realizó en una cohorte de 283 hombres, que consistía en 135 hombres con biopsia positiva y 148 hombres con biopsia negativa. Las características de edad y PSA de la cohorte se presentan en la tabla 6. Aunque el grupo con biopsia positiva era significativamente mayor y tenía una mediana del nivel de PSA significativamente mayor (8,90 frente a 6,05), existe un solapamiento considerable en el intervalo de edades y niveles de PSA para ambos grupos (figuras 7A y 7B). De hecho, la media y la mediana de los niveles de PSA para el grupo con biopsia negativa están por encima del umbral de 4 ng/ml usado ampliamente para indicar la necesidad de biopsia de próstata. La cohorte con biopsia positiva se consideró en términos de estratificación por grupos de riesgo (según los criterios de D'Amico), que engloba el grado tumoral (puntuación de Gleason), el nivel de PSA y el estadio clínico) y la estratificación del grado tumoral (tabla 6, figuras 7C y 7d ).

Se analizó individualmente cada uno del panel de 6 genes en cada paciente, y se generó una puntuación del índice de metilación normalizado (IMN) para cada gen (figura 8). Se estudiaron diferentes enfoques para determinar el método de mejor rendimiento para (1) discriminar la biopsia positiva de la biopsia negativa y (2) detectar selectivamente la enfermedad de alto riesgo y alto grado. Se estudió el rendimiento de genes individuales frente a diferentes combinaciones usando LASSO y modelos matemáticos de árboles. En cada caso, el rendimiento de un umbral de IMN (ecuaciones 3 a 5 a continuación) produjo los mejores índices de rendimiento (poder predictivo positivo y negativo) (tablas 7-9). La ecuación de IMN normaliza la cantidad de ADN modificado con bisulfito de entrada presente en la muestra y calcula la proporción de la secuencia diana que está metilada en relación con una secuencia de ADN completamente metilada al 100%.

IMN = [(DIANA^muestra/DIANA^{M c} )/(ACTB^muestra/ACTB^{M c})] X 1000 ..................(3)

El umbral de IMN para diferenciar la biopsia positiva de la biopsia negativa se determinó como de 0,73:

SUMA DE IMN (POSITIVO): (IMN^{gen 1} + IMN^{gen 2} + IMN^{gen 3} + IMN^{gen 4} + IMN^{gen 5} + IMN^{gen 6})> 0,73........ (4)

Los datos de los 283 hombres muestran que para el panel de 6 genes, el umbral de IMN para detectar enfermedad de alto riesgo/grado alto se determinó como de 1,25 en el panel de 6 genes.

SUMA DE IMN (ALTO RIESGO): (IMN^{gen 1} + IMN^{gen 2} + IMN^{gen 3} + IMN^{gen 4} + IMN^{gen 5} + IMN^{gen 6})> 1,25....(5) Detección de cáncer de próstata de alto grado

Aplicando este modelo (IMN_SUM> 1,25), epiCaPture tiene una sensibilidad comparable para el cáncer de próstata de alto grado (>= puntuación de Gleason 8) en comparación con la prueba de predicado, PSA (tabla 9, figura 9). En esta cohorte de hombres, epiCaPture detectó el 84,85% de los hombres con enfermedad de alto grado, en comparación con el 90,91% detectado por el PSA. La especificidad y el valor predictivo negativo (tabla 9, tabla 10) de epiCaPture son bastantes superiores a los de PSA. Casi el 98% de los hombres con una biopsia negativa dieron negativo en la prueba epiCaPture. De manera comparable, sólo el 24,44% de los 135 hombres con una biopsia negativa no tenían un p Sa elevado. Esta alta tasa de falsos positivos (76%) de PSA es el motivo por el que tantos hombres se someten a biopsias innecesarias.

Los genes individuales (diana) variaron en su capacidad para discriminar la presencia de cáncer de próstata (biopsia positiva) de la ausencia (biopsia negativa), variando desde una sensibilidad del 33% (gen 4) hasta el 40% (gen 6) (tabla 7) . El aumento del número de marcadores, por ejemplo, los mejores 4 ó 5 o los 6, mejoró la sensibilidad de detección en orina del cáncer de próstata hasta el 45%, el 49% y el 50%, respectivamente.

Sin embargo, la suma de IMN en el panel de genes y la aplicación de un umbral de suma de IMN de > 0,73 mejoró la sensibilidad al 55% de los hombres con cáncer de próstata. Los valores predictivos positivo y negativo para el cáncer de próstata aplicando un umbral de suma de IMN > 0,73 son del 90% y el 65%, respectivamente.

Los genes individuales (diana) variaron en su capacidad para detectar cánceres de próstata de alto riesgo, desde una sensibilidad del 46% (gen 3) hasta el 63% (gen 1) (tabla 8). El aumento del número de marcadores, por ejemplo, los mejores 4 ó 5 o los 6, no mejora notablemente la precisión de la detección del cáncer de próstata de alto riesgo, con respecto a los marcadores individuales, lo que puede atribuirse a la heterogeneidad molecular del cáncer de próstata.

Sin embargo, la suma de IMN en el panel de los mejores 4 o los mejores 5 o la aplicación de un umbral de suma de IMN de 1,25 mejoró la sensibilidad hasta el 80% y el 83%, respectivamente. Los valores predictivo positivo y negativo para el cáncer de próstata de alto riesgo aplicando un umbral de suma de IMN > 1,25 son del 52% y el 96%, respectivamente.

Los genes individuales también variaron en su capacidad para detectar cánceres de próstata de alto grado (puntuación de Gleason >= 8), oscilando desde una sensibilidad del 52% (genes 3 y 6) hasta el 64% (genes 2 y 5) (tabla 9). El aumento del número de marcadores, por ejemplo, los mejores 4 ó 5 o los 6, no mejora notablemente la precisión en la detección del cáncer de próstata de alto grado, con respecto a los marcadores individuales, lo que puede atribuirse a la heterogeneidad molecular del cáncer de próstata.

Sin embargo, la suma del IMN a lo largo del panel de los mejores 4 o los mejores 5 o la aplicación de un umbral de suma de IMN de 1,25 mejoró la sensibilidad hasta el 82% y el 85%, respectivamente. Los valores predictivos positivo y negativo para el cáncer de próstata de alto grado aplicando un umbral de suma de IMN > 1,25 son del 38% y el 98%, respectivamente.

Aplicando este modelo (IMN_SUM> 1,25), epiCaPture tiene una sensibilidad comparable para el cáncer de próstata de alto grado (>= puntuación de Gleason 8) en comparación con la prueba de predicado, PSA (tabla 10, figura 9). En esta cohorte de hombres, epiCaPture detectó el 84,85% de los hombres con enfermedad de alto grado, en comparación con el 90,91% detectado por el PSA. La especificidad y el valor predictivo negativo (tabla 8, tabla 9) de epiCaPture son bastante superiores a los de PSA. Casi el 98% de los hombres con una biopsia negativa dieron negativo en la prueba epiCaPture. De manera comparable, sólo el 24,44% de los 135 hombres con una biopsia negativa no tenían un p Sa elevado. Esta alta tasa de falsos positivos (76%) de PSA es el motivo por el que tantos hombres se someten a biopsias innecesarias.

El análisis cuantitativo de la metilación del ADN en seis loci de genes en tejidos de próstata y muestras de orina indica que los altos niveles de metilación detectados en tejidos tumorales de alto riesgo pueden medirse en la orina como sustituto. Se muestran ejemplos de esto para cinco de los seis paneles de genes, diana 1 (GSTP1; figura 10), diana 2 (SFRP2; figura 11), diana 3 (IGFBP3; figura 12), diana 4 (IGFBP7; figura 13) y diana 5 (a Pc ; figura 14).

El análisis cuantitativo de la metilación del ADN en los siete de los diez loci de genes restantes que se analizaron en los tejidos de la próstata indica que pueden medirse los altos niveles de metilación detectados en tejidos tumorales de alto riesgo. Se analizaron los genes en 3 cohortes independientes de muestras de tejido de próstata y todas muestran patrones de metilación significativa consistentes en el cáncer de próstata agresivo/de alto riesgo. Se muestran ejemplos de esto para la diana 7 (LXN; figura 15), la diana 8 (MAGPIE-1B; figura 16), la diana 9 (DNAH10; figura 17), la diana 10 (ZMIZ1; figura 18), la diana 11 (CENPV; figura 19), la diana 12 (OR2L13; figura 20) y la diana 13 (F3; figura 21). Se proporcionan a continuación los detalles de las tres cohortes diferentes usadas para el estudio relacionado con los genes enumerados anteriormente.

Cohorte A

Se obtuvo tejido de próstata benigno de cistoprostatectomía radical o resección transuretral de la próstata, de hombres sin evidencias clínicas o histopatológicas de cáncer de próstata. Se obtuvieron las lesiones precursoras, atrofia inflamatoria proliferativa (AIP) y neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (NIPAG), (NIPAG) y tumores primarios (de crecimiento lento (CPCL) y agresivo (CPA)) a partir de muestras de prostatectomía radical. El CPCL se definió como enfermedad de Gleason 6, pT2, con un PSA preoperatorio <10 ng/ml y sin evidencias de recidiva bioquímica o clínica (seguimiento de 5 años). El CPA se definió como enfermedad primaria de Gleason > 4, pT3, con evidencias de recidiva bioquímica o clínica. Se obtuvieron las lesiones metastásicas a partir de metástasis viscerales (en hígado o ganglio linfático), obtenidas durante una autopsia rápida. Todas las muestras de pacientes se obtuvieron de manera retrospectiva con la aprobación ética otorgada por las instituciones asociadas: benignas (St. James's Hospital (SJH), Irlanda; Adelaide and Meath Hospital que incorpora el National Children's Hospital (AMNCH), Irlanda); AIP (SJH); NIPAG (AMNCH); CPCL (SJH; Mater Misericordiae (MM), Irlanda; Beaumont Hospital (BH), Irlanda); CPA (SJH; MM; BH); CPM (Universidad de Washington, EE.UU.).

En cada caso, se revisaron portaobjetos con H&E por un patólogo consultor, quien identificó y marcó las áreas diana relevantes. Se cortaron seis secciones en serie de 8 pm de los bloques respectivos incrustados en parafina y fijados con formalina (FFPE, por sus siglas en inglés) y se prepararon en portaobjetos de vidrio con membrana de PEN (Life Technologies) para la microdisección mediante captura láser (MCL). Se tiñó la sexta sección con H&E y se revisó para asegurar un porcentaje constante de células diana. Se realizó MCL para enriquecer los epitelios diana tal como se describió previamente, usando el sistema Arcturus XT (Life Technologies). Se aislaron ADN y ARN total de las tapas de MCL (que albergan tejido microdisecado) en paralelo, usando el microkit de ADN QlAamp (Qiagen) y el kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales RecoverAll (Ambion), respectivamente.

Tabla 11 Datos clínico-patológicos para la cohorte A

Cohorte B

Se usó una cohorte retrospectiva de casos de prostatectomía radical para validar regiones metiladas diferencialmente potencialmente de pronóstico identificadas en la cohorte 1. Todas las muestras de pacientes se obtuvieron de manera retrospectiva con aprobación ética otorgada por las instituciones asociadas: benignas (SJH, AMNCH) y tumorales (SJH, MM y BH). Se asignaron las muestras tumorales como de bajo riesgo (puntuación de Gleason 3+3, pT2; n = 23); significativas (puntuación de Gleason 7, pT2; n = 42); o de alto riesgo (puntuación de Gleason > 4+3, pT3; n = 39), según la revisión histopatológica de muestras de prostatectomía radical. Con propósitos de control, se obtuvieron tejidos de próstata histológicamente benignos (n = 21) a partir de prostatectomía radical o resección transuretral de la próstata. Los focos tumorales y benignos los marcó un histopatólogo consultor (SPF, BL) y se llevó a cabo una macrodisección dirigida con un bisturí en cuatro secciones de 5 pm en serie. Se aislaron ADN y ARN total usando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales RecoverAll (Ambion).

Tabla 12 Datos clínico-patológicos para el tumor de cohorte B

Cohorte C

En junio de 2014, se extrajeron datos de la base de datos del Cáncer Genome Atlas (TCGA) para obtener datos de HM450k para muestras de pacientes correspondientes a CaP de bajo riesgo (n = 9), significativo (n = 68) y de alto riesgo (n = 67) tal como se definió ya para la cohorte 2. También se recuperaron datos histológicamente benignos de HM450k (n = 29). Para cada muestra, se extrajeron archivos *IDAT sin tratar y se procesaron mediante una ejecución abreviada de RnBeads (incluyendo el prefiltrado, la normalización BMIQ y el posfiltrado). Se extrajeron los valores p para las sondas contenidas en los 13 DMR potencialmente de pronóstico y se calculó un valor p de DMR medio para cada muestra. Las diferencias de metilación entre las cohortes se evaluaron mediante una prueba de la T para datos independientes con corrección de Welch. La significación se atribuyó a P <0,05.

Tabla 13 Datos clínico-patológicos para la cohorte C

En la memoria descriptiva, los términos “comprenden, comprende, comprendido y que comprende” o cualquier variación de los mismos y los términos “ incluyen, incluye, incluido y que incluye” o cualquier variación de los mismos se consideran totalmente intercambiables y todos deben tener la interpretación más amplia posible, y viceversa. Bibliografía

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2. Bastian PJ, Boorjian SA, Bossi A, et al. High-risk prostate cancer: from definition to contemporary management. European urology 2012; 61(6): 1096-106.

3. Eads CA DK, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D, Danenberg PV, Laird PW. MethyLight: a highthroughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Research 2000; 28(8): E32.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i . Método de determinación de cáncer de próstata de alto riesgo en un individuo, comprendiendo el método una etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas del grupo que comprende: las SEQ ID NO 1 a 6 y calcular una puntuación de índice de metilación normalizado (IMN), en el que la presencia de las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas y la puntuación de IMN calculada indica un cáncer de próstata de alto riesgo.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la detección de al menos cuatro, cinco o seis secuencias de ADN reguladoras metiladas del grupo que comprende las SEQ ID NO 1 a 6 y la puntuación de IMN calculada indica con la presencia de un cáncer de próstata de alto riesgo.
3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6 y que tienen una sensibilidad de al menos el 80%, y la puntuación de IMN calculada indica la presencia de cáncer de próstata de alto riesgo.
4. 4. Método según la reivindicación 1, en el que la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6 y la puntuación de IMN calculada indica la presencia de cáncer de próstata de alto riesgo.
5. 5. Método según la reivindicación 4, en el que la detección de seis secuencias de ADN reguladoras metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6 y que tienen una sensibilidad de al menos el 80%, y la puntuación de IMN calculada indica la presencia de cáncer de próstata de alto riesgo.
6. 6. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es orina o un derivado de orina del individuo.
7. 7. Método según la reivindicación 1, para determinar un cáncer de próstata agresivo en un individuo, comprendiendo el método la etapa de someter a ensayo una muestra biológica obtenida del individuo para detectar la presencia de al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO 17 y 18, en el que la detección de al menos cuatro de las secuencias de ADN reguladoras metiladas de las SEQ ID NO 1 a 6 y una secuencia de las SEQ ID NO 17 y 18 en una muestra y calcular una puntuación de IMN indica la presencia de un cáncer de próstata agresivo, y en el que la sensibilidad del ensayo para detectar las al menos cuatro secuencias de ADN reguladoras metiladas de las SEQ ID NO 1 a 6 es de al menos el 80%.
8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que la al menos una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO 17 y 18 es SEQ ID NO: 18, que codifica para antígeno prostático específico (PSA).
9. 9. Método según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la detección de al menos seis secuencias reguladoras de ADN metiladas definidas por las SEQ ID NO 1 a 6 y que tienen una sensibilidad de al menos el 80% y la puntuación de IMN calculada indica la presencia de un cáncer de próstata agresivo (metastásico).
10. 10. Kit para detectar la presencia de cáncer de próstata en una muestra de un individuo, comprendiendo el kit un oligonucleótido de control definido por SEQ Id NO 19, 20 ó 21, y un conjunto de oligonucleótidos para detectar las SEQ ID NO 1 a 6, en el que la detección de al menos cuatro secuencias de las SEQ ID NO 1 a 6 en la muestra es indicativa de la presencia de cáncer de próstata, y en el que la sensibilidad del ensayo para detectar las al menos cuatro secuencias de las SEQ ID NO 1 a 6 es de al menos el 80%.
11. 11. Kit según la reivindicación 10, en el que el kit comprende además un oligonucleótido para detectar la presencia de PSA.
12. 12. Kit según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el conjunto de oligonucleótidos se define por las SEQ ID NO 22 a 72.
13. 13. Kit según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el kit comprende además un soporte que tiene al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo de las SEQ ID NO 1 a 6 anclado en el mismo.
14. 14. Método según la reivindicación 1 y la reivindicación 7, en el que las secuencias de ADN reguladoras metiladas seleccionadas de las SEQ ID NO 1 a 6 comprenden las SEQ ID NO 1 y 3.